Bezkomórkowa plama punktowa jako praktyczna i elastyczna platforma testów immunologicznych do wykrywania odpowiedzi przeciwciał w surowicach ludzkich i zwierzęcych

Protokół ten demonstruje technikę bezkomórkowej krwi punktowej, elastyczną i przystępną cenowo platformę testów immunologicznych opracowaną w odpowiedzi na pandemię COVID-19. Istniejące złote standardowe metody testów immunologicznych obejmują odmiany techniki ELISA i testy przepływu bocznego. Zainteresowanie wzbudziło opracowanie nowatorskich testów immunologicznych wykorzystujących takie technologie, jak podzielone białka, interfejsy elektrochemiczne i nanocząstki koloidalne.

Wyzwanie polega na tym, że większość złotych standardów testów immunologicznych jest niedostępna dla niescentralizowanych społeczności ze względu na zależność od drogich i wyrafinowanych komponentów i sprzętu molekularnego. Ta nowatorska technika testu immunologicznego CFDB może być szybko dostosowana do pojawiających się ognisk choroby. Wykorzystuje podstawowy sprzęt laboratoryjny i opiera się całkowicie na komponentach molekularnych, które mogą być produkowane we własnym zakresie i przy niskich zasobach.

Aby rozpocząć, uzyskaj sekwencję białka z bazy danych UniProt za pomocą kodu dostępu P0DTC9. Kod optymalizujący sekwencję dla wyrażenia opartego na ecoli za pomocą kodu IDT w narzędziu optymalizacyjnym. Wstaw zoptymalizowaną sekwencję do matrycy SnapGene dla szkieletu konstrukcji ekspresji przed zamówieniem zoptymalizowanej sekwencji do syntezy komercyjnej jako jednoniciowego fragmentu DNA ponownie zawieszonego w wodzie.

Wykonaj wstępny test ekspresji w skali pięciu mikrolitrów, dodając 10% produkt PCR do reakcji bezkomórkowej ecoli BL21 w probówce PCR. Inkubować reakcję bez wstrząsania w temperaturze 30 stopni Celsjusza przez 15 godzin. Oceń jakość ekspresji białka nukleokapsydu lub antygenu NP, ładując jeden mikrolitr reakcji bezkomórkowej do żelu 12% SDS i przenosząc go do membrany nitrocelulozowej w celu uzyskania western blot.

Zmontować bezkomórkową reakcję w skali jednego mililitra przy użyciu 15-nanomolowego oczyszczonego liniowego produktu matrycowego do bezkomórkowego testu punktowego Inkubować mieszaninę ekspresji w 15-mililitrowej stożkowej probówce z wytrząsaniem przy 80 obr./min przez 15 godzin w temperaturze 30 stopni Celsjusza. Po dokonaniu oceny jakości wyrażenia przy użyciu western blot i podaniu 50 mikrolitrów mieszaniny ekspresyjnej, należy przechowywać podwielokrotności w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza. Użyj głównego obrazu siatki, jak pokazano, przedstawiającego wzór o wymiarach sześć na sześć centymetrów zawierający 12 na 12 okręgów o średnicy dwóch milimetrów, każdy o średnicy dwóch milimetrów, zaprojektowanych tak, aby pasowały do zdolności wykrywania płytki 96-dołkowej.

Po wydrukowaniu siatki głównej, umieść wydrukowaną siatkę mocno między dwiema warstwami samoprzylepnej folii sufitowej z płytą PCR, przytnij kanapkę na wymiar wzdłuż zewnętrznych granic siatki. Za pomocą dwumilimetrowego stempla do biopsji wydrąż każdy zaznaczony okrąg na siatce. Wytnij kawałek membrany nitrocelulozowej o wymiarach 6,5 na 6,5 centymetra, umieść go pod kratką główną na czystej powierzchni i zabezpiecz taśmą klejącą.

Za pomocą markera zaznacz najbardziej zewnętrzne pozycje okręgów na membranie nitrocelulozowej, które mają służyć jako prowadnica do cięcia membrany po plamieniu próbki. Rozcieńczyć próbki surowicy od 1 do 10 w PBS. Za pomocą mikropipety dozować trzykrotnie 0,4 mikrolitra każdej próbki na membranę nitrocelulozową w określonych pozycjach siatki.

Pozostawić nakrapiane próbki do związania i wyschnięcia w temperaturze otoczenia przez 10 minut. Za pomocą pęsety ostrożnie wyjmij membranę nitrocelulozową i przetnij ją wzdłuż zaznaczonych zewnętrznych okręgów. Przenieś membranę na 10-centymetrową szalkę Petriego zawierającą 10 mililitrów roztworu blokującego.

Inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 minut, delikatnie wstrząsając przy 100 obr./min. Wyjmij 50 mikrolitrów podwielokrotności bezkomórkowej mieszaniny ekspresji antygenu z zamrażarki i po rozmrożeniu dodaj ją do pięciu mililitrów roztworu blokującego na 10-centymetrowej szalce Petriego. Przenieść błonę bezpośrednio do roztworu zawierającego antygen i inkubować w temperaturze pokojowej przez jedną godzinę, wstrząsając z prędkością 100 obr./min.

Po godzinie spłucz i umyj membranę w TBST zawierającej 0,05%Tween 20. Następnie dodaj 10 mililitrów buforu blokującego zawierającego 10 mikrogramów na mililitr oczyszczonego SpyCatcher, dwa wierzchołki, dwa białka, do błony i umieść membranę w naczyniu zawierającym wierzchołek SpyCatcher. Inkubować przez godzinę z wytrząsaniem przy 100 obr./min. Po przepłukaniu membrany solą fizjologiczną buforowaną trójpierścieniowo lub TBS, przemyć dwukrotnie przez pięć minut w TBST, a następnie przepłukać końcowo w TBS.

Przyklej i zabezpiecz kawałek parafilmu na czystej powierzchni roboczej w pobliżu przyrządu do obrazowania blotów. Usuń nadmiar płynu, stukając w membranę i za pomocą pęsety umieść go na wierzchu parafilmu. Natychmiast dodaj trzy mililitry wzmocnionego roztworu chemiluminescencji lub ECL na wierzch membrany i inkubuj w temperaturze pokojowej dokładnie przez 90 sekund.

Po wysuszeniu membrany w kranach przenieś ją do przyrządu do obrazowania kompatybilnego z chemiluminescencją. Skorzystaj z funkcji analizy obrazu urządzenia, aby uzyskać intensywność plamki, w tym dla trzech ślepych pozycji na membranie nitrocelulozowej. Utrzymuj stałą objętość pomiarową na punkt.

Eksportuj dane do arkusza kalkulacyjnego, zapewniając prawidłowe oznaczenie każdej pozycji spotu. Obliczyć średnią i odchylenie standardowe intensywności potrójnej plamki. Odejmij tło membrany nitrocelulozowej od wszystkich pomiarów próbki.

Następnie użyj podanego równania, aby uzyskać wartość odcięcia do interpretacji wyników dodatnich lub ujemnych. Na koniec wykreśl odjęte dane odcięcia na wykresie słupkowym. Bezkomórkowy test plam kropkowych przeprowadzono na wstępnie scharakteryzowanej komercyjnej ludzkiej Sarze, a obraz plamy wraz z odpowiednim wykresem intensywności sygnału przedstawiono na tym rysunku.

Test punktowy bez komórek z powodzeniem zidentyfikował wszystkie ujemne próbki kontrolne i większość próbek dodatnich. Niezależne testy bezkomórkowego testu punktowego w Narodowym Laboratorium Mikrobiologicznym prawidłowo zidentyfikowały wszystkie 12 ujemnych i 12 dodatnich próbek pacjentów, potwierdzając jego solidność. Test bezkomórkowy dot blot wykrył również odpowiedzi przeciwciał u chomika Sarah zakażonego SARS-CoV-2, z pozytywnymi sygnałami zaobserwowanymi w 18 z 24 próbek pobranych po infekcji pięć dni po ponownym zakażeniu, podczas gdy wszystkie próbki sprzed infekcji pozostały negatywne.