Izolacja, utrwalenie i charakterystyka młodocianych leukocytów nerkowych dorady za pomocą cytometrii przepływowej

Protokół ten standaryzuje izolację, utrwalanie i ocenę żywotności leukocytów z nerki głowy dorady za pomocą cytometrii przepływowej, umożliwiając wysokoprzepustowe przetwarzanie próbek bez utraty jakości.

Tradycyjne techniki, takie jak ręczne liczenie komórek za pomocą komór Neubauera i barwione rozmazy krwi, są powszechne w immunologii ryb. Cytometria przepływowa staje się coraz bardziej popularna, ale jej zastosowanie w badaniach ryb pozostaje ograniczone. Tradycyjne metody immunologiczne ryb obciążają wątrobę i są podatne na błędy. Badania na młodych zwierzętach są ograniczone ze względu na trudności w uzyskaniu czystych leukocytów i konieczność natychmiastowej oceny żywotności, co ogranicza przepustowość próbek.

Protokół ten umożliwia szczegółową analizę komórek odpornościowych poprzez identyfikację kluczowych populacji leukocytów i odróżnienie komórek żywych od martwych. Fiksacja zachowuje żywotność przez miesiąc, umożliwiając skalowalne, elastyczne i wydajne przepływy pracy cytometrii przepływowej.

Nasze odkrycia przyczyniają się do rozwoju immunologii ryb, ujawniając mechanizmy immunologiczne i wpływ środowiska na żywotność komórek, pomagając w opracowaniu ulepszonych strategii zarządzania chorobami w akwakulturze.

[Narrator] Na początek zaaklimatyzuj młode dorady Sparus aurata w recyrkulacyjnych systemach akwakultury, w których woda jest stale filtrowana i recyrkulowana w celu utrzymania stabilnego środowiska. Upewnij się, że system obejmuje mechaniczną i biologiczną filtrację, napowietrzanie i kontrolę temperatury w celu utrzymania optymalnych parametrów abiotycznych. Dostosuj czynniki środowiskowe, takie jak okres fotografowania, temperatura, zasolenie, pH i poziom rozpuszczonego tlenu, zgodnie z konkretnymi potrzebami badania. Użyj siatki, aby delikatnie przenieść młode dorady do tymczasowego pojemnika wypełnionego wodą ze zbiornika. Po eutanazji ryby połóż jedną rybę na boku na sterylnej tacce do sekcji. Za pomocą skalpela wykonaj ostrożne nacięcie wzdłuż brzusznej linii środkowej ryby od otworu wentylacyjnego w kierunku skrzeli. Użyj nożyczek preparacyjnych, aby przedłużyć nacięcie i odsłonić narządy wewnętrzne. Zlokalizuj nerkę główową, która znajduje się tuż za skrzelami w pobliżu przedniego obszaru grzbietowego jamy ciała i rozciąga się wzdłuż górnej strony poniżej kręgosłupa. Za pomocą kleszczy i nożyczek z cienką końcówką ostrożnie usuń otaczające tkanki, aby lepiej uwidocznić nerkę głowy. Następnie podnieś nerkę głowy i wykonaj precyzyjne nacięcia wokół niej, aby uwolnić ją od otaczających tkanek. Natychmiast umieścić odciętą nerkę głowy w sitku do komórek umieszczonym na sterylnej szalce Petriego. Odpipetuj dwa mililitry zbilansowanego roztworu soli Hanksa (HBSS) na sterylnej szalce Petriego. Macerować wyciętą nerkę głowy na sitku do komórek za pomocą tłoka strzykawki, aby uwolnić komórki do roztworu. Następnie przygotuj roztwór podłoża o gradiencie gęstości. Odpipetować 600 mikrolitrów roztworu pożywki o gradiencie gęstości do pięciomililitrowych probówek z polistyrenu o okrągłym dnie. Powoli przenieś dwa mililitry zawiesiny komórkowej z szalki Petriego do każdej probówki. Wirować przy 400 g przez 45 minut w czterech stopniach Celsjusza przy wyłączonym hamulcu. Po odwirowaniu wyjmij probówkę i obserwuj pierścień leukocytów. Następnie za pomocą sterylnej pipety Pasteura delikatnie przenieś około 100 mikrolitrów pierścienia leukocytów do dwumililitrowej probówki mikrowirówkowej. Teraz uzupełnij objętość do dwóch mililitrów za pomocą HBSS i delikatnie ponownie zawieś ogniwa. Odwirować próbkę o masie 400 g przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Po odwirowaniu ostrożnie wyrzucić supernatant, nie naruszając osadu na dnie probówki. Następnie ponownie zawieś oczyszczony granulat w jednym mililitrze HBSS, aż końcowe stężenie komórek wyniesie od 10 000 do miliona komórek na mililitr. Dodać 50 mikrolitrów dimetylosulfotlenku do fiolki zawierającej barwnik reaktywny. Po dostosowaniu gęstości komórek do miliona komórek na mililitr, przenieś jeden mililitr zawiesiny komórek do dwumililitrowych probówek wirówek. Przygotować próbki kontrolne żywotności zgodnie z podaniem. Wywołaj śmierć komórek w probówkach trzeciej i czwartej, umieszczając je w łaźni wodnej o temperaturze 70 stopni Celsjusza na siedem minut. Aby zabarwić komórki, należy odpipetować jeden mikrolitr odtworzonego barwnika fluorescencyjnego do probówek nr 2 i 4 zawierających jeden mililitr zawiesiny komórek i dobrze wymieszać. Inkubować poplamione probówki w temperaturze pokojowej przez 30 minut, chroniąc przed światłem. Następnie umyj komórki dwukrotnie jednym mililitrem HBSS i ponownie zawieś ostatnią osadkę w 900 mikrolitrach tego samego buforu. Następnie odpipetuj 100 mikrolitrów 37% formaldehydu, aby utrwalić komórki i inkubować w temperaturze pokojowej przez 15 minut. Po dwukrotnym przemyciu komórek jednym mililitrem HBSS zawierającym 1% BSA, ponownie zawiesić w jednym mililitrze tego samego roztworu. Próbki należy przechowywać w temperaturze czterech stopni Celsjusza w lodówce przez okres do jednego miesiąca. Umieść zamocowaną probówkę z próbką w porcie próbki cytometru przepływowego w celu analizy. Zarejestruj co najmniej 10 000 zdarzeń dla każdej próbki w bramce podwójnej. Zapisz wszystkie dane i utwórz ich kopię zapasową na dyskach zewnętrznych lub w chmurze. Wizualizuj dane cytometrii przepływowej, wykreślając obszar rozproszenia do przodu w porównaniu z obszarem rozproszenia bocznego, aby ocenić rozmiar i stopień szczegółowości komórki. Wykonaj bramkowanie komórek singletowych i wyklucz wielokrotności, wykreślając obszar rozproszenia do przodu względem wysokości rozproszenia do przodu. Zidentyfikuj trzy populacje leukocytów na podstawie profili rozproszenia do przodu i bocznego. Ustaw próg barwienia barwnikiem żywotności w odpowiednim kanale fluorescencji, aby odróżnić żywe i martwe komórki. W optymalnych warunkach limfocyty, monocyty i granulocyty stanowiły odpowiednio 31%, 38% i 31% populacji leukocytów, podczas gdy pod wpływem stresu termicznego limfocyty zmniejszyły się do 21,3%, monocyty wzrosły do 45,6%, a granulocyty pozostały stabilne na poziomie 33,1%. Próbka poddana optymalnym warunkom wykazała wyższą żywotność, z przewagą żywych komórek we wszystkich populacjach leukocytów. W przeciwieństwie do tego, próbka poddana stresowi termicznemu wykazała znaczny wzrost śmierci komórki.