Name: Protokół cytometrii elektroporacyjnej do mikroskopii fluorescencyjnej żywych komórek z wykorzystaniem hodowli komórkowej U2 OS (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-06-13T12:45:00.000+00:00
Duration: 6 min 1 s
Description: Poznaj protokół cytometrii elektroporacyjnej do mikroskopii fluorescencyjnej żywych komórek z wykorzystaniem hodowli U2 OS. Technika ta umożliwia ciągłe eksperymenty do 72 godzin.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Chcielibyśmy podziękować zarówno członkom Gupta Lab, jak i Rackus Group za ich nieustające wsparcie w laboratorium i poza nim. Dotacje hojnie udzielone dzięki partnerstwu z Mitacs.

1. Przygotowanie hodowli komórkowej
<ol>
	<li>Przygotować stabilną linię za pomocą odwracalnej elektroporacji o następujących parametrach: 100 μl zawieszonych komórek U2 OS (6 × 106 komórek/ml) z 5 μg plazmidowego DNA w kuwecie o średnicy 0,4 cm i impulsem prostokątnym 180 V przez 10 ms.</li>
	<li>Wydrukuj niestandardowy projekt komory za pomocą dowolnej odpowiedniej drukarki 3D i biokompatybilnego tworzywa sztucznego, takiego jak kwas polimlekowy (PLA) (patrz plik uzupełniający 1). Zdezynfekuj gotową komorę za pomocą etanolu (70%) i przechowuj w sterylnym pojemniku przed użyciem.</li>
	<li>Hoduj komórki U2-OS FUCCI(CA)5 na 10 cm płytce z 10 ml zmodyfikowanego podłoża Eagle (DMEM) firmy Dulbecco-High Glucose zawierającego 10% płodowej surowicy bydlęcej i 1% PenStrep i inkubuj w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .</li>
	<li>Gdy hodowla osiągnie 80% konfluencji, odessać pożywkę, przemyć kulturę komórkową solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS) i zdysocjować komórki za pomocą 1 ml 0,25% trypsyny przez 1,5 minuty.</li>
	<li>Zneutralizuj trypsynę, ponownie zawieszając hodowlę komórkową w 5 ml DMEM-High Glucose (zawierającego 10% FBS i 1% PenStrep).</li>
	<li>Z zawieszonej hodowli komórkowej pobrać próbkę o objętości 100 μl i umieścić ją w komorze systemu cytometrii elektroporacyjnej na dolnym szklanym szkiełku nakrywkowym. Upewnij się, że komora jest w 30% zlewająca się po wprowadzeniu próbki. Jeśli próbka wydaje się nadmiernie zlewać przed inkubacją, należy ją zassać i zmniejszyć objętość.</li>
	<li>Powoli dodaj 4 ml DMEM-High Glucose (zawierającego 10% FBS i 1% PenStrep) na drugi koniec komory, zapobiegając wypłukaniu próbki przez płyn.</li>
	<li>Umieścić standardowe szkiełko mikroskopowe na górze komory i inkubować komorę w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez 24 godziny, upewniając się, że kultura całkowicie przylega do dna komory. Opcjonalnie użyj Hoechst 33342 (1 μg/ml) do barwienia jąder komórkowych w celu łatwiejszej kwantyfikacji komórek, a także apoptozy. Wykonaj barwienie 30 minut przed mikroskopią poklatkową.</li>
</ol>
2. Przygotowanie mikroskopu
<ol>
	<li>Najpierw włącz odwrócony mikroskop fluorescencyjny z kontrolą środowiska i komorą, co pozwoli na ustabilizowanie się warunków przed wykonaniem elektroporacji. 
	UWAGA: Każdy odwrócony mikroskop fluorescencyjny z systemem środowiskowym, który akceptuje szkiełko o wymiarach 25 mm x 55 mm x 16 mm. Konstrukcja została pierwotnie zaprojektowana do pracy z referencyjnym mikroskopem odwróconym (patrz tabela materiałów) i odpowiednim systemem środowiskowym. 
	Nagrzewanie stolika może powodować przesunięcie obrazu z powodu rozszerzania się metalu.</li>
	<li>Podczas gdy system otoczenia osiąga optymalną temperaturę, podłącz multimetr cyfrowy do kondensatora generatora impulsów i przełącznika wysokiego napięcia za pomocą odpowiednich elektrycznych. Aby postępować zgodnie z tym protokołem, należy użyć zaciskowych "aligator", aby umożliwić szybki montaż i demontaż z komorą elektroporacyjną.</li>
	<li>Następnie wybierz powiększenie 20x i za pomocą oprogramowania mikroskopu upewnij się, że kanały FITC (GFP) i A594 (TexRed/mCherry) (opcjonalnie kanał DAPI dla Hoechst 33342) są wybrane odpowiednio do dwóch białek fluorescencyjnych w systemie FUCCI(CA)5. Użyj niskich ustawień ekspozycji (zwykle <0,05 s), aby uniknąć uszkodzeń zdjęć w długotrwałych filmach poklatkowych.</li>
	<li>Zoptymalizuj ostrość i jakość obrazu, wykonując zdjęcia testowe przed rozpoczęciem filmu poklatkowego. 
	UWAGA: Fluorescencja powinna być tylko tak jasna, jak jest to konieczne do wizualizacji kolorów.</li>
	<li>Zaprogramuj film poklatkowy tak, aby rejestrował od 3 do 6 punktów widzenia co 10 minut przez 24 godziny, aby uzyskać dużą ilość danych dotyczących cyklu komórkowego na film poklatkowy, jednocześnie łagodząc uszkodzenia zdjęć. 
	UWAGA: Czas ten może się różnić w zależności od skali czasowej aktywności komórkowej.</li>
	<li>Upewnij się, że autofokus jest włączony dla kanału A594, aby uzyskać najlepsze wyniki śledzenia kultury komórkowej podczas filmu poklatkowego.</li>
	<li>Pozostaw oprogramowanie w trybie czuwania do czasu wykonania elektroporacji. Po dostarczeniu impulsu natychmiast aktywuj tryb poklatkowy, aby zapewnić najwyższą możliwą dokładność danych.</li>
</ol>
3. Elektroporacja
<ol>
	<li>Umieścić komorę cytometrii elektroporacyjnej w mikroskopie z odpowiednią komorą środowiskową. Przed elektroporacją pozostaw komorę zamkniętą z uruchomionym systemem środowiskowym, aby upewnić się, że cykl ogniw nie zostanie zakłócony.</li>
	<li>Podłącz multimetr cyfrowy do generatora impulsów i podłącz generator impulsów do elektrod komory za pomocą z zaciskiem krokodylkowym, otwierając komorę środowiskową.</li>
	<li>Naładuj kondensator w generatorze impulsów do 180 V i szybko rozładuj impuls do komory, aż multimetr cyfrowy wskaże 0 woltów.</li>
	<li>Odłącz połączenia elektryczne z komorą i załóż pokrywę tak szybko, jak to możliwe, aby zapewnić odpowiednie warunki hodowli.</li>
	<li>Natychmiast aktywuj film poklatkowy, gdy system środowiskowy mikroskopu jest na swoim miejscu.</li>
</ol>
4. Akwizycja danych poklatkowych
<ol>
	<li>Po zakończeniu tworzenia filmu poklatkowego użyj oprogramowania mikroskopu, aby zapisać film poklatkowy jako pojedynczy film na podstawie obrazów zarejestrowanych w czasie trwania filmu. Popraw jakość wizualną na tym etapie, aby pomóc w ręcznym oznaczaniu ilościowym. 
	UWAGA: Można wybrać dowolną liczbę klatek na sekundę; Jednak 6 klatek/s zapewnia umiarkowaną prędkość odtwarzania z 1 sekundą wideo, co daje 1 godzinę czasu rzeczywistego.</li>
	<li>Po przygotowaniu filmu poklatkowego śledź fazy komórek w czasie, obserwując zmiany w sygnałach FITC i A594</li>
</ol>

<ol><li>Shi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+review+on+electroporation-based+intracellular+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Molecules%22%5BJournal%5D)">A review on electroporation-based intracellular delivery.</a> Molecules. 23 (11), 3044(2018).</li>
<li>Kandušer, M., Miklavčič, D. Electroporation in biological cell and tissue: An overview. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKandu%C5%A1er%2C+M+%22Electrotechnologies+for+extraction+from+food+plants+and+biomaterials.+Food+Engineering+Series%22">Electrotechnologies for extraction from food plants and biomaterials. Food Engineering Series</a>. , Springer. New York. (2009).</li>
<li>Cemazar, M., Sersa, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+electrochemotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Bioelectricity%22%5BJournal%5D)">Recent advances in electrochemotherapy.</a> Bioelectricity. 1 (4), 204-213 (2019).</li>
<li>Iyengar, S. K., Iyengar, S., Srivathsan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+promise+of+pulsed+field+ablation+and+the+challenges+ahead%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cardiovasc+Med%22%5BJournal%5D)">The promise of pulsed field ablation and the challenges ahead.</a> Front Cardiovasc Med. 10, 1235317(2023).</li>
<li>Miklavčič, D., Mali, B., Kos, B., Heller, H., Serša, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrochemotherapy%3A+From+the+drawing+board+into+medical+practice%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+Eng+Online%22%5BJournal%5D)">Electrochemotherapy: From the drawing board into medical practice.</a> Biomed Eng Online. 13 (1), 29(2014).</li>
<li>Ando, R., Sakaue-Sawano, A., Shoda, K., Miyawaki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+coral+fluorescent+proteins+of+distinct+colors+for+sharp+visualization+of+cell-cycle+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Struct+Funct%22%5BJournal%5D)">Two coral fluorescent proteins of distinct colors for sharp visualization of cell-cycle progression.</a> Cell Struct Funct. 48 (2), 132-144 (2023).</li>
<li>Nesmith, T., Vieira, C., Rackus, D., Gupta, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+electroporation+cytometry+system+for+long-term%2C+live+cell+cycle+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Biomicrofluidics%22%5BJournal%5D)">An electroporation cytometry system for long-term, live cell cycle analysis.</a> Biomicrofluidics. 18 (4), 044105(2024).</li>
<li>Hulett, H. R., Bonner, W. A., Barrett, J., Herzenberg, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+sorting%3A+automated+separation+of+mammalian+cells+as+a+function+of+intracellular+fluorescence%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Cell sorting: automated separation of mammalian cells as a function of intracellular fluorescence.</a> Science. 166 (3906), 747-749 (1969).</li>
<li>Chao, H. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+that+the+human+cell+cycle+is+a+series+of+uncoupled%2C+memoryless+phases%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Sys+Bio%22%5BJournal%5D)">Evidence that the human cell cycle is a series of uncoupled, memoryless phases.</a> Mol Sys Bio. 15 (3), e8604(2019).</li>
<li>Diehl, F. F., Sapp, K. M., Vander Heiden, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+bidirectional+relationship+between+metabolism+and+cell+cycle+control%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Cell+Bio%22%5BJournal%5D)">The bidirectional relationship between metabolism and cell cycle control.</a> Trends Cell Bio. 34 (2), 136-149 (2024).</li>
<li>Rems, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+electrofusion+using+nanosecond+electric+pulses%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Cell electrofusion using nanosecond electric pulses.</a> Sci Rep. 3, 3382(2013).</li>
<li>Klein, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toward+best+practices+for+controlling+mammalian+cell+culture+environments%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Dev+Bio%22%5BJournal%5D)">Toward best practices for controlling mammalian cell culture environments.</a> Front Cell Dev Bio. 10, 788808(2022).</li>
</ol>

Autorzy nie mają do zadeklarowania konfliktu interesów.

Przy prawidłowym wykonaniu dane dotyczące fazy cyklu komórkowego można określić ilościowo dla dużych ilości pojedynczych komórek przez okres do 24 godzin. Protokół ten dostarczył danych dotyczących cyklu komórkowego porównywalnych z alternatywnymi metodami, takimi jak FAC. Jest to powszechnie stosowana metoda, w której komórki są znakowane fluorescencyjnie w miarę przechodzenia przez cykl komórkowy. Po inkubacji przez co najmniej 24 godziny sortuje się je według intensywności fluorescencji, korelując z wielkością populac...

Pulsacyjne pola elektryczne (PEF) stały się powszechnym narzędziem do różnych zastosowań w biologii i zastosowaniach klinicznych1. Można je ogólnie podzielić na elektroporację (EP) i elektrostymulację (ES). Elektroporacja ma dwie poddziedziny znane jako elektroporacja odwracalna i nieodwracalna. Odwracalna elektroporacja (RE) jest używana od dziesięcioleci jako skuteczne narzędzie do przenoszenia ładunków molekularnych, takich jak plazmidowe DNA, do komórek różnych typów, takich jak ssaki, bakterie i drożdże2. Ostatnio nieodwracalna elektroporacja (IRE) zyskała na znaczeniu jako nietoksyczna alternatywa dla obecnych metod leczenia raka3. Wyłaniająca się poddziedzina jest określana jako ablacja w polu pulsacyjnym (PFA), która koncentruje się na nietermicznym usuwaniu tkanek, w szczególności w leczeniu niektórych dysfunkcji serca4. W połączeniu z lekami i innymi odczynnikami doprowadziło to do rozwoju elektrochemioterapii (ECT). Jednak obecna wiedza na temat leczenia PEF jest wyprzedzana przez zastosowania kliniczne5. Prezentujemy system cytometrii elektroporacyjnej do badania elektrochemioterapii. Cykl komórkowy stanowi kluczowy wskaźnik żywotności komórek, a zmiany mogą identyfikować efekty specyficzne dla fazy. Opracowując te narzędzia, protokoły mogą być szybciej dostosowywane, zapewniając skuteczniejsze leczenie szerszego zakresu nowotworów.
Nasz niestandardowy system elektrocytometryczny (<silna klasa="xfig">Rysunek 1) składa się z komory z aluminiowymi równoległymi elektrodami płytkowymi i dnem ze szkła nakrywkowego, a także prostego generatora impulsów rozpadu wykładniczego. Komora jest zbudowana z komory wydrukowanej w 3D, a szklane dno #1.5 jest przymocowane za pomocą kleju wrażliwego na nacisk klasy medycznej. Elektrody formowane są z samoprzylepnej folii aluminiowej umieszczonej na wspornikach wbudowanych w komorę, zapewniając dwie równoległe elektrody oddalone od siebie o 0,4 cm. Jest to powszechna konfiguracja dla elektrod komercyjnych i zapewnia solidną konstrukcję, która może szybko dostosować obecne protokoły. Komora może mieścić się w obudowach środowiskowych przeznaczonych do szkiełek o wymiarach 25 mm x 55 mm, co jest również powszechnym formatem szkiełek obsługiwanym przez komercyjnych dostawców mikroskopów. Generator impulsów zapewnia impulsy zaniku wykładniczego do 330 V, co pozwala na przeprowadzenie szerokiego zakresu eksperymentów, w tym elektroporacji odwracalnej i nieodwracalnej.
Aby zbadać wpływ PEF na cykl komórkowy, użyliśmy transgenicznej linii komórkowej ludzkiego kostniakomięsaka (U2 OS) wyrażającej Wskaźnik Cyklu Komórkowego Ubikwitynacji Fluorescencyjnej (CA)5 (FUCCI(CA)5), fluorescencyjny konstrukt reportera żywego cyklu komórkowego. System wprowadza dwie fluorescencyjne, skrócone formy Gemininy i Cdt1, które są produkowane i poddawane recyklingowi w określonych ilościach podczas cyklu komórkowego. Dodatkowo, apoptoza może być bezpośrednio monitorowana podczas eksperymentu przy użyciu stabilnie eksprymującej linii FUCCI(CA)5 komórek U2-OS. Podczas cyklu komórkowego reporter działa w sposób przewidywalny w każdej fazie, ponieważ są one wytwarzane i degradowane w tym samym tempie, co wersje funkcjonalne naturalnie wyrażane w komórce. Kiedy dochodzi do apoptozy, cykl ten zostaje zakłócony, a cykl komórkowy szybko się wyłącza. Zazwyczaj objawia się to wizualnie jako stęchłość fluorescencji w cyklu komórkowym, po której następują dramatyczne zmiany morfologiczne w jądrze, co jest wyraźnie widoczne ze względu na lokalizację reporterów w jądrze6. Pozwala to na wizualną identyfikację każdej fazy w pojedynczych komórkach w czasie (<silna klasa="xfig">Rysunek 2). Odwracalna elektroporacja powoduje zmiany w warunkach wewnątrzkomórkowych, a do badań wybrano impuls rozpadu wykładniczego 180 V. Impuls ten został dobrany tak, aby jak najbardziej ograniczyć śmierć komórki, zapewniając jednocześnie elektroporację u większości populacji. Ustalono to na podstawie wcześniejszych badań nad optymalnymi parametrami impulsu elektroporacyjnego dla sześciu linii komórkowych ssaków. Gęstość energii impulsu 180 V była nieco niższa niż optymalne parametry transfekcji, zapewniając lepszą żywotność ogniwa przy wysokim poration7. Wpływ impulsu badano w komórkach niezsynchronizowanych i komórkach zsynchronizowanych w fazie S przy użyciu podwójnego bloku tymidyny z aplikacją PEF i bez niej (<silna klasa = "xfig">Rysunek 3). Wyniki wskazały na zmniejszenie średniej długości dla S i G2 w porównaniu z kontrolą. Wskazywało to, że faza S była wrażliwa na ekspozycję na PEF, co skutkowało szybszym cyklem komórkowym. Wykazano w ten sposób, że system cytometrii elektroporacyjnej był w stanie połączyć dostarczanie PEF z długoterminowym obrazowaniem żywych komórek w celu zbadania cyklu komórkowego. Chociaż wykorzystaliśmy tę platformę do obserwacji progresji komórek w cyklu komórkowym w odpowiedzi na PEF, jest to przydatne narzędzie do badania różnych zastosowań i warunków PEF i hodowli komórek.

<table><tbody><tr><td>Zjeżdżalnia komorowa (wydrukowana w 3D/oceniona)&nbsp;</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Płytka hodowlana (10 cm)</td><td>Sarstedt</td><td>83.3902</td><td></td></tr><tr><td>Delta Vision</td><td>Olympus</td><td>N/A</td><td>Można również używać alternatywnych modeli mikroskopów. Upewnij się, że stage i system środowiskowy mogą pomieścić szkiełko komorowe do elektroporacji (55 mm x&nbsp;</td></tr><tr><td>DMEM &ndash; Wysoka zawartość glukozy</td><td>Gibco</td><td>11965092</td><td></td></tr><tr><td>płodowa surowica bydlęca&nbsp;</td><td>ThermoFisher</td><td>A5256701&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Drukarka 3D i3 MK3S</td><td>Prusa</td><td>N/A</td><td>Można używać alternatywnych modeli drukarek, które mogą korzystać z plików STL.&nbsp;</td></tr><tr><td>Długopis Strep</td><td>ThermoFisher</td><td>15070063</td><td></td></tr> Sól fizjologiczna <tr><td>buforowana fosforanem</td><td>Gibco</td><td>10010031</td><td></td></tr><tr><td>tFUCCI(CA)5</td><td>Addgene</td><td>153521</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>9002-07-07</td><td></td></tr><tr><td>Linia komórkowa U2-OS</td><td>ATCC</td><td>HTB-96</td><td></td></tr></tbody></table>

protokół cytometrii elektroporacyjnej do mikroskopii fluorescencyjnej żywych komórek z wykorzystaniem hodowli komórkowej u2 os

An Electroporation Cytometry Protocol for Live-Cell, Fluorescence Microscopy Using U2 OS Cell Culture

Pulsacyjne pola elektryczne (PEF) mają szeroki zakres zastosowań w badaniach medycznych i zastosowaniach klinicznych. Kluczowy obszar badań skupia się na elektroporacji (odwracalnej lub nieodwracalnej). Odwracalna elektroporacja jest stosowana od kilkudziesięciu lat do przenoszenia cząsteczek przez błony komórkowe, takie jak plazmidowe DNA, zwykle określane jako elektrotransfer genów (GET). I odwrotnie, nieodwracalna elektroporacja stała się popularną techniką w leczeniu raka, zapewniając nietoksyczną alternatywę poprzez trwałe rozerwanie komórek za pomocą PEF. Można to łączyć z różnymi rodzajami leków lub odczynników w celu wzmocnienia efektu, który stał się znany jako elektrochemioterapia (ECT). Jednak pomimo szerokiego sukcesu w praktycznych zastosowaniach, potrzebne jest dalsze wsparcie technologiczne i badania w celu ulepszenia obecnych technik. Aby rozwiązać ten problem, opracowano system cytometrii elektroporacyjnej, który wspiera eksperymenty z PEF na żywych komórkach z możliwością wykonywania długotrwałej mikroskopii fluorescencyjnej. Było to w połączeniu ze stabilną linią komórkową FUCCI(CA)5 U2-OS do oceny zmian w cyklu komórkowym w odpowiedzi na ekspozycję na PEF. W ten sposób uzyskano do 30-godzinnej mikroskopii poklatkowej, która zapewnia zmiany aktywności komórek w czasie rzeczywistym w oparciu o reporter FUCCI(CA)5. W rezultacie, zmiany specyficzne dla danej fazy były kwantyfikowalne na potrzeby dalszej analizy.

Wykorzystując system FUCCI (Rycina 2), uzyskano wizualne dane dotyczące cyklu komórkowego poprzez pomiar czasu ekspresji każdego koloru w komórce, wynikającego z ekspresji białek i braku ubikwitynacji. Na podstawie wyników z eksperymentów niesynchronizowanych i synchronizowanych (Rycina 3) stało się oczywiste, że ekspozycja na PEF w fazie S przyspieszyła cykl komórkowy. Świadczyło o tym skrócenie średniego czasu trwania poszczególnych faz, co wskazuje na szybszy...

Elektroporacja to użycie impulsowych pól elektrycznych (PEF) do tworzenia przejściowych porów w hodowlach komórkowych w celu wprowadzenia ładunku molekularnego. Technika ta stała się ostatnio szeroko stosowana w warunkach badawczych i klinicznych. W tym miejscu opisujemy techniki elektroporacji z wykorzystaniem niedawno opracowanego "systemu cytometrii elektroporacyjnej" do wykonywania mikroskopii fluorescencyjnej na żywych komórkach.

Protokół cytometrii elektroporacyjnej do mikroskopii fluorescencyjnej żywych komórek z wykorzystaniem hodowli komórkowej U2 OS

Pulsed electric fields (PEFs) have a wide range of applications in medical research and clinical applications. A key area of research focuses on ...

Zakres tych badań koncentruje się na wpływie pulsacyjnych pól elektrycznych na zachowanie komórek, a w szczególności na tym, jak elektroporacja wpływa na cykl komórkowy.Podstawową zaletą tego protokołu jest możliwość przeprowadzania ciągłych eksperymentów z elektroporacją żywych komórek przy użyciu hodowli komórek ssaków przez okres do 72 godzin. Nasze laboratorium koncentruje się na dostosowaniu tych technik do mikrofluidyki, co pozwoli na zmniejszenie rozmiarów próbek, zmniejszenie wymagań dotyczących odczynników i lepszą kontrolę próbek dla przyszłych protokołów.[Narrator] Na początek posadź komórki U2OS FUCCI CA5 na 10-centymetrowej płytce z 10 mililitrami DMEM o wysokiej zawartości glukozy zawierającej 10% FBS i 1% penicyliny streptomycyny. Inkubuj płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza w środowisku 5% dwutlenku węgla. Gdy kultura osiągnie 80% zbieżności, odessać pożywkę z płytki. Umyj komórki PBS, a następnie dodaj jeden mililitr 0,25% trypsyny i inkubuj przez 1,5 minuty w celu dysocjacji komórek. Zneutralizuj trypsynę, ponownie zawieszając zdysocjowane komórki w pięciu mililitrach DMEM o wysokiej zawartości glukozy. Pobrać próbkę o pojemności 100 mikrolitrów z zawieszonej kultury i umieścić ją na szkiełku pokrywowym dolnej szklanej w komorze systemu cytometrii elektroporacyjnej. Upewnij się, że komora jest w 30% zlewająca się po wprowadzeniu próbki. Powoli dodaj cztery mililitry wysokiej glukozy DMEM na drugi koniec komory, zapobiegając wypłukiwaniu próbki przez ciecz. Umieść standardowe szkiełko mikroskopowe nad komorą i inkubuj komorę w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla przez 24 godziny. Włącz odwrócony mikroskop fluorescencyjny z komorą kontroli środowiska, aby umożliwić ustabilizowanie się systemu przed elektroporacją. Podczas gdy komora środowiskowa stabilizuje się, użyj z zaciskiem krokodylkowym, aby podłączyć multimetr cyfrowy do kondensatora generatora impulsów i przełącznika wysokiego napięcia w celu szybkiej konfiguracji z komorą elektroporacyjną. Teraz wybierz 20-krotne powiększenie w mikroskopie. W oprogramowaniu mikroskopu upewnij się, że kanały FITC/GFP i A594 Texas Red M Cherry są wybrane zgodnie z dwoma białkami fluorescencyjnymi w systemie FUCCI CA5. Używaj niskich ustawień ekspozycji, zwykle krótszych niż 0,05 sekundy, aby zapobiec uszkodzeniom zdjęcia podczas długotrwałego obrazowania. Wykonaj zdjęcia testowe, aby zoptymalizować ostrość i jakość obrazu przed rozpoczęciem obrazowania poklatkowego. Zaprogramuj upływ czasu, aby rejestrować obrazy z trzech do sześciu różnych punktów widzenia co 10 minut w ciągu 24 godzin, aby uzyskać dużą ilość danych dotyczących cyklu komórkowego na upływ czasu, jednocześnie łagodząc uszkodzenia zdjęć. Upewnij się, że autofokus jest włączony dla kanału A594, aby zoptymalizować śledzenie kultury podczas upływu czasu. Pozostaw oprogramowanie otwarte do momentu zakończenia elektroporacji. Umieścić komorę cytometrii elektroporacyjnej w mikroskopie wyposażonym w odpowiednią komorę środowiskową. Przed elektroporacją trzymaj komorę zamkniętą i upewnij się, że system środowiskowy nadal działa, aby utrzymać odpowiednie warunki cyklu ogniw. Otwórz komorę środowiskową i podłącz multimetr cyfrowy do generatora impulsów, a następnie za pomocą z zaciskiem krokodylkowym podłącz generator impulsów do elektrod komory. Naładuj kondensator generatora impulsów do 180 woltów. Szybko rozładuj impuls do komory, aż multimetr cyfrowy wyświetli zero woltów. Odłącz wszystkie połączenia elektryczne od komory i niezwłocznie załóż pokrywę komory, aby zapewnić optymalne warunki hodowli. Obrazowanie poklatkowe należy aktywować natychmiast po bezpiecznym umieszczeniu komory środowiskowej. Po zakończeniu upływu czasu użyj oprogramowania mikroskopu, aby zapisać wszystkie przechwycone obrazy jako pojedynczy film. Dostosuj jakość wizualną, aby zwiększyć przejrzystość funkcji komórek na potrzeby ręcznej kwantyfikacji. Na koniec obserwuj zmiany w sygnałach FITC i A594 w czasie, aby śledzić fazy komórek w filmie poklatkowym. Korzystając z systemu Fuji, zebrano dane wizualne, śledząc zmiany koloru związane z ekspresją białek i ubikwitynacją, co pozwoliło na wyraźne rozróżnienie faz G1, S, G2, M. Umożliwiło to bezpośrednią obserwację progresji cyklu komórkowego w różnych warunkach. Rysunek ten przedstawia podsumowanie kluczowych danych zebranych z dwóch zestawów eksperymentów z wykorzystaniem niezsynchronizowanych i zsynchronizowanych hodowli komórkowych w fazie S. Ekspozycja na pulsacyjne pole elektryczne w niezsynchronizowanych komórkach znacznie zwiększyła średnią długość faz G1, G2 i M, podczas gdy faza S pozostała niezmieniona. W zsynchronizowanych komórkach ekspozycja na pulsacyjne pole elektryczne prowadziła do skrócenia czasu trwania faz G1, S i G2, chociaż tylko S i G2 były statystycznie istotne, podczas gdy faza M pozostała nienaruszona.

an-electroporation-cytometry-protocol-for-live-cell-fluorescence

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

W niniejszym filmie prezentujemy efektywną elektrofuzję komórek in vitro za pomocą zmodyfikowanej metody adhezyjnej z wykorzystaniem elektroporacji oraz późniejszą detekcję i wizualizację sfuzowanych komórek przy użyciu mikroskopii fluorescencyjnej.

Wizualizacja elektrofuzyjnej fuzji komórek za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej

Kinetykę transkrypcyjną polimerazy RNA II mierzy się na wybranych genach w żywych komórkach. mRNA transkrybowane z badanego genu są znakowane fluorescencyjnie, a za pomocą metody FRAP (Fluorescence Recovery After Photobleaching) wyznacza się kinetykę elongacji transkrypcji in vivo.

Pomiar kinetyki transkrypcji mRNA w pojedynczych żywych komórkach

Źródło: Aigrain, L. i in. Internalizacja i obserwacja fluorescencyjnych biomolekuł w żywych mikroorganizmach za pomocą elektroporacji.  J. Vis. Exp. (2015)Film pokazuje dostarczanie fluorescencyjnych biomolekuł do elektrokompetentnych komórek mikrobiologicznych za pomocą elektroporacji. Proces rozpoczyna się od wprowadzenia DNA lub białek oznaczonych fluoroforem do schłodzonej zawiesiny komórkowej. Następnie stosuje się impuls wysokiego napięcia, aby utworzyć tymczasowe pory błonowe,...

Dostarczanie biomolekuł fluorescencyjnej do komórek bakteryjnych za pomocą elektroporacji

Ten film opisuje BiFC-PALM ― połączenie fotoaktywowanej mikroskopii lokalizacyjnej i dwucząsteczkowej komplementacji fluorescencji ― do oceny interakcji białko-białko. BiFC polega na fuzji dwóch fluorescencyjnych fragmentów białek z dwoma oddziałującymi białkami będącymi przedmiotem zainteresowania. Kiedy te dwa białka wchodzą w interakcję, fragmenty są zbliżane do siebie, co pozwala obu częściom połączyć się i odtworzyć funkcjonalne białko fluorescencyjne. Fluorescencja pojedynczego fluoroforu...

Mikroskopia lokalizacji fotoaktywowanej sprzężona z fluorescencją fluorescencji bimolekularnej

Ten film demonstruje obrazowanie na żywych komórkach topologii synaps immunologicznych, badając interakcje między limfocytami T a komórkami nabłonkowymi przenoszącymi antygeny fluorescencyjne. Mikroskopia fluorescencyjna ujawnia przemieszczenie czerwonej cytoplazmy i żółte pierścienie błonowe w komórkach śródbłonka, co wskazuje na tworzenie się synaps immunologicznych.

Ocena topologii synaps immunologicznych za pomocą obrazowania żywych komórek

Badania biomolekuł in vivo są kluczowe dla zrozumienia funkcji molekularnej w kontekście biologicznym. W tym miejscu opisujemy nowatorską metodę pozwalającą na internalizację biomolekuł fluorescencyjnych, takich jak DNA czy białka, do żywych mikroorganizmów. Przedstawiono i omówiono również analizę danych in vivo zarejestrowanych za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej.

Internalizacja i obserwacja biomolekuł fluorescencyjnych w żywych mikroorganizmach za pomocą elektroporacji

Interakcje białko-białko są wizualizowane w komórkach z nanometrową rozdzielczością przestrzenną poprzez połączenie dwucząsteczkowej komplementacji fluorescencji (BiFC) z fotoaktywowaną mikroskopią lokalizacyjną (PALM). Opisano tutaj zastosowanie BiFC-PALM do obrazowania oddziaływań Ras-Raf w komórkach U2OS do wizualizacji klastrowania i dyfuzji w nanoskali poszczególnych kompleksów Ras-Raf.

Fotoaktywowana mikroskopia lokalizacyjna z dwucząsteczkową komplementacją fluorescencji (BiFC-PALM)

Podwójna elektroporacja w macicy pozwala na celowanie w populacje komórek, które są przestrzennie i czasowo oddzielone. Technika ta jest przydatna do wizualizacji interakcji między tymi populacjami komórek przy użyciu białek fluorescencyjnych w normalnych warunkach, ale także po eksperymentach funkcjonalnych w celu zakłócenia interesujących genów.

Podwójna elektroporacja in utero w celu ukierunkowania na czasowo i przestrzennie oddzielone populacje komórek

Ten protokół opisuje techniki mikrofabrykacji wymagane do zbudowania urządzenia do elektroporacji mikroprzepływowej typu lab-on-a-chip. Konfiguracja eksperymentalna wykonuje kontrolowane transfekcje na poziomie pojedynczej komórki w ciągłym przepływie i może być rozszerzona do wyższych przepustowości dzięki kontroli populacyjnej. Przedstawiono analizę pokazującą możliwość elektrycznego monitorowania stopnia przepuszczalności błony komórkowej w czasie rzeczywistym.

Wytwarzanie i działanie systemu mikroelektroporacji o ciągłym przepływie z detekcją przepuszczalności

Do badania reakcji komórek pobudliwych in vitro, protokół opisuje optyczne monitorowanie zmian w generowaniu potencjału czynnościowego przez elektroporację na prostym pobudliwym modelu komórkowym genetycznie modyfikowanych komórek HEK z tet-on, jak również zmian napięcia transbłonowego z automatyczną ekstrakcją odpowiednich parametrów.

Monitorowanie wywołanych przez elektroporację zmian w generowaniu potencjału czynnościowego w genetycznie modyfikowanych ogniwach HEK Tet-On Spiking

Protokół ten określa procedurę wykonywania głębokiej, całkomórkowej mikroskopii lokalizacyjnej pojedyncząsteczkowej (SMLM) za pomocą obrotowego mikroskopu konfokalnego z optycznym przesunięciem fotonów, co umożliwia obrazowanie DNA-PAINT bez potrzeby stosowania niestandardowej optyki czy złożonego oświetlenia.

Obrazowanie całokomórkowe superrozdzielczości za pomocą DNA-PAINT na obracającym się dysku konfokalnym z optycznym przekształceniem fotonów

Poznaj protokół cytometrii elektroporacyjnej do mikroskopii fluorescencyjnej żywych komórek z wykorzystaniem hodowli U2 OS. Technika ta umożliwia ciągłe eksperymenty do 72 godzin.

Protokół cytometrii elektroporacyjnej do mikroskopii fluorescencyjnej żywych komórek z wykorzystaniem hodowli komórkowej U2 OS

Przeglądaj więcej filmów