Name: Przygotowanie i utrzymanie eksperymentu z izododatnią klatką z wykluczeniem biologicznym do przeszczepu kału u myszy wolnych od zarazków (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-02-28T14:45:00.000+00:00
Duration: 7 min 45 s
Description: Poznaj metodę przeszczepu kału do myszy wolnych od zarazków w systemie izododatniej klatki. Technika ta umożliwia badanie roli mikrobiomu w rozwoju i terapii nowotworów.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Autorzy są wdzięczni Wydziałowi Usług Wolnych od Zarazków UF Animal Care Services za pomoc w hodowli gnotobiotyków, dr Brooke Bloomberg i dr Laurze Eurell za pomoc weterynaryjną i IACUC oraz Josee Gauthier za pomoc w sekwencjonowaniu genu 16S rRNA. Badania te były częściowo wspierane przez UF Health Cancer Center Funds (C.J.) i UF Department of Medicine Gatorade Fund (C.J.). R.Z.G. został wsparty ze środków UF Health Cancer Center. R.C.N. był wspierany przez National Institutes of Health TL1 Training Grant na Uniwersytecie Florydy (TL1TR001428, UL1TR001427), National Cancer Institute of the National Institutes of Health Team-Based Interdisciplinary Cancer Research Training Program T32CA257923 oraz UF Health Cancer Center. Badania przedstawione w tej publikacji były wspierane przez UF Health Cancer Center, wspierane częściowo przez środki stanowe przewidziane w Fla. Stat. § 381.915 oraz National Cancer Institute of the National Institutes of Health w ramach nagrody numer P30CA247796. Wyłączną odpowiedzialność za treść ponoszą autorzy i niekoniecznie reprezentują one oficjalne poglądy National Institutes of Health lub stanu Floryda. Fundatorzy nie odgrywali żadnej roli w projektowaniu badania, gromadzeniu i analizie danych, podejmowaniu decyzji o publikacji lub przygotowaniu manuskryptu.

<ol><li>Park, J. C., Im, S. -H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Of+men+in+mice%3A+the+development+and+application+of+a+humanized+gnotobiotic+mouse+model+for+microbiome+therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Of men in mice: the development and application of a humanized gnotobiotic mouse model for microbiome therapeutics.</a> Exp Mol Med. 52 (9), 1383-1396 (2020).</li>
<li>Li, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbiome+remodelling+leads+to+inhibition+of+intestinal+farnesoid+X+receptor+signalling+and+decreased+obesity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Microbiome remodelling leads to inhibition of intestinal farnesoid X receptor signalling and decreased obesity.</a> Nat Commun. 4, 2384(2013).</li>
<li>Schwabe, R. F., Jobin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+microbiome+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">The microbiome and cancer.</a> Nat Rev Cancer. 13 (11), 800-812 (2013).</li>
<li>Wen, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Innate+immunity+and+intestinal+microbiota+in+the+development+of+Type+1+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Innate immunity and intestinal microbiota in the development of Type 1 diabetes.</a> Nature. 455 (7216), 1109-1113 (2008).</li>
<li>Gray, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+adaptation+of+human+inflammatory+bowel+diseases+microbiota+enhances+colonization+efficiency+and+alters+microbiome+aggressiveness+depending+on+recipient+colonic+inflammatory+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiome%22%5BJournal%5D)">Mouse adaptation of human inflammatory bowel diseases microbiota enhances colonization efficiency and alters microbiome aggressiveness depending on recipient colonic inflammatory environment.</a> Microbiome. 12 (1), 147(2024).</li>
<li>Gopalakrishnan, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gut+microbiome+modulates+response+to+anti-PD-1+immunotherapy+in+melanoma+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Gut microbiome modulates response to anti-PD-1 immunotherapy in melanoma patients.</a> Science. 359 (6371), 97-103 (2018).</li>
<li>Matson, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+commensal+microbiome+is+associated+with+anti-PD-1+efficacy+in+metastatic+melanoma+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The commensal microbiome is associated with anti-PD-1 efficacy in metastatic melanoma patients.</a> Science. 359 (6371), 104-108 (2018).</li>
<li>Routy, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gut+microbiome+influences+efficacy+of+PD-1-based+immunotherapy+against+epithelial+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Gut microbiome influences efficacy of PD-1-based immunotherapy against epithelial tumors.</a> Science. 359 (6371), 91-97 (2018).</li>
<li>Paik, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potential+for+using+a+hermetically-sealed%2C+positive-pressured+isocage+system+for+studies+involving+germ-free+mice+outside+a+flexible-film+isolator%5BTitle%5D)+AND+%22Gut+Microbes%22%5BJournal%5D)">Potential for using a hermetically-sealed, positive-pressured isocage system for studies involving germ-free mice outside a flexible-film isolator.</a> Gut Microbes. 6 (4), 255-265 (2015).</li>
<li>Hecht, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+cage-autonomous+method+for+the+maintenance+of+the+barrier+status+of+germ-free+mice+during+experimentation%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Anim%22%5BJournal%5D)">A simple cage-autonomous method for the maintenance of the barrier status of germ-free mice during experimentation.</a> Lab Anim. 48 (4), 292-297 (2014).</li>
<li>Dremova, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sterility+testing+of+germ-free+mouse+colonies%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Sterility testing of germ-free mouse colonies.</a> Front Immunol. 14, 1275109(2023).</li>
<li>Newsome, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+of+bacterial+genera+associated+with+therapeutic+response+to+immune+checkpoint+PD-1+blockade+in+a+United+States+cohort%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Med%22%5BJournal%5D)">Interaction of bacterial genera associated with therapeutic response to immune checkpoint PD-1 blockade in a United States cohort.</a> Genome Med. 14 (1), 35(2022).</li>
<li>Le Roy, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+evaluation+of+microbiota+engraftment+following+fecal+microbiota+transfer+in+mice+models%3A+age%2C+kinetic+and+microbial+status+matter%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Comparative evaluation of microbiota engraftment following fecal microbiota transfer in mice models: age, kinetic and microbial status matter.</a> Front Microbiol. 9, 3289(2018).</li>
<li>Lebeuf, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contaminants+and+where+to+find+them%3A+microbiological+quality+control+in+axenic+animal+facilities%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Contaminants and where to find them: microbiological quality control in axenic animal facilities.</a> Front Microbiol. 12, (2021).</li>
<li>He, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Campylobacter+jejuni+promotes+colorectal+tumorigenesis+through+the+action+of+cytolethal+distending+toxin%5BTitle%5D)+AND+%22Gut%22%5BJournal%5D)">Campylobacter jejuni promotes colorectal tumorigenesis through the action of cytolethal distending toxin.</a> Gut. 68 (2), 289-300 (2019).</li>
<li>Wu, G. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Linking+long-term+dietary+patterns+with+gut+microbial+enterotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Linking long-term dietary patterns with gut microbial enterotypes.</a> Science. 334 (6052), 105-108 (2011).</li>
<li>Ross, F. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+interplay+between+diet+and+the+gut+microbiome%3A+implications+for+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The interplay between diet and the gut microbiome: implications for health and disease.</a> Nat Rev Microbiol. 22 (11), 671-686 (2024).</li>
<li>Maier, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extensive+impact+of+non-antibiotic+drugs+on+human+gut+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Extensive impact of non-antibiotic drugs on human gut bacteria.</a> Nature. 555 (7698), 623-628 (2018).</li>
<li>Walter, J., Armet, A. M., Finlay, B. B., Shanahan, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishing+or+exaggerating+causality+for+the+gut+microbiome%3A+Lessons+from+human+microbiota-associated+rodents%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Establishing or exaggerating causality for the gut microbiome: Lessons from human microbiota-associated rodents.</a> Cell. 180 (2), 221-232 (2020).</li>
<li>Berland, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+engraftment+capacity+of+frozen+ready-to-use+human+fecal+microbiota+transplants+assessed+in+germ-free+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">High engraftment capacity of frozen ready-to-use human fecal microbiota transplants assessed in germ-free mice.</a> Sci Rep. 11 (1), 4365(2021).</li>
<li>Choo, J. M., Rogers, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+murine+gut+microbiota+in+gnotobiotic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22iScience%22%5BJournal%5D)">Establishment of murine gut microbiota in gnotobiotic mice.</a> iScience. 24 (2), 102049(2021).</li>
<li>Bokoliya, S. C., Dorsett, Y., Panier, H., Zhou, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Procedures+for+fecal+microbiota+transplantation+in+murine+microbiome+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Infect+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Procedures for fecal microbiota transplantation in murine microbiome studies.</a> Front Cell Infect Microbiol. 11, 711055(2021).</li>
<li>Li, Y., Cao, W., Gao, N. L., Zhao, X. -M., Chen, W. -H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Consistent+alterations+of+human+fecal+microbes+after+transplantation+into+germ-free+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Genomics+Proteomics+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Consistent alterations of human fecal microbes after transplantation into germ-free mice.</a> Genomics Proteomics Bioinformatics. 20 (2), 382-393 (2022).</li>
<li>Turnbaugh, P. J., Ridaura, V. K., Faith, J. J., Rey, F. E., Knight, R., Gordon, J. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+diet+on+the+human+gut+microbiome%3A+a+metagenomic+analysis+in+humanized+gnotobiotic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">The effect of diet on the human gut microbiome: a metagenomic analysis in humanized gnotobiotic mice.</a> Sci Transl Med. 1 (6), 6ra14(2009).</li>
<li>Staley, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stable+engraftment+of+human+microbiota+into+mice+with+a+single+oral+gavage+following+antibiotic+conditioning%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiome%22%5BJournal%5D)">Stable engraftment of human microbiota into mice with a single oral gavage following antibiotic conditioning.</a> Microbiome. 5 (1), 87(2017).</li>
<li>Lebeuf, M., Turgeon, N., Faubert, C., Robillard, J., Paradis, É, Duchaine, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Managing+the+bacterial+contamination+risk+in+an+axenic+mice+animal+facility%5BTitle%5D)+AND+%22Can+J+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Managing the bacterial contamination risk in an axenic mice animal facility.</a> Can J Microbiol. 67 (9), 657-666 (2021).</li>
<li>Basic, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+and+contamination+incidence+of+gnotobiotic+experiments+performed+in+microisolator+cages%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Med+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Monitoring and contamination incidence of gnotobiotic experiments performed in microisolator cages.</a> Int J Med Microbiol. 311 (3), 151482(2021).</li>
<li>Amorim, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Refining+a+protocol+for+faecal+microbiota+engraftment+in+animal+models+after+successful+antibiotic-induced+gut+decontamination%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Med%22%5BJournal%5D)">Refining a protocol for faecal microbiota engraftment in animal models after successful antibiotic-induced gut decontamination.</a> Front Med. 9, 770017(2022).</li>
</ol>

Autorzy nie pozostają w konflikcie interesów.

Opisany tutaj protokół zapewnia powtarzalną, bardzo szczegółową metodę humanizacji myszy wolnych od zarazków trzymanych w eksperymentalnych izoklatkach. Możliwość wyłącznego przeszczepiania kału od ludzi do mysich gospodarzy jest nieoceniona w badaniach nad mikrobiomem. Bez zanieczyszczenia mikrobiotą komensalną specyficzną dla myszy można badać wpływ bakterii rezydujących u ludzi na różne stany zdrowia i choroby lub wpływ interwencji, takich jak dieta lub podawanie leków, na mikrobiotę człowieka 16,17,18.<sup class="xre...

Myszy wolne od mikroorganizmów (germ-free) stanowią niezbędne narzędzie w arsenale badaczy mikrobiomu, umożliwiając analizę wpływu mikrobioty na zdrowie gospodarza oraz stany chorobowe. Myszy wolne od mikroorganizmów rodzą się całkowicie sterylne i pozostają akseniczne przez całe życie1. Kolonizacja myszy wolnych od mikroorganizmów specyficznymi szczepami bakterii pozwala na prowadzenie badań przyczynowo-skutkowych między tymi taksonami a funkcjami metabolicznymi, odpornościowymi lub innymi funkcjami gospodarza2,3,4,5. Szczególnie korzystna jest możliwość „humanizacji” mikrobioty myszy wolnych od mikroorganizmów poprzez transplantację kału otrzymanego od ludzkich dawców, co przy zachowaniu warunków barierowych pozwala zapobiec kontaminacji mikroorganizmami pochodzenia mysiego1. Podejście to umożliwiło wiele istotnych odkryć w dziedzinie mikrobiomu, na przykład w zakresie wpływu ludzkiego mikrobiomu jelitowego na odpowiedź na immunoterapię nowotworów6,7,8.
Jednakże, mimo że humanizowane myszy wolne od mikroorganizmów (germ-free) są nieocenione w badaniach nad mikrobiomem, istnieje wiele ograniczeń, które hamują szersze zastosowanie tego podejścia. Myszy wolne od mikroorganizmów są hodowane i utrzymywane w dużych izolatorach o sztywnej lub elastycznej ścianie, jednak eksperymenty funkcjonalne wymagają przygotowania osobnych mini-izolatorów, z których jeden mieści kilka klatek, ale tylko w ramach jednego warunku eksperymentalnego. Podejście z wykorzystaniem mini-izolatorów zwiększa zapotrzebowanie na przestrzeń i koszty, jednocześnie drastycznie ograniczając liczbę warunków eksperymentalnych, które można zbadać w jednym doświadczeniu, oraz liczbę eksperymentów możliwych do przeprowadzenia równolegle. Obiecującym rozwiązaniem jest zastosowanie indywidualnego, modułowego systemu klatkowego zwanego ISOcage P Bioexclusion System (zwanego tutaj systemem isocage)9,10. System isocage umożliwia manipulacje eksperymentalne z myszami wolnymi od mikroorganizmów w indywidualnych, hermetycznie zamkniętych klatkach izolacyjnych z nadciśnieniem, co pozwala na zastosowanie odrębnych warunków eksperymentalnych dla każdej klatki, a nie dla każdego mini-izolatora. Przy zastosowaniu odpowiedniej techniki aseptycznej, zwierzęta mogą być utrzymywane w klatkach isocage przez maksymalnie 12 tygodni w warunkach wolnych od mikroorganizmów lub mogą zostać humanizowane poprzez przeszczep kału ludzkiego do wykorzystania w dowolnym kompatybilnym podejściu eksperymentalnym (tzn. takim, które może być wykonane w warunkach aseptycznych). Dzięki systemowi isocage można równolegle prowadzić wiele niezależnych eksperymentów, a zapotrzebowanie na przestrzeń i koszty są znacznie mniejsze niż w przypadku przeprowadzania wielu doświadczeń w mini-izolatorach.
Celem hodowli myszy wolnych od drobnoustrojów (germ-free) w izolatorach hodowlanych z elastycznej folii jest staranne utrzymanie statusu aksenicznego11. Techniki stosowane do monitorowania statusu germ-free obejmują rutynowe wymazy z powierzchni ciała i jam ustnych myszy, a także aseptyczne pobieranie próbek kału, które są następnie poddawane hodowli oraz testom z wykorzystaniem komercyjnych zestawów opartych na metodzie PCR. Do określenia statusu germ-free wymagane są badania bakteriologiczne, serologiczne i mykologiczne tych próbek11. Podczas przenoszenia myszy germ-free z izolatorów hodowlanych do klatek izolacyjnych (isocages) w celu wykorzystania ich w eksperymentach, pobiera się wymazy i przeprowadza testy w celu potwierdzenia ich statusu germ-free w momencie transferu. Kontrole sterylności klatek izolacyjnych są przeprowadzane poprzez aseptyczne pobieranie próbek kału, które są następnie hodowane w celu wykrycia zanieczyszczeń bakteryjnych, wirusowych i grzybiczych. Staranne pobieranie i zapisywanie wyników tych kontroli sterylności od narodzin aż do zakończenia protokołu eksperymentalnego jest niezbędne do walidacji statusu germ-free tych myszy.
System isocage składa się z pojedynczych klatek (Rysunek 1), dysków transferowych do transportu z izolatorów hodowlanych (Rysunek 1) oraz regału isocage, w którym znajdują się klatki (Rysunek 2). Każda klatka isocage posiada zainstalowany na wlocie powietrza zasilającego wysokowydajny filtr cząsteczek (HEPA) oraz uszczelkę silikonową, która po zamknięciu tworzy szczelne zamknięcie, zapobiegając przedostawaniu się zanieczyszczeń do klatki wraz z powietrzem (Rysunek 1A). Pokrywa klatki może służyć jako sterylna powierzchnia robocza, gdy zostanie umieszczona do góry dnem w wysterylizowanej komorze z laminarnym przepływem powietrza (Rysunek 1A). Druciana kratka wewnątrz klatki utrzymuje pokarm i butelkę z wodą (Rysunek 1B). Do wszystkich manipulacji wymagających kontaktu z wewnętrznymi powierzchniami klatki używa się pęset autoklawowanych wewnątrz klatki. Sama klatka posiada wycięcia na wyjmowany uchwyt karty identyfikacyjnej zwierząt, a także dysze wlotowe i wylotowe powietrza, które łączą się z regałem isocage (Rysunek 1C-E). Klamry bezpiecznego zamknięcia oraz blokada na pokrywie uszczelniają klatkę, gdy jest ona gotowa do ponownego podłączenia do systemu regałów (Rysunek 1F). Sugerowaną ściółką jest Alpha-dri, zalecane jest również stosowanie autoklawowalnej chatki wzbogacającej środowisko (Rysunek 1F). Dyski transferowe służą do przenoszenia myszy wolnych od drobnoustrojów z izolatorów hodowlanych do klatek isocage i zawierają obrotową pokrywę komory z trójkątnym otworem umożliwiającym manipulację zwierzętami (Rysunek 1G-H). Dyski występują w rozmiarach małym (średnica 21.6 cm) i dużym (średnica 28 cm), przy czym oba mają pojemność dla ośmiu myszy. Do tworzenia szczelnych zamknięć na obwodzie i otworach powietrznych dysku używa się autoklawowanej taśmy; czynność tę wykonuje się przed namoczeniem w środku sterylizującym i transportem w torbie nasączonej sterylizantem (Rysunek 1I). Sam system regałów posiada ekran do monitorowania dmuchaw powietrza, stanu filtrów HEPA na poziomie regału oraz zasilania awaryjnego z baterii, które są standardowymi funkcjami systemu (Rysunek 2A). Zamknięty manometr Magnehelic wyświetla ciśnienie dodatnie utrzymywane przez system klatek, a automatyczny wizualny wskaźnik dokowania pokazuje status podłączenia klatek (wysunięta żółta zakładka oznacza, że żadna klatka nie jest podłączona lub dokowanie nie powiodło się) (Rysunek 2B-D). Do manipulacji klatkami isocage niezbędna jest również standardowa certyfikowana komora z laminarnym przepływem powietrza.
Przedstawiony tutaj protokół opisuje właściwe metody skutecznego przenoszenia myszy wolnych od mikroorganizmów (germ-free) z izolatorów hodowlanych w warunkach aseptycznych do klatek izolatowych przy zachowaniu stanu germ-free, humanizację myszy germ-free przy użyciu zawiesiny kałowej od ludzkiego dawcy oraz pobieranie kału od myszy utrzymywanych w klatce izolatowej w celu potwierdzenia statusu germ-free lub zachowania żywotności mikroorganizmów do dalszych badań funkcjonalnych. W tym przykładzie myszy germ-free są humanizowane za pomocą połączonych próbek kału od ludzi leczonych immunoterapią raka płuc, podzielonych na respondentów i nierespondentów na terapię. W tym przypadku fenotyp odpowiedzi na immunoterapię został przeniesiony poprzez humanizację mikrobioty jelitowej do myszy biorców, które następnie mogły zostać zaszczepione komórkami nowotworowymi i leczone immunoterapią. Protokół przygotowania ludzkiej zawiesiny kałowej można łatwo dostosować do kału dowolnego ludzkiego dawcy lub dowolnego przedklinicznego modelu choroby, zgodnie z potrzebami badacza. Stosując ten protokół, możliwe jest przeniesienie mikrobioty od dowolnego ludzkiego dawcy kału do gospodarza germ-free, co umożliwia dalsze badanie roli mikrobioty w zdrowiu i chorobie.
<img alt="Schemat systemu klatek dla gryzoni z filtrem XT HEPA, butelką z wodą i układem wlotowym powietrza." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68029/68029fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Schemat klatki izolatowej (isocage) i dysków transferowych. (A) Widok z góry spodu pokrywy klatki z etykietami wskazującymi położenie wewnętrznego filtra HEPA na poziomie klatki oraz silikonowej uszczelki. (B) Widok z góry wnętrza klatki z etykietami wskazującymi drutowaną kratkę pokrywy, wewnętrzną butelkę z wodą wraz z dzióbkiem oraz miejsce w drucianym koszyku na autoklawowalną karmę. (C) Widok z przodu klatki pokazujący wcięcia na uchwyt karty klatki. (D) Widok z góry pełnej klatki z nałożoną pokrywą, pokazujący sposób montażu filtra HEPA na dyszy wlotowej powietrza. (E). Widok z tyłu klatki pokazujący dysze wlotowe i wylotowe powietrza, które są łączone z systemem regałów isocage. (F) Widok boczny pełnej klatki z nałożoną pokrywą z etykietami wskazującymi zaciski bezpiecznego zamknięcia w pozycji otwartej, z białymi zakładkami na każdym zacisku, które blokują je w miejscu. Wnętrze klatki pokazuje ściółkę Alpha-dri ułożoną warstwowo na dnie oraz sugerowaną chatkę wzbogacającą umieszczoną w ściółce. (G) Widok z góry dysków transferowych z nałożoną pokrywą. (H) Widok z góry wnętrza dysku transferowego, pokazujący obrotową pokrywę komory z trójkątnym otworem umożliwiającym manipulację zwierzętami. (I) Widok boczny w pełni zmontowanego dysku transferowego pokazujący miejsce przyklejenia taśmy do autoklawowania, która tworzy szczelne zamknięcie podczas transferu z izolatora rozrodczego do klatki isocage. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68029/68029fig01large.jpg" target="_blank">Aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny, kliknij tutaj.</a>
<img alt="Schemat szafy systemu bioizolacyjnego, filtr HEPA, ekran monitorujący, konfiguracja klatek eksperymentalnych." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68029/68029fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Schemat szafy z systemem klatek izolatorskich (isocage). (A) Kompletna szafa isocage z podłączonymi klatkami oraz etykietą wskazującą ekran monitorujący stan dmuchawy powietrza, filtr HEPA i baterię awaryjną. W dolnej lewej części szafy znajduje się gniazdo na filtr HEPA poziomu szafy. (B) Zamknięty manometr Magnehelic pokazujący nadciśnienie utrzymywane przez szafę. (C) Podłączona klatka isocage bez widocznego żółtego wskaźnika dokowania, co świadczy o prawidłowym połączeniu szafy z dyszami powietrznymi. (D) Puste gniazdo w szafie z widocznym automatycznym wizualnym wskaźnikiem dokowania, wskazującym na brak klatki w tym miejscu i brak połączenia dysz powietrznych z klatką isocage. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68029/68029fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.</a>

<table><tbody><tr><td>Sterylna strzykawka BD Slip Tip 1 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>309659</td><td></td></tr><tr><td>2,0 ml Rurka z nakrętką, bez radełkowania, z listwą podłogową, naturalna, sterylna rurka E-Beam z dołączoną nasadką</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-755-228</td><td></td></tr><tr><td>36 x 32 x 48 "3 Mil Gusset Poly Bags</td><td>Uline</td><td>S-13455</td><td></td></tr><tr><td>5-galonowy zbiornik aktywatora sterylizatora dwutlenku chloru Exspor&nbsp;</td><td>Ecolab</td><td>6301680</td><td></td></tr><tr><td>zbiornik o pojemności 5 galonów na bazie sterylizatora dwutlenku chloru Exspor&nbsp;</td><td>Ecolab</td><td>6301194</td><td></td></tr><tr><td>Zlewki polipropylenowe 600 ml</td><td>Fisher Scientific</td><td>S01914</td><td></td></tr><tr><td>Pościel ALPHA-dri</td><td>Shepherd Specialty Papers</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Komora anaerobowa</td><td>Produkty Coy Lab</td><td>Typ B</td><td></td></tr><tr><td>Szafa bezpieczeństwa biologicznego klasa 2</td><td>Certyfikowany przez Nuaire</td><td></td><td></td></tr><tr><td>autoklawowalny filtr HEPA IsoCage XT Extreme Temperature</td><td>Tecniplast</td><td>1245ISOFHXT</td><td></td></tr><tr><td>Przezroczyste soczewki LPX IQuity Gogle ochronne&nbsp;</td><td>Mocowanie</td><td>922205455</td><td></td></tr><tr><td>DuPont&nbsp; Tyvek&nbsp; Tuleja - 18"</td> <td>Uline</td><td>S-13893E</td><td></td></tr><tr><td>DWK Nauki Przyrodnicze DURAN 45 mm Nasadka z kauczuku naturalnego wciskana</td><td>Fisher Scientific</td><td>01-258-107</td><td>Gumowa nakrętka do butelek autoklawu 1 L</td></tr><tr><td>Butelki z opryskiwaczem HDPE Dynalon Quick Mist</td><td>Fisher Scientific</td><td>03-438-12B</td><td></td></tr><tr><td>Cylindry z podziałką polipropylenową Fisher</td><td>Scientific</td><td>03-007-44</td><td></td></tr><tr><td>Ryby&nbsp; Kleszcze preparacyjne o zaostrzeniu</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-887</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand Woreczki do sterylizacji z natychmiastowym uszczelnieniem</td><td>Fisher Scientific</td><td>01-812-51</td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze do zastosowań ogólnych Fisherbrand Straight, Szeroka, Mocna&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>16-100-107</td><td></td></tr><tr><td>Marka rybacka&nbsp; Bezołowiowa taśma autoklawu</td><td>Fisher Scientific</td><td>15-901-110</td><td></td></tr><tr><td>Igła do gaźniaka, wielokrotnego użytku ze stali nierdzewnej. Prosty. Igła o rozmiarze 22, średnica końcówki 1,25 mm, długość 38 mm lub 1,5 cala (doz)</td><td>Braintree Scientific</td><td>N-PK 020</td><td></td></tr><tr><td>H-B Instrument Durac Timer</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-202-015</td><td></td></tr><tr><td>IsoPositive Klatki i stojaki (tj. izoklatki)</td><td>Tecniplast&nbsp; &nbsp;</td><td>Klatki ISO30P</td><td>30 (6 szer. x 5 wys.), jednostronne</td></tr><tr><td>rękawice odporne na chemikalia nitrylowe Rozmiar S (7), M (8) lub L (9) 18" długości, 22 mil,</td> Rękawice nitrylowe Ansell <td>Grainger</td><td>4T426</td><td></td></tr>, <tr><td>średnie, niesterylne, bezpudrowe</td><td>MedSupply Partners</td><td>KG-1101M</td><td></td></tr><tr><td>Oliwka / Purpurowy bagnet Gaz & Wkłady parowe / filtr cząstek stałych 2Ct&nbsp;</td><td>&nbsp; 3M/Fastenal</td><td>50051138541878</td><td></td></tr><tr><td>Poliwęglan RadDisk Mini dla myszy 8-75 x 4</td><td>Braintree</td><td>Scientific IRD-P M</td><td></td></tr><tr><td>Polipropylenowe czapki Bouffant - 24", niebieskie</td><td>Uline</td><td>S-10480BLU</td><td></td></tr><tr><td>Puritan Cary-Blair Medium, 5 ml</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-029-646</td><td></td></tr><tr><td>S, M i L Niebieska silikonowa dwutrybowa półmaska na głowę z uprzężą na głowę&nbsp;</td><td>&nbsp; 3M/Fastenal</td><td>50051131370826</td><td></td></tr><tr><td>Sgpf Series Sterylne bezpudrowe rękawice lateksowe, CT International, Grubość = 6.5 mm, Długość = 30.5 cm (12), Rozmiar rękawicy = 8.5, Kolor rękawicy = Biały</td><td>Fisher Scientific</td><td>18-999-102F</td><td></td></tr><tr><td>Antypoślizgowy pokrowiec na buty</td><td>Uline</td><td>&nbsp; S-25639</td><td></td></tr><tr><td>Fartuch chirurgiczny, ręcznik, sterylny, duży, 32/cs</td><td>Thomas Scientific</td><td>KIM 95111</td><td></td></tr><tr><td>Teklad Global 18% białkowa dieta dla gryzoni ekstrudowana (sterylizowalna)&nbsp;</td><td>Inotiv</td><td>2018SX</td><td></td></tr><tr><td>Thermo Scientific Nalgene Wytrzymały prostokątny zbiornik LLDPE z pokrywą (objętość 20 l)</td><td>Thermo Scientific</td><td>14-831-330J</td><td></td></tr><tr><td>VERIFY Dwugatunkowe samodzielne wskaźniki biologiczne</td><td>Steris</td><td>Healthcare S3061</td><td></td></tr><tr><td>WypAll L40 1&frasl; Wycieraczki 4-krotne</td><td>Uline</td><td>S-8490</td><td></td></tr></tbody></table>

przygotowanie i utrzymanie eksperymentu z izododatnią klatką z wykluczeniem biologicznym do przeszczepu kału u myszy wolnych od zarazków

Preparation and Maintenance of Bioexclusion IsoPositive Cage Experiment for Human Fecal Transplantation into Germ-Free Mice

Myszy wolne od zarazków są ważnym narzędziem badawczym do zrozumienia wpływu mikroorganizmów na zdrowie i chorobę gospodarza, umożliwiając ocenę specyficznej roli jednostek, zdefiniowanych lub złożonych grup mikroorganizmów w odpowiedzi gospodarza. Hodowla myszy bez zarazków i eksperymentalne manipulacje, tradycyjnie hodowane i hodowane w izolatorach z elastyczną folią lub półsztywną, są kosztowne i wymagają licznego wyszkolonego personelu oraz dużej powierzchni w pomieszczeniach dla zwierząt. System klatkowy IsoPositive pozwala na eksperymentalną manipulację myszami wolnymi od zarazków w indywidualnych, hermetycznie zamkniętych, dodatnio ciśnieniowych klatkach izolacyjnych (izoklatkach), zmniejszając koszty i umożliwiając większą elastyczność w manipulacjach eksperymentalnych. 
Tutaj opisany jest protokół transferu myszy wolnych od zarazków z izolatorów hodowlanych do izoklatek, a następnie transferu kału z ludzkiego kału dawcy do myszy w celu stworzenia stabilnych, długoterminowych "humanizowanych" myszy jelitowych do przyszłych badań. Opisano materiały i przygotowanie potrzebne do użytkowania systemu isocage, w tym użycie sterylizatora chemicznego z dwutlenkiem chloru do czyszczenia klatek, materiałów eksploatacyjnych, sprzętu i środków ochrony osobistej. Omówiono metody potwierdzania statusu wolnych od zarazków przenoszonych myszy oraz sposoby określania zanieczyszczenia w systemie klatkowym. Dalej omówiono procedurę hodowli, w tym ściółkę, pożywienie i zaopatrzenie w wodę. Opisano protokół przygotowania ludzkiej gnojowicy kałowej i zgłębnika do myszy wolnych od zarazków w celu stworzenia "humanizowanych" myszy jelitowych, wraz z pobieraniem kału w celu monitorowania składu społeczności mikrobiologicznej tych myszy. Eksperyment pokazuje, że dwa tygodnie po przeszczepie kału u człowieka pozwala na stabilną kolonizację mikrobioty dawcy w mysich gospodarzach, umożliwiając późniejsze wykorzystanie eksperymentalne. Ponadto opisano gromadzenie humanizowanych odchodów myszy w pożywkach zachowujących żywotność, umożliwiających wykorzystanie w dalszych eksperymentach funkcjonalnych. Ogólnie rzecz biorąc, metody te pozwalają na bezpieczne i skuteczne tworzenie humanizowanych społeczności myszy w eksperymentalnych klatkach gnotobiotycznych w celu dalszej manipulacji.

Ludzkie próbki kału, połączone w grupy według fenotypu osób odpowiadających i nieodpowiadających na leczenie ICI (opisanego wcześniej w protokole), podano drogą gavage mieszanym płciowo myszom GF-WT, umieszczonym w 3 izoklatkach na grupę (n = 1-2 myszy/klatka, n = 6 dla osób odpowiadających i n = 5 dla osób nieodpowiadających). Myszy poddano aklimatyzacji przez 1 tydzień po transferze. Następnie zebrano próbki kału od tych myszy (w warunkach wolnych od drobnoustrojów). Następnie myszom podano drogą gavage 1 × 107</s...

Ten protokół opisuje najlepsze praktyki transferu myszy wolnych od zarazków do eksperymentalnych izolatorów jednoklatkowych (izoklatek) przy zachowaniu sterylnych warunków. Omówiono metody przeszczepu kału myszom wolnym od zarazków i pobierania żywych bakterii od tych "humanizowanych" myszy jelitowych w celu dalszych zastosowań.

Przygotowanie i utrzymanie eksperymentu z izododatnią klatką z wykluczeniem biologicznym do przeszczepu kału u myszy wolnych od zarazków

Germ-free mice are an important investigation tool for understanding the contribution of microorganisms in host health and disease, enabling assessment of ...

Badaliśmy interakcję między bakteriami a gospodarzem, a nasz wewnętrzny i zewnętrzny czynnik zmodyfikował tę relację, aby zmienić zdrowie. W szczególności jesteśmy zainteresowani zrozumieniem roli bakterii w rozwoju, progresji i leczeniu raka. My i inne laboratorium mikrobiomu wykorzystujemy system klatek ISO dodatnich do przenoszenia społeczności kałowej z człowieka do mysiego gospodarza biorcy, aby stworzyć stabilną i długoterminową społeczność mikrobiologiczną.Technologia ta umożliwiła nam dokonanie nowego odkrycia na temat roli istotnych bakterii klinicznych w zdrowiu i chorobie. Wiele prospektywnych badań klinicznych wykazało powiązania między określonymi drobnoustrojami a rozwojem, progresją i odpowiedzią na leczenie raka, ale korelacja nie oznacza związku przyczynowego. Humanizacja myszy wolnych od zarazków za pomocą próbek kału ludzkiego umożliwia walidację związku przyczynowego w odpowiednich modelach raka.Korzystając z systemu klatek ISO dodatnich, wykazaliśmy, że specyficzne szczepy Bacteroides od pacjentów z niedrobnokomórkowym rakiem płuc reagujących na immunoterapię u ludzi reagują na myszy. Na początek umieść 10 chusteczek w zbiorniku na sterylizujący dwutlenek chlor

preparation-maintenance-bioexclusion-isopositive-cage-experiment-for

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Ten film demonstruje metodę generowania podwójnie humanizowanej myszy BLT (szpik, wątroba i grasica) z funkcjonalnym ludzkim układem odpornościowym i stabilnym, wszczepionym ludzkim mikrobiomem jelitowym.

Generowanie podwójnie humanizowanego modelu myszy BLT (szpik kostny, wątroba, grasica)

Ten film pokazuje procedurę przeszczepu mikrobioty kałowej u myszy z niedoborem interleukiny-10 z zapaleniem jelita grubego. Skolonizowane drobnoustroje kałowe w jelitach uwalniają metabolity wtórne, wywołując uwalnianie cytokin przeciwzapalnych i zmniejszając stan zapalny jelita grubego.

Ocena skutków przeszczepu mikrobioty kałowej u myszy z niedoborem interleukiny-10

Rośnie zainteresowanie ilościową charakterystyką limfocytów jelitowych ze względu na coraz większą świadomość, że komórki te odgrywają kluczową rolę w różnych chorobach jelitowych i ogólnoustrojowych. W tym protokole opisujemy, jak izolować populacje pojedynczych komórek z różnych przedziałów jelita cienkiego w celu późniejszej charakterystyki cytometrii przepływowej.

Izolacja i charakterystyka cytometryczna mysich limfocytów jelita cienkiego

Opisujemy nowatorską metodę generowania podwójnie humanizowanych myszy BLT, które posiadają funkcjonalny ludzki układ odpornościowy i stabilny, wszczepiony ludzki mikrobiom jelitowy. Protokół ten może być stosowany bez konieczności stosowania myszy wolnych od zarazków lub urządzeń gnotobiotycznych.

Podwójnie humanizowany model myszy BLT ze stabilnym mikrobiomem jelitowym podobnym do ludzkiego i ludzkim układem odpornościowym

Interakcja genetycznej podatności, odporności błony śluzowej i mikroekologicznego środowiska jelitowego jest zaangażowana w patogenezę nieswoistego zapalenia jelit (IBD). W tym badaniu zastosowaliśmy przeszczep mikrobioty kałowej myszom z niedoborem IL-10 i zbadaliśmy jej wpływ na zapalenie okrężnicy i czynność serca.

Ocena terapeutyczna przeszczepu mikrobioty kałowej w mysim modelu z niedoborem interleukiny 10

Celem jest tutaj nakreślenie protokołu do badania mechanizmów dysbiozy w chorobach sercowo-naczyniowych. W artykule omówiono, jak aseptycznie pobierać i przeszczepiać próbki kału myszy, izolować jelita i stosować metodę "Swiss-roll", a następnie techniki barwienia immunologicznego w celu zbadania zmian w przewodzie pokarmowym.

Izolacja kału myszy i przeszczep mikrobioty

Tutaj opisujemy strukturę i procedury operacyjne, w tym środki powstrzymywania mikroorganizmów w obiekcie dla "dzikich myszy", używając próbki krwi do immunofenotypowania jako przykładu.

Procedury operacyjne i hermetyzacji biologicznej w obiekcie dla myszy laboratoryjnych z naturalnym mikrobiomem: procedura immunofenotypowania

Ten protokół szczegółowo opisuje montaż układów mini-bioreaktorów, które mają być wykorzystane do hodowli złożonego przepływu złożonych zbiorowisk kałowych w warunkach beztlenowych. Omówiono również metody montażu, inokulacji i pobierania próbek z reaktorów do dalszej analizy.

Montaż bioreaktora do ciągłej hodowli złożonych zbiorowisk kałowych

Protokół ten opisuje niezbędne kroki kolonizacji myszy z pks+ Escherichia coli w warunkach niezapalnych, a także nieinwazyjne metody walidacji kolonizacji i oceny ekspansji pks+ E. coli w kału.

Kolonizacja przez myszą pks+ Escherichia coli w warunkach niezapalnych

Badania nad boreliozą często wymagają uzyskania kleszczy zakażonych patogenem Borrelia burgdorferi, co jest procesem trwającym zazwyczaj kilka tygodni. W niniejszym materiale prezentujemy procedurę zakażania kleszczy metodą mikroiniekcji, którą można przeprowadzić w ciągu kilku godzin. Przedstawiamy również metodę immunofluorescencji do lokalizacji in situ B. burgdorferi wewnątrz kleszczy.

Metody szybkiego przenoszenia i lokalizacji patogenów choroby z Lyme w jelicie kleszcza

Poznaj metodę przeszczepu kału do myszy wolnych od zarazków w systemie izododatniej klatki. Technika ta umożliwia badanie roli mikrobiomu w rozwoju i terapii nowotworów.

Przygotowanie i utrzymanie eksperymentu z izododatnią klatką z wykluczeniem biologicznym do przeszczepu kału u myszy wolnych od zarazków (Wideo) | JoVE Journal

Przygotowanie i utrzymanie eksperymentu z izododatnią klatką z wykluczeniem biologicznym do przeszczepu kału u myszy wolnych od zarazków

Przeglądaj więcej filmów