Wytwarzanie i charakterystyka indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych astrocytów pochodzących z komórek macierzystych, pozbawionych kruchej rybonukleoproteiny przekaźnika X

Praca ta koncentruje się na czterech ludzkich astrocytach specyficznych dla mózgu i ich zmianach w wyniku zaburzeń neurorozwojowych, takich jak zespół łamliwego chromosomu X. Wcześniejsze prace wykorzystywały modele zwierzęce do badania głównie neuronów, więc ta praca nadaje nowy wymiar temu obszarowi badań.

Mechanistyczne spostrzeżenia z badań na zwierzętach spotkały się z ograniczonym sukcesem klinicznym. Głównym wyzwaniem jest uzyskanie podobnych informacji na temat neuronów i astrocytów pochodzenia ludzkiego.

W ramach naszego protokołu udało się wygenerować funkcjonalne astrocyty specyficzne dla wiatru, które wykazują rozregulowany, glikolityczny i mitochondrialny metabolizm w zespole łamliwego chromosomu X, umożliwiając badania nad rolą komórek glejowych w biologii choroby. Pomimo coraz większej liczby dowodów na kluczową rolę gleju w funkcjonowaniu neuronów w zdrowiu i chorobie, niewiele wiadomo na temat wpływu ludzkich astrocytów na zaburzenia neurorozwojowe, takie jak zespół łamliwego chromosomu X.

Patrząc w przyszłość, będziemy opierać się na tych ramach, aby zbadać, w jaki sposób astrocyty i ich interakcje z neuronami są zmieniane przez chorobę, a następnie, jak można je skorygować za pomocą interwencji terapeutycznych.

[Instruktor] Na początek pokryj naczynie z sześcioma pęczniejącymi Matrigelem rozcieńczonym w stosunku 1 do 60 w zaawansowanym DMMF 12. Panierowane naczynie przechowuj w temperaturze od dwóch do ośmiu stopni Celsjusza. W dniu hodowli należy usunąć materiał powlekający z naczynia i dodać jeden mililitr kompletnego niezbędnego podłoża ósemkowego wraz z inhibitorem skał o końcowym stężeniu jednego X. Umieścić naczynie w inkubatorze. Ustaw na 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla przed dodaniem ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych lub IPSC. Wysiewaj ludzkie IPSC w kompletnej, niezbędnej ósemce z inhibitorem skał o końcowym stężeniu jednego X, aby zwiększyć przyleganie kolonii. Następnego dnia należy wymienić kompletną ósemkę zasadniczą na świeżą pożywkę, pozbawioną inhibitora skały. Kontynuuj codzienne uzupełnianie pożywki, aż komórki osiągną 80% konfluencji, co zajmuje około czterech do pięciu dni. Gdy kolonie osiągną 80% konfluencji, dodaj mieszaninę kolagenazy i dypazy, aby enzymatycznie oderwać je od naczynia. Gdy kolonie zaczną się podnosić, wyjmij naczynie z inkubatora i dodaj dwa mililitry DPBS, aby zneutralizować aktywność enzymu. Za pomocą DPBS zeskrobać kolonie i zebrać zawiesinę do stożkowej probówki o pojemności 15 mililitrów, używając szerokiej deski 10 mililitrowej pipety serologicznej. Następnie, za pomocą 10-mililitrowej pipety serologicznej, delikatnie rozetrzeć zawiesinę dwa do trzech razy, aby rozbić kolonie. Pozwól koloniom się osiedlić. Po około dwóch minutach odessać mieszaninę enzymów DPBS, pozostawiając około jednego mililitra płynu w probówce. Następnie dodaj dwa mililitry DPBS do probówki i wymieszaj, delikatnie stukając, aby ponownie zawiesić kolonie. Pozwól im się uspokoić i powtórz ten proces dwa razy, aby usunąć resztki enzymu. Po usunięciu supernatantu ponownie zawiesić kolonie w jednym mililitrze kompletnej pożywki z ośmiu niezbędnych składników i umieścić je w świeżo przygotowanym naczyniu pokrytym Matrigelem. Enzymatycznie podnieś indukowane przez człowieka pluripotencjalne komórki macierzyste, jak opisano wcześniej. Umieść je na nieprzylegającym 100-milimetrowym naczyniu do hodowli zawiesiny z chemicznie zdefiniowanym podłożem. Umieść zawiesinę komórek na wytrząsarce orbitalnej z prędkością 40 obrotów na minutę przez siedem dni w warunkach normoksyjnych, aby ułatwić rozwój sfer korowych. Ósmego dnia przenieś kulki korowe do pożywki proliferacyjnej komórek i utrzymuj je przez siedem dni. Aby wywołać specyfikację glejową, inkubuj sfery korowe w pożywce wzbogacającej glej przez dwa tygodnie, aby uzyskać wczesne sfery glejowe. W celu dojrzewania wczesnych sfer glejowych zastąp podstawowy czynnik wzrostu fibroblastów H 20 nanogramami na mililitr czynnika hamującego białaczkę i utrzymuj kulki przez cztery tygodnie.

Po czterech tygodniach w pożywce do dojrzewania kontynuuj utrzymywanie kulek w pożywce do wzbogacania gleju przez dłuższy czas. Aby zapobiec agregacji i utracie żywotności, kulki gleju należy mechanicznie siekać co dwa tygodnie za pomocą sterylnego ostrza przemysłowego. Zastąp całe podłoże DNazą, aby usunąć fragmenty DNA powstałe w wyniku siekania. Następnie rozdziel sfery gleju na mono warstwy komórek progenitorowych astrocytów za pomocą zestawu do dysocjacji papainy. Umieść zdysocjowane komórki na kulturze komórkowej, potraktowanej przylegającej misce wstępnie pokrytej Matrigelem w rozcieńczeniu od 1 do 80. Rozmnażaj komórki progenitorowe astrocytów w pożywce wzbogacającej glej, aż osiągną 80% zbiegalności. Przejście komórek usuwa zużyte podłoże i zbiera je w stożkowej probówce. Dodaj pożywkę enzymatyczną do oddzielania komórek do komórek i odczekaj od jednej do dwóch minut. Gdy komórki zaczną się odłączać, dodaj zużytą pożywkę, aby zneutralizować aktywność enzymu. Zebrać zawiesinę komórkową i odwirować przy 800 G przez dwie minuty. Po odrzuceniu supernatantu ponownie zawiesić komórki w pożywce wzbogacającej glej. Płytkę około 10 razy 10 do mocy sześciu komórek na studzienkę na naczyniu pokrytym Matrigelem w rozcieńczeniu od jednego do 80. W celu kriokonserwacji ponownie zawiesić osad komórkowy w zimnej mieszaninie 90% pożywki do proliferacji kul korowych i 10% krioprotektantu. Przenieś ponownie zawieszone komórki do fiolek kriogenicznych. Natychmiast przenieś fiolki kriogeniczne do pudełka kriogenicznego i przechowuj w zamrażarce w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza przez noc. Następnego dnia przenieś wszystkie fiolki kriogeniczne do zbiornika z ciekłym azotem w celu długotrwałego przechowywania. Scharakteryzuj zdysocjowane komórki progenitorowe astrocytów przez barwienie immunologiczne markerami Vimenton i czynnika jądrowego IAM. Aby potwierdzić czteroobszarową specyficzność mózgu ludzkich APC pochodzących z IPSC, przeprowadź analizę QPCR w czasie rzeczywistym dla ludzkiej skrzynki widelcowej G1 i ludzkiej skrzynki homeo, B4. Różnicuj APC w astrocyty i pożywkę różnicowania astrocytarnego przez 14 dni. Umieść astrocyty na 35-milimetrowym szklanym dnie, o gęstości pięć razy 10 do mocy trzech komórek na naczynie, aby zmierzyć ich odpowiedź na adenozyno-pięciotrifosforan. Pozwól komórkom przylegać do szklanego dna przez 24 godziny. Umyj przylegające komórki trzykrotnie zrównoważonym roztworem soli Hanka bez wapnia. Następnie inkubować komórki w pożywce hodowlanej zawierającej diureide metryczny o stosunku pięciu mikromolów 2:00 AM i 0,02% pluronu F127 przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej. Po dwukrotnym umyciu komórek pożywką hodowlaną, zastąp pożywkę dwumilimolowym roztworem wapnia zawierającym zrównoważony roztwór soli Hanka. Zobrazuj komórki z prędkością dwóch klatek na sekundę, używając 60-krotnego obiektywu zanurzeniowego w oleju na odwróconym mikroskopie z kompensacją zwierciedli. Na koniec zarejestruj odpowiedzi wapnia wywołane ATP po dodaniu ATP w końcowym stężeniu pięciu milimoli po 25 sekundach. Ludzkie kolonie IPSC wykazywały ekspresję markerów pluripotencjalnych opt four i nano, co potwierdzono barwieniem immunologicznym. APC pochodzące z zespołu łamliwego chromosomu X i linii kontrolnych wykazywały porównywalne proporcje komórek dodatnich wimentyny i NFIA. Komórki progenitorowe astrocytów z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych indukowanych przez człowieka zarówno z grupy kontrolnej, jak i zespołu łamliwego chromosomu X wykazywały regulację w górę Fox G1 w porównaniu z HOXB4, co wskazuje na tożsamość przodomózgowia. Astrocyty pochodzące z ludzkich linii zespołu łamliwego chromosomu X IPSC wykazywały zmniejszoną liczbę ekspresji GFAP. Astrocyty kontrolne i zespół łamliwego chromosomu X wykazywały stany przejściowe wapnia indukowane przez ATP, ale liczba osób reagujących była znacznie niższa w astrocytach zespołu łamliwego chromosomu X. Szczytowa amplituda pierwszego przejściowego wapnia wywołanego ATP była znacznie niższa w astrocytach zespołu łamliwego chromosomu X w porównaniu z komórkami kontrolnymi. Ludzkie astrocyty zespołu łamliwego chromosomu X pochodzące z IPSC wykazały wzrost glikolizy, zdolności glikolitycznej i rezerw glikolitycznych, ale wykazały znaczny spadek maksymalnego oddychania w porównaniu z astrocytami kontrolnymi.