Protokół cytometrii elektroporacyjnej do mikroskopii fluorescencyjnej żywych komórek z wykorzystaniem hodowli komórkowej U2 OS

Zakres tych badań koncentruje się na wpływie pulsacyjnych pól elektrycznych na zachowanie komórek, a w szczególności na tym, jak elektroporacja wpływa na cykl komórkowy.

Podstawową zaletą tego protokołu jest możliwość przeprowadzania ciągłych eksperymentów z elektroporacją żywych komórek przy użyciu hodowli komórek ssaków przez okres do 72 godzin. Nasze laboratorium koncentruje się na dostosowaniu tych technik do mikrofluidyki, co pozwoli na zmniejszenie rozmiarów próbek, zmniejszenie wymagań dotyczących odczynników i lepszą kontrolę próbek dla przyszłych protokołów.

[Narrator] Na początek posadź komórki U2OS FUCCI CA5 na 10-centymetrowej płytce z 10 mililitrami DMEM o wysokiej zawartości glukozy zawierającej 10% FBS i 1% penicyliny streptomycyny. Inkubuj płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza w środowisku 5% dwutlenku węgla. Gdy kultura osiągnie 80% zbieżności, odessać pożywkę z płytki. Umyj komórki PBS, a następnie dodaj jeden mililitr 0,25% trypsyny i inkubuj przez 1,5 minuty w celu dysocjacji komórek. Zneutralizuj trypsynę, ponownie zawieszając zdysocjowane komórki w pięciu mililitrach DMEM o wysokiej zawartości glukozy. Pobrać próbkę o pojemności 100 mikrolitrów z zawieszonej kultury i umieścić ją na szkiełku pokrywowym dolnej szklanej w komorze systemu cytometrii elektroporacyjnej. Upewnij się, że komora jest w 30% zlewająca się po wprowadzeniu próbki. Powoli dodaj cztery mililitry wysokiej glukozy DMEM na drugi koniec komory, zapobiegając wypłukiwaniu próbki przez ciecz. Umieść standardowe szkiełko mikroskopowe nad komorą i inkubuj komorę w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla przez 24 godziny. Włącz odwrócony mikroskop fluorescencyjny z komorą kontroli środowiska, aby umożliwić ustabilizowanie się systemu przed elektroporacją. Podczas gdy komora środowiskowa stabilizuje się, użyj z zaciskiem krokodylkowym, aby podłączyć multimetr cyfrowy do kondensatora generatora impulsów i przełącznika wysokiego napięcia w celu szybkiej konfiguracji z komorą elektroporacyjną. Teraz wybierz 20-krotne powiększenie w mikroskopie. W oprogramowaniu mikroskopu upewnij się, że kanały FITC/GFP i A594 Texas Red M Cherry są wybrane zgodnie z dwoma białkami fluorescencyjnymi w systemie FUCCI CA5. Używaj niskich ustawień ekspozycji, zwykle krótszych niż 0,05 sekundy, aby zapobiec uszkodzeniom zdjęcia podczas długotrwałego obrazowania. Wykonaj zdjęcia testowe, aby zoptymalizować ostrość i jakość obrazu przed rozpoczęciem obrazowania poklatkowego. Zaprogramuj upływ czasu, aby rejestrować obrazy z trzech do sześciu różnych punktów widzenia co 10 minut w ciągu 24 godzin, aby uzyskać dużą ilość danych dotyczących cyklu komórkowego na upływ czasu, jednocześnie łagodząc uszkodzenia zdjęć. Upewnij się, że autofokus jest włączony dla kanału A594, aby zoptymalizować śledzenie kultury podczas upływu czasu. Pozostaw oprogramowanie otwarte do momentu zakończenia elektroporacji. Umieścić komorę cytometrii elektroporacyjnej w mikroskopie wyposażonym w odpowiednią komorę środowiskową. Przed elektroporacją trzymaj komorę zamkniętą i upewnij się, że system środowiskowy nadal działa, aby utrzymać odpowiednie warunki cyklu ogniw. Otwórz komorę środowiskową i podłącz multimetr cyfrowy do generatora impulsów, a następnie za pomocą z zaciskiem krokodylkowym podłącz generator impulsów do elektrod komory. Naładuj kondensator generatora impulsów do 180 woltów. Szybko rozładuj impuls do komory, aż multimetr cyfrowy wyświetli zero woltów. Odłącz wszystkie połączenia elektryczne od komory i niezwłocznie załóż pokrywę komory, aby zapewnić optymalne warunki hodowli. Obrazowanie poklatkowe należy aktywować natychmiast po bezpiecznym umieszczeniu komory środowiskowej. Po zakończeniu upływu czasu użyj oprogramowania mikroskopu, aby zapisać wszystkie przechwycone obrazy jako pojedynczy film. Dostosuj jakość wizualną, aby zwiększyć przejrzystość funkcji komórek na potrzeby ręcznej kwantyfikacji. Na koniec obserwuj zmiany w sygnałach FITC i A594 w czasie, aby śledzić fazy komórek w filmie poklatkowym. Korzystając z systemu Fuji, zebrano dane wizualne, śledząc zmiany koloru związane z ekspresją białek i ubikwitynacją, co pozwoliło na wyraźne rozróżnienie faz G1, S, G2, M. Umożliwiło to bezpośrednią obserwację progresji cyklu komórkowego w różnych warunkach. Rysunek ten przedstawia podsumowanie kluczowych danych zebranych z dwóch zestawów eksperymentów z wykorzystaniem niezsynchronizowanych i zsynchronizowanych hodowli komórkowych w fazie S. Ekspozycja na pulsacyjne pole elektryczne w niezsynchronizowanych komórkach znacznie zwiększyła średnią długość faz G1, G2 i M, podczas gdy faza S pozostała niezmieniona. W zsynchronizowanych komórkach ekspozycja na pulsacyjne pole elektryczne prowadziła do skrócenia czasu trwania faz G1, S i G2, chociaż tylko S i G2 były statystycznie istotne, podczas gdy faza M pozostała nienaruszona.