Name: Regulacja chemogenetyczna w przeprogramowanych komórkach prekursorowych pochodzących z komórek macierzystych w leczeniu chorób neurodegeneracyjnych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-05-02T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 44 s
Description: Poznaj metodę chemogenetycznej regulacji komórek prekursorowych pochodzących z przeprogramowanych komórek macierzystych w leczeniu choroby Parkinsona u myszy. Technika ta umożliwia precyzyjną kontrolę aktywności neuronów i ocenę funkcjonalnej integracji przeszczepu.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez Pekińską Fundację Nauk Przyrodniczych (7242068), Narodową Fundację Nauk Przyrodniczych Chin (82171250), Fundusz Miejskiej Komisji Zdrowia w Pekinie (PXM2020_026283_000005) oraz Projekt Rozwoju Technologii Instytutów Badań Medycznych związanych z Pekinem (11000023T000002036310).

Wszystkie eksperymenty na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi określonymi przez Pekińskie Stowarzyszenie Badań nad Zwierzętami Laboratoryjnymi oraz Narodowe Instytuty Zdrowia ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Laboratoryjnych. Ludzkie komórki jednojądrzaste krwi obwodowej (PBMC) uzyskano od zdrowego dawcy za pisemną świadomą zgodą, jak opisano w poprzednim badaniu17.
1. Budowa niefuzyjnych linii komórkowych opartych na komórkach macierzystych DREADD
<ol>
	<li>Zbuduj plazmid dawcy DREADD. 
	UWAGA: Miejsca trawienia powinny być zaprojektowane zgodnie z sekwencją wektorów. Fragmenty powinny być syntetyzowane i amplifikowane z zakładkami 20-30 pz dopasowanymi do ramion fragmentów w celu zwiększenia wydajności montażu.
	<ol>
		<li>Zaprojektuj i zsyntetyzuj fragment T2A-ZsGreen (Fragment I).</li>
		<li>Amplifikować fragment hM3Dq / hM4Di-T2A z oryginalnego plazmidu za pomocą PCR (fragment II). Ustaw reakcję PCR (całkowita objętość 50 μl) tak, aby zawierała 1x bufor PCR, 200 μM każdej mieszaniny dNTP, 0,5 μM starterów do przodu i do tyłu, 10-50 ng matrycy plazmidowego DNA i 1,25 U polimerazy DNA o wysokiej wierności. Przeprowadzić termocykl w następujących warunkach: wstępna denaturacja w temperaturze 98 °C przez 2,75 minuty w celu pełnej denaturacji matrycy; 32 cykle amplifikacji, składające się z 98 °C przez 15 s (denaturacja), 60 °C przez 30 s (wyżarzanie startera) i 72 °C przez 60 s (przedłużenie); końcowe przedłużenie w temperaturze 72 °C przez 7 min.</li>
		<li>Strawić plazmid wektorowy odpowiednim enzymem, aby uzyskać wektor zlinearyzowany. Oczyścić wszystkie fragmenty za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym i oznaczyć je ilościowo za pomocą spektrofotometru. 
		UWAGA: Tutaj oryginalny plazmid został strawiony za pomocą MluI i SalI.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Delikatnie wymieszaj 50-100 ng zlinearyzowanego wektora, Fragmentu I i Fragmentu II w stosunku molowym 1:3:3, wraz z 2x Mieszanką Klonowania. Inkubować mieszaninę w temperaturze 55 °C przez 1 godzinę, aby ułatwić rekombinację homologiczną za pomocą zespołu Gibsona.</li>
	<li>Wstaw przewodnik RNA ukierunkowany na miejsce AAVS1 do miejsca BbsI wektora pX458. 
	UWAGA: Przeprowadź weryfikację sekwencji na wszystkich skonstruowanych plazmidach za pomocą sekwencjonowania Sangera.</li>
	<li>Utrzymuj przeprogramowane komórki macierzyste w pożywce, dążąc do gęstości komórek 2-5 × 106 komórek/ml. 
	UWAGA: Przeprogramowane komórki macierzyste użyte tutaj zostały wyindukowane z ludzkich PBMC, jak opisano w poprzednim badaniu17. Monitorowanie stanu ogniw jest niezbędne, ponieważ stan ogniw znacząco wpływa na wydajność elektroporacji. Zobacz tabelę materiałów, aby zapoznać się z porównaniem nośników.</li>
	<li>Wymieszaj 2-5 × 106 komórek, po 2 μg każdego plazmidu dawcy (hM4Di-T2A-ZsGreen lub hM3Dq-T2A-ZsGreen) i 2 μg plazmidu gRNA w 100 μl buforu do elektroporacji i przenieś do kuwety w celu elektroporacji. 
	UWAGA: Upewnij się, że mieszanina jest dobrze wymieszana i wolna od pęcherzyków przed przystąpieniem do elektroporacji. Zoptymalizuj parametry elektroporacji w zależności od typu ogniwa, aby zmaksymalizować wydajność transfekcji, ponieważ różne urządzenia mogą wymagać określonych regulacji.</li>
	<li>Ustaw Nucleofector na program B16 i zainicjuj elektroporację, aby ułatwić wydajną transfekcję docelowych iNSC.</li>
	<li>Dodać 1 ml 50 μg/ml poli-D-lizyny (PDL) do każdego dołka na 6-dołkowej płytce i inkubować w temperaturze pokojowej przez co najmniej 2 godziny. Usunąć cały PDL z dołków i dodać 1,5 ml lamininy o stężeniu 5 μg/ml do każdego dołka i inkubować w temperaturze 37 °C przez 2-4 godziny. Pokrytą płytkę należy natychmiast użyć lub przechowywać w temperaturze 2-8 °C przez 1 tydzień.</li>
	<li>Przenieś elektroporowane ogniwa na sześciodołkowe płytki, które zostały pokryte PDL i lamininą. Rozprowadź około 500 000 komórek na studzienkę w objętości 2 ml pożywki hodowlanej na studzienkę.</li>
	<li>Po 72 godzinach elektroporacji użyj cytometru przepływowego, aby posortować fluorescencyjne komórki dodatnie.
	<ol>
		<li>Ponownie zawiesić zdysocjowane komórki w DPBS i przefiltrować przez sitko komórkowe o wielkości 70 μm.</li>
		<li>Skonfiguruj sorter z kanałem FITC do wykrywania ZsGreen. Włączyć niepoddane działaniu iNSC jako kontrole ujemne w celu określenia fluorescencji wyjściowej.</li>
		<li>Skalibruj przyrząd za pomocą dysz 100 μm przy ciśnieniu w osłonie 20 psi. Zaimplementuj czterokierunkowy tryb sortowania czystości z potwierdzeniem pojedynczej komórki.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Umieść pojedyncze komórki ZsGreen+ na 96-dołkowych płytkach wstępnie pokrytych PDL i lamininą, a następnie dodaj 200 μl pożywki hodowlanej na basenik, aby wspomóc początkowy wzrost. Przechowywać w pożywce hodowlanej przez 7-14 dni 
	UWAGA: Codziennie monitoruj studzienki pod kątem oznak wzrostu i fluorescencji wskazujących na udaną integrację i oznaczaj studzienkę dodatnią.</li>
	<li>Wyizolować pojedyncze klony wykazujące fluorescencję za pomocą odwróconego mikroskopu fluorescencyjnego wyposażonego w zestaw filtrów GFP. Klony ekranu przy 10-krotnym powiększeniu. Oznacz studzienki zawierające kolonie monoklonalne trwałym, jednolitym sygnałem ZsGreen. Rejestruj obrazy jasnego pola i fluorescencji, aby udokumentować morfologię i intensywność fluorescencji. 
	UWAGA: Przed obrazowaniem wymień świeże podłoże, aby zmniejszyć fluorescencję tła. Wyklucz kolonie o nieregularnej morfologii lub autofluorescencji.</li>
	<li>Rozpręż komórki dodatnie na powlekanych płytkach 48-dołkowych. Następnie podziel na dwie części, jedną dla hodowli, a drugą dla genotypowania.</li>
	<li>Ekstrakcja genomowego DNA z potencjalnych klonów. Przygotuj reakcje PCR z dwiema parami starterów: jedną parą w celu potwierdzenia insercji genu będącego przedmiotem zainteresowania, drugą starterem w celu rozróżnienia klonów homozygotycznych i heterozygotycznych. Przeprowadzić cykl termiczny w następujących warunkach: wstępna denaturacja w temperaturze 95 °C przez 5 min; 38 cykli w temperaturze 95 °C przez 30 s, 60 °C przez 30 s i 72 °C przez 45 s; końcowe przedłużenie w temperaturze 72 °C przez 7 min. Rozwiąż produkty PCR na 2% żelu agarozowym. 
	UWAGA: Zobacz tabelę materiałów, aby zapoznać się z podkładami. Potwierdź insercję interesującego genu za pomocą pojedynczego pasma 650 pz (starter 1). Zidentyfikuj heterozygotyczne klony na podstawie obecności pojedynczego prążka 630 pz, a klony homozygotyczne na podstawie braku tego pasma (starter 2).</li>
	<li>Rozpręż dodatnie komórki na powlekanych płytkach sześciodołkowych.</li>
	<li>Roztrawić komórki i umyć je w roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) przez odwirowanie w stężeniu 250 × g przez 3 minuty. Zamrażać komórki w pożywce do kriokonserwacji z 10% DMSO o gęstości 2,5 × 106 komórek w fiolce.</li>
</ol>
2. Przeszczepiono komórki prekursorowe pochodzące z komórek macierzystych DREADD do myszy modelowych PD
<ol>
	<li>Podać dootrzewnowe wstrzyknięcie dezypraminy w stężeniu 5 mg/ml (10 mg/kg) myszom z niedoborem odporności 30 minut przed zabiegiem. Znieczulić myszy 2% izofluranem.</li>
	<li>Przeprowadzić jednostronne stereotaktyczne wstrzyknięcia 3 μl 6-hydroksydopaminy (6-OHDA, 5 μg/μL). Celuj w prawe ciało prążkowia przy użyciu następujących współrzędnych: przednio-tylny = 0,5 mm, boczny = 2,1 mm i pionowy = -3,2 mm. 
	UWAGA: 6-OHDA należy rozpuścić w roztworze soli fizjologicznej zawierającym 0,2% kwasu askorbinowego. Zapewnij precyzyjne ukierunkowanie, aby zminimalizować zmienność nasilenia zmian. 
	UWAGA: 6-OHDA jest cytotoksyczny i wytwarza reaktywne formy tlenu, które indukują stres komórkowy. Obchodź się ostrożnie.</li>
	<li>Podać dootrzewnowe wstrzyknięcie apomorfiny (1 mg/kg, 0,5 mg/ml rozpuszczonej w soli fizjologicznej) w celu potwierdzenia zmian 4 tygodnie po operacji. Wybierz myszy z uszkodzeniami, które wykazują ponad 100 przeciwległych obrotów w ciągu 30-minutowego okresu obserwacji, do kolejnych eksperymentów. 
	UWAGA: Apomorfina jest agonistą receptora dopaminowego, który bezpośrednio aktywuje superwrażliwe receptory postsynaptyczne w odnerwionym prążkowiu, zaburzając równowagę obustronnej aktywności obwodu nigrostriatalnego. Rotacja indukowana apomorfiną służy do oceny nasilenia jednostronnych zmian dopaminergicznych przez 6-OHDA.</li>
	<li>Komórki nasienne i hodowlane w powlekanych płytkach sześciodołkowych (150 000 komórek na dołek). Inkubować w pożywce różnicującej fazy 1 przez 10 dni, odświeżając pożywkę co 2 dni. W dniu 11 należy przejść na pożywkę różnicującą fazy 2 i kontynuować inkubację do dnia 13, zmieniając pożywkę każdego dnia. 
	UWAGA: Patrz Tabela materiałów w celu porównania podłoża różnicującego.</li>
	<li>Zbierz komórki w 10 i 13 dniu różnicowania, a następnie wymieszaj je w stosunku 1:7. Zawiesić mieszaninę w buforze do przeszczepu w stężeniu 100 000 komórek/μL. 
	UWAGA: Patrz Tabela materiałów w celu porównania bufora do przeszczepów.</li>
	<li>Podać stereotaktyczne wstrzyknięcie całkowitej objętości 4 μl przygotowanej zawiesiny komórkowej do myszy z chorobą Parkinsona.</li>
	<li>Wykonaj test cylindryczny w różnych punktach czasowych po przeszczepie komórek. Umieść szklaną zlewkę (średnica: 20 cm, wysokość: 30 cm) na płaskiej, nieodbijającej światła powierzchni. Umieść kamerę z widokiem z góry nad cylindrem, aby uchwycić pełną średnicę. 
	UWAGA: Owiń cylinder czarnymi zasłonami, aby wyeliminować zewnętrzne bodźce wzrokowe.</li>
	<li>Umieść każdą mysz na środku cylindra i rozpocznij jednoczesne nagrywanie wideo (3 min/sesję). Po zakończeniu sesji umieść mysz z powrotem w klatce domowej. 
	UWAGA: Zaaklimatyzuj myszy w pomieszczeniu testowym przez 30 minut w warunkach oświetleniowych. Wyczyść cylinder 70% etanolem między próbami, aby wyeliminować sygnały węchowe.</li>
	<li>Oceń zdolność ruchową kończyn górnych myszy przez 3 minuty. Oblicz liczbę kontaktów ze ścianą wykonanych przez upośledzoną kończynę przednią w stosunku do całkowitej liczby kontaktów wykonanych przez obie kończyny przednie.</li>
	<li>Podawać sól fizjologiczną lub CNO w dawce 1,2 mg/kg mc. we wstrzyknięciu dootrzewnowym. Przeprowadź test cylindra, aby ocenić modulację behawioralną w modelu myszy PD po podaniu CNO 
	UWAGA: Przed przystąpieniem do oceny należy odczekać około 40 minut na regenerację.</li>
</ol>
3. Profilowanie elektrofizjologiczne in vivo komórek modulowanych chemicznie
<ol>
	<li>Znieczulić myszy przez dootrzewnowe wstrzyknięcie 250 mg/kg pentobarbitalu. Usuń mózg i natychmiast umieść go w lodowatym sztucznym płynie mózgowo-rdzeniowym na bazie sacharozy (s-ACSF), aby zachować integralność komórkową. Za pomocą wibratomu pokrój mózg na sekcje o grubości 300-400 μm. 
	UWAGA: Pracuj szybko, aby utrzymać mózg w niskich temperaturach, aby zachować funkcje komórkowe. Patrz tabela materiałów dla s-ACSF stosowanego w preparowaniu świeżych wycinków mózgu.</li>
	<li>Przenieść próbki do komory wypełnionej ACSF o zrównoważonym stężeniu 95%O2 i 5% CO2 w temperaturze 34 °C, upewniając się, że ta temperatura jest utrzymywana przez cały czas trwania doświadczenia. 
	UWAGA: Patrz tabela materiałów dla ACSF.</li>
	<li>Załaduj szklane pipety lodowatym roztworem wewnątrzkomórkowym, o rezystancji elektrod w zakresie od 7 do 10 MΩ, 
	UWAGA: Zobacz tabelę materiałów dla roztworu wewnątrzkomórkowego. Pipety szklane są wykonane ze szklanych kapilar za pomocą ściągacza do mikropipet18. Przed rozpoczęciem eksperymentów sprawdź, czy szklane pipety nie przeciekają, upewniając się, że końcówki są wystarczająco ostre, aby przeniknąć przez błonę komórkową. Szybko przygotuj pipety, aby zminimalizować wahania temperatury w roztworze wewnątrzkomórkowym.</li>
	<li>Umieścić plastry w zanurzonej komorze rejestracyjnej przekrwione (2 ml/min) natlenionym ACSF w temperaturze 34 °C. Umieścić pipety za pomocą mikromanipulatorów z napędem silnikowym pod mikroskopią kontrastową z różnicowymi zakłóceniami w podczerwieni. Ustal konfigurację całej komórki, stosując delikatne ssanie (opór > 1 GΩ) do połatanych neuronów w regionach przeszczepu. Ogniwa cęgowe przy napięciu -70 mV za pomocą wzmacniacza krosowego; nabierz podstawowe sEPSC przez 8 minut przy częstotliwości próbkowania 10 kHz (filtrowane przy 2 kHz) i stale monitoruj rezystancję dostępu (cel: <20 MΩ; odrzucić, jeśli >25 MΩ lub wahania >10%). 
	UWAGA: Podczas ssania należy stosować odpowiedni nacisk, aby uniknąć niepożądanego przemieszczenia lub pęknięcia komórek, a następnie ostrożnie wyregulować pozycję pipety, aby uzyskać dobre uszczelnienie. Jeśli jakość zgrzewu jest niska, wyrzuć pipetę i spróbuj ponownie.</li>
	<li>Dodać 50 μM CNO do komory rejestracyjnej natychmiast po zakończeniu pomiaru podstawowego i kontynuować rejestrację danych przez dodatkowe 16 minut, obserwując zmiany częstotliwości lub amplitudy sEPSC.</li>
	<li>Przeprowadzić procedurę wymłukiwania, zastępując roztwór CNO świeżym ACSF, aby skutecznie usunąć CNO z komory rejestracyjnej. Kontynuuj rejestrowanie danych przez pozostałą część eksperymentu, aby ocenić ewentualne odzyskanie aktywności synaptycznej.</li>
</ol>

<ol><li>Thiel, G. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aThiel%2C+G+%22Designer+receptors+exclusively+activated+by+designer+drugs%22">Designer receptors exclusively activated by designer drugs</a>. , Humana Press. (2015).</li>
<li>Roth, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dreadds+for+neuroscientists%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Dreadds for neuroscientists.</a> Neuron. 89 (4), 683-694 (2016).</li>
<li>Gomez, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemogenetics+revealed%3A+DREADD+occupancy+and+activation+via+converted+clozapine%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Chemogenetics revealed: DREADD occupancy and activation via converted clozapine.</a> Science. 357 (6350), 503-507 (2017).</li>
<li>Chehelgerdi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploring+the+promising+potential+of+induced+pluripotent+stem+cells+in+cancer+research+and+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cancer%22%5BJournal%5D)">Exploring the promising potential of induced pluripotent stem cells in cancer research and therapy.</a> Mol Cancer. 22 (1), 189(2023).</li>
<li>Song, J., Patel, R. V., Sharif, M., Ashokan, A., Michaelides, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemogenetics+as+a+neuromodulatory+approach+to+treating+neuropsychiatric+diseases+and+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Chemogenetics as a neuromodulatory approach to treating neuropsychiatric diseases and disorders.</a> Mol Ther. 30 (3), 990-1005 (2022).</li>
<li>Parmar, M., Grealish, S., Henchcliffe, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+future+of+stem+cell+therapies+for+Parkinson+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The future of stem cell therapies for Parkinson disease.</a> Nat Rev Neurosci. 21 (2), 103-115 (2020).</li>
<li>Dell'anno, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Remote+control+of+induced+dopaminergic+neurons+in+Parkinsonian+rats%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Remote control of induced dopaminergic neurons in Parkinsonian rats.</a> J Clin Invest. 124 (7), 3215-3229 (2014).</li>
<li>Chen, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+control+of+grafted+human+PSC-derived+neurons+in+a+mouse+model+of+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Chemical control of grafted human PSC-derived neurons in a mouse model of Parkinson's disease.</a> Cell Stem Cell. 18 (6), 817-826 (2016).</li>
<li>Bjorklund, A., Parmar, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dopamine+cell+therapy%3A+From+cell+replacement+to+circuitry+repair%5BTitle%5D)+AND+%22J+Parkinsons+Dis%22%5BJournal%5D)">Dopamine cell therapy: From cell replacement to circuitry repair.</a> J Parkinsons Dis. 11 (S2), S159-S165 (2021).</li>
<li>Alcacer, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemogenetic+stimulation+of+striatal+projection+neurons+modulates+responses+to+Parkinson%27s+disease+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Chemogenetic stimulation of striatal projection neurons modulates responses to Parkinson's disease therapy.</a> J Clin Invest. 127 (2), 720-734 (2017).</li>
<li>Alexander, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Remote+control+of+neuronal+activity+in+transgenic+mice+expressing+evolved+G+protein-coupled+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Remote control of neuronal activity in transgenic mice expressing evolved G protein-coupled receptors.</a> Neuron. 63 (1), 27-39 (2009).</li>
<li>Stachniak, T. J., Ghosh, A., Sternson, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemogenetic+synaptic+silencing+of+neural+circuits+localizes+a+hypothalamus+midbrain+pathway+for+feeding+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Chemogenetic synaptic silencing of neural circuits localizes a hypothalamus midbrain pathway for feeding behavior.</a> Neuron. 82 (4), 797-808 (2014).</li>
<li>Kang, H. J., Minamimoto, T., Wess, J., Roth, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemogenetics+for+cell-type-specific+modulation+of+signalling+and+neuronal+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Methods+Primers%22%5BJournal%5D)">Chemogenetics for cell-type-specific modulation of signalling and neuronal activity.</a> Nat Rev Methods Primers. 3 (1), 93(2023).</li>
<li>Miyanishi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Behavioral+tests+predicting+striatal+dopamine+level+in+a+rat+hemi-Parkinson%27s+disease+model%5BTitle%5D)+AND+%22Neurochem+Int%22%5BJournal%5D)">Behavioral tests predicting striatal dopamine level in a rat hemi-Parkinson's disease model.</a> Neurochem Int. 122, 38-46 (2019).</li>
<li>Zheng, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+IPSC-derived+midbrain+organoids+functionally+integrate+into+striatum+circuits+and+restore+motor+function+in+a+mouse+model+of+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Theranostics%22%5BJournal%5D)">Human IPSC-derived midbrain organoids functionally integrate into striatum circuits and restore motor function in a mouse model of Parkinson's disease.</a> Theranostics. 13 (8), 2673-2692 (2023).</li>
<li>Xiong, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+stem+cell-derived+neurons+repair+circuits+and+restore+neural+function%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Human stem cell-derived neurons repair circuits and restore neural function.</a> Cell Stem Cell. 28 (1), 112-126.e6 (2021).</li>
<li>Yuan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dopaminergic+precursors+differentiated+from+human+blood-derived+induced+neural+stem+cells+improve+symptoms+of+a+mouse+Parkinson%27s+disease+model%5BTitle%5D)+AND+%22Theranostics%22%5BJournal%5D)">Dopaminergic precursors differentiated from human blood-derived induced neural stem cells improve symptoms of a mouse Parkinson's disease model.</a> Theranostics. 8 (17), 4679(2018).</li>
<li>Zhu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+acute+spinal+cord+slices+for+whole-cell+patch-clamp+recording+in+substantia+gelatinosa+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Preparation of acute spinal cord slices for whole-cell patch-clamp recording in substantia gelatinosa neurons.</a> J Vis Exp. (143), (2019).</li>
<li>Wang, X., Han, D., Zheng, T., Ma, J., Chen, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+human+induced+neural+stem+cell-derived+dopaminergic+neurons+by+DREADD+reveals+therapeutic+effects+on+a+mouse+model+of+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Res+Ther%22%5BJournal%5D)">Modulation of human induced neural stem cell-derived dopaminergic neurons by DREADD reveals therapeutic effects on a mouse model of Parkinson's disease.</a> Stem Cell Res Ther. 15 (1), 297(2024).</li>
<li>Iancu, R., Mohapel, P., Brundin, P., Paul, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Behavioral+characterization+of+a+unilateral+6-OHDA-lesion+model+of+Parkinson%27s+disease+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Behav+Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Behavioral characterization of a unilateral 6-OHDA-lesion model of Parkinson's disease in mice.</a> Behav Brain Res. 162 (1), 1-10 (2005).</li>
<li>Surmeier, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+dopamine+in+modulating+the+structure+and+function+of+striatal+circuits%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Brain+Res%22%5BJournal%5D)">The role of dopamine in modulating the structure and function of striatal circuits.</a> Prog Brain Res. 183, 148-167 (2010).</li>
</ol>

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

W protokole tym wykorzystano technologię CRISPR do inżynierii ludzkich przeprogramowanych komórek macierzystych w celu ekspresji pobudzających receptorów hM3Dq i hamujących hM4Di. Modulację aktywności neuronalnej za pomocą CNO oceniano poprzez przeszczep komórek do mysich modeli choroby Parkinsona, którym towarzyszyły oceny behawioralne i zapisy elektrofizjologiczne.
Pierwszym krytycznym krokiem w generowaniu stabilnie eksprymowanych, niefuzyjnych konstruktów DREADD w chemogenicznie przeprogra...

Receptory projektanta aktywowane wyłącznie przez (DREADD) to zmodyfikowane receptory sprzężone z białkiem G, które mogą być selektywnie aktywowane przez obojętne syntetyczne ligandy1. Podejście chemogenetyczne stało się podstawowym narzędziem w neurobiologii, umożliwiając naukowcom badanie połączeń obwodów neuronowych z dużą precyzją i zwiększając nasze zrozumienie funkcji komórkowych zarówno in vivo, jak i in vitro poprzez selektywną aktywację lub hamowanie określonych regionów mózgu lub typów komórek2,3.
Terapia oparta na komórkach macierzystych stanowi obiecującą strategię leczenia chorób neurodegeneracyjnych. Skuteczność przeszczepionych komórek zależy od prawidłowej integracji, przeżycia i funkcjonalnego wkładu w tkanki gospodarza. Niekontrolowana aktywność komórkowa może prowadzić do negatywnych konsekwencji, w tym nowotworzenia4; co wymaga precyzyjnej kontroli tych komórek po przeszczepie. Wykorzystanie technologii DREADD w ludzkich przeprogramowanych komórkach macierzystych i pochodnych neuronach zapewnia środki do precyzyjnej kontroli aktywności neuronalnej poprzez podawanie CNO2,5. W kontekście choroby Parkinsona (PD), która charakteryzuje się utratą neuronów dopaminergicznych, manipulowanie aktywnością neuronów dopaminergicznych pochodzących z komórek macierzystych ma kluczowe znaczenie dla badania ich danych synaptycznych i wzorców projekcji w modelach gryzoni6,7,8,9,10. Włączenie pobudzających receptorów hM3Dq i hamujących hM4Di do tych modeli umożliwia precyzyjną modulację aktywności neuronalnej11,12.
Połączenie ocen behawioralnych zwierząt i zapisów elektrofizjologicznych pozwala na kompleksową ocenę wpływu modulacji chemogenetycznej na przeszczepione komórki in vivo13. Oceny behawioralne, w tym rotacja wywołana apomorfiną, test cylindra i test rotarod, oceniają koordynację ruchową i dostarczają wglądu w zmiany w funkcjach motorycznych związane z eksperymentalnymi modelami PD14. Techniki elektrofizjologiczne, takie jak zapisy patch-clamp, umożliwiają monitorowanie w czasie rzeczywistym odpowiedzi synaptycznych i potencjałów czynnościowych, zapewniając kompleksowy wgląd w to, jak przeszczepione komórki integrują się z istniejącymi sieciami neuronowymi15. Łącząc oceny behawioralne z ocenami elektrofizjologicznymi, możemy zbadać, w jaki sposób modulacja chemogenetyczna wpływa na integrację i funkcjonalność tych komórek w obwodach nerwowych gospodarza16. Wstępne wyniki sugerują, że podawanie CNO skutecznie moduluje aktywność neuronalną w przeszczepionych komórkach, co skutkuje lepszymi wynikami funkcjonalnymi w modelach zwierzęcych.
W tym protokole, ludzkie przeprogramowane komórki macierzyste zostały zaprojektowane tak, aby wyrażały receptory hM3Dq lub hM4Di za pomocą technologii CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeats). Po różnicowaniu zmodyfikowanych, przeprogramowanych komórek macierzystych w dopaminergiczne komórki prekursorowe śródmózgowia, komórki te przeszczepiono do mysich modeli PD w celu oceny ich integracji i regulacji funkcjonalnej w obwodach nerwowych gospodarza przy użyciu ocen behawioralnych i zapisów elektrofizjologicznych.

<table><tbody><tr><td>2 x Rapid Taq Master Mix</td><td>Vazyme</td><td>P222-01</td><td>używany do analizy genotypowania</td></tr><tr><td>2 razy; Bezproblemowa mieszanka klonowania Biomed</td><td>Gene Tech.</td><td>CL117-01</td><td>używany do budowy plazmidu</td></tr><tr><td>6-OHDA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4381</td><td>używany do ustanawiania modelu myszy PD</td></tr><tr><td>AAVS1-Pur-CAG-EGFP</td><td>Addgene</td><td>80945</td><td>używany jako kontrola&nbsp;</td></tr><tr><td>AAVS1-Pur-CAG-hM4Di-mCherry</td><td>Addgene</td><td>80947</td><td>oryginalny plazmid do budowy hM4Di-T2A-ZsGreen</td></tr><tr><td>AAVS1-Pur-CAG-hM3Dq-mCherry</td><td>Addgene</td><td>80948</td><td>oryginalny plazmid do budowy hM3Dq-T2A-ZsGreen</td></tr><tr><td>AAVS1-CAG-hM4Di-T2A-ZsGreen</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Skonstruowany plazmid dawcy oparty na #80947</td></tr><tr><td>AAVS1-CAG-hM3Dq-T2A-ZsGreen</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Skonstruowany plazmid dawcy na podstawie #80948</td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Invitrogen</td><td>A11105-01</td><td>Używany do trawienia komórek</td></tr><tr><td>AMAXA Nucleofector</td><td>Lonza</td><td>AAD-1001S</td><td></td></tr><tr><td>Apomorfina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4393</td><td></td></tr><tr><td>Sztuczny płyn mózgowo-rdzeniowy (ACSF)</td> <td>Nie</td> dotyczy <td>Nie</td> <td>dotyczy125 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 2 mM CaCl2, 1,25 mM NaH2PO4, 1 mM MgSO4, 25 mM glukozy, i&nbsp; 26 mM Kwas NaHCO3</td></tr><tr><td>Askorbinowy Kwas</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1043003</td><td></td></tr><tr><td>B-27 Suplement</td><td>Gibco</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>BDNF</td><td>Peprotech</td><td>450-02</td><td></td></tr><tr><td>cAMP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D0627</td><td></td></tr><tr><td>CHIR99021</td><td>Yeasen</td><td>53003ES10</td><td></td></tr><tr><td>N-tlenek klozapiny</td><td>Enzo</td><td>BML-NS105</td><td></td></tr><tr><td>DAPT</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5942</td><td></td></tr><tr><td>Dezypramina&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D3900</td><td></td></tr><tr><td>D-glukoza</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5767</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Gibco</td><td>11330-032</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Gibco</td><td>11320-033</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>FGF8</td><td>Peprotech</td><td>100-25</td><td></td></tr><tr><td>GDNF</td><td>Peprotech</td><td>450-10</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMax</td><td>Gibco</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>Motek' s Zrównoważony roztwór soli (HBSS)</td><td>Gibco</td><td>14175095</td><td></td></tr><tr><td>Czynnik hamujący białaczkę ludzką (hrLIF)</td><td>Milipory</td><td>LIF1010</td><td></td></tr><tr><td>Mrożony płyn wewnątrzkomórkowy</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>130 mM K-glukonian, 16 mM KCl, 0,2 mM EGTA, 2 mM MgCl2, 10 mM HEPES, 4 mM Na2-ATP, 0,4 mM Na3-GTP, 0,3% neurobiotyny</td></tr><tr><td>KnockOut Serum Replacement</td><td>Gibco</td><td>10828028</td><td></td></tr><tr><td>Laminin</td><td>Roche</td><td>11243217001</td><td></td></tr><tr><td>Ściągacz do mikropipet</td><td>Sutter Instrument Company</td><td>P-1000</td><td></td></tr><tr><td>N-2 Suplement</td><td>Thermo Fisher</td><td>17502048</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal-A Medium</td><td>Gibco</td><td>10888-022</td><td></td></tr><tr><td>Aminokwasy endogenne kwasy (NEAA)</td><td>Gibco</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Pakiet oprogramowania Gibco</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>pCLAMP 11</td><td>Urządzenia molekularne</td><td>Nie dotyczy</td><td>Oprogramowanie do akwizycji i analizy danych elektrofizjologicznych z zaciskiem krosowym</td></tr><tr><td>Faza 1 pożywka</td><td>różnicująca N/A</td><td>N/A</td><td>96% DMEM/F12 (Gibco, 11320-033), 1% suplement B-27, 1% suplement N-2, 1% NEAA, 1% GlutaMax, 1 &mikro; M SAG1 i 100 ng/ml FGF8&nbsp;</td></tr><tr><td>Faza 2 różnicowanie pożywki&nbsp;</td><td>Nie dotyczy</td><td></td><td>nie dotyczy 96% DMEM/F12 (Gibco, 11320-033), 1% suplement B-27, 1% suplement N-2, 1% NEAA i 1% GlutaMax, 10 ng/ml BDNF, 10 ng/ml GDNF, 1 ng/mL TGF-&beta; III, 10 i mikro; M DAPT, 0,2 mM kwas askorbinowy i 0,5 mM cAMP.</td></tr><tr><td>Bromowodorek poli-D-lizyny (PDL)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7886</td><td></td></tr><tr><td>Startery do genotypowania</td><td>Nie</td><td>dotyczy</td><td>Insercja Dla Ciebie: TCTTCACTCGCTGGGTTCCCTT; Odwrotny odwrót wstawiania: CCTGTGGGAGGAAGAGAAGAGGT; homozygotyczność Foward: CGTCTCCCTGGCTTTAGCCA; Odwrotność homozygotyczności: GATCCTCTCTGGCTCTCCATCG</td></tr><tr><td>pX458</td><td>Addgene</td><td>152199</td><td></td></tr><tr><td>SAG1</td><td>Enzo</td><td>ALX-270-426-M01</td><td></td></tr><tr><td>SB431542</td><td>Yeasen</td><td>53004ES50</td><td></td></tr><tr><td>sztuczny płyn mózgowo-rdzeniowy na bazie sacharozy (s-ACSF)</td><td></td><td></td><td>234 mM sacharoza, 2,5 mM KCl, 26 mM NaHCO3, 1,25 mM NaH2PO4, 11 mM Dglukoza, 0,5 mM CaCl2 i 10 mM Hodowla</td></tr><tr><td>komórek macierzystych Media</td><td>Nie dotyczy</td><td>Nie dotyczy</td><td>&nbsp; 48% DMEM/F12 (Gibco, 11330-032) i 48% Neurobasal, z dodatkiem 1% B27, 1% N2, 1% NEAA, 1% GlutaMax, 10 ng/mL hrLIF, 2 &mikro; M SB431542 oraz 3 i mikro; M CHIR99021</td></tr><tr><td>TGF-&beta; III</td><td>Peprotech</td><td>100-36E</td><td></td></tr><tr><td>Bufor transplantacyjny</td><td>N/A N</td><td>/A</td><td>Bufor HBSS z 5 g/L D-glukozy, 100 ng/ml BDNF, 100 ng/mL GDNF i 0,2 mM</td></tr><tr><td>wibratome</td> kwasu askorbinowego <td>Leica&nbsp;</td><td>VT1000 S</td><td></td></tr><tr><td>Urządzenia molekularne</td> <td>do zacisków krosowych na całe komórki</td><td>&nbsp; Zacisk MultiClamp700B</td><td></td></tr></tbody></table>

regulacja chemogenetyczna w przeprogramowanych komórkach prekursorowych pochodzących z komórek macierzystych w leczeniu chorób neurodegeneracyjnych

Chemogenetic Regulation in Reprogrammed Stem Cell-derived Precursor Cells in Treating Neurodegenerative Diseases

Integracja receptorów projektanta aktywowanych wyłącznie przez (DREADD) z terapiami opartymi na komórkach macierzystych przedstawia zaawansowaną strategię precyzyjnej modulacji neuronów. W tym przypadku wykorzystaliśmy zmodyfikowane przez CRISPR ludzkie przeprogramowane komórki macierzyste eksprymujące pobudzające (hM3Dq) lub hamujące (hM4Di) receptory DREADD, aby ocenić funkcjonalną integrację i modulację przeszczepionych prekursorów dopaminergicznych w mysim modelu choroby Parkinsona (PD). Kluczowe kroki obejmowały wygenerowanie niefuzyjnych linii komórek macierzystych z ekspresją DREADD, różnicowanie ich w prekursory dopaminergiczne śródmózgowia i przeszczepienie tych komórek do prążkowia myszy z uszkodzeniem 6-hydroksydopaminą (6-OHDA). Przeprowadziliśmy oceny behawioralne i zapisy elektrofizjologiczne, aby przeanalizować efekty przeszczepionych komórek. Testy behawioralne, takie jak test cylindryczny, wykazały znaczną modulację funkcji motorycznych po podaniu N-tlenku klozapiny (CNO). W szczególności aktywacja hM4Di zmniejszyła przeciwległy ruch kończyn przednich, podczas gdy aktywacja hM3Dq wiązała się ze zwiększonym zachowaniem motorycznym. Zapisy elektrofizjologiczne ujawniły wyraźne reakcje synaptyczne. Aktywacja hM4Di zwiększała interwały międzyzdarowe i zmniejszała amplitudy szczytowe spontanicznych pobudzających prądów postsynaptycznych (sEPSC), podczas gdy aktywacja hM3Dq zmniejszała interwały międzyzdarciowe i zwiększała amplitudy pików, odzwierciedlając wzmocnioną sygnalizację pobudzającą. Podsumowując, integracja ocen behawioralnych i elektrofizjologicznych potwierdza precyzyjną funkcjonalną inkorporację zmodyfikowanych, chemicznie przeprogramowanych komórek macierzystych do obwodów nerwowych gospodarza.

Rysunek 1 przedstawia kluczowe etapy tego podejścia metodologicznego dla zmodyfikowanych ludzkich przeprogramowanych komórek macierzystych wykazujących ekspresję pobudzających (hM3Dq) lub hamujących (hM4Di) receptorów DREADD, w celu oceny funkcjonalnej integracji i modulacji pochodnych prekursorów dopaminergicznych w mysim modelu choroby Parkinsona (PD). Rysunek 2 przedstawia strategię knock-in genu za pomocą CRISPR/Cas9 w celu wprowadzenia konstruktów niefuzyjn...

Tutaj opisujemy protokół inżynierii chemicznie przeprogramowanych komórek macierzystych w celu osiągnięcia precyzyjnej modulacji neuronalnej poprzez różnicowanie tych komórek w dopaminergiczne komórki prekursorowe, przeszczepianie ich do mysich modeli choroby Parkinsona oraz ocenę wyników behawioralnych i elektrofizjologicznych w celu potwierdzenia udanej integracji i funkcjonalnej skuteczności przeszczepionych komórek.

Regulacja chemogenetyczna w przeprogramowanych komórkach prekursorowych pochodzących z komórek macierzystych w leczeniu chorób neurodegeneracyjnych

The integration of designer receptors exclusively activated by designer drugs (DREADD) with stem cell-based therapies presents an advanced strategy for ...

Nasze badania koncentrują się na zilustrowaniu patogennego mechanizmu leżącego u podstaw choroby neurodegeneracyjnej, przy jednoczesnej integracji zaawansowanych technologii w celu opracowania skutecznych technik terapii komórkowej do zastosowań klinicznych. Nasze ostatnie prace polegały na przeszczepieniu chemogenetycznie zmodyfikowanych komórek macierzystych w mysich modelach choroby Parkinsona. Modulujemy aktywność neuronów jednej komórki za pomocą, a więc monitorowania elektrofizjologicznego i oceny behawioralnej. Wykorzystujemy CRISPR przede wszystkim do inżynierii genetycznej, elektrofizjologii do monitorowania aktywności neuronalnej oraz testów behawioralnych do oceny odzyskiwania funkcji w modelach choroby Parkinsona. Skuteczność przeszczepionych komórek wzrasta w zależności od prawidłowego wskazania, przeżycia i funkcjonalnego wkładu w tkankę gospodarza w terapii opartej na komórkach macierzystych, leczącej choroby neurodegeneracyjne. Niekontrolowana aktywność komórkowa związana z negatywnymi konsekwencjami, w tym genezą guza.Wykorzystanie technologii w ludzkich przeprogramowanych komórkach macierzystych i neuronach sterujących zapewnia środki do precyzyjnej kontroli aktywności neuronalnej poprzez podawanie CNO.[Instruktor] Na początek delikatnie wymieszaj od 50 do 100 nanogramów zlinearyzowanego wektora, fragment pierwszy i fragment drugi, w stosunku 1 do trzech do trzech molowych, wraz z mieszanką klonowania 2X. Inkubuj mieszaninę w temperaturze 55 stopni Celsjusza przez godzinę, aby ułatwić rekombinację homologiczną za pomocą montażu Gibsona. Wstaw przewodnik RNA ukierunkowany na miejsce AAVS1 do miejsca BBS1 wektora PX458. Utrzymuj przeprogramowane komórki macierzyste w pożywkach hodowlanych, dążąc do gęstości komórek od dwóch do 5 milionów komórek na mililitr. Teraz wymieszaj od dwóch do 5 milionów komórek, dwa mikrogramy każdego plazmidu dawcy i dwa mikrogramy plazmidu GRNA w 100 mikrolitrach buforu do elektroporacji. Przenieś mieszaninę ogniw i plazmidów do kuwety, aby wykonać elektroporację. Następnie przenieś elektroporowane ogniwa na sześciodołkowe płytki, które zostały pokryte poli-D-lizyną i lamininą. Rozprowadź około 500 000 komórek na studzienkę w dwóch mililitrach pożywki hodowlanej. Po 72 godzinach elektroporacji użyj cytometru przepływowego, aby posortować fluorescencyjne komórki dodatnie. Skonfiguruj sorter z kanałem FITC do wykrywania ZsGreen. Włączenie nieleczonych indukowanych nerwowych komórek macierzystych jako kontroli ujemnych w celu określenia wyjściowej fluorescencji. Umieść pojedyncze komórki ZsGreen-dodatnie na 96-dołkowych płytkach wstępnie pokrytych poli-D-lizyną i lamininą i dodaj 200 mikrolitrów pożywki hodowlanej na basenik. Utrzymuj kulturę przez siedem do 14 dni. Wyizolować pojedyncze klony wykazujące fluorescencję za pomocą odwróconego mikroskopu fluorescencyjnego wyposażonego w zestaw filtrów białkowych z zieloną fluorescencyjną. Po namnażeniu dodatnich komórek na powlekanych 48-dołkowych płytkach, podziel je na dwie części, jedną do kontynuacji hodowli, a drugą do genotypowania. Ekstrakcja genomowego DNA z potencjalnych klonów. Przygotuj mieszankę PCR przy użyciu dwóch podstawowych napraw, jednej w celu potwierdzenia insercji genu będącego przedmiotem zainteresowania, a drugiej w celu rozróżnienia klonów homozygotycznych i heterozygotycznych. Strawić komórki, umyć je w PBS i odwirować przy 250 G przez trzy minuty. Przeprowadź jednostronne stereotaktyczne wstrzyknięcia trzech mikrolitrów 6-hydroksydopaminy w stężeniu pięciu mikrogramów na mikrolitr na znieczulonym zwierzęciu. Celuj w prawe ciało prążkowane, używając prawidłowych współrzędnych. Podać dootrzewnowe wstrzyknięcie apomorfiny w ilości jednego miligrama na kilogram przy użyciu 0,5 miligrama na mililitr roztworu rozpuszczonego w soli fizjologicznej cztery tygodnie po operacji w celu walidacji zmian. Podać stereotaktyczne wstrzyknięcie czterech mikrolitrów przygotowanej zawiesiny komórkowej do mysiego modelu choroby Parkinsona. Wykonaj test cylindra w wielu punktach czasowych po przeszczepie komórek. Umieść szklaną zlewkę o średnicy 20 centymetrów i wysokości 30 centymetrów na płaskiej, nieodblaskowej powierzchni. Następnie umieść kamerę widoku z góry nad cylindrem, aby uchwycić pełną średnicę. Umieść każdą mysz na środku cylindra i rozpocznij jednoczesne nagrywanie wideo przez trzy minuty na sesję. Po sesji przywróć mysz do jej domowej klatki. Oceń ruch kończyn górnych myszy podczas trzyminutowej sesji. Oblicz liczbę kontaktów ze ścianą wykonanych przez upośledzoną kończynę przednią w stosunku do całkowitej liczby kontaktów wykonanych przez obie kończyny przednie. Podawać sól fizjologiczną lub N-tlenek klozapiny w dawce 1,2 miligrama na kilogram we wstrzyknięciu dootrzewnowym. Przeprowadź ponownie test cylindra, aby ocenić modulację behawioralną w mysim modelu choroby Parkinsona po podaniu N-tlenku klozapiny. Po pobraniu mózgu od znieczulonego zwierzęcia i natychmiastowym umieszczeniu go w lodowatym sztucznym płynie mózgowo-rdzeniowym na bazie sacharozy, aby zachować integralność komórkową Za pomocą wibratomu pokrój mózg na sekcje o grubości od 300 do 400 mikrometrów. Dostosuj ustawienia dopływu gazu, aby zrównoważyć się z 95% tlenu i 5% dwutlenkiem węgla w temperaturze 34 stopni Celsjusza. Przenieś wycinki mózgu do komory wypełnionej sztucznym płynem mózgowo-rdzeniowym. Załaduj szklane pipety lodowatym roztworem wewnątrzkomórkowym, upewniając się, że rezystancja elektrody wynosi od siedmiu do 10 megaomów. Zamontuj plastry w zanurzonej komorze rejestracyjnej przepełnionej w ilości dwóch mililitrów na minutę natlenionym sztucznym płynem mózgowo-rdzeniowym w temperaturze 34 stopni Celsjusza. Ustawić pipety za pomocą mikromanipulatorów z napędem silnikowym pod mikroskopią kontrastową z interferencją różnicową w podczerwieni. Ustal konfigurację całej komórki za pomocą delikatnego ssania, aby załatać neurony o oporności większej niż jeden gigaom. Zaciśnij ogniwa przy minus 70 miliwoltach za pomocą wzmacniacza patch clampowego i uzyskaj podstawowe spontaniczne pobudzające prądy postsynaptyczne przez osiem minut przy częstotliwości próbkowania 10 kiloherców. Dodać 50 mikromolowy N-tlenek klozapiny do komory rejestracyjnej natychmiast po pomiarze podstawowym. Kontynuuj rejestrowanie danych przez 16 minut i monitoruj zmiany spontanicznej pobudzającej częstotliwości lub amplitudy prądu postsynaptycznego. Na koniec wykonaj procedurę wymłukiwania, zastępując roztwór N-tlenku klozapiny świeżym sztucznym płynem mózgowo-rdzeniowym i kontynuuj nagrywanie, aby ocenić odzyskanie aktywności synaptycznej. Modulacja hemogenetyczna za pomocą N-tlenku klozapiny zmniejszyła ruch kończyn przednich po przeciwnej stronie u myszy z przeszczepem hM4Di i zwiększyła go u myszy z przeszczepem hM3Dq w porównaniu z leczeniem solą fizjologiczną, wykazując dwukierunkową kontrolę behawioralną. Zapisy elektrofizjologiczne ujawniły, że komórki przeszczepione hM4Di miały dłuższe odstępy i mniejsze amplitudy pików w spontanicznych pobudzających prądach postsynaptycznych, podczas gdy przeszczepione komórki hM3Dq miały krótsze odstępy i większe amplitudy, co wskazuje na odpowiednie tłumienie i zwiększenie aktywności synaptycznej. Analiza immunofluorescencyjna potwierdziła ekspresję in vivo hydroksylazy tyrozynowej i ZsGreen w przeszczepionych komórkach hM4Di i hM3Dq, wspierając pomyślną integrację przeszczepu.

chemogenetic-regulation-reprogrammed-stem-cell-derived-precursor

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Neurogeneza korowa: przejście od osiągnięć laboratoryjnych do terapii komórkowych

Ten film pokazuje bezpośrednie przeprogramowanie genetycznie zmodyfikowanych hematopoetycznych komórek progenitorowych na neuronalne komórki macierzyste. Czynniki transkrypcyjne ulegające ekspresji przez krwiotwórcze komórki progenitorowe wywołują kaskadę zdarzeń molekularnych ułatwiających ich transformację. Dalsze specyficzne pożywki są używane do selekcji i wzrostu indukowanych neuronalnych komórek macierzystych.

Bezpośrednie przeprogramowanie hematopoetycznych komórek progenitorowych w neuronalne komórki macierzyste

Źródło: Sharma, A. D., et.al. Wysokoprzepustowa charakterystyka dorosłych komórek macierzystych zmodyfikowanych w celu dostarczania czynników terapeutycznych w strategiach neuroprotekcyjnych. J. Vis. Exp. (2015)Film ten pokazuje proces charakteryzowania transgenicznych mezenchymalnych komórek macierzystych zaprojektowanych do ekspresji terapeutycznych czynników neurotroficznych. Przedstawiono w nim etapy związane z utrwalaniem, przepuszczalnością i barwieniem komórek za pomocą pierwszorzędowych...

Charakterystyka genetycznie modyfikowanych mezenchymalnych komórek macierzystych do zastosowań neuroterapeutycznych

Ten protokół opisuje nowatorską metodę mechanicznego siekania, która pozwala na ekspansję sferycznych agregatów nerwowych komórek macierzystych i progenitorowych bez dysocjacji do zawieszenia pojedynczej komórki. Utrzymanie kontaktu komórka/komórka pozwala na szybki i stabilny wzrost przez ponad 40 przejść.

Metoda ekspansji stosowana do cGMP dla agregatów ludzkich nerwowych komórek macierzystych i progenitorowych pochodzących z pluripotencjalnych komórek macierzystych lub tkanki mózgowej płodu

To badanie opisuje eksperymentalną platformę do szybkiego charakteryzowania zmodyfikowanych komórek macierzystych i ich zachowań przed ich zastosowaniem w długoterminowych badaniach nad przeszczepami in vivo w celu ratowania i naprawy układu nerwowego.

Wysokoprzepustowa charakterystyka dorosłych komórek macierzystych zmodyfikowanych pod kątem dostarczania czynników terapeutycznych w strategiach neuroprotekcyjnych

Generowanie indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych dostarcza fascynujących perspektyw dla pochodnych autologicznych przeszczepów. Jednak progresja przez stan pluripotencjalny i pracochłonne różnicowanie nadal utrudnia translację kliniczną. Tutaj opisujemy pochodzenie fibroblastów dorosłego człowieka i ich bezpośrednią konwersję do indukowanych nerwowych komórek progenitorowych, a następnie różnicowanie w linie nerwowe.

Wyprowadzanie fibroblastów dorosłego człowieka i ich bezpośrednia konwersja do ekspandowalnych nerwowych komórek progenitorowych

Bezpośrednie przeprogramowanie neuronów generuje neurony, które utrzymują wiek początkowej komórki somatycznej. W tym miejscu opisujemy pojedynczą metodę opartą na wektorach do generowania indukowanych neuronów z fibroblastów skóry uzyskanych od dorosłych dawców ludzkich.

Proste generowanie wysokowydajnej kultury indukowanych neuronów z dorosłych fibroblastów skóry człowieka

Protokół przedstawia przeprogramowanie komórek jednojądrzastych krwi obwodowej w celu wywołania nerwowych komórek macierzystych przez infekcję wirusem Sendai, różnicowanie iNSC w neurony dopaminergiczne, przeszczepianie prekursorów DA do jednostronnie uszkodzonych modeli mysich choroby Parkinsona oraz ocenę bezpieczeństwa i skuteczności prekursorów DA pochodzących z iNSC w leczeniu PD.

Generowanie indukowanych nerwowych komórek macierzystych z obwodowych komórek jednojądrzastych i różnicowanie w kierunku prekursorów neuronów dopaminergicznych do badań transplantacyjnych

Prezentujemy metodę bez modyfikacji genetycznie (GMO) do uzyskania komórek z fenotypem neuronalnym z przeprogramowanych komórek krwi obwodowej. Aktywacja szlaku sygnałowego powiązanego z nowym ludzkim białkiem połączonym z GPI ujawnia skuteczną, wolną od GMO metodę pozyskiwania ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych.

Wytwarzanie komórek neuronalnych pochodzących z krwi bez GMO

Opisujemy protokół przeprogramowania fibroblastów pochodzących z ludzkiej skóry w indukowane neuronalne komórki progenitorowe (iNPC), a następnie ich różnicowanie w indukowane astrocyty (iAs). Metoda ta prowadzi do szybkiego i powtarzalnego generowania iNPC i iA w dużych ilościach.

Modelowanie in vitro chorób neurologicznych z wykorzystaniem bezpośredniej konwersji z fibroblastów do neuronalnych komórek progenitorowych i różnicowania w astrocyty

Przeszczepienie ludzkich pluripotencjalnych neuronów GABA-ergicznych pochodzących z komórek macierzystych, generowanych przez programowanie neuronalne, może być potencjalnym podejściem do leczenia zaburzeń neurorozwojowych. Protokół ten opisuje wytwarzanie i przeszczepianie prekursorów neuronów GABA-ergicznych pochodzących z ludzkich komórek macierzystych do mózgów nowonarodzonych myszy, umożliwiając długoterminowe badanie przeszczepionych neuronów i ocenę ich potencjału terapeutycznego.

Przeszczep ludzkich neuronów GABA-ergicznych pochodzących z ludzkich komórek macierzystych do wczesnopourodzeniowego hipokampa myszy w celu złagodzenia zaburzeń neurorozwojowych

Poznaj metodę chemogenetycznej regulacji komórek prekursorowych pochodzących z przeprogramowanych komórek macierzystych w leczeniu choroby Parkinsona u myszy. Technika ta umożliwia precyzyjną kontrolę aktywności neuronów i ocenę funkcjonalnej integracji przeszczepu.

Regulacja chemogenetyczna w przeprogramowanych komórkach prekursorowych pochodzących z komórek macierzystych w leczeniu chorób neurodegeneracyjnych (Wideo) | JoVE Journal

Regulacja chemogenetyczna w przeprogramowanych komórkach prekursorowych pochodzących z komórek macierzystych w leczeniu chorób neurodegeneracyjnych

Przeglądaj więcej filmów