Montaż bioreaktora do ciągłej hodowli złożonych zbiorowisk kałowych

Badamy interakcje bakterii gospodarza oraz wpływ czynników wewnętrznych i zewnętrznych na zdrowie, koncentrując się na wpływie bakterii na rozwój, progresję i odpowiedź na leczenie. Badaliśmy inhibitory immunologicznych punktów kontrolnych anty-PD-1 w społecznościach bakteryjnych, stwierdzając, że metabolity bakteryjne zwiększają skuteczność terapii anty-PD-1.

Izolowanie wpływu czynników gospodarza na mikrobiom in vivo jest trudne ze względu na wiele czynników. Układ mikrobioreaktorów umożliwia kontrolowane badanie określonych procesów, wyjaśniając ich bezpośredni wpływ na społeczności drobnoustrojów. Protokół ten oferuje opłacalną metodę hodowli zbiorowisk kałowych w kontrolowanych warunkach, umożliwiając jednocześnie naukowcom stosunkowo szybkie przeprowadzanie eksperymentów równolegle.

[Instruktor] Na początek zdobądź wydrukowany w 3D sześcioodwiertowy układ reaktorów. Wytnij dwanaście 25-milimetrowych pasków z rurki PTFE 1/8 cala i użyj maszynki do golenia końcówek. Włóż jeden koniec każdego paska do otworu gwintu męskiego Luera ze złączką z gwintem od 25 do 28. Bezpiecznie przykręć złączki do wyznaczonych otworów odpływowych i próbnych w tablicy. Teraz włóż mikromieszadło do każdej studzienki reaktora. Wkręć męski gwint 1/4-28 w otwory źródłowe każdej studni reaktora. Przykręć żeńskie złączki adaptera węża Luer do złączek gwintowanych przyłączy odpływowych i źródłowych każdej studni reaktora. Następnie wkręć żeńskie złączki adaptera Luer X do 3-32/2-calowego adaptera kolców węża do złączek gwintowanych 1/4-28 dla portów próbki. Umieść gumową przegrodę na adapterach zadziorów węża i złóż górną część. Następnie przetnij dwa zestawy rurek E-LFL 2,06 milimetra do przewodów odpływowych i źródłowych. Użyj gorącej wody, aby zmiękczyć rurkę, aby ułatwić mocowanie. Podłącz rurkę do żeńskich złączek adaptera króćca węża Luer X do 1/8 cala dla przyłączy źródła i odpływu. Teraz przymocuj męski Luer za pomocą pierścienia blokującego X do adaptera króćca węża 1/8 cala, pasując do drugiego końca rurki. Wkręć w niego żeński adapter króćca węża Luer X do 1/16 cala. Podłącz rurkę dwustopniową o odpowiednim rozmiarze do odpowiedniego źródła i przyłączy odpływowych. Następnie przymocuj kolejny żeński adapter króćca węża Luer X do 1/16 cala do drugiego końca rurki. Po powtórzeniu tego dla wszystkich złączek źródłowych i odpływowych, włóż męski Luer z pierścieniem blokującym X do złączek adaptera kolców węża 1/8 cala do kawałka rurki E-LFL 2. Przymocuj jeden koniec do niezajętego żeńskiego adaptera króćca węża Luer X do 1/16 cala na końcu każdej sekcji rurki z dwoma przystankami dla wszystkich elementów. Po powtórzeniu tego dla wszystkich złączek źródłowych i odpływowych, podłącz rurkę E-LFL 2,06 milimetra do przewodów źródłowych pierwszej i drugiej studni reaktora, używając przeciwległych końców żeńskiego Luer T. Następnie przymocuj pięciocentymetrowy kawałek rurki za pomocą męskiego Luera z pierścieniem blokującym X do złączek adaptera 1/8 cala na każdym końcu do środkowego wylotu T, prowadząc do drugiego złącza T. Teraz podłącz rurkę źródłową E-LFL 2,06 milimetra do trzeciego reaktora po przeciwnej stronie drugiego T. Podłącz kolejny pięciocentymetrowy segment rurki z męskim Luerem z pierścieniem blokującym adapterem X na 1/8 cala na jednym końcu i żeńskim Luerem z pierścieniem blokującym X do adaptera 1/8 cala na drugim. Następnie przymocuj męski Luer z pierścieniem blokującym X do adaptera króćca węża 1/8 cala do jednego końca 25-centymetrowego odcinka rurki E-LFL 2.06 milimetra. Przymocuj żeński adapter zadzioru węża Luer X do 1/8 cala na drugim końcu i przykryj go folią aluminiową. Aby zmontować butelkę do zbierania odpadów, luźno przymocuj nakrętkę z dwoma otworami do dwulitrowej butelki. Włóż złączki z gwintem męskim 1/4-28 do obu otworów nasadki. Następnie przymocuj żeński adapter Luer z adapterem zadzioru węża 1/8 cala do złączki z gwintem zewnętrznym, która nie łączy się z wstępnie przymocowaną rurką PTFE w nasadce. Podłącz pięciocentymetrowy kawałek rurki E-LFL 2.06 milimetra do adaptera zadzioru węża na butelce. Przymocuj męski Luer z pierścieniem blokującym X do adaptera zadzioru węża 1/8 cala do drugiego końca rurki przed przykryciem jej folią. Na koniec przykryj całą nakrętkę butelki folią aluminiową przed autoklawowaniem w temperaturze 121 stopni Celsjusza i 15 psi przez 45 minut. Po zakończeniu autoklawowania dokręć złączki i uszczelki foliowe, a następnie umieść reaktory w komorze beztlenowej na 48 godzin przed użyciem. Ustaw układ reaktora wewnątrz komory beztlenowej na magnetycznej płycie mieszającej ustawionej na 1,600 obr./min. Następnie zamontuj rurkę z dwoma zaworami odcinkowymi zarówno dla przewodu źródłowego, jak i odpływowego w zaciskach odpowiednich pomp perystaltycznych. Zablokuj zaciski na miejscu, jeśli zostanie to zrobione na mniej niż 25 godzin przed użyciem. W przeciwnym razie pozostaw go luźnym, aby zmniejszyć zużycie rurki. Teraz zdejmij foliową nakrętkę z butelki źródłowej. Przykręć złączki do męskich złączek z gwintem Luer do 1/4-28, upewniając się, że te otwory są połączone z wewnętrznym przewodem PTFE. Zdejmij nakrętki foliowe i przymocuj filtr strzykawkowy o średnicy 0,22 mikrometra do pięciocentymetrowego przewodu wentylacyjnego zarówno butelki źródłowej, jak i butelki na odpady. Rozpocznij przepływ z umiarkowaną szybkością, aby rozpocząć napełnianie reaktora. Upewnij się, że rurka w talii wewnątrz każdej studzienki reaktora jest umieszczona niżej niż rurka źródłowa, aby zapobiec przepełnieniu lub całkowitemu opróżnieniu każdej studzienki. Gdy reaktory zaczną się napełniać, sprawdź, czy wszystkie studnie osiągają tę samą objętość i czy media spływają do linii talii przed opuszczeniem reaktorów w celu odgazowania na noc. Zacznij od przeniesienia materiałów doświadczalnych do komory beztlenowej na 24 godziny. Po obliczeniu ilości potrzebnego inokulum kału, przenieś zakonserwowane próbki kału w fiolkach kriogenicznych do komory beztlenowej i pozostaw do rozmrożenia przez 15 minut. Za pomocą końcówki do pipet o szerokim otworze przenieś materiał kałowy z fiolek kriogenicznych do stożkowej probówki o pojemności 50 mililitrów. Odwirować szczelnie zamkniętą probówkę o masie 200 g przez pięć minut, aby osadzić cząstki stałe. Przenieś probówki z powrotem do komory beztlenowej. Następnie usunąć supernatant. Użyj szpatułki laboratoryjnej do autoklawu, aby przenieść 5,7 grama kału do nowej 50-mililitrowej stożkowej probówki. Dodaj 17,1 mililitra sterylnego roztworu soli fizjologicznej beztlenowej do probówki i szczelnie zamknij. Teraz wiruj probówkę przez pięć minut przed odwirowaniem, jak pokazano wcześniej. Użyj 10% chusteczki laboratoryjnej z wybielaczem, aby sterylizować przegrody na wierzchu każdego reaktora przez co najmniej dwie minuty. Po powrocie próbek do komory beztlenowej odpipetować supernatant do nowych 50-mililitrowych stożkowych probówek. Teraz przenieś 3,8 mililitra supernatantu z zawiesiny kałowej do sześciu oddzielnych pięciomililitrowych strzykawek wyposażonych w igły o średnicy 16 cali i średnicy 1,5 cala. Usuń chusteczkę wybielacza z przegrody reaktora. Następnie włóż igłę przez przegrodę i powoli wstrzyknij 3,8 mililitra gnojowicy kałowej do każdego reaktora przed pozostawieniem reaktorów na noc. Po 16-18-godzinnej inkubacji rozpocząć przepływ do reaktora. Ustawić magnetyczną płytkę mieszającą na maksymalną prędkość natychmiast po wstrzyknięciu gnojowicy kałowej. Skład zbiorowisk mikrobiologicznych w obu replikowanych reaktorach zmieniał się w czasie, przy czym różne gatunki wykazywały różną względną liczebność w ciągu dni. Wybredne bakterie beztlenowe, takie jak Clostridium genera, były konsekwentnie wykrywane w każdym reaktorze we wszystkich punktach czasowych.