Regulacja chemogenetyczna w przeprogramowanych komórkach prekursorowych pochodzących z komórek macierzystych w leczeniu chorób neurodegeneracyjnych

Nasze badania koncentrują się na zilustrowaniu patogennego mechanizmu leżącego u podstaw choroby neurodegeneracyjnej, przy jednoczesnej integracji zaawansowanych technologii w celu opracowania skutecznych technik terapii komórkowej do zastosowań klinicznych. Nasze ostatnie prace polegały na przeszczepieniu chemogenetycznie zmodyfikowanych komórek macierzystych w mysich modelach choroby Parkinsona. Modulujemy aktywność neuronów jednej komórki za pomocą, a więc monitorowania elektrofizjologicznego i oceny behawioralnej. Wykorzystujemy CRISPR przede wszystkim do inżynierii genetycznej, elektrofizjologii do monitorowania aktywności neuronalnej oraz testów behawioralnych do oceny odzyskiwania funkcji w modelach choroby Parkinsona. Skuteczność przeszczepionych komórek wzrasta w zależności od prawidłowego wskazania, przeżycia i funkcjonalnego wkładu w tkankę gospodarza w terapii opartej na komórkach macierzystych, leczącej choroby neurodegeneracyjne. Niekontrolowana aktywność komórkowa związana z negatywnymi konsekwencjami, w tym genezą guza.

Wykorzystanie technologii w ludzkich przeprogramowanych komórkach macierzystych i neuronach sterujących zapewnia środki do precyzyjnej kontroli aktywności neuronalnej poprzez podawanie CNO.

[Instruktor] Na początek delikatnie wymieszaj od 50 do 100 nanogramów zlinearyzowanego wektora, fragment pierwszy i fragment drugi, w stosunku 1 do trzech do trzech molowych, wraz z mieszanką klonowania 2X. Inkubuj mieszaninę w temperaturze 55 stopni Celsjusza przez godzinę, aby ułatwić rekombinację homologiczną za pomocą montażu Gibsona. Wstaw przewodnik RNA ukierunkowany na miejsce AAVS1 do miejsca BBS1 wektora PX458. Utrzymuj przeprogramowane komórki macierzyste w pożywkach hodowlanych, dążąc do gęstości komórek od dwóch do 5 milionów komórek na mililitr. Teraz wymieszaj od dwóch do 5 milionów komórek, dwa mikrogramy każdego plazmidu dawcy i dwa mikrogramy plazmidu GRNA w 100 mikrolitrach buforu do elektroporacji. Przenieś mieszaninę ogniw i plazmidów do kuwety, aby wykonać elektroporację. Następnie przenieś elektroporowane ogniwa na sześciodołkowe płytki, które zostały pokryte poli-D-lizyną i lamininą. Rozprowadź około 500 000 komórek na studzienkę w dwóch mililitrach pożywki hodowlanej. Po 72 godzinach elektroporacji użyj cytometru przepływowego, aby posortować fluorescencyjne komórki dodatnie. Skonfiguruj sorter z kanałem FITC do wykrywania ZsGreen. Włączenie nieleczonych indukowanych nerwowych komórek macierzystych jako kontroli ujemnych w celu określenia wyjściowej fluorescencji. Umieść pojedyncze komórki ZsGreen-dodatnie na 96-dołkowych płytkach wstępnie pokrytych poli-D-lizyną i lamininą i dodaj 200 mikrolitrów pożywki hodowlanej na basenik. Utrzymuj kulturę przez siedem do 14 dni. Wyizolować pojedyncze klony wykazujące fluorescencję za pomocą odwróconego mikroskopu fluorescencyjnego wyposażonego w zestaw filtrów białkowych z zieloną fluorescencyjną. Po namnażeniu dodatnich komórek na powlekanych 48-dołkowych płytkach, podziel je na dwie części, jedną do kontynuacji hodowli, a drugą do genotypowania. Ekstrakcja genomowego DNA z potencjalnych klonów. Przygotuj mieszankę PCR przy użyciu dwóch podstawowych napraw, jednej w celu potwierdzenia insercji genu będącego przedmiotem zainteresowania, a drugiej w celu rozróżnienia klonów homozygotycznych i heterozygotycznych. Strawić komórki, umyć je w PBS i odwirować przy 250 G przez trzy minuty. Przeprowadź jednostronne stereotaktyczne wstrzyknięcia trzech mikrolitrów 6-hydroksydopaminy w stężeniu pięciu mikrogramów na mikrolitr na znieczulonym zwierzęciu. Celuj w prawe ciało prążkowane, używając prawidłowych współrzędnych. Podać dootrzewnowe wstrzyknięcie apomorfiny w ilości jednego miligrama na kilogram przy użyciu 0,5 miligrama na mililitr roztworu rozpuszczonego w soli fizjologicznej cztery tygodnie po operacji w celu walidacji zmian. Podać stereotaktyczne wstrzyknięcie czterech mikrolitrów przygotowanej zawiesiny komórkowej do mysiego modelu choroby Parkinsona. Wykonaj test cylindra w wielu punktach czasowych po przeszczepie komórek. Umieść szklaną zlewkę o średnicy 20 centymetrów i wysokości 30 centymetrów na płaskiej, nieodblaskowej powierzchni. Następnie umieść kamerę widoku z góry nad cylindrem, aby uchwycić pełną średnicę. Umieść każdą mysz na środku cylindra i rozpocznij jednoczesne nagrywanie wideo przez trzy minuty na sesję. Po sesji przywróć mysz do jej domowej klatki. Oceń ruch kończyn górnych myszy podczas trzyminutowej sesji. Oblicz liczbę kontaktów ze ścianą wykonanych przez upośledzoną kończynę przednią w stosunku do całkowitej liczby kontaktów wykonanych przez obie kończyny przednie. Podawać sól fizjologiczną lub N-tlenek klozapiny w dawce 1,2 miligrama na kilogram we wstrzyknięciu dootrzewnowym. Przeprowadź ponownie test cylindra, aby ocenić modulację behawioralną w mysim modelu choroby Parkinsona po podaniu N-tlenku klozapiny. Po pobraniu mózgu od znieczulonego zwierzęcia i natychmiastowym umieszczeniu go w lodowatym sztucznym płynie mózgowo-rdzeniowym na bazie sacharozy, aby zachować integralność komórkową Za pomocą wibratomu pokrój mózg na sekcje o grubości od 300 do 400 mikrometrów. Dostosuj ustawienia dopływu gazu, aby zrównoważyć się z 95% tlenu i 5% dwutlenkiem węgla w temperaturze 34 stopni Celsjusza. Przenieś wycinki mózgu do komory wypełnionej sztucznym płynem mózgowo-rdzeniowym. Załaduj szklane pipety lodowatym roztworem wewnątrzkomórkowym, upewniając się, że rezystancja elektrody wynosi od siedmiu do 10 megaomów. Zamontuj plastry w zanurzonej komorze rejestracyjnej przepełnionej w ilości dwóch mililitrów na minutę natlenionym sztucznym płynem mózgowo-rdzeniowym w temperaturze 34 stopni Celsjusza. Ustawić pipety za pomocą mikromanipulatorów z napędem silnikowym pod mikroskopią kontrastową z interferencją różnicową w podczerwieni. Ustal konfigurację całej komórki za pomocą delikatnego ssania, aby załatać neurony o oporności większej niż jeden gigaom. Zaciśnij ogniwa przy minus 70 miliwoltach za pomocą wzmacniacza patch clampowego i uzyskaj podstawowe spontaniczne pobudzające prądy postsynaptyczne przez osiem minut przy częstotliwości próbkowania 10 kiloherców. Dodać 50 mikromolowy N-tlenek klozapiny do komory rejestracyjnej natychmiast po pomiarze podstawowym. Kontynuuj rejestrowanie danych przez 16 minut i monitoruj zmiany spontanicznej pobudzającej częstotliwości lub amplitudy prądu postsynaptycznego. Na koniec wykonaj procedurę wymłukiwania, zastępując roztwór N-tlenku klozapiny świeżym sztucznym płynem mózgowo-rdzeniowym i kontynuuj nagrywanie, aby ocenić odzyskanie aktywności synaptycznej. Modulacja hemogenetyczna za pomocą N-tlenku klozapiny zmniejszyła ruch kończyn przednich po przeciwnej stronie u myszy z przeszczepem hM4Di i zwiększyła go u myszy z przeszczepem hM3Dq w porównaniu z leczeniem solą fizjologiczną, wykazując dwukierunkową kontrolę behawioralną. Zapisy elektrofizjologiczne ujawniły, że komórki przeszczepione hM4Di miały dłuższe odstępy i mniejsze amplitudy pików w spontanicznych pobudzających prądach postsynaptycznych, podczas gdy przeszczepione komórki hM3Dq miały krótsze odstępy i większe amplitudy, co wskazuje na odpowiednie tłumienie i zwiększenie aktywności synaptycznej. Analiza immunofluorescencyjna potwierdziła ekspresję in vivo hydroksylazy tyrozynowej i ZsGreen w przeszczepionych komórkach hM4Di i hM3Dq, wspierając pomyślną integrację przeszczepu.