Name: Bezkomórkowa plama punktowa jako praktyczna i elastyczna platforma testów immunologicznych do wykrywania odpowiedzi przeciwciał w surowicach ludzkich i zwierzęcych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-05-23T13:20:00.000+00:00
Duration: 8 min 21 s
Description: Poznaj technikę bezkomórkowej plamy punktowej jako dostępną i elastyczną platformę immunoassay do wykrywania przeciwciał w surowicach ludzkich i zwierzęcych. Ta metoda umożliwia szybką adaptację do nowych chorób zakaźnych w warunkach ograniczonych zasobów.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

S.S. i R.Z. są wspierane przez fundusze z Agencji Zaawansowanych Projektów Badawczych w Obszarze Obronności (DARPA), numer umowy N66001-23-2-4042. Wyrażone poglądy, opinie i/lub ustalenia są poglądami autorów i nie powinny być interpretowane jako reprezentujące oficjalne poglądy lub politykę Departamentu Obrony lub rządu Stanów Zjednoczonych. Praca ta została wsparta funduszami dla K.P. z programu grantowego CIHR Foundation (201610FDN-375469), CIHR Canada Research Chair Program (950-231075 i 950-233107), University of Toronto's Medicine by Design Initiative, która otrzymuje finansowanie z Canada First Research Excellence Fund oraz fundusze dla K.P., z Defense Research and Development Canada's, Canadian Safety and Security Program (umowa 39903-200137). Rysunek 1 i rysunek uzupełniający S1 zostały utworzone przy użyciu przeglądarki SnapGene Viewer.

<ol><li>Carter, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assay+techniques+and+test+development+for+COVID-19+diagnosis%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Cent+Sci%22%5BJournal%5D)">Assay techniques and test development for COVID-19 diagnosis.</a> ACS Cent Sci. 6, 591-605 (2020).</li>
<li>Amanat, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+serological+assay+to+detect+SARS-CoV-2+seroconversion+in+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">A serological assay to detect SARS-CoV-2 seroconversion in humans.</a> Nat Med. 26 (7), 1033-1036 (2020).</li>
<li>Stadlbauer, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SARS-CoV-2+seroconversion+in+humans%3A+A+detailed+protocol+for+a+serological+assay%2C+antigen+production%2C+and+test+setup%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Microbiol%22%5BJournal%5D)">SARS-CoV-2 seroconversion in humans: A detailed protocol for a serological assay, antigen production, and test setup.</a> Curr Protoc Microbiol. 57 (1), e100(2020).</li>
<li>Pardee, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Portable%2C+on-demand+biomolecular+manufacturing%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Portable, on-demand biomolecular manufacturing.</a> Cell. 167 (1), 248-259.e12 (2016).</li>
<li>Norouzi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-free+dot+blot%3A+an+ultra-low-cost+and+practical+immunoassay+platform+for+detection+of+anti-SARS-CoV-2+antibodies+in+human+and+animal+sera%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol+Spectr%22%5BJournal%5D)">Cell-free dot blot: an ultra-low-cost and practical immunoassay platform for detection of anti-SARS-CoV-2 antibodies in human and animal sera.</a> Microbiol Spectr. 11 (2), e0245722(2023).</li>
<li>Lam, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+evolution+of+APEX2+for+electron+microscopy+and+proximity+labeling%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Directed evolution of APEX2 for electron microscopy and proximity labeling.</a> Nat Methods. 12 (1), 51-54 (2014).</li>
<li>Norouzi, M., Panfilov, S., Pardee, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-efficiency+protection+of+linear+DNA+in+cell-free+extracts+from+Escherichia+coli+and+Vibrio+natriegens%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synth+Biol%22%5BJournal%5D)">High-efficiency protection of linear DNA in cell-free extracts from Escherichia coli and Vibrio natriegens.</a> ACS Synth Biol. 10 (7), 1615-1624 (2021).</li>
<li>IDT codon optimization tool. , Integrated DNA Technologies. 
 <a target="_blank" href="https://www.idtdna.com/pages/tools/codon-optimization-tool">https://www.idtdna.com/pages/tools/codon-optimization-tool</a> (2025).</li>
<li>General protocol for western blotting. , Bio-Rad. 
 <a target="_blank" href="https://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/Bulletin_6376.pdf">https://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/Bulletin_6376.pdf</a> (2025).</li>
<li>Mruk, D. D., Cheng, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+chemiluminescence+%28ECL%29+for+routine+immunoblotting%5BTitle%5D)+AND+%22Spermatogenesis%22%5BJournal%5D)">Enhanced chemiluminescence (ECL) for routine immunoblotting.</a> Spermatogenesis. 1, 121-122 (2011).</li>
<li>Levine, M. Z., Gregorio, N. E., Jewett, M. C., Watts, K. R., Oza, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Escherichia+coli-based+cell-free+protein+synthesis%3A+Protocols+for+a+robust%2C+flexible%2C+and+accessible+platform+technology%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Escherichia coli-based cell-free protein synthesis: Protocols for a robust, flexible, and accessible platform technology.</a> J Vis Exp. (144), (2019).</li>
<li>Plasma and serum preparation. , ThermoFisher Scientific. 
 <a target="_blank" href="https://www.thermofisher.com/ca/en/home/references/protocols/cell-and-tissue-analysis/elisa-protocol/elisa-sample-preparation-protocols/plasma-and-serum-preparation.html">https://www.thermofisher.com/ca/en/home/references/protocols/cell-and-tissue-analysis/elisa-protocol/elisa-sample-preparation-protocols/plasma-and-serum-preparation.html</a> (2025).</li>
<li>Mattiuzzo, G., et al. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMattiuzzo%2C+G+%22WHO%2FBS.2020.2403+Establishment+of+the+WHO+International+Standard+and+Reference+Panel+for+anti-SARS-CoV-2+antibody%22">WHO/BS.2020.2403 Establishment of the WHO International Standard and Reference Panel for anti-SARS-CoV-2 antibody</a>. , (2020).</li>
<li>Gong, F., Wei, H., Li, Q., Liu, L., Li, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+and+comparison+of+serological+methods+for+COVID-19+diagnosis%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Mol+Biosci%22%5BJournal%5D)">Evaluation and comparison of serological methods for COVID-19 diagnosis.</a> Front Mol Biosci. 8, 682405(2021).</li>
<li>Peeling, R. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serology+testing+in+the+COVID-19+pandemic+response%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Serology testing in the COVID-19 pandemic response.</a> Lancet Infect Dis. 20 (9), e245-e249 (2020).</li>
<li>Smith, M. T., Berkheimer, S. D., Werner, C. J., Bundy, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lyophilized+Escherichia+coli-based+cell-free+systems+for+robust%2C+high-density%2C+long-term+storage%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Lyophilized Escherichia coli-based cell-free systems for robust, high-density, long-term storage.</a> Biotechniques. 56 (4), 186-193 (2014).</li>
</ol>

M.N. i K.P. są współtwórcami metody bezkomórkowej kropkowej plamy. Złożono tymczasowy wniosek patentowy związany z tą pracą (PCT/CA2024/050097, złożony w styczniu 2024 r.).

Pandemia COVID-19 uwypukliła znaczenie dostępnej i solidnej diagnostyki dla kontrolowania ognisk zakażeń i optymalizacji globalnych strategii zdrowotnych. Testy serologiczne wykrywające przeciwciała ochronne okazały się niezbędne do śledzenia wzorców przenoszenia się nowych wariantów, identyfikowania gorących punktów, kierowania opracowywaniem szczepionek, klasyfikowania podejrzanych przypadków i ochrony wrażliwych populacji14. Pandemia obnażyła również nierówności w zakresie dostępności testów, p...

Pandemia COVID-19 ujawniła krytyczne zapotrzebowanie na niedrogie, skalowalne narzędzia diagnostyczne, szczególnie dla ustawień o niskich zasobach1. Konwencjonalne testy immunologiczne, takie jak testy immunoenzymatyczne (ELISA), okazały się niezbędne do wykrywania odpowiedzi immunologicznych2,3. Jednak ich wysoki koszt, uzależnienie od złożonych odczynników i uzależnienie od specjalistycznego sprzętu ograniczają ich dostępność, zwłaszcza podczas globalnych kryzysów zdrowotnych. W odpowiedzi na te wyzwania opracowaliśmy Cell-Free Dot Blot (CFDB), tanią, adaptowalną platformę testów immunologicznych przeznaczoną do wykrywania przeciwciał anty-SARS-CoV-2 w surowicach ludzkich i zwierzęcych.
CFDB wykorzystuje bezkomórkową biologię syntetyczną do szybkiej, na żądanie produkcji antygenów wirusowych przy użyciu liniowych szablonów DNA4,5. Eliminuje to potrzebę tradycyjnych procesów klonowania, ekspresji i oczyszczania opartych na komórkach, znacznie przyspieszając produkcję antygenu przy jednoczesnym obniżeniu kosztów. Metoda CFDB upraszcza wykrywanie przeciwciał dzięki zastosowaniu formatu kropkowego, w którym surowice są bezpośrednio nakrapiane na błony nitrocelulozowe. System ten eliminuje potrzebę stosowania drogich płytek wielodołkowych i specjalistycznego sprzętu laboratoryjnego, umożliwiając prosty przepływ pracy "zanurzania" w etapach inkubacji i mycia. Platforma wykorzystuje również system SpyCatcher-SpyTag, w którym chimera peroksydazy SpyCatcher2-Apex2 działa jako uniwersalny wtórny odczynnik wykrywający5,6. Jest on wytwarzany przy użyciu standardowej ekspresji opartej na Escherichia coli, co eliminuje zależność od kosztownych komercyjnych koniugatów przeciwciał. W rezultacie, system CFDB może wykonywać testy serologiczne z wydajnością porównywalną do testów ELISA przy znacznie niższych kosztach - około 3 USD za test 96 próbek w porównaniu do ponad 300 USD za komercyjny zestaw ELISA5.
Aby zademonstrować skuteczność CFDB, przetestowaliśmy jego zdolność do wykrywania przeciwciał w wstępnie scharakteryzowanych surowicach ludzkich i zwierzęcych. Nasze wyniki ściśle korelowały z testem ELISA w identyfikacji próbek dodatnich i ujemnych pod względem COVID-19. Oprócz diagnostyki u ludzi oceniliśmy przydatność CFDB w modelach zwierzęcych, testując surowice chomików zakażonych SARS-CoV-2 i tych zaszczepionych rekombinowanym białkiem nukleokapsydu. Testy te potwierdziły potencjał CFDB do wykorzystania zarówno w diagnostyce ludzi, jak i weterynarzy, co czyni go wszechstronnym narzędziem do monitorowania odpowiedzi immunologicznych u różnych gatunków. Jedną z kluczowych zalet kontraktów CFDB jest ich elastyczność. Poprzez prostą modyfikację matrycy DNA kodującej antygen będący przedmiotem zainteresowania, platforma może być szybko przystosowana do wykrywania przeciwciał przeciwko różnym patogenom, co czyni ją cenną dla przyszłej gotowości na wypadek pandemii. Niski koszt, prosty przepływ pracy i minimalne wymagania infrastrukturalne sprawiają, że jest szczególnie przydatny w zdecentralizowanych laboratoriach i środowiskach o niskich zasobach, w których dostęp do komercyjnej diagnostyki jest ograniczony. 
W tej pracy przedstawimy instrukcje krok po kroku, jak przygotować i przeprowadzić test CFDB. Po pierwsze, zajmiemy się projektowaniem i syntezą liniowych matryc DNA do bezkomórkowej produkcji antygenów, które są podstawowymi odczynnikami wykrywającymi w teście. Następnie opisujemy etapy przygotowania wtórnego odczynnika wykrywającego test SpyCatcher2-Apex2. Następnie dostarczamy instrukcje dotyczące produkcji bezkomórkowej i kontroli jakości samych antygenów. Na koniec szczegółowo opisujemy proces przeprowadzania testu CFDB na próbkach surowicy ludzkiej lub zwierzęcej.

<table><tbody><tr><td>1 kb drabinka DNA</td><td>NEB</td><td>N3232</td><td>Stosowany jako znacznik wielkości dla żeli agarozowych</td></tr><tr><td>20 Aminokwasy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>LAA21-1KT</td><td>Składnik reakcji bezkomórkowej Roztwór B</td></tr><tr><td>Dziurkacz do biopsji 2 mm&nbsp;</td><td>Integra Miltex&nbsp;</td><td>33-31-P/25</td> Do przygotowania chlorowodorku kwasu 5-aminolewulinowego <td>w siatce głównej CFDB</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3785</td><td>Prekursor hemu do indukcji SpyCatcher2-Apex2</td></tr><tr><td>Agaroza w proszku</td><td>BioShop</td><td>AGA002</td><td>Do analizy elektroforetycznej DNA przeciwciała</td></tr><tr><td>anty-SARS-CoV2-nukleokapsydu</td><td>Sinobiological</td><td>40588-T62</td><td>Do wykrywania WB antygenu NP wytwarzanego bez komórek</td></tr><tr><td>Bio-Rad ChemiDoc&nbsp; XRS+</td><td>Bio-Rad</td><td>N/A</td><td>Żelowy aparat do obrazowania</td></tr><tr><td>Koncentratory odśrodkowe</td><td>Cytiva</td><td>28-9323-60</td><td>Do zagęszczania i wymiany buforowej białek</td></tr><tr><td>Wirówka</td><td>Eppendorf</td><td>EP022628257</td><td>Do zbioru kultur bakteryjnych</td></tr><tr><td>Koenzym&nbsp; Hydrat soli sodowej (CoA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3144</td><td>Składnik reakcji bezkomórkowej Roztwór A</td></tr><tr><td>Wstępnie barwiony wzorzec białka barwiony kolorem (szeroki zakres)</td><td>NEB</td><td>P7719</td><td>Stosowany jako znacznik wielkości dla żeli SDS-PAGE</td></tr><tr><td>Panel surowicy Covid-19</td><td>RayBiotech</td><td>CoV-PosSet</td><td>Wstępnie scharakteryzowane surowice do weryfikacji i optymalizacji odczynników/warunków</td></tr> <tr><td>CFDBD-(&minus;)-3-Fosfogliceryna kwas disodowy sól (3-PGA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8877</td><td>Składnik reakcji bezkomórkowej Roztwór B</td></tr><tr><td>Ditiotreitol (DTT)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10197777001</td><td>Składnik</td></tr><tr><td>E. coli 5-alfa</td><td>NEB</td><td>C2987&nbsp;</td><td>do przygotowania plazmidu</td></tr><tr><td>E. coli BL21&nbsp;</td><td>NEB</td><td>C2530&nbsp;</td><td>Do otrzymywania lizatów bezkomórkowych</td></tr><tr><td>E. coli BL21 (DE3)</td><td>NEB</td><td>C2527&nbsp;</td><td>Do wyrażania SpyCatcher2-Apex2</td></tr><tr><td>Tabletka z inhibitorem proteazy bez EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>11836153001</td><td>Składnik buforu do lizy E. coli</td></tr><tr><td>Eppendorf&nbsp; Nowy Brunszwik&nbsp; Inkubator Innova 43/43R</td><td>Shaker Eppendorf</td><td>EPM1320</td><td>Inkubator do hodowli komórek E. coli do ekspresji białek i bezkomórkowego przygotowania lizatu</td></tr><tr><td>Kwas folinowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>47612</td><td>Składnik reakcji bezkomórkowej Roztwór A</td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G9012</td><td>Składnik buforu magazynującego SpyCatcher2-Apex2</td></tr><tr><td>Chlorek hemin&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H9039&nbsp;</td><td>Do suplementacji hemem SpyCatcher2-Apex2</td></tr><tr><td>Nadtlenek wodoru 30%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H1009</td><td>Do wytwarzania odczynnika ECL</td></tr><tr><td>Oprogramowanie Image Lab</td><td>Oprogramowanie Bio-Rad</td><td>1709690</td><td>do żelu ChemiDoc&nbsp; Przyrząd do obrazowania</td></tr><tr><td>Izopropylo-b-D-1-tiogalaktopiranozyd&nbsp;</td><td>Bioshop</td><td>IPT001</td><td>Do indukcji SpyCatcher2-Apex2 expressikon</td></tr><tr><td>Kanamycin Sulfate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>60615</td><td>Do przygotowania kultury bakteryjnej SpyCatcher2-Apex2</td></tr><tr><td>Agar LB</td><td>BioShop</td><td>LBL406</td><td>Do wzrostu E. coli</td></tr><tr><td>bulion LB</td><td>BioShop</td><td>LBL407</td><td>Do wzrostu E. coli</td></tr><tr><td>luminol&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4685</td><td>Do wytwarzania odczynnika ECL</td></tr><tr><td>Lizozym</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L6876</td><td>Do lizy komórek bakteryjnych</td></tr><tr><td>Octan magnezu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M5661</td><td>Składnik reakcji bezkomórkowej Roztwór B</td></tr><tr><td>Żywica NEBExpress Ni&nbsp;</td><td>NEB</td><td>S1428S</td><td>Do oczyszczania SpyCatcher2-Apex2</td></tr><tr><td>Beztłuszczowe mleko w proszku</td><td>Bioshop</td><td>SKI400</td><td>Do blokowania membran WB i CFDB</td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Bemis</td><td>2099-1337410</td><td>Do inkubacji ECL</td></tr><tr><td>kwas p-kumarowy CFDB blot&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C9008</td><td>Do wytwarzania odczynnika ECL</td></tr><tr><td>pET24b-SpyCatcher2-Apex2 plazmid</td><td>Pardee Laboratory</td><td>N/A</td><td>Używany do ekspresji białka SpyCatcher2-Apex2</td></tr><tr><td>szalka Petriego</td><td>Fisherbrand</td><td>FB0875712</td><td>Pojemnik do inkubacji błon WB i CFDB&nbsp;</td></tr><tr><td>Solanka fizjologiczna buforowana fosforanami 10%</td><td>BioShop</td><td>PBS405</td><td>Składnik</td></tr><tr><td>Glutaminian potasu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1501</td><td>Składnik reakcji bezkomórkowej Roztwór B</td></tr><tr><td>Szczawian potasu Monohydrat (kwas szczawiowy)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>223425</td><td>Składnik reakcji bezkomórkowej Roztwór A</td></tr><tr><td>Prefabrykat SDS-PAGE</td><td>żel BioRad</td><td>4561036EDU</td><td>Do analizy elektroforetycznej</td></tr><tr><td>polimerazy DNA o wysokiej wierności białka Q5&nbsp;</td><td>NEB</td><td>M0491&nbsp;</td><td>Do amplifikacji PCR LET</td></tr><tr><td>Zestaw do oczyszczania QIAquick PCR&nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>28106</td><td>Do oczyszczania LETS</td></tr><tr><td>Zestaw roztworów rybonukleotydowych</td><td>NEB</td><td>N0450S</td><td>Składnik reakcji bezkomórkowej Roztwór A</td></tr><tr><td>Odtłuszczone mleko w proszku</td><td>BioShop</td><td>SKI400</td><td>Stosowany jako środek blokujący dla western blot i CFDB</td></tr><tr><td>Chlorek sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9625</td><td>Składnik do oczyszczania białek</td></tr><tr><td>Sonicator</td><td>Qsonica</td><td>Q500</td><td>Do lizy komórek bakteryjnych</td></tr><tr><td>Spermidyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2626</td><td>Składnik reakcji bezkomórkowej Roztwór A</td></tr><tr><td>Filtr strzykawkowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SLGSR33SS</td><td>Do sterylizacji i roztworów</td></tr><tr><td>Termocykler</td><td>BioRad</td><td>T100</td><td>Przyrząd do inkubacji reakcji PCR</td></tr><tr><td>Transfer RNA (tRNA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R8759</td><td>Składnik reakcji bezkomórkowej Roztwór</td></tr><tr><td>A Tris buforowana sól fizjologiczna</td><td>Thermo Scientific</td><td>J60764. K2</td><td>Składnik buforu płuczkowego WB i CFDB Baza</td></tr><tr><td>Trizma</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503</td><td>Do wytwarzania buforu tris</td></tr><tr><td>Tunair SS-5012 Kolba do wytrząsania z półprzegrodą, 2,5 l</td><td>Cole-Parmer</td><td>RK-01835-39</td><td>Naczynie do hodowli komórek E. coli do ekspresji białek i bezkomórkowego przygotowania lizatu</td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>BioShop</td><td>TWN510</td><td>Składnik bufora do płukania WB i CFDB</td></tr><tr><td>Pęseta</td><td>Almedic</td><td>7728-A10-100</td> Do obsługi spektrofotometru UV-Vis <td>z membraną CFB NC</td></tr><tr><td></td><td>Thermo Scientific</td><td>13400518</td><td>Służy do pomiaru stężenia kwasów nukleinowych i DNA oraz hodowli bakterii</td></tr><tr><td>OD WHO Międzynarodowy Panel Referencyjny dla immunoglubuliny anty-SARS-CoV-2</td><td>NISBC</td><td>20/268</td><td>Wstępnie scharakteryzowane surowice do weryfikacji i optymalizacji odczynników/warunków</td></tr> <tr><td>CFDB&beta;-Hydrat dinukleotydu nikotynamidoadeninowego (NAD)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10127965001</td><td>Składnik reakcji bezkomórkowej Roztwór A</td></tr></tbody></table>

bezkomórkowa plama punktowa jako praktyczna i elastyczna platforma testów immunologicznych do wykrywania odpowiedzi przeciwciał w surowicach ludzkich i zwierzęcych

Cell-Free Dot Blot as a Practical and Adaptable Immunoassay Platform for the Detection of Antibody Response in Human and Animal Sera

Seria globalnych epidemii patogenów w ciągu ostatnich dwóch dekad uwypukliła znaczenie strategii nadzoru serologicznego. Platformy testów immunologicznych, które służą do wykrywania przeciwciał specyficznych dla choroby w surowicach pacjentów, są podstawą nadzoru serologicznego. Typowe przykłady obejmują testy immunoenzymatyczne i testy przepływu bocznego; Jednak, chociaż są to złote standardy, wymagają one materiałów eksploatacyjnych specyficznych dla patogenów i specjalistycznego sprzętu, co ogranicza ich zastosowanie poza dobrze wyposażonymi laboratoriami. 
Niedawno opracowaliśmy nową platformę testów immunologicznych o nazwie Cell-Free Dot-Blot (CFDB) i przetestowaliśmy ją za pomocą surowic ludzkich i zwierzęcych przeciwko SARS-CoV-2. W przeciwieństwie do konwencjonalnych testów immunologicznych, próbki surowicy pacjenta CFDB są unieruchamiane do fazy stałej (błony nitrocelulozowej), podczas gdy docelowy antygen jest zawieszony w fazie ruchomej testu. Aby poprawić dostęp do możliwości nadzoru serologicznego, antygeny CFDB są produkowane na żądanie i przy użyciu infrastruktury o niskim obciążeniu, wykorzystującej ekspresję białek in vitro. W tym przypadku antygen jest łączony ze znacznikiem peptydowym, który można wykryć za pomocą pojedynczego uniwersalnego białka reporterowego dla dowolnego testu CFDB. W rezultacie CFDB nie wymaga dostępu do czytnika płytek wielodołkowych ani oczyszczonych komercyjnych komponentów do testów molekularnych. Biorąc pod uwagę te rozważania projektowe, CFDB rozwiązuje problemy z istniejącymi platformami testów immunologicznych, zapewniając dostęp do niescentralizowanych laboratoriów, zdolność adaptacji do pojawiających się patogenów oraz przystępność cenową dla społeczności o niższych dochodach. 
W obecnym artykule przedstawimy krok po kroku protokół przygotowania i przeprowadzenia testu immunologicznego CFDB. Korzystając z naszych ostatnich prac nad SARS-CoV-2 CFDB jako przykładu, omówimy projektowanie antygenowego DNA do produkcji bezkomórkowej na żądanie, a następnie przygotowanie białka reporterowego CFDB, immobilizację próbek surowicy w fazie stałej, a na koniec etapy wiązania antygenu i wykrywania testu. Przewidujemy, że postępując zgodnie z tymi instrukcjami, naukowcy będą w stanie dostosować test CFDB do wykrywania odpowiedzi immunologicznych w surowicach ludzkich i zwierzęcych na dowolny patogen.

Amplifikacja PCR liniowej matrycy ekspresyjnej dla antygenu docelowego 
W celu amplifikacji PCR LET białka NP SARS-CoV-2 zastosowano uniwersalne primery Ter forward i reverse, zgodnie z opisem w sekcji 1.2 protokołu, a następnie 1 μL produktu sprawdzono na żelu agarozowym (Rysunek 4>) przed przystąpieniem do oczyszczania produktu PCR.
<img alt="Wyniki elektroforezy żelowej, rozdział DNA, drabinka pasm,...

Opisujemy niedawno opracowaną platformę testów immunologicznych opartą na zasadach bezkomórkowej biologii syntetycznej i technice dot-blot do konfigurowalnego wykrywania odpowiedzi przeciwciał w surowicach ludzkich i zwierzęcych.

Bezkomórkowa plama punktowa jako praktyczna i elastyczna platforma testów immunologicznych do wykrywania odpowiedzi przeciwciał w surowicach ludzkich i zwierzęcych

The string of global pathogenic outbreaks over the past two decades has highlighted the importance of serosurveillance strategies. Immunoassay platforms ...

Protokół ten demonstruje technikę bezkomórkowej krwi punktowej, elastyczną i przystępną cenowo platformę testów immunologicznych opracowaną w odpowiedzi na pandemię COVID-19. Istniejące złote standardowe metody testów immunologicznych obejmują odmiany techniki ELISA i testy przepływu bocznego. Zainteresowanie wzbudziło opracowanie nowatorskich testów immunologicznych wykorzystujących takie technologie, jak podzielone białka, interfejsy elektrochemiczne i nanocząstki koloidalne.Wyzwanie polega na tym, że większość złotych standardów testów immunologicznych jest niedostępna dla niescentralizowanych społeczności ze względu na zależność od drogich i wyrafinowanych komponentów i sprzętu molekularnego. Ta nowatorska technika testu immunologicznego CFDB może być szybko dostosowana do pojawiających się ognisk choroby. Wykorzystuje podstawowy sprzęt laboratoryjny i opiera się całkowicie na komponentach molekularnych, które mogą być produkowane we własnym zakresie i przy niskich zasobach.Aby rozpocząć, uzyskaj sekwencję białka z bazy danych UniProt za pomocą kodu dostępu P0DTC9. Kod optymalizujący sekwencję dla wyrażenia opartego na ecoli za pomocą kodu IDT w narzędziu optymalizacyjnym. Wstaw zoptymalizowaną sekwencję do matrycy SnapGene dla szkieletu konstrukcji ekspresji przed zamówieniem zoptymalizowanej sekwencji do syntezy komercyjnej jako jednoniciowego fragmentu DNA ponownie zawieszonego w wodzie.Wykonaj wstępny test ekspresji w skali pięciu mikrolitrów, dodając 10% produkt PCR do reakcji bezkomórkowej ecoli BL21 w probówce PCR. Inkubować reakcję bez wstrząsania w temperaturze 30 stopni Celsjusza przez 15 godzin. Oceń jakość ekspresji białka nukleokapsydu lub antygenu NP, ładując jeden mikrolitr reakcji bezkomórkowej do żelu 12% SDS i przenosząc go do membrany nitrocelulozowej w celu uzyskania western blot.Zmontować bezkomórkową reakcję w skali jednego mililitra przy użyciu 15-nanomolowego oczyszczonego liniowego produktu matrycowego do bezkomórkowego testu punktowego Inkubować mieszaninę ekspresji w 15-mililitrowej stożkowej probówce z wytrząsaniem przy 80 obr./min przez 15 godzin w temperaturze 30 stopni Celsjusza. Po dokonaniu oceny jakości wyrażenia przy użyciu western blot i podaniu 50 mikrolitrów mieszaniny ekspresyjnej, należy przechowywać podwielokrotności w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza. Użyj głównego obrazu siatki, jak pokazano, przedstawiającego wzór o wymiarach sześć na sześć centymetrów zawierający 12 na 12 okręgów o średnicy dwóch milimetrów, każdy o średnicy dwóch milimetrów, zaprojektowanych tak, aby pasowały do zdolności wykrywania płytki 96-dołkowej.Po wydrukowaniu siatki głównej, umieść wydrukowaną siatkę mocno między dwiema warstwami samoprzylepnej folii sufitowej z płytą PCR, przytnij kanapkę na wymiar wzdłuż zewnętrznych granic siatki. Za pomocą dwumilimetrowego stempla do biopsji wydrąż każdy zaznaczony okrąg na siatce. Wytnij kawałek membrany nitrocelulozowej o wymiarach 6,5 na 6,5 centymetra, umieść go pod kratką główną na czystej powierzchni i zabezpiecz taśmą klejącą.Za pomocą markera zaznacz najbardziej zewnętrzne pozycje okręgów na membranie nitrocelulozowej, które mają służyć jako prowadnica do cięcia membrany po plamieniu próbki. Rozcieńczyć próbki surowicy od 1 do 10 w PBS. Za pomocą mikropipety dozować trzykrotnie 0,4 mikrolitra każdej próbki na membranę nitrocelulozową w określonych pozycjach siatki.Pozostawić nakrapiane próbki do związania i wyschnięcia w temperaturze otoczenia przez 10 minut. Za pomocą pęsety ostrożnie wyjmij membranę nitrocelulozową i przetnij ją wzdłuż zaznaczonych zewnętrznych okręgów. Przenieś membranę na 10-centymetrową szalkę Petriego zawierającą 10 mililitrów roztworu blokującego.Inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 minut, delikatnie wstrząsając przy 100 obr./min. Wyjmij 50 mikrolitrów podwielokrotności bezkomórkowej mieszaniny ekspresji antygenu z zamrażarki i po rozmrożeniu dodaj ją do pięciu mililitrów roztworu blokującego na 10-centymetrowej szalce Petriego. Przenieść błonę bezpośrednio do roztworu zawierającego antygen i inkubować w temperaturze pokojowej przez jedną godzinę, wstrząsając z prędkością 100 obr./min.Po godzinie spłucz i umyj membranę w TBST zawierającej 0,05%Tween 20. Następnie dodaj 10 mililitrów buforu blokującego zawierającego 10 mikrogramów na mililitr oczyszczonego SpyCatcher, dwa wierzchołki, dwa białka, do błony i umieść membranę w naczyniu zawierającym wierzchołek SpyCatcher. Inkubować przez godzinę z wytrząsaniem przy 100 obr./min. Po przepłukaniu membrany solą fizjologiczną buforowaną trójpierścieniowo lub TBS, przemyć dwukrotnie przez pięć minut w TBST, a następnie przepłukać końcowo w TBS.Przyklej i zabezpiecz kawałek parafilmu na czystej powierzchni roboczej w pobliżu przyrządu do obrazowania blotów. Usuń nadmiar płynu, stukając w membranę i za pomocą pęsety umieść go na wierzchu parafilmu. Natychmiast dodaj trzy mililitry wzmocnionego roztworu chemiluminescencji lub ECL na wierzch membrany i inkubuj w temperaturze pokojowej dokładnie przez 90 sekund.Po wysuszeniu membrany w kranach przenieś ją do przyrządu do obrazowania kompatybilnego z chemiluminescencją. Skorzystaj z funkcji analizy obrazu urządzenia, aby uzyskać intensywność plamki, w tym dla trzech ślepych pozycji na membranie nitrocelulozowej. Utrzymuj stałą objętość pomiarową na punkt.Eksportuj dane do arkusza kalkulacyjnego, zapewniając prawidłowe oznaczenie każdej pozycji spotu. Obliczyć średnią i odchylenie standardowe intensywności potrójnej plamki. Odejmij tło membrany nitrocelulozowej od wszystkich pomiarów próbki.Następnie użyj podanego równania, aby uzyskać wartość odcięcia do interpretacji wyników dodatnich lub ujemnych. Na koniec wykreśl odjęte dane odcięcia na wykresie słupkowym. Bezkomórkowy test plam kropkowych przeprowadzono na wstępnie scharakteryzowanej komercyjnej ludzkiej Sarze, a obraz plamy wraz z odpowiednim wykresem intensywności sygnału przedstawiono na tym rysunku.Test punktowy bez komórek z powodzeniem zidentyfikował wszystkie ujemne próbki kontrolne i większość próbek dodatnich. Niezależne testy bezkomórkowego testu punktowego w Narodowym Laboratorium Mikrobiologicznym prawidłowo zidentyfikowały wszystkie 12 ujemnych i 12 dodatnich próbek pacjentów, potwierdzając jego solidność. Test bezkomórkowy dot blot wykrył również odpowiedzi przeciwciał u chomika Sarah zakażonego SARS-CoV-2, z pozytywnymi sygnałami zaobserwowanymi w 18 z 24 próbek pobranych po infekcji pięć dni po ponownym zakażeniu, podczas gdy wszystkie próbki sprzed infekcji pozostały negatywne.

cell-free-dot-blot-as-practical-adaptable-immunoassay-platform-for

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Wykorzystując technologię mikrosfer xMAP firmy Luminex Corporation, opracowaliśmy wielowiązkowy fluorometryczny test immunoenzymatyczny (MFIA) do nadzoru serologicznego różnych gatunków zwierząt laboratoryjnych. MFIA to zawiesinowa macierz mikrosfer, w której antygen, kontrola tkankowa lub immunoglobuliny są kowalencyjnie powiązane z kolorowo kodowanymi mikrosferami polistyrenowymi. Omówiono metodę testową MFIA oraz różne zagadnienia związane z rozwiązywaniem problemów.

Metodyka przeprowadzania i rozwiązywanie problemów w multipleksowym fluorometrycznym immunoprzebiegu

Ten film opisuje technikę testu immunologicznego wykorzystującą fluorescencyjne kulki magnetyczne lub mikrosfery w połączeniu z różnymi antygenami do jednoczesnego wykrywania różnych izotypów przeciwciał w próbce surowicy. Test jest pomocny w zrozumieniu serokonwersji podczas infekcji lub po szczepieniu.

Multianalitowy test immunobealikowy: Technika testu immunologicznego oparta na przepływie do jednoczesnego wykrywania wielu podtypów przeciwciał w próbce ludzkiej surowicy

Ten protokół opisuje rozwój dwóch przeciwciał monoklonalnych klasy IgG (mAb) silnie reaktywnych na mioglobinę u waleni. Te mAb są nakładane na koloidalny złoty immunochromatograficzny pasek testowy oparty na formacie kanapkowym w celu odróżnienia Mb waleni od fok i innych zwierząt.

Opracowanie immunochromatograficznego paska testowego na bazie złota koloidalnego do wykrywania mioglobiny waleni

Ludzka krew obwodowa jest powszechnie używana do oceny humoralnej odpowiedzi immunologicznej. W tym miejscu opisano metody izolowania ludzkich limfocytów B z krwi obwodowej, różnicowania ludzkich komórek B w limfocyty B wydzielające przeciwciała (Ab) (ASC) w hodowli oraz liczenia całkowitych IgM- i IgG-ASC za pomocą testu ELISpot.

Izolacja, różnicowanie i kwantyfikacja ludzkich limfocytów B wydzielających przeciwciała z krwi: ELISpot jako funkcjonalny odczyt odporności humoralnej

Demonstrujemy technologię chipową do wykonywania testów immunologicznych typu sandwich bez reaktywności krzyżowej, po prostu pstrykając dwa slajdy. Aparat zatrzaskowy służy do niezawodnego przenoszenia odczynników z mikromacierzy do mikromacierzy. Chip zatrzaskowy może być stosowany do wszelkich reakcji biochemicznych wymagających kolokalizacji różnych odczynników bez zanieczyszczenia krzyżowego.

Snap Chip do multipleksowanych testów immunologicznych typu sandwich wolnych od reaktywności krzyżowej i Spotterów

Tutaj demonstrujemy szczegółowy proces ilościowej analizy punktowej (QDB) poprzez określenie bezwzględnej zawartości docelowego białka, białka aktynowego capping, gelsolin-like (CAPG), w trzech różnych tkankach myszy. Demonstrujemy wysokoprzepustową, wygodną, ilościową technikę immunoblot do walidacji biomarkerów na poziomie komórkowym i tkankowym.

Wysoka przepustowość, bezwzględne oznaczanie zawartości wybranego białka na poziomie tkankowym za pomocą ilościowej analizy igłowej (QDB)

W tym artykule opisujemy protokół charakteryzujący odpowiedzi immunoglobuliny (Ig) zależnej od T i niezależnej od T u myszy za pomocą testu ELISA. Ta metoda stosowana samodzielnie lub w połączeniu z cytometrią przepływową pozwoli naukowcom zidentyfikować różnice w odpowiedziach izotypu Ig za pośrednictwem komórek B u myszy po immunizacji antygenu T zależnej i niezależnej od T.

Charakterystyka odpowiedzi izotypu immunoglobuliny zależnej i niezależnej od grasicy u myszy przy użyciu testu immunoenzymatycznego

Ten artykuł opisuje wygodną metodę monitorowania dynamicznych zmian w mianach przeciwciał dla dwóch izotypów immunoglobulin jednocześnie (IgA, IgM lub IgG) wynikających z odpowiedzi immunologicznej na zakażenie SARS-CoV-2 lub szczepienie. Ten "Multianalitowy panel odpowiedzi immunologicznej Covid-19" wykorzystuje trzy pośrednie testy immunologiczne zbudowane na kodowanych mikrosferach, które są odczytywane za pomocą przepływowego czytnika multipleksowego z funkcją "dwukanałową".

Dynamiczne monitorowanie serokonwersji za pomocą wieloanalitowego testu immunobeadowego w kierunku Covid-19

Ten protokół opisuje metodologię przygotowania kulek lateksowych do testów z użyciem przeciwciał IgY do wykrywania antygenów.

Standaryzacja cytometrycznego testu kulkowego opartego na przeciwciałach przeciwko żółtku jaja kurzego

Testy immunologiczne oparte na krwi pełnej dostarczają łatwego i zasobooszczędnego narzędzia do analizy odporności specyficznej dla antygenu do celów diagnostycznych i badawczych. W tym artykule przedstawiono zoptymalizowany protokół oparty na krwi pełnej z podwójną kostymulacją do kompleksowej analizy odporności gospodarza na patogeny grzybowe i wirusowe, w tym wersję o małej objętości dla pacjentów pediatrycznych i małych zwierząt.

Test krwi pełnej z podwójną kostymulacją do specyficznej dla antygenu analizy odporności gospodarza na patogeny grzybowe i wirusowe

Prezentujemy zwalidowany test ELISA z użyciem nowych przeciwciał monoklonalnych anty-HER2. Test ten umożliwia precyzyjne określenie ilościowe związanego z komórkami i uwolnionego białka HER2 z komórek hodowanych in vitro i innych próbek, w tym krwi i tkanek.

Zwalidowany test immunochemiczny do kompleksowego określenia receptora ludzkiego naskórkowego czynnika wzrostu 2 uwalnianego z komórek i związanego z komórkami

Poznaj technikę bezkomórkowej plamy punktowej jako dostępną i elastyczną platformę immunoassay do wykrywania przeciwciał w surowicach ludzkich i zwierzęcych. Ta metoda umożliwia szybką adaptację do nowych chorób zakaźnych w warunkach ograniczonych zasobów.

Bezkomórkowa plama punktowa jako praktyczna i elastyczna platforma testów immunologicznych do wykrywania odpowiedzi przeciwciał w surowicach ludzkich i zwierzęcych (Wideo) | JoVE Journal

Bezkomórkowa plama punktowa jako praktyczna i elastyczna platforma testów immunologicznych do wykrywania odpowiedzi przeciwciał w surowicach ludzkich i zwierzęcych

Przeglądaj więcej filmów