Przygotowanie i utrzymanie eksperymentu z izododatnią klatką z wykluczeniem biologicznym do przeszczepu kału u myszy wolnych od zarazków

Badaliśmy interakcję między bakteriami a gospodarzem, a nasz wewnętrzny i zewnętrzny czynnik zmodyfikował tę relację, aby zmienić zdrowie. W szczególności jesteśmy zainteresowani zrozumieniem roli bakterii w rozwoju, progresji i leczeniu raka. My i inne laboratorium mikrobiomu wykorzystujemy system klatek ISO dodatnich do przenoszenia społeczności kałowej z człowieka do mysiego gospodarza biorcy, aby stworzyć stabilną i długoterminową społeczność mikrobiologiczną.

Technologia ta umożliwiła nam dokonanie nowego odkrycia na temat roli istotnych bakterii klinicznych w zdrowiu i chorobie. Wiele prospektywnych badań klinicznych wykazało powiązania między określonymi drobnoustrojami a rozwojem, progresją i odpowiedzią na leczenie raka, ale korelacja nie oznacza związku przyczynowego. Humanizacja myszy wolnych od zarazków za pomocą próbek kału ludzkiego umożliwia walidację związku przyczynowego w odpowiednich modelach raka.

Korzystając z systemu klatek ISO dodatnich, wykazaliśmy, że specyficzne szczepy Bacteroides od pacjentów z niedrobnokomórkowym rakiem płuc reagujących na immunoterapię u ludzi reagują na myszy. Na początek umieść 10 chusteczek w zbiorniku na sterylizujący dwutlenek chloru i upewnij się, że są w pełni namydlone. Następnie, za pomocą cylindra z podziałką, napełnij dużą plastikową torbę co najmniej 100 mililitrami środka sterylizującego z dwutlenku chloru.

Potrząśnij torbą, aby upewnić się, że wszystkie powierzchnie wewnętrzne są przemoczone i odłóż ją na bok. Wyjmij pojedynczą klatkę ISO ze stojaka i umieść ją w zbiorniku na sterylizujący dwutlenek chloru, zapewniając pełny kontakt z cieczą. Użyj nasączonych chusteczek do wyszorowania wszystkich powierzchni klatki.

Po namoczeniu klatki poproś asystenta, aby otworzył nasączoną plastikową torbę. Umieść klatkę w środku i natychmiast zamknij otwór. Za pomocą butelki z rozpylaczem spryskaj otwór worka środkiem sterylizującym z dwutlenku chloru.

Gdy wszystkie klatki i materiały eksploatacyjne zostaną zapakowane w worki, zanurz rękawice odporne na chemikalia w środku sterylizującym z dwutlenku chloru. W międzyczasie przenieś nasączone chusteczki do szafki bezpieczeństwa biologicznego i namocz wszystkie powierzchnie. W przypadku powierzchni niezabezpieczonych ściśnij na nich chusteczki bez ich dotykania.

Po 20 minutach, używając wysterylizowanych rękawic odpornych chemicznie, przenieś każdą klatkę i butelkę do wysterylizowanej szafki bezpieczeństwa biologicznego. Aby otworzyć hermetycznie zamkniętą klatkę ISO, podnieś białe zaczepy na dwóch zaciskach po bokach pokrywy i wyciągnij każdy zacisk na boki, aby odblokować pokrywę. Używając sterylnych kleszczy wewnątrz klatki na ruszcie, wyjmij pustą butelkę na wodę i umieść ją po wewnętrznej stronie pokrywki.

Zdejmij gumową uszczelkę i wlej wodę do butelki, aby ją napełnić. Za pomocą sterylnych kleszczyków umieść dyszę na butelce z wodą i mocno dociśnij, aby uszczelnić. Następnie za pomocą sterylnych kleszczy podnieś ruszt i przesuń go do tyłu o kilka cali, aby utworzyć otwór na dno klatki.

Oprzyj sterylne kleszcze na ruszcie, upewniając się, że uchwyty nie stykają się z powierzchniami klatki. Po otrzymaniu dysku transferowego poproś asystenta, aby przytrzymał i częściowo odwinął plastikową osłonę, tak aby nasączona powierzchnia była odsłonięta, ale nie dotykana. Zakładając rękawice odporne na chemikalia nasączone środkiem sterylizującym z dwutlenku chloru, wyjmij krążek transferowy z plastikowego opakowania i umieść go na płaskiej powierzchni wewnątrz wysterylizowanej szafki bezpieczeństwa biologicznego.

Aby otworzyć dysk transferowy, odklej taśmę uszczelniającą obwód dysku, a następnie zdejmij pokrywę. Następnie, używając sterylnych kleszczyków wcześniej spoczywających na ruszcie, manipuluj pokrywą komory, aby wyrównać otwór z myszą, która ma zostać przeniesiona. Za pomocą sterylnych kleszczyków chwyć podstawę ogona myszy przez otwór w pokrywie dysku transferowego, podnieś i przenieś mysz do klatki ISO przez otwór między rusztem a klatką.

Po przeniesieniu wszystkich myszy zastąp ruszt sterylnymi kleszkami. Podnieś pokrywę klatki i umieść ją z powrotem na klatce. Podnieś każdy clamp pokrywy klatki do góry i ostrożnie opuść go na boki klatki.

Dociśnij białe wypustki, aby bezpiecznie uszczelnić pokrywę klatki. Teraz poproś asystenta, aby spryskał każdą dyszę miejsca dokowania na stojaku klatki środkiem sterylizującym z dwutlenku chloru. Wyjmij klatkę z szafy bezpieczeństwa biologicznego i zadokuj ją na stojaku na klatkę.

Świt nowy sterylny fartuch chirurgiczny i sterylne rękawice chirurgiczne zamiast rękawic odpornych na chemikalia. Aby przygotować igły do zgłębnika, rozpakuj każdą torebkę sterylizacyjną i użyj wnętrza torebki jako suchej, sterylnej powierzchni spoczynkowej. Podłączyć igłębnik do strzykawki.

Otwórz rurkę na gnojowicę kałową i wlej 200 mikrolitrów gnojowicy do każdej strzykawki. Za pomocą kleszczy chwyć podstawę ogona myszy i umieść go na ruszcie. Delikatnie przytrzymuj mysz, pocierając luźną skórę za szyją.

Trzymając mysz w pionowej pozycji, włóż igłębkę i delikatnie wstrzyknij gnojowicę kałową. Po wstrzyknięciu należy natychmiast usunąć igłę. Umieść mysz bezpośrednio w jednym ze wysterylizowanych kubków w celu obserwacji.

Po tym, jak wszystkie myszy otrzymają zgłębnik, użyj kleszczy, aby przenieść każdą mysz z powrotem do łóżka w klatce. Humanizowana struktura społeczności kałowej myszy znacznie różniła się między fenotypami odpowiedzi we wszystkich trzech punktach czasowych. Myszy skolonizowane kałem nie wykazały różnicy w strukturze społeczności drobnoustrojów między pierwszym a drugim tygodniem oraz drugim a czwartym.

Podczas gdy myszy skolonizowane kałem bez odpowiedzi wykazywały inną strukturę społeczności drobnoustrojów między pierwszym a drugim tygodniem, ale podobną strukturę między drugim a czwartym tygodniem. Ludzkie inokulum dawcy wykazało zwiększoną reprezentację Blautia, Eubacterium, ruminococcus i streptococcus, podczas gdy myszy biorce miały zwiększoną względną liczebność bacteroides, Lachnoclostridium, Marvinbryantia i Parabecteroides.