Name: Mysi model chirurgicznego uszkodzenia macicy i późniejszych wyników ciąży (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-06-27T12:55:00.000+00:00
Duration: 4 min 8 s
Description: Poznaj model uszkodzenia macicy u myszy do badania odpowiedzi rany i defektów rozwojowych w kolejnych ciążach. Ta metoda umożliwia testowanie strategii interwencyjnych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy UC Davis Teaching and Research Animal Care Services (TRACS) za ich ciągłe wsparcie hodowlane, proceduralne i logistyczne. Dziękujemy Animal Model Core UC Davis Cardiovascular Research Institute (CVRI) i głównemu dyrektorowi dr Yi-Je (Jay) Chen, D.V.M., Ph.D. za wskazówki techniczne i wsparcie, a także korzystanie z sali operacyjnej podczas filmowania. Dziękujemy wszystkim członkom laboratorium Zhang za ich wsparcie dla tej pracy. Rysunek 5A został utworzony za pomocą BioRender.com (https://BioRender.com/ig9sfon).

Wszystkie procedury przedstawione w tym protokole zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Wykorzystania Zwierząt (IACUC) Uniwersytetu Kalifornijskiego w Davis (Protokół IACUC #23985). Procedury opisane w tym protokole są zwykle wykonywane na samicach C3H w wieku 7-10 tygodni i wadze 19-25 g, chociaż protokół ten jest odpowiedni dla samic myszy wszystkich szczepów, wieku i wagi, w zależności od pytania badacza. Monitoruj zwierzęta przed operacją, aby upewnić się, że do badań wykorzystywane są tylko zdrowe zwierzęta bez oznak urazu lub stresu. Szczegółowe informacje na temat odczynników i używanego sprzętu są wymienione w Tabeli materiałów.
1. Przygotowanie pola operacyjnego
<ol>
	<li>Przed dniem operacji umieść wszystkie narzędzia chirurgiczne (cienkie kleszcze (#5 lub #55), uchwyt na igłę, zakrzywione nożyczki do tęczówki i aplikator do przycinania skóry (załadowany klipsami)) w woreczkach sterylizacyjnych i autoklawie.</li>
	<li>W przypadku stosowania środka znieczulającego do wstrzykiwań, należy przygotować robocze rozcieńczenie 10 mg/ml ketaminy i 1 mg/ml ksylazyny w 0,9% roztworze soli fizjologicznej chlorku sodu. UWAGA: Alternatywnie, izofluran podawany przez noznos jest dopuszczalną formą znieczulenia40.</li>
	<li>Bezpośrednio przed zabiegiem należy założyć środki ochrony osobistej (PPE): fartuch laboratoryjny, chirurgiczną czepkę do włosów, chirurgiczną maskę na twarz i rękawiczki.</li>
	<li>Przygotuj obszar przedoperacyjny. UWAGA: Może składać się z jednej chłonnej podkładki wyłożonej ręcznikami papierowymi oraz klatki, w której zwierzę może odpocząć po otrzymaniu znieczulenia przed operacją. Wyłóż klatkę dla zwierząt ręcznikami papierowymi i umieść ją obok podkładki na ławkę przed operacją.</li>
	<li>Zważyć zwierzę przeznaczone do operacji w wytarowanej plastikowej zlewce lub podobnym pojemniku na wadze (ryc. 1A). Zapisz wagę, aby obliczyć odpowiednie ilości środka znieczulającego, przeciwbólowego i soli fizjologicznej.</li>
	<li>Podaj zwierzęciu znieczulenie iniekcyjne, wykonując następujące czynności:<ol>
		<li>Napełnić strzykawkę insulinową odpowiednią objętością roboczego rozcieńczenia ketaminy/ksylazyny (patrz krok 1.1), aby uzyskać dawkę 100 mg/kg ketaminy i 10 mg/kg ksylazyny (Rysunek 1B). UWAGA: Na przykład zwierzę ważące 22 g wymagałoby 0,22 ml 10 mg/ml ketaminy i 1 mg/ml ksylazynowego roztworu znieczulającego.</li>
		<li>Odpowiednią dawkę ketaminy/ksylazyny wstrzyknąć dootrzewnowo (I.P.) po bezpiecznym otarciu i odwróceniu zwierzęcia do pozycji leżącejna plecach 41 (Rysunek 1C). UWAGA: W razie potrzeby można zastosować osłonę przeciwzadrapaniową.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Monitoruj zwierzę przez około 3 minuty. Wstrzyknąć dodatkowe 0,02 ml roztworu ketaminy/ksylazyny I.P.41 , jeśli w tym oknie czasowym zaobserwowany jest ruch.</li>
	<li>Sprawdź, czy sedacja jest odpowiednia, wykonując szczypanie przedniego palca u nogi ~10 min po podaniu znieczulenia40,42. UWAGA: Zwierzęta zazwyczaj osiągają chirurgiczną płaszczyznę znieczulenia w ciągu 10-15 minut. Myszy C3H zazwyczaj wymagają ~ 20% więcej środka znieczulającego niż zwierzęta C57BL/6 lub BALB/c (np. 0,24 ml roztworu ketaminy/ksylazyny na zwierzę o wadze 20 g). Może być konieczne empiryczne określenie dawkowania na podstawie każdego szczepu.</li>
	<li>Po ustaniu ruchu, podskórnie (S.C.) wstrzyknąć zwierzęciu41 0,5 mg/kg buprenorfiny o przedłużonym uwalnianiu (ryc. 1D). UWAGA: Biorąc pod uwagę małą objętość i lepki charakter buprenorfiny o przedłużonym uwalnianiu, zaleca się wstrzykiwanie jej w pobliżu łopatki, jednocześnie napinając skórę drugą ręką.</li>
	<li>Aby chronić oczy zwierzęcia, nałóż maść okulistyczną za pomocą sterylnego bawełnianego wacika (ryc. 2A).</li>
	<li>Znieczulone zwierzę należy umieścić na przedoperacyjnym podkładzie chłonnym wyłożonym ręcznikami papierowymi.</li>
	<li>Ostrożnie ogolić miejsce nacięcia w dolnej i środkowej części pleców za pomocą trymera do futra (Rysunek 2B). Usuń nadmiar sierści za pomocą ręczników papierowych, a następnie wałka do kłaczków (Rysunek 2C).1.12 UWAGA: Krem do depilacji można nakładać za pomocą sterylnego wacika w celu całkowitego usunięcia sierści.</li>
	<li>Zdezynfekuj miejsce nacięcia za pomocą wacików nasączonych alkoholem i wacików powidonowo-jodowych w następujący sposób:<ol>
		<li>Zaczynając od środka zamierzonego miejsca nacięcia, wytrzyj na zewnątrz wacikiem nasączonym alkoholem okrężnymi ruchami (Rysunek 2D).</li>
		<li>Następnie przetrzyj miejsce nacięcia wacikiem jodowo-powidonowym w podobny sposób (ryc. 2E).</li>
		<li>Na przemian z wacikami do przygotowywania świeżego alkoholu i wacikami z widonem i jodem, w sumie 3 rundy.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotować obszar operacyjny w następujący sposób (patrz rysunek 3A):<ol>
		<li>Umieść drugi wkład chłonny pod oświetlaczem, a następnie sterylną serwetę chirurgiczną na wkładce chłonnej.</li>
		<li>Zdezynfekuj iluminator 70% etanolem. Zmień rękawice na sterylne przed kontaktem ze wysterylizowanymi narzędziami i wykonaniem nacięcia.</li>
		<li>Umieść sterylne narzędzia chirurgiczne na krawędziach serwety chirurgicznej i umieść zwierzę na środku pola operacyjnego.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Stwórz sterylne pole, umieszczając sterylną serwetę (np. Glad Press 'n Seal) nad zwierzęciem, pozostawiając odsłonięty tylko pysk (ryc. 3B). UWAGA: Podczas użytkowania czyste narzędzia chirurgiczne można umieszczać na sterylnych powierzchniach, takich jak sterylna serweta w obrębie obszaru operacyjnego.</li>
	<li>Wytnij mały kwadrat nad ogolonym obszarem, przygotowując się do wykonania nacięcia w tym miejscu (ryc. 3C,D). Patrz UWAGA dla kroku 2.1 (poniżej), aby zapoznać się z konkretną lokalizacją miejsca nacięcia.</li>
</ol>
2. Chirurgiczna indukcja uszkodzenia macicy
UWAGA: W tej sekcji opisano operację i procedurę wprowadzania urazu do pojedynczego rogu macicy samicy myszy, która nie jest w ciąży. Najpierw wykonuje się laparotomię grzbietową w celu odsłonięcia górnej części rogu macicy. Następnie do światła macicy wprowadza się zadziorną igłę o wadze 25 G, aby uszkodzić błonę śluzową macicy i, w razie potrzeby, przeciąć mięśniówkę macicy. W ten sposób powstaje podłużna rana w uszkodzonym rogu macicy, co umożliwia dalsze eksperymenty w celu odpowiedzi na takie pytania, jak gojenie się macicy i jak uraz wpływa na późniejszą ciążę. Ważne jest, aby zwierzę zostało odpowiednio uspokojone przed wykonaniem zabiegu. Jak opisano w kroku 1, kilka parametrów wskazuje, że zwierzę jest odpowiednio znieczulone. Należą do nich ustanie ruchu, zmniejszenie częstości oddechów i brak odruchu kończyn przednich. Ponadto odruch kończyn tylnych przy lekkim dotyku powinien być nieobecny, chociaż odruch ten czasami pozostaje obecny pomimo odpowiedniego znieczulenia, jeśli zostanie przyłożony wystarczający nacisk40,42.
<ol>
	<li>Wytnij 2-3 mm nacięcie w skórze grzbietowej myszy za pomocą nożyczek (prostych lub zakrzywionych nożyczek tęczówki), przytrzymując skórę cienkimi kleszczami (#5 lub #55). UWAGA: Odetnij ~1/3 odległości między podstawą ogona a szyją i ~0,5 cm od linii środkowej. Zobacz rysunek 4A.</li>
	<li>Wyciąć 2-3 mm nacięcie w powięzi bezpośrednio nakładające się na poduszeczkę tłuszczową jajnika (ryc. 4B).</li>
	<li>Delikatnie chwyć poduszeczkę tłuszczową jajnika za pomocą kleszczy i wyjmij ją z nacięć w powięzi i skórze (ryc. 4C). UWAGA: Może być konieczne przecięcie części poduszeczki tłuszczowej, aby można było usunąć jajnik i macicę z jamy ciała. Unikaj uszkodzenia jakiejkolwiek części samego żeńskiego układu rozrodczego, a także śledziony i wszelkich dużych naczyń krwionośnych w pobliżu poduszeczki tłuszczowej.</li>
	<li>Po odsłonięciu górnej jednej trzeciej macicy wykonaj następujące czynności (ryc. 4D):<ol>
		<li>Delikatnie zabezpiecz podwiązanie macicy za pomocą kleszczyków (ryc. 5A,B).</li>
		<li>Użyj ostrego końca zadziornej igły, aby utworzyć mały otwór w górnej części macicy (ryc. 5A,B).</li>
		<li>Ostrożnie włóż igłę i zacznij zeskrobywać powierzchnię antymesometrialną rogu macicy (ryc. 5C).</li>
		<li>Kontynuuj skrobanie, aż zostanie osiągnięta całkowita perforacja zarówno warstwy endometrium, jak i mięśniówki macicy (ryc. 5D). UWAGA: Nadmierny nacisk za pomocą kleszczy i/lub wkłucia igły może rozerwać macicę przy podwiązaniu macicy, co powoduje oddzielenie rogu macicy od jajowodu i jajnika. Jeśli trudno jest wykonać otwór wejściowy do macicy za pomocą igły z zadziorami bez uszkodzenia podwiązania macicy, alternatywą może być użycie niezadziorowanej igły 25 G lub 27 G. Zadziorowaną igłę można następnie włożyć do tego otworu, aby wygenerować nacięcie, jak opisano powyżej. W opisanym tutaj podejściu w rogu macicy wprowadza się nacięcia o pełnej grubości. Jeśli jednak pożądane jest mniej rozległe uszkodzenie macicy, igła z zadziorami 25 G może być użyta do zeskrobania tylko najbardziej wewnętrznych warstw macicy, takich jak endometrium. Ponadto procedura ta nie wykorzystuje szwów do zamykania macicy, aby uniknąć wprowadzania reakcji ciała obcego jako dodatkowej zmiennej; Jednak szycie macicy jest akceptowalną alternatywą dla tej procedury.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Delikatnie przywróć uszkodzony róg macicy do jamy ciała za pomocą kleszczy (ryc. 6A,B).</li>
	<li>Zszyj43 powięź zamknij szwem w rozmiarze 4-0 i usuń nadmiar szwu (ryc. 6C-E). UWAGA: Pojedynczy szew jest zazwyczaj wystarczający do zamknięcia nacięcia w powięzi.</li>
	<li>Zamknij nacięcie skóry klipsami za pomocą aplikatora do klipsów do skóry (Rysunek 6F). UWAGA: Do zamknięcia nacięcia niezbędny jest jeden lub dwa klipsy.</li>
	<li>Wstrzyknąćpodskórnie 41 10 mg/kg karprofenu jako środek przeciwbólowy i 0,5 ml soli fizjologicznej (0,9% NaCl) do pooperacyjnej opieki podtrzymującej. Zobacz rysunek 7A.</li>
	<li>Użyj dziurkacza do uszu lub numerowanych metalowych kolczyków, aby zidentyfikować zwierzę44.</li>
	<li>Umieść zwierzę w ogrzewanej klatce w celu rekonwalescencji pooperacyjnej (ryc. 7B). UWAGA: Gdy zwierzę będzie w stanie podnieść głowę, umieść je z powrotem w zwykłej klatce z pościelą. Zobacz krok 2.12 poniżej.</li>
	<li>Jeśli wykonujesz dodatkowe operacje przy użyciu tych samych narzędzi chirurgicznych, wykonaj następujące czynności:<ol>
		<li>Najpierw wyczyść 70% etanolem i ręcznikami papierowymi.</li>
		<li>Następnie ponownie wysterylizuj narzędzia, umieszczając je w suchym sterylizatorze szklanym na 30 sekund.</li>
		<li>Przed dalszym użyciem poczekaj, aż narzędzia ostygną do temperatury pokojowej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zwrócić zwierzę (zwierzęta) do umieszczenia w obiekcie dla zwierząt po wznowieniu przemieszczania, ~ 1-2 godziny po rekonwalescencji po operacji, jeśli zastosowano ketaminę/ksylazynę lub ~ 5 minut po znieczuleniu izofluranem.</li>
	<li>Należy codziennie monitorować zwierzę (zwierzęta) pod kątem objawów bólu i niepokoju oraz w razie potrzeby wstrzykiwać 10 mg/kg karprofenu przez okres do 3 dni po operacji. UWAGA: Skala grymasu45 i ocena kondycji ciała46 są standardowymi weterynaryjnymi ocenami dobrostanu zwierząt.</li>
</ol>
3. Krycie i sekcja ciężarnych myszy w celu oceny konsekwencji uszkodzenia macicy
UWAGA: W zależności od konkretnego pytania badawczego można przeprowadzić różne analizy punktów końcowych po urazie macicy. Na przykład zwierzęta, które nie są w ciąży, mogą być poddawane sekcji w różnych punktach czasowych po urazie w celu zbadania kinetyki gojenia się ran27. Ponadto zranione zwierzęta mogą zostać zapłodnione poprzez naturalne krycie lub transfer zarodków w celu zbadania wpływu urazu na kolejne ciąże27. Ten Krok opisuje ocenę rozwoju embrionalnego i łożyskowego w uszkodzonym środowisku macicy. W szczególności krok ten zawiera szczegółowe informacje na temat ustalania krycia w określonym czasie i sekcji zwierząt w 12,5 dniu ciąży w embrionalnym dniu ciąży (E12,5, z porannym czopem dopochwowym zdefiniowanym jako E0,5; więcej informacji na temat identyfikacji czopów dopochwowych w kroku 3.2 poniżej). Ogólnie rzecz biorąc, krok 3 stanowi przykład dalszych analiz, które można przeprowadzić po urazie w celu zbadania określonego zestawu pytań eksperymentalnych.
<ol>
	<li>Po rekonwalescencji pooperacyjnej należy przeprowadzić krycia czasowe47 poprzez wspólne trzymanie rannej samicy z reproduktorem w wieku 11 tygodni lub starszym. UWAGA: Czas rekonwalescencji po urazie zostanie określony przez konkretne pytanie badawcze. Badania z wykorzystaniem tego protokołu zazwyczaj pozwalają na 30 dni rekonwalescencji (z testowanym zakresem 5-105 dni) przed rozpoczęciem krycia w czasie. Kojarzenie trio lub harem obniża koszty utrzymania i zwiększa efektywność tego eksperymentalnego podejścia. Należy jednak pamiętać, że takie konfiguracje krycia wymagają zatwierdzenia instytucjonalnego i są przeznaczone wyłącznie do celów sekcji w czasie ciąży; Żywe urodzenia z krzyżowania trio lub haremu powodują stres u zwierząt i nie są ogólnie zalecane ani dozwolone.</li>
	<li>Wykonuj kontrole zatyczki dopochwowej każdego ranka, aż zostanie zidentyfikowany czop (patrz ryc. 8), w którym to momencie samica może być trzymana oddzielnie od samca ćwieka. UWAGA: Zatyczki pojawią się jako biała masa w kanale pochwy (ryc. 8A) lub jako wybrzuszenie całego obszaru pochwy. Jeśli na zewnątrz nie widać śladu zatyczki, sondę naprowadzającą można powoli wprowadzić do kanału pochwy (ryc. 8C,D). Jakikolwiek opór przed pełnym włożeniem końcówki aż do zagięcia w głowicy naprowadzającej sondy wskazuje na zatyczkę. Kontrole wtyczek należy przeprowadzać o ~7 rano lub tak wcześnie, jak to możliwe rano, ponieważ wtyczki wypadają w ciągu dnia. Aby uzyskać więcej informacji na temat sprawdzania zatyczek dopochwowych, patrz Behringer i wsp.48. W celu dodatkowego i bardziej wiarygodnego potwierdzenia ciąży można zastosować ultrasonografię o wysokiej częstotliwości49,50. Jeśli ultradźwięki są niedostępne lub niepożądane, wykazano, że przyrost masy ciała pozwala przewidzieć ciążę z rozsądną dokładnością przez E7.7551.</li>
	<li>Zwierzę należy złożyć w ofierze (zgodnie z instytucjonalnie zatwierdzonymi protokołami) w pożądanym wieku ciążowym. Zobacz NOTATKĘ poniżej, aby uzyskać szczegółowe informacje na temat tego, jak przeprowadzić eutanazję zwierząt i jak wybrać wiek ciążowy do sekcji. UWAGA: Data wtyczki jest oznaczona jako E0.5. Wybierz wiek ciążowy w momencie składania ofiary na podstawie pytania eksperymentalnego, na które odpowiadasz. Na przykład E4.5-E5.5 jest odpowiedni do badania biologii okołoimplantacyjnej. E11.5-E14.5 jest wskazany do badania wad łożyska w połowie ciąży, w tym obecności zrośniętych łożysk. Postępuj zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi dotyczącymi eutanazji zwierząt. Dopuszczalną procedurą jest 8-minutowy okres inkubacjiCO2 , po którym następuje 2-minutowy okres oczekiwania i obserwacji, a na końcu wtórne potwierdzenie eutanazji poprzez zwichnięcie szyjki macicy.</li>
	<li>Po eutanazji przygotuj się do sekcji w następujący sposób (patrz ryc. 9A):<ol>
		<li>Umieść zwierzę w pozycji leżącej na powierzchni sekcyjnej.</li>
		<li>Zaopatrz się w niezbędne narzędzia preparacyjne (kleszcze, nożyczki) wraz z szalkami Petriego wypełnionymi 1× PBS.</li>
		<li>Aby zapobiec przywieraniu luźnych pasm futra do miejsca sekcji, przed rozcięciem należy najpierw zwilżyć sierść na brzuchu 70% etanolem, wodą lub 1× PBS.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wykonaj nacięcie w dolnej części brzucha, przytrzymując skórę brzucha kleszczami i przecinając nożyczkami kształt litery V wzdłuż brzucha, aż dojdziesz do dna klatki piersiowej (~ 2 cm nacięcie na każde pociągnięcie litery "V"). Patrz rysunek 9B-D.</li>
	<li>Wykonaj nacięcie w kształcie litery V w leżącej poniżej ścianie mięśnia brzucha (nacięcie ~2 cm na każde pociągnięcie litery "V"), trzymając je kleszczami i tnąc w kształcie litery V, aż jama brzuszna będzie widoczna. Patrz rysunek 9E,F.</li>
	<li>Odsłoń macicę, delikatnie odsuwając na bok jelita i inną zawartość jamy brzusznej. Wyciągnij macicę zawierającą zarodki z jamy brzusznej i umieść ją w polu widzenia. Zobacz rysunek 9G.</li>
	<li>Usuń macicę wraz z zamkniętymi zarodkami z jamy brzusznej. Umieść macicę na szalce Petriego wypełnionej 1× PBS. Zobacz rysunek 9H. UWAGA: Użyj kleszczy, aby najpierw chwycić poduszeczkę tłuszczową jajnika. Następnie użyj nożyczek, aby oddzielić macicę od reszty jamy ciała, najpierw przecinając tłuszcz jajnikowy, następnie tętnice mesometrialne, pochwę, tętnice mesometrialne wzdłuż drugiego rogu macicy, a na końcu drugą poduszeczkę tłuszczową jajnika. W razie potrzeby można przeprowadzić dalszą sekcję w celu uzyskania pożądanej dalszej analizy, takiej jak mikroskopia lub histologia. Na rysunku 10 przedstawiono przykładowe dane.</li>
</ol>

Autorzy nie mają do zadeklarowania konfliktu interesów.

Cesarskie cięcie stanowi ~33% porodów w USA i do 55%-65% porodów w krajach takich jak Brazylia i Egipt12,52, a jednak niewiele wiadomo o tym, jak macica goi się po urazie lub jak te urazy wpływają na kolejne ciąże. Chociaż wcześniejsze cesarskie cięcie jest głównym czynnikiem ryzyka zaburzeń ciąży, takich jak spektrum przylegania łożyska (PAS) i łożysko przodujące, mechanizmy, w wyniku których one powstają, są niejasne 3,6,14,17...

Chociaż 1 na 3 porody w USA odbywa się przez cesarskie cięcie (cesarskie cięcie), niewiele wiadomo o tym, jak goi się macica i jak uszkodzona macica prowadzi do komplikacji w kolejnych ciążach 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12, Rozdział 13. Powikłania te obejmują pęknięcie macicy, łożysko przodujące, PAS i ciążę z blizną po cesarskim cięciu, które razem dotykają ~ 2,5% pacjentek, które miały jedno lub więcej cesarskich cięć 1,2,6,8,12,14,15,16,17. Łożysko przodujące charakteryzuje się nieprawidłowym umieszczeniem łożyska w dolnej części macicy 4,16. Powoduje to nie tylko fizyczną niedrożność szyjki macicy i zwiększone ryzyko krwawienia w czasie ciąży, ale jest również istotnym czynnikiem ryzyka cięższego, inwazyjnego stanu PAS 8,12. PAS definiuje się jako nadmierną inwazję łożyska zbyt głęboko w tkanki matki, nawet do pęcherza moczowego lub odbytnicy, i często wymaga histerektomii przez cesarskie cięcie, aby wykluczyć zagrażający życiu krwotok matki12,17. Ciąże z bliznami po cesarskim cięciu, choć rzadkie, niosą ze sobą wysoki odsetek powiązanych chorób, w tym poronienia, obumarcia płodu i przedwczesnego porodu18,19. Oprócz powikłań związanych z historią wcześniejszych cesarskich cięć, inne zabiegi macicy, takie jak miomektomia lub dylatacja i łyżeczkowanie (D&C), również prowadzą do chorób chorobowych pacjentki. Na przykład, ~ 30% pacjentek poddawanych D&C po późnym samoistnym poronieniu i do 46% pacjentek poddawanych drugiej histeroskopowej resekcji mięśniaka gładkokomórkowego rozwija zrosty wewnątrzmaciczne charakterystyczne dla zespołu Ashermana (AS)20,21. AS dotyka ~ 2% kobiet, powodując brak miesiączki, bolesne miesiączkowanie, niepowodzenie implantacji zarodka, nawracające utrata ciąży, przedwczesny poród i/lub PAS21,22. W związku z tym, biorąc pod uwagę znaczną liczbę poważnych zachorowań i śmiertelności związanych z wcześniejszymi urazami macicy, eksperymentalny model zwierzęcy ma kluczowe znaczenie nie tylko dla wyjaśnienia mechanizmów, za pomocą których rany macicy goją się i jak uszkodzenie macicy wpływa na późniejsze wyniki ciąży, ale także jako platforma do rozwoju nowatorskiej diagnostyki i terapii23,24.
W związku z tym w kilku badaniach opracowano mysie modele uszkodzenia macicy. Jednak wczesne badania albo nie badały konsekwencji uszkodzenia macicy na kolejne ciąże25, albo ograniczały uszkodzenia powierzchni światła macicy w celu zbadania implantacji zarodka poza oknem receptywności endometrium u myszy poddanych owariektomii26. Aby wypełnić te luki w wiedzy, model opisany w tym protokole, wraz z innymi niedawnymi badaniami, przedstawia nowatorską metodologię chirurgiczną wprowadzania uszkodzenia macicy u myszy27,28. Protokół ten wykorzystuje zwykłą mysz laboratoryjną jako organizm modelowy ze względu na jej szeroką dostępność, podatność genetyczną, krótką ciążę, szybki czas od urodzenia do dojrzewania, duże rozmiary miotu i opłacalność. Ponadto cecha anatomiczna dwóch rogów macicy u myszy pozwala na wewnętrzną kontrolę z nieuszkodzonym rogiem u każdego zwierzęcia doświadczalnego, a także na możliwość oddzielenia miejscowych wad bezpośrednio przy bliźnie vs. globalne wady w całym środowisku macicy. Podejście opisane w tym protokole obejmuje prostą laparotomię grzbietową, po której następuje użycie zadziornej igły w celu wykonania nacięcia zarówno przez warstwę endometrium, jak i mięśniówkę macicy pojedynczego rogu macicy. Metodologia ta najwierniej naśladuje urazy obserwowane podczas cesarskich cięć i miomektomii, chociaż można ją łatwo zmodyfikować w celu zbadania urazów bez nacięcia, takich jak D&C, które poprzedzają AS29,30. Po urazie zwierzętom pozwala się na powrót do zdrowia, a następnie kryje się je z samcami reproduktora w czasie ciąży w celu zbadania konsekwencji urazu dla późniejszych wyników w macicy27,28.
Chociaż ogólna strategia jest podobna do innych ostatnich badań, istnieją aspekty tego protokołu, które zapewniają wyraźne korzyści. Na przykład zarówno Li i wsp., jak i Burke i wsp. uzyskali dostęp do macicy brzusznie, a nie grzbietowo, jak opisano tutaj 31,32. Podejście grzbietowe jest zarówno prostsze do wykonania, jak i bardziej sprzyja szybkiej rekonwalescencji pooperacyjnej zwierzęcia. W przypadku myszy niebędących w ciąży w badaniu Burke i wsp., do zeskrobywania endometrium użyto wygiętych igieł lub kiret, naśladując w ten sposób D&C, w przeciwieństwie do urazów nacięć o pełnej grubości w tym protokole, które dokładniej modelują cesarskie cięcia i miomektomie32. U myszy okołoporodowych Burke i in. wprowadzili nacięcia na mezometrium, w przeciwieństwie do powierzchni antymesometrialnej, na której zagnieżdżają się zarodki, jak opisano tutaj. Używając igły z zadziorami, w przeciwieństwie do nożyczek używanych przez Li i wsp.31, podejście to można łatwiej zmodyfikować od urazów o pełnej grubości do urazów ograniczonych endometrium, aby modelować zarówno D&C, jak i cesarskie cięcia i miomektomię. Zarówno Li i wsp., jak i Burke i wsp. zamknęli rany macicy szwami, które, choć bardziej wierne wydarzeniom podczas cesarskiego cięcia, wprowadzają dodatkową zmienność w procesie gojenia, a także potencjalne skutki dla ciał obcych 31,32,33,34,35,36. W podobnych badaniach na szczurach wykorzystano drogi brzuszne w celu wygenerowania ran macicy o pełnej grubości37,38 lub39 nacięć, które są zamykane za pomocą szwów 37,38,39 zarówno u kobiet niebędących w ciąży38,39, jak i w ciąży37 zwierzęta. W związku z tym przedstawiony tutaj protokół jest szczególnie odpowiedni dla badaczy zainteresowanych łatwym i powtarzalnym podejściem, które wymaga minimalnego doświadczenia chirurgicznego, odnosi się do zdarzeń związanych z implantacją zarodka i łożyskiem po urazie macicy o pełnej grubości i można go łatwo dostosować do szerokiej gamy pytań, w tym podobnych do D&C urazów endometrium27,28.
Krok 1 tego protokołu określa kroki przedoperacyjne. Krok 2 opisuje procedurę chirurgiczną mającą na celu wywołanie uszkodzenia rogu macicy. Wreszcie, Krok 3 szczegółowo opisuje sekcję ciężarnej matki w celu zbadania wpływu operacji macicy na kolejną ciążę. Podsumowując, badanie to przedstawia unikalny model chirurgiczny gojenia się ran macicy u gryzoni i związanych z tym wyników ciąży, który jest szybki do wykonania i łatwy do przyjęcia.

<table><tbody><tr><td>0,9% NaCl do wstrzykiwań, sterylne</td><td>Fresenius Kabi</td><td>63323-186-10</td><td></td></tr><tr><td>25 G x 5/8 cala BD PrecisionGlide&handel; Igła</td><td>BD</td><td>305122</td><td></td></tr><tr><td>70% etanolu</td><td>Fisher Naukowy</td><td>BP82031GAL</td><td></td></tr><tr><td>Wchłanialny szew vicryl 4-0</td><td>Etyka</td><td>Zobacz materiał J214</td><td></td></tr><tr><td>Klatki dla zwierząt</td><td>Firma VWR</td><td>10712-110 oraz 10715-323</td><td>Dopuszczalne są klatki dostarczone przez zakład dla zwierząt badacza</td></tr><tr><td>Zwierzęcy kolczyk w ucho</td><td>Fisher Naukowy</td><td>13-812-201</td><td></td></tr><tr><td>System zamykania ran AutoClip</td><td>Narzędzia naukowe</td><td>12020-00</td><td></td></tr><tr><td>Strzykawka insulinowa U-100</td><td>Fisher Naukowy</td><td>14-826-79</td><td>Marka BD</td></tr><tr><td>Waciki Betadine</td><td>Linia medline</td><td>MDS093901</td><td></td></tr><tr><td>Buprenorfina o przedłużonym uwalnianiu, 1,3 mg/ml (Ethiqa XR)</td><td>Fidelis Pharmaceuticals</td><td>099114</td><td>Dopuszczalne są alternatywne buprenorfiny o przedłużonym uwalnianiu lub chlorowodorku buprenorfiny</td></tr><tr><td>Karprofen (RIMADYL) 50 mg/ml&nbsp;</td><td>Urządzenie Zoetis</td><td>FELGA-00284R1</td><td></td></tr><tr><td>Zakrzywione nożyczki do tęczówki</td><td>Światowe instrumenty precyzyjne</td><td>501759G</td><td></td></tr><tr><td>Sterylizator narzędzi chirurgicznych z suchymi szklanymi kulkami</td><td>VWR MIĘDZYNARODOWA</td><td>75999-324</td><td></td></tr><tr><td>Wkład do suchych kulek szklanych</td><td>VWR MIĘDZYNARODOWA</td><td>75999-332</td><td></td></tr><tr><td>Samice myszy, zwykle w wieku od 8 do 12 tygodni, np. szczep C3H</td><td>Rzeka Karola</td><td>025</td><td></td></tr><tr><td>Cienkie nożyczki - zakrzywione 10,5 cm</td><td>Narzędzia naukowe</td><td>14370-23</td><td></td></tr><tr><td>Trymer do futra</td><td>Fisher Naukowy</td><td>50-195-4544</td><td></td></tr><tr><td>Zadowolona prasa ' n Pieczęć</td><td>Fisher Naukowy</td><td>NC1089054</td><td></td></tr><tr><td>Rękawice nitrylowe</td><td>Fisher Naukowy</td><td>19-130-1597C</td><td></td></tr><tr><td>H2O, sterylnie destylowany</td><td>Narzędzia naukowe</td><td>15230170</td><td></td></tr><tr><td>Oświetlacz do operacji</td><td>AmScope</td><td>HL150-AY</td><td></td></tr><tr><td>Ketamina, 100 mg/ml (zetamina)</td><td>Dechra (Głuch)</td><td>501072</td><td></td></tr><tr><td>Fartuch laboratoryjny</td><td>Uline powiedział:</td><td>S-15376W-50</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop świetlny</td><td>Fisher Naukowy</td><td>Zobacz materiał S13039</td><td></td></tr><tr><td>Wałek do kłaczków</td><td>Fisher Naukowy</td><td>17-018-329</td><td></td></tr><tr><td>Krem do depilacji Nair</td><td>Cel</td><td>049-06-3304</td><td></td></tr><tr><td>Uchwyt na igłę</td><td>Narzędzia naukowe</td><td>12500-12</td><td></td></tr><tr><td>Ręczniki papierowe</td><td>Scott</td><td>1804</td><td></td></tr><tr><td>szalka Petriego</td><td>Fisher Naukowy</td><td>08-757-100</td><td></td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)</td><td>Thermo Fisher Naukowy</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>Plastikowa zlewka</td><td>Thermo Fisher Naukowy</td><td>12010250</td><td></td></tr><tr><td>Głowica nasadcza z wygiętym końcem</td><td>Fisher Naukowy</td><td>08-995</td><td></td></tr><tr><td>Marka rybaków&handel; Woreczki do sterylizacji z natychmiastowym uszczelnieniem 9 cm (szer.) x 13,3 cm (wys.)</td><td>Fisher Naukowy</td><td>181250</td><td></td></tr><tr><td>Marka rybaków&handel; Woreczki do sterylizacji z natychmiastowym uszczelnieniem 9 cm (szer.) x 23 cm (wys.)</td><td>Fisher Naukowy</td><td>181251</td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze, w porządku, #5</td><td>Narzędzia naukowe</td><td>11254-20</td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze, w porządku, #55&nbsp;</td><td>Narzędzia naukowe</td><td>11295-51</td><td></td></tr><tr><td>Skala</td><td>Fisher Naukowy</td><td>Numer katalogowy S93805 powiedział:</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki chirurgiczne</td><td>Narzędzia naukowe</td><td>14060-09</td><td></td></tr><tr><td>Butelka z rozpylaczem</td><td>Fisher Naukowy</td><td>S413505P</td><td></td></tr><tr><td>Sterylne waciki nasączone alkoholem</td><td>Fisher Naukowy</td><td>22-363-750</td><td></td></tr><tr><td>Sterylna okulistyczna maść weterynaryjna</td><td>Puralube (Purałub)</td><td>PH-PURALUBE-VET</td><td></td></tr><tr><td>Sterylne waciki do aplikacji maści do oczu</td><td>Fisher Naukowy</td><td>18-366-472</td><td></td></tr><tr><td>Woreczki do sterylizacji</td><td>Fisher Naukowy</td><td>19-910-673</td><td></td></tr><tr><td>Serweta chirurgiczna</td><td>Fisher Naukowy</td><td>50-209-1792</td><td></td></tr><tr><td>Chirurgiczny czepek do włosów</td><td>Uline powiedział:</td><td>S-10480BLU</td><td></td></tr><tr><td>Maski chirurgiczne</td><td>Fisher Naukowy</td><td>18-048-010</td><td></td></tr><tr><td>Thomas Scientific Chłonny podkład pod ławkę, podkładki pod ławki, 16,5 x 23 cale / 42 x 58 cm</td><td>Fisher Naukowy</td><td>NC1588452</td><td></td></tr><tr><td>Komora grzewcza/indukcyjna z pełnym ociepleniem podłogi</td><td>Fisher Naukowy</td><td>14-370-302</td><td></td></tr><tr><td>Wkłady do klipsów do ran</td><td>Narzędzia naukowe</td><td>12022-09</td><td></td></tr><tr><td>100 mg / ml ksylazyny</td><td>Dechra (Głuch)</td><td>Rompun 100 mg/ml ksylazyna</td><td></td></tr></tbody></table>

mysi model chirurgicznego uszkodzenia macicy i późniejszych wyników ciąży

Mouse Model of Surgical Uterine Injury and Subsequent Pregnancy Outcomes

Uszkodzenie macicy spowodowane cesarskim cięciem (cesarskim cięciem) i innymi zabiegami (rozszerzanie i łyżeczkowanie, miomektomia itp.) może prowadzić do kilku chorób w kolejnych ciążach, w tym łożyska przodującego, spektrum przylegania łożyska (PAS), ciąży z blizną po cesarskim cięciu i pęknięcia macicy. Cesarskie cięcia stanowią około 30% porodów w USA, przy czym przewiduje się, że stawki wzrosną. W związku z tym niezbędne jest głębsze zrozumienie mechanizmów, w wyniku których powstają zaburzenia ciążowe związane z urazami, oraz platforma do testowania możliwych interwencji. Aby osiągnąć te cele, istnieje pilne zapotrzebowanie na zwierzęce modele uszkodzenia macicy, w szczególności te, które dotyczą wpływu urazu na późniejsze wyniki w życiu płodowym. Protokół ten opisuje nowatorską procedurę chirurgiczną dla modelu mechanicznie indukowanego uszkodzenia macicy u myszy laboratoryjnej (Mus musculus). Przedstawiono kroki podjęte w ramach przygotowań do operacji, indukcji samego urazu macicy oraz procedur rekonwalescencji pooperacyjnej. Podano dodatkowe informacje dotyczące dalszej sekcji myszy zarówno niebędących w ciąży, jak i ciężarnych. Ogólnie rzecz biorąc, poprzez wyszczególnienie zestawu procedur wywoływania uszkodzenia macicy w modelu in vivo , protokół ten przedstawia wykonalną metodę wyjaśniania molekularnych i komórkowych zdarzeń gojenia się ran macicy i ich wpływu na późniejszą ciążę.

Po zabiegu chirurgicznym z zastosowaniem ketaminy/ksylazyny jako środka znieczulającego, zwierzęta zazwyczaj odzyskują częściową sprawność ruchową w ciągu ~1 h, a pełną sprawność w ciągu ~4-6 h. Wybudzanie z znieczulenia izofluranem następuje zazwyczaj w ciągu kilku minut. Wszelkie powikłania, które mogą wystąpić, takie jak rozszerzenie rany lub ból, są zazwyczaj widoczne w ciągu 1-3 dni po operacji. Należy przeprowadzać codzienne kontrole dobrostanu w celu monitorowania bólu lub powikłań, aż do czasu zagojenia się nacię...

Protokół ten opisuje procedurę wywoływania uszkodzenia macicy w modelu mysim, po której następują dalsze analizy podczas kolejnej ciąży.

Mysi model chirurgicznego uszkodzenia macicy i późniejszych wyników ciąży

Uterine injury from Cesarean sections (C-sections) and other procedures (dilation and curettage, myomectomies, etc.) can lead to several morbidities in ...

Badamy, w jaki sposób bliznowacenie macicy po cesarskim cięciu lub innych zabiegach może skutkować kilkoma chorobami w kolejnych ciążach, w tym łożyskiem przodującym, spektrum przylegania łożyska i niepłodnością.Zrozumienie mechanizmów, za pomocą których uszkodzenie macicy prowadzi do późniejszych wad ciążowych, było wyzwaniem bez modeli zwierzęcych. Dlatego opracowaliśmy nowy model myszy, aby wypełnić tę lukę badawczą. Ten zwierzęcy model uszkodzenia macicy umożliwia naukowcom badanie reakcji na rany macicy i tego, jak upośledzone gojenie powoduje wady rozwojowe w czasie ciąży. Model ten stanowi również platformę do testowania strategii interwencyjnych. Nasz model pozwala naukowcom badać, jak goi się macica, jak powstają defekty w uszkodzonej macicy, jakie zmiany są obecne na bliźnie i dlaczego niektóre wady embrionalne występują nawet w nieuszkodzonym rogu macicy.Zbadamy, w jaki sposób urazy prowadzą do niepowodzenia implantacji zarodka, jak zarodki resorbują się w bliźnie i dlaczego tylko urazy w późniejszych fazach cyklu rujowego prowadzą do wad, takich jak nieprawidłowy odstęp między zarodkami.[Instruktor] Aby rozpocząć, przygotuj obszar przedoperacyjny. Przykryj znieczulone zwierzę sterylną zasłoną, odsłaniając tylko pysk. Użyj prostych lub zakrzywionych nożyczek do tęczówki, aby wyciąć dwu- lub trzymilimetrowe nacięcie w skórze grzbietowej, jednocześnie przytrzymując skórę cienkimi kleszczami. Wytnij dwu- lub trzymilimetrowe nacięcie w powięzi pokrywającej poduszeczkę tłuszczową jajnika. Delikatnie chwyć poduszeczkę tłuszczową jajnika kleszczami i wyciągnij ją z powięzi i nacięć skóry. Po odsłonięciu górnej 1/3 macicy delikatnie zabezpiecz połączenie macicowo-jajowodowe kleszczami. Następnie użyj igły dla ptaków, aby utworzyć mały otwór w górnej części macicy. Następnie włóż igłę i ostrożnie zeskrob powierzchnię przedzębną rogu macicy. Kontynuuj skrobanie, aż zarówno warstwa endometrium, jak i mięśniówka macicy zostaną całkowicie perforowane. Teraz delikatnie przywróć uszkodzony róg macicy do jamy ciała za pomocą kleszczy. Zszyj powięź zamkniętą szwem w rozmiarze 4-0 i usuń nadmiar szwu. Zamknij nacięcie skóry za pomocą klipsa z aplikatora do klipsów do skóry. Rana macicy po trzech dniach od urazu wykazała otwartą zmianę z widocznie odsłoniętym światłem macicy. Po miesiącu od urazu rana macicy zamknęła się z minimalnymi widocznymi bliznami w miejscu wcześniejszego urazu. Uszkodzone rogi macicy wykazywały resorpcję zarodków i krwawienie wewnątrzmaciczne, widoczne jako ciemne obszary i krwotok. Prawidłowy wynik implantacji obejmował pojedyncze łożysko i zarodek wyraźnie oddzielone w rogu macicy. Uszkodzenie macicy skutkowało zwartymi parami zarodków ze zrośniętym łożyskiem, co ilustruje niewłaściwe rozmieszczenie zarodków. Para zarodków rozmieszczonych w różnych odstępach wykazywała jeden słabo rozwinięty zarodek i normalny worek owodniowy, co odzwierciedlało niekorzystne wyniki rozwojowe.

mouse-model-surgical-uterine-injury-subsequent-pregnancy

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Opis chirurgicznego indukowania endometriozy u myszy i szczurów poprzez autotransplantację tkanki macicy do kaskady tętniczej krezki jelitowej.

Myszowy model chirurgicznie wywołanej endometriozy poprzez autotransplantację tkanki macicy

Transfer zarodków macicowo-jajowodowych wykorzystuje połączenie macicowo-jajowodowe jako barierę zapobiegającą odpływowi zarodka, który może wystąpić podczas transferu macicy. Mężczyźni poddani wazektomii są zobowiązani do pozyskania biorców pseudociężarnych do transferu zarodków. Omówiono obie techniki.

Transfer zarodka macicowo-jajowodowego i wazektomia w modelu mysim

Podczas rozwoju ssaków, rany skóry na wczesnym etapie ciąży goją się bez blizny. Tutaj szczegółowo opisujemy wiarygodny i powtarzalny model gojenia się ran bez blizn płodu w grzbietu skóry zarodków myszy E16.5 (bez blizn) i E18.5 (bliznowaciejących).

Model skóry płodu myszy z gojeniem ran bez blizn

Ten protokół opisuje technikę oceny zmian w unaczynieniu matki podczas ciąży u myszy. Za pomocą metod stereologicznych ocenia się ilościowo przebudowę dziesiętnych tętnic spiralnych, a wyniki potwierdza się jakościowo za pomocą immunohistochemii.

Ocena przebudowy naczyń krwionośnych matki w czasie ciąży w macicy myszy

Ultradźwięki o wysokiej rozdzielczości mogą pomóc usprawnić eksperymenty wymagające myszy w ciąży w czasie, określając stan ciąży, wiek ciążowy i straty ciąży. Przedstawiono tutaj protokół ilustrujący metody oceny ciąż myszy, a także potencjalne pułapki (artefakty obrazu), które mogą naśladować ciążę.

Czy moja mysz jest w ciąży? Ocena ultrasonograficzna o wysokiej częstotliwości

Wiele modeli endometriozy u gryzoni jest ograniczonych przez techniczną złożoność, powtarzalność i/lub potrzebę stosowania zwierząt z obniżoną odpornością lub specjalnych myszy reporterowych. Przedstawiamy uproszczony system indukcji zmian chorobowych przy użyciu dowolnej myszy eksperymentalnej z niezależnie weryfikowalnym, obiektywnym systemem punktacji i bez konieczności wycinki owariektomii lub operacji przeżycia.

Syngeniczny mysi model endometriozy przy użyciu myszy z naturalną jazdą na rowerze

Ustanowienie ciąży to dynamiczny proces obejmujący skomplikowane przenikanie się zarodków i macicy. Dokładny wkład środowiska macicy matki w te procesy pozostaje aktywnym obszarem badań. W tym miejscu przedstawiono szczegółowe protokoły, które mają pomóc w projektowaniu modeli zwierzęcych in vivo, aby odpowiedzieć na te pytania badawcze.

Metody badania wkładu macicy w powstanie ciąży w mysim modelu owariektomii

Ten artykuł przedstawia szczegółowy protokół preparowania więzadeł maciczno-krzyżowych i innych tkanek dna miednicy, w tym szyjki macicy, odbytnicy i pęcherza moczowego u myszy, w celu rozszerzenia badań nad żeńskimi tkankami rozrodczymi.

Izolacja i charakterystyka mysich więzadeł maciczno-krzyżowych i narządów dna miednicy

Badanie to wprowadza nowy model mysi zaprojektowany specjalnie do symulacji endometriozy, klinicznie istotnego podtypu endometriozy. Wykorzystując myszy C57BL/6J, model ma na celu wyjaśnienie patofizjologicznych mechanizmów leżących u podstaw niepłodności związanej z endometrioma, oferując wyrafinowane narzędzie do wypełnienia obecnej luki w wiedzy w medycynie reprodukcyjnej.

Stworzenie eksperymentalnego mysiego modelu endometrioma w celu zbadania związanej z nim niepłodności

Wcześniaki (poród &lt; 37. tygodniu) to pilny globalny problem zdrowotny z nieoptymalnymi opcjami profilaktyki i leczenia. Przedstawiamy myszy model wcześnianego porodu wywołanego infekcją bakteryjną pochwy oraz opisujemy, jak analizować wynikającą z tego chorobność i śmiertelność noworodków.

Modelowanie wznoszącej się infekcji pochwy, przedwczesnych porodów i noworodkowej zachorowalności u myszy

Zrosty wewnątrzmaciczne (IUA), najczęstsza patologiczna konsekwencja uszkodzenia endometrium, poważnie upośledzają funkcje rozrodcze. Urazy i infekcje są powszechnie uznawane za kluczowe czynniki ryzyka rozwoju IUA. Udało nam się stworzyć powtarzalny szczurzy model wkładki domacicznej, łącząc dwie krytyczne metody urazów: kiretaż mechaniczny i indukcję infekcyjną za pomocą lipopolisacharydu.

Opracowanie modelu szczurzego dla zrostów wewnątrzmacicznych poprzez podwójny uraz: łyżeczkowanie i infekcję

Poznaj model uszkodzenia macicy u myszy do badania odpowiedzi rany i defektów rozwojowych w kolejnych ciążach. Ta metoda umożliwia testowanie strategii interwencyjnych.

Mysi model chirurgicznego uszkodzenia macicy i późniejszych wyników ciąży

Przeglądaj więcej filmów