Name: Wytwarzanie i charakterystyka indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych astrocytów pochodzących z komórek macierzystych, pozbawionych kruchej rybonukleoproteiny przekaźnika X (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-06-06T14:35:00.000+00:00
Duration: 10 min 59 s
Description: Poznaj protokół różnicowania ludzkich komórek iPSC w czynnościowe astrocyty przedmózgowiowe. Metoda umożliwia badanie roli komórek glejowych w zaburzeniach neurorozwojowych, takich jak zespół kruchej chromosomu X.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Prof. Sumantra Chattarji za fundusze stacjonarne. Dziękujemy prof. Gaiti Hasanowi za dostęp do zestawu do obrazowania wapnia, Central Imaging and Flow Facility-National Centre for Biological Sciences, Padmanabh Singh i Prangya Hota za korektę i sugestie, a także zespołowi Labmate Asia za pomoc w przeprowadzaniu testów Seahorse XF.

Wszystkie eksperymenty z użyciem ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (hiPSC) (Tabela 1) zostały przeprowadzone po uzyskaniu odpowiednich instytucjonalnych zgód regulacyjnych. <silna klasa="xfig">Rysunek 1A przedstawia kompletny protokół różnicowania hiPSC do dojrzałych astrocytów specyficznych dla przodomózgowia.
1. Utrzymanie i rozbudowa hiPSC
<ol>
	<li>Na dzień przed posiewem iPSC pokryć 6-dołkowe naczynie rozcieńczonym w stosunku 1:60 Matrigelem (macierz zewnątrzkomórkowa [ECM]) w Advanced Dulbecco's Modified Eagle Medium/Ham's F-12 (DMEM/F12) i przechowywać w temperaturze 2-8 °C. 
	UWAGA: Unikaj przechowywania naczyń pokrytych Matrigelem przez >5 dni w temperaturze 2-8 °C, ponieważ może to z czasem spowodować degradację białek w ECM. Aby uniknąć wysuszenia naczynia, posmaruj co najmniej 1 ml rozcieńczonego Matrigelu w proporcji 1:60 na jeden dołek naczynia 6-dołkowego i równomiernie rozprowadź na naczyniu. W przypadku stosowania tego samego dnia należy przechowywać płytkę w nawilżanym inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez 1 godzinę.</li>
	<li>W dniu hodowli hiPSC usunąć materiał powlekający i dodać 1 ml kompletnej pożywki Essential 8 (pożywka podstawowa E8 z suplementem Essential 8) wraz z inhibitorem ROCK o stężeniu końcowym 1x i przechowywać szalkę w inkubatorze o temperaturze 37 °C i 5% CO2 przed dodaniem hiPSC.</li>
	<li>Zawiesić hiPSC w kompletnym podłożu E8 wraz z inhibitorem ROCK w stężeniu końcowym 1x dla lepszego przylegania kolonii. 
	UWAGA: Nie należy przygotowywać dużych ilości pożywki hodowlanej. Przygotować maksymalnie przez 3-4 dni i przechowywać w temperaturze 2-8 °C.</li>
	<li>Następnego dnia uzupełnij całą pożywkę E8 bez inhibitora ROCK, aż komórki będą zlewać się w 80% (około 4-5 dni).</li>
	<li>Gdy osiągną 80% konfluencji, odłącz kolonie enzymatycznie.
	<ol>
		<li>Aby przejść przez iPSC, należy usunąć zużyte podłoże z naczynia i dodać 1 ml do studzienki wstępnie podgrzanej (37 °C) mieszaniny kolagenazy (2 mg/ml) i dyspazy (1 mg/ml) w stosunku 1:1 i inkubować w temperaturze 37 °C przez ponad 20-30 minut, aby umożliwić podniesienie się kolonii iPSC. 
		UWAGA: Nie pozostawiaj naczyń w temperaturze 37 °C na dłużej niż 20-30 minut; Po tym okresie kolonie rozpadną się, a komórki umrą.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Kiedy kolonie zaczną się podnosić, wyjmij szalki z inkubatora i zneutralizuj aktywność enzymu, dodając 2 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (DPBS) firmy Dulbecco.</li>
	<li>Zeskrobać kolonie za pomocą DPBS i zebrać zawiesinę do stożkowej probówki o pojemności 15 ml za pomocą pipety serologicznej o szerokim otworze 10 ml.</li>
	<li>Delikatnie rozcierać zawiesinę 2-3 razy, aby rozbić kolonie za pomocą pipety serologicznej o pojemności 10 ml i pozwolić koloniom się uspokoić. 
	UWAGA: Nie przekształcaj kolonii w pojedyncze komórki; Może to spowodować, że komórki nie będą przylegać do naczynia i spowodować większą śmierć komórek. Co więcej, nie zostawiaj ich jako wielkich kolonii; Doprowadzi to później do bardziej zróżnicowanych kolonii.</li>
	<li>Gdy kolonie osiądą (około po 2 minutach), odessać mieszaninę enzymów DPBS, pozostawiając około 1 ml w probówce.</li>
	<li>Dodaj 2 ml DPBS do probówki, wymieszaj kolonie, stukając i pozwól im się osadzić. Powtórz to 2x, aby usunąć wszystkie resztki enzymu z kolonii. Usunąć jak najwięcej supernatantu po drugim płukaniu, ponownie zawiesić kolonie w 1 ml kompletnego podłoża E8 i umieścić na płytce w świeżo przygotowanym naczyniu, jak wspomniano w krokach 1.2-1.3.</li>
	<li>Alternatywnie, kriokonserwuj część kolonii przy użyciu 10% dimetylosulfotlenku (DMSO) jako roztworu krioprotektantu do przyszłej ekspansji i wykorzystania.
	<ol>
		<li>Przygotować podłoże do krioprezerwacji na świeżo, mieszając 90% kompletnego podłoża E8 i 10% DMSO jako roztwór krioprotektantu i umieścić w temperaturze 2-8 °C do momentu użycia.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Aby przeprowadzić krioprezerwację, wykonaj kroki 1.5-1.10.</li>
	<li>W kroku 1.10, po 2przemyciu, pozwól koloniom osiąść i usuń supernatant. Do kolonii dodać 1 ml świeżo przygotowanej zimnej pożywki do kriokonserwacji i przenieść do kriowialików. 
	UWAGA: Po dodaniu pożywki do krioprezerwacji do kolonii należy szybko przenieść zawartość do kriowialiów. Opóźnienie może skutkować niższym wskaźnikiem odrodzenia, ponieważ DMSO jest krioprotektantem, który może uszkadzać komórki.</li>
	<li>Natychmiast przenieś kriowiale do krioboxa i przechowuj przez noc w zamrażarce w temperaturze -80 °C.</li>
	<li>Następnego dnia przenieś wszystkie kriowia do zbiornika z ciekłym azotem (zbiornik LN2) do wykorzystania w przyszłości. 
	UWAGA: hiPSC powinny być rutynowo kariotypowane przy użyciu pasm G (rysunek uzupełniający S1) pod kątem wszelkich nieprawidłowości, scharakteryzowane za pomocą immunocytochemii pod kątem pluripotencji (<silna klasa = "xfig">Figura 1B) i testowane na obecność mykoplazmy.
	<ol>
		<li>Aby scharakteryzować hiPSC za pomocą immunocytochemii, należy ułożyć kolonie na pokrytych matrycą, autoklawowanych szkiełkach nakrywkowych o średnicy 13 mm pokrytych Matrigelem w skali 1:60. Gdy osiągną 40% zlewu, przemyj komórki PBS-T (PBS-0,1% Tween 20), utrwal 4% paraformaldehydem przez 10 minut, przepuszczaj 0,3% Triton X-100 w PBS przez 10 minut i blokuj 3% albuminą surowicy bydlęcej (BSA) w PBS przez 1 godzinę, aby zapobiec niespecyficznemu wiązaniu.</li>
		<li>Po zablokowaniu inkubować kultury z przeciwciałami pierwszorzędowymi przez 1 godzinę, a następnie przemywać 3x PBS-T przez 5 minut każda, a następnie odpowiednie przeciwciała drugorzędowe (tabela materiałów) w ciemności przez 1 godzinę.</li>
		<li>Zamontuj szkiełka nakrywkowe na szkiełkach podstawowych z podłożem montażowym i uzyskaj obrazy za pomocą konfokalnego skanowania laserowego przy 405 nm, 488 nm, 561 nm i 633 nm. Przechwytuj obrazy w rozdzielczości 512 x 512 pikseli; ustawić rozmiar kroku Z na 0,5 μm z 1 przewiewną jednostką średnicy otworka.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Generowanie i charakterystyka astrocytarnych komórek progenitorowych (APC)
<ol>
	<li>Enzymatycznie podnieść hiPSC, jak wspomniano w krokach 1.5-1.10 i umieścić je na nieprzylegającym naczyniu do hodowli zawiesiny (100 mm) z chemicznie zdefiniowanym podłożem14 zawierającym 50% zmodyfikowanej pożywki Dulbecco firmy Iscove (IMDM), 50% mieszanki składników odżywczych F-12 szynki (F12), 5 mg/ml BSA, 1% chemicznie zdefiniowanego koncentratu lipidowego (CD-Lipid), 450 μM monotioglicerolu, 7 μg/ml insuliny, 15 μg/ml transferyny, 1% penicylina-streptomycyna uzupełniona mitogenami modelującymi przodomózgowie: N-acetylocysteiną (1 mM), LDN 193189 (0,1 μM) i SB431542 (10 μM) przez 7 dni. 
	UWAGA: Inhibitory małocząsteczkowe SB431542 i LDN-193189 (LDN) są inhibitorami białka morfogenetycznego kości i transformujących szlaki sygnałowe czynnika wzrostu-beta. 
	Od tego momentu podłoże było uzupełniane raz na 2 dni lub zgodnie z protokołem poniedziałek/środa/piątek.</li>
	<li>Umieść zawiesinę komórek na wytrząsarce orbitalnej z prędkością 40 obr./min przez 7 dni w warunkach normoksyjnych, aby wspomóc rozwój kortykosfery (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1A).</li>
	<li>W 8 dniu przenieś kortykosferę do pożywki proliferacyjnej komórek zawierającej Advanced DMEM/F12 z 1% antybiotyko-antybiotykiem, 1% suplementem N2, 1% substytutem glutaminy, 0,1% suplementem B27 i 2,5 ng/ml zasadowego czynnika wzrostu fibroblastów (bFGF) przez 7 dni.</li>
	<li>Indukuj kulki w celu specyfikacji glejowej, poddając je pożywce wzbogacającej glej zawierającej Advanced DMEM / F12 z 1% antybiotykiem przeciwgrzybiczym, 1% N2, 1% substytutem glutaminy, 0,1% suplementem B27, 20 ng / ml naskórkowego czynnika wzrostu (EGF), bFGF-H (20 ng / ml bFGF-5 mg / ml heparyny) przez 2 tygodnie, aby uzyskać wczesne glejosfery (<silna klasa = "xfig">Figura 1A).</li>
	<li>W celu dojrzewania wczesnych glejów należy zastąpić bFGF-H czynnikiem hamującym białaczkę o stężeniu 20 ng / ml (LIF) i utrzymywać kulki przez 4 tygodnie.</li>
	<li>Po 4 tygodniach w pożywce dojrzewającej utrzymuj kulki w pożywce do wzbogacania gleju przez dłuższy czas. Aby zapobiec agregacji i utracie żywotności, co 2 tygodnie mechanicznie siekaj glejosfery za pomocą sterylnego ostrza przemysłowego i zastąp całe podłoże DNazą I, aby usunąć fragmenty DNA powstałe w wyniku siekania.</li>
	<li>Dysocjuj glejosfery na monowarstwy APC za pomocą zestawu do dysocjacji papainy i płytki na naczyniu adherentnym poddanym hodowli komórkowej z rozcieńczeniem powłoki Matrigel w stosunku 1:80.</li>
	<li>Rozmnażaj APC w pożywce do wzbogacania gleju aż do 80% zlewania i enzymatycznie pasuj je za pomocą pożywki do oddzielania komórek enzymatycznych (patrz tabela materiałów).</li>
	<li>Do przejścia:
	<ol>
		<li>Usuń zużyte media i zbierz je w stożkowej tubie. Do komórek dodaj pożywkę enzymatyczną do oddzielania komórek i odczekaj 1-2 minuty. Gdy komórki zaczną się odłączać, dodaj zużytą pożywkę, aby zneutralizować aktywność enzymu.</li>
		<li>Zebrać zawiesinę komórek i odwirować przy 800 x ɡ przez 2 minuty.</li>
		<li>Odessać supernatant, ponownie zawiesić komórki w pożywce do wzbogacania gleju i umieścić około 1 x 106 komórek / studzienkę na 6-dołkowym naczyniu pokrytym Matrigelem w proporcji 1:80.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Do krioprezerwacji:
	<ol>
		<li>Ponownie zawiesić komórki w zimnej mieszaninie 90% pożywki proliferacyjnej kortykosfery (bez bFGF) i 10% krioprotektantu. Przenieś zawieszone komórki do kriowialiów.</li>
		<li>Natychmiast przenieś kriowiale do krioboxa i przechowuj przez noc w zamrażarce w temperaturze -80 °C.</li>
		<li>Następnego dnia przenieś wszystkie kriowia do zbiornika z ciekłym azotem (zbiornik LN2) do wykorzystania w przyszłości. 
		UWAGA: APC były kriokonserwowane przy użyciu 10% DMSO aż do przejścia numer 6.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Scharakteryzuj zdysocjowane APC przez barwienie immunologiczne (jak wspomniano w krokach 1.15.1-1.15.3) za pomocą wimentyny i markerów czynnika jądrowego IA (NFIA) (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 1C, D) (patrz tabela materiałów dla rozcieńczeń).</li>
	<li>Aby potwierdzić regionalną specyficzność APC pochodzącego z hiPSC, przetestuj komórki pod kątem markera przodomózgowia, takiego jak ludzki widelec G1 (hFOXG1) (dodatni) i marker tyłomózgowia, taki jak ludzki Homeobox B4 (hHOXB4) (ujemny) za pomocą qPCR w czasie rzeczywistym (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1E,F). 
	UWAGA: Sekwencje starterów użyte w tych eksperymentach zostały wymienione w Tabeli Uzupełniającej S1.</li>
</ol>
3. Generowanie i charakterystyka jednorodnej populacji astrocytów specyficznych dla przodomózgowia
<ol>
	<li>Różnicowanie astrocytów od APC
	<ol>
		<li>Użyj pożywki do różnicowania astrocytów (ADM) przez 14 dni, aby różnicować APC w astrocyty. Pożywka do różnicowania astrocytów zawiera Neurobasal, 1% antybiotyk-antybiotyk przeciwgrzybiczy, 1% substytut glutaminy, 1% suplement N2, 0,2% suplement B27, 1% pożywkę dla aminokwasów endogennych (NEAA) i 10 ng/ml rzęskowego czynnika neurotroficznego (CNTF).</li>
		<li>Potwierdź tożsamość astrocytarną za pomocą barwienia immunologicznego (jak wspomniano w krokach 1.15.1-1.15.3.) z kwaśnym białkiem fibrylarnym gleju (GFAP) i markerami ekspresji S100β (<silna klasa = "xfig">Rysunek 2A,B).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Synteza białek de novo w APC i astrocytach
	<ol>
		<li>Utrzymuj APC i astrocyty przodomózgowia pochodzące z hiPSC na sterylnych, autoklawowanych szkiełkach nakrywkowych o średnicy 13 mm i wybarwiaj je immunologicznie, jak wspomniano w krokach 1.15.1-1.15.3.</li>
		<li>Do syntezy białek de novo należy użyć metody fluorescencyjnego niekanonicznego znakowania aminokwasów (FUNCAT), wyjaśnionej pokrótce w krokach 3.2.3-3.2.6 (<silna klasa="xfig">Rysunek 3A).</li>
		<li>Aby zapewnić niedobór metioniny, należy usunąć pożywkę wzrostową z kultur i zastąpić pożywką wolną od metioniny i cysteiny zmieszaną z 1 mM L-azydohomoalaniną (AHA) przez 30 minut w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .</li>
		<li>Przemyć kultury PBS-T, utrwalić 4% paraformaldehydem przez 10 minut, przepuścić 0,3% Triton X-100 w PBS przez 10 minut i zablokować 3% BSA w PBS przez 1 godzinę, aby zapobiec niespecyficznemu wiązaniu.</li>
		<li>Inkubować kultury w ciemności przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej z mieszanką reakcyjną chemii komórek Click i Alkyne Alexa Fluor 647, a następnie przeciwciałami pierwszorzędowymi przez 1 godzinę i odpowiadającymi im przeciwciałami drugorzędowymi (tabela materiałów) przez 1 godzinę (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 3B).</li>
		<li>Zamontuj szkiełka nakrywkowe na szkiełkach podstawowych z medium montażowym i użyj ich do dalszej analizy obrazu.
		<ol>
			<li>Pozyskiwanie obrazów za pomocą konfokalnego skanowania laserowego przy 405 nm, 488 nm, 561 nm i 633 nm.</li>
			<li>Rejestruj obrazy w rozdzielczości 512 x 512 pikseli; ustaw rozmiar kroku Z na 0,5 μm za pomocą 1 przewiewnej jednostki średnicy otworka.</li>
			<li>Utrzymuj parametry mikroskopii i obrazowania na stałym poziomie dla wszystkich typów komórek. Przechwytywanie obrazów dla każdej repliki biologicznej w tej samej sesji.</li>
			<li>Wykonuj pomiary intensywności za pomocą dowolnego standardowego oprogramowania do analizy obrazu (np. Fidżi lub Imaris). W Imaris użyj modułu SURFACES, aby uzyskać pomiary objętościowe ciał komórkowych dodatnich dla sygnału fluorescencyjnego niekanonicznego znakowania aminokwasów (FUNCAT) z wimentyną (APC) i GFAP (astrocyty) ograniczającymi zakres wokseli (250-350) w celu usunięcia zanieczyszczeń. 
			UWAGA: Utrzymuj parametry we wszystkich kontrpróbach biologicznych dla obu typów komórek.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Oscylacyjne fale wapniowe indukowane adenozyno-5′-trifosforanem (ATP)
	<ol>
		<li>Płytka astrocytów na szklanym dnie (35 mm) w temperaturze 5 × 103 komórek / naczynie, aby zmierzyć odpowiedź komórkową na ATP.</li>
		<li>Pozostaw komórki do przylegania do szklanego dna przez 24 godziny, umyj je 3x HBSS (20 mM HEPES, 137 mM NaCl, 5 mM KCl, 10 mM Glukoza, 1 mM MgCl2, pH = 7,3) bez wapnia i inkubuj w pożywce hodowlanej z barwnikiem metrycznym Fura-2AM o stosunku 5 μM i 0,02% Pluronics F127 przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. 
		UWAGA: Fura-2AM jest substancją chemiczną wrażliwą na światło i temperaturę; przechowywać w temperaturze -20 °C.</li>
		<li>Po inkubacji przemyć 2x pożywką hodowlaną i zastąpić 2 mM Ca2+ zawierającym HBSS i zobrazować komórki z prędkością 2 FPS za pomocą obiektywu olejowego 60x (1,35 NA) w odwróconym mikroskopie z kompensacją dryftu ostrości.</li>
		<li>Rejestruj reakcje wapnia wywołane przez ATP przez zastosowanie ATP w kąpieli w końcowym stężeniu 5 mM przy 25th s (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 4A).</li>
		<li>Narysuj interesujące obszary wokół każdej komórki za pomocą Fidżi/ImageJ i oblicz stosunek F340/F380 we wszystkich punktach czasowych (<silna klasa = "xfig">Rysunek 4B).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Testy metaboliczne komórek 
	UWAGA: Wskaźnik zużycia tlenu (OCR) i wskaźnik zakwaszenia zewnątrzkomórkowego (ECAR) żywych komórek zostały zmierzone zgodnie z protokołem producenta (patrz Tabela materiałów).
	<ol>
		<li>Na jeden dzień przed badaniem pozwól astrocytom przylegać do mikropłytki (gęstość wysiewu 1,5 ×10 4) w pożywce CNTF i inkubować w temperaturze 37 °C z 5% CO2 .</li>
		<li>Do testu stresu glikolizy:
		<ol>
			<li>Zastąp pożywkę do hodowli komórkowej pożywką zasadową uzupełnioną 2 mM glutaminą (pH dostosowaną do 7,4) i inkubuj w komorze niezawierającejCO2 w temperaturze 37 °C przez 1 h. 
			UWAGA: pH należy dostosować w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C.</li>
			<li>Włóż płytkę wkładu do przyrządu, aby skalibrować czujnik. Po kalibracji zastąp płytkę wkładu płytką do hodowli komórkowej przy końcowym stężeniu następujących składników zestawu: 10 mM glukozy, 1 μM oligomycyny i 50 mM 2-deoksy-glukozy (2-DG) (<silna klasa="xfig">Rysunek 5A).</li>
			<li>Pod koniec badania poddać komórki lizie i oszacować całkowitą zawartość białka.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Do testu stresu mitochondrium:
		<ol>
			<li>Zastąpić pożywkę CNTF pożywką zasadową uzupełnioną 2 mM glutaminy, 1 mM pirogronianu, 10 mM glukozy (pH dostosowane do 7,4) w łaźni wodnej w temperaturze 37 °C.</li>
			<li>Inkubować płytkę w komorze niezawierającejCO2 w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę. W międzyczasie włóż płytkę wkładu do przyrządu, aby skalibrować czujnik.</li>
			<li>Po kalibracji zastąp płytkę wkładu płytką do hodowli komórkowej o końcowym stężeniu następujących składników zestawu: 1,5 μM oligomycyny, 1 μM cyjanku karbonylu-4 (trifluorometoksy) fenylohydrazonu (FCCP) i 0,5 μM rotenonu/antymycyny A (<klasa silna = "xfig" >Rysunek 5C).</li>
			<li>Pod koniec badania poddać komórki lizie i oszacować całkowitą zawartość białka.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Santoro, M. R., Bray, S. M., Warren, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+of+fragile+X+syndrome%3A+A+twenty-year+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Pathol%22%5BJournal%5D)">Molecular of fragile X syndrome: A twenty-year perspective.</a> Annu Rev Pathol. 7, 219-245 (2012).</li>
<li>Wang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmentally-programmed+FMRP+expression+in+oligodendrocytes%3A+A+potential+role+of+FMRP+in+regulating+translation+in+oligodendroglia+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Genet%22%5BJournal%5D)">Developmentally-programmed FMRP expression in oligodendrocytes: A potential role of FMRP in regulating translation in oligodendroglia progenitors.</a> Hum Mol Genet. 13 (1), 79-89 (2004).</li>
<li>Pacey, L. K. K., Doering, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+expression+of+FMRP+in+the+astrocyte+lineage%3A+Implications+for+fragile+X+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Developmental expression of FMRP in the astrocyte lineage: Implications for fragile X syndrome.</a> Glia. 55 (15), 1601-1609 (2007).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+and+characterization+of+progenitor+and+mature+human+astrocytes+reveals+transcriptional+and+functional+differences+with+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Purification and characterization of progenitor and mature human astrocytes reveals transcriptional and functional differences with mouse.</a> Neuron. 89 (1), 37-53 (2016).</li>
<li>Allen, N. J., Barres, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroscience%3A+Glia+-+more+than+just+brain+glue%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Neuroscience: Glia - more than just brain glue.</a> Nature. 457 (7230), 675-677 (2009).</li>
<li>Khakh, B. S., McCarthy, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrocyte+calcium+signaling%3A+From+observations+to+functions+and+the+challenges+therein%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Perspect+Biol%22%5BJournal%5D)">Astrocyte calcium signaling: From observations to functions and the challenges therein.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 7 (4), a020404(2015).</li>
<li>Allen, N. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrocyte+glypicans+4+and+6+promote+formation+of+excitatory+synapses+via+GluA1+AMPA+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Astrocyte glypicans 4 and 6 promote formation of excitatory synapses via GluA1 AMPA receptors.</a> Nature. 486 (7403), 410-414 (2012).</li>
<li>Chung, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+and+molecular+interrogation+of+intact+biological+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structural and molecular interrogation of intact biological systems.</a> Nature. 497 (7449), 332-337 (2013).</li>
<li>Rothstein, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Knockout+of+glutamate+transporters+reveals+a+major+role+for+astroglial+transport+in+excitotoxicity+and+clearance+of+glutamate%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Knockout of glutamate transporters reveals a major role for astroglial transport in excitotoxicity and clearance of glutamate.</a> Neuron. 16 (3), 675-686 (1996).</li>
<li>Almad, A., Maragakis, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+stocked+toolbox+for+understanding+the+role+of+astrocytes+in+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurol%22%5BJournal%5D)">A stocked toolbox for understanding the role of astrocytes in disease.</a> Nat Rev Neurol. 14 (6), 351-362 (2018).</li>
<li>Zhang, Y., Barres, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrocyte+heterogeneity%3A+An+underappreciated+topic+in+neurobiology%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Astrocyte heterogeneity: An underappreciated topic in neurobiology.</a> Curr Opin Neurobiol. 20 (5), 588-594 (2010).</li>
<li>Clarke, L. E., Barres, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+roles+of+astrocytes+in+neural+circuit+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Emerging roles of astrocytes in neural circuit development.</a> Nat Rev Neurosci. 14 (5), 311-321 (2013).</li>
<li>Bradley, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regionally+specified+human+pluripotent+stem+cell-derived+astrocytes+exhibit+different+molecular+signatures+and+functional+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Regionally specified human pluripotent stem cell-derived astrocytes exhibit different molecular signatures and functional properties.</a> Development. 146 (13), dev170910(2019).</li>
<li>Das Sharma, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrocytes+mediate+cell+non-autonomous+correction+of+aberrant+firing+in+human+FXS+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Astrocytes mediate cell non-autonomous correction of aberrant firing in human FXS neurons.</a> Cell Rep. 42 (4), 112344(2023).</li>
<li>Chambers, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+neural+conversion+of+human+ES+and+iPS+cells+by+dual+inhibition+of+SMAD+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling.</a> Nat Biotechnol. 27 (3), 275-280 (2009).</li>
<li>Hu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+JAK%2FSTAT+signaling+pathway%3A+from+bench+to+clinic%5BTitle%5D)+AND+%22Sig+Transduct+Target+Ther%22%5BJournal%5D)">The JAK/STAT signaling pathway: from bench to clinic.</a> Sig Transduct Target Ther. 6, 402(2021).</li>
<li>Baser, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Onset+of+differentiation+is+post-transcriptionally+controlled+in+adult+neural+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Onset of differentiation is post-transcriptionally controlled in adult neural stem cells.</a> Nature. 566 (7742), 100-104 (2019).</li>
<li>Pal, R., Bhattacharya, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modelling+protein+synthesis+as+a+biomarker+in+fragile+x+syndrome+patient-derived+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Sci%22%5BJournal%5D)">Modelling protein synthesis as a biomarker in fragile x syndrome patient-derived cells.</a> Brain Sci. 9 (3), 1-12 (2019).</li>
<li>Gross, C., Bassell, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Excess+protein+synthesis+in+FXS+patient+lymphoblastoid+cells+can+be+rescued+with+a+p110%CE%B2-selective+inhibitor%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Excess protein synthesis in FXS patient lymphoblastoid cells can be rescued with a p110β-selective inhibitor.</a> J Mol Med. 18 (3), 336-345 (2012).</li>
<li>Kumari, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+fragile+X+syndrome+specific+molecular+markers+in+human+fibroblasts%3A+A+useful+model+to+test+the+efficacy+of+therapeutic+drugs%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mutat%22%5BJournal%5D)">Identification of fragile X syndrome specific molecular markers in human fibroblasts: A useful model to test the efficacy of therapeutic drugs.</a> Hum Mutat. 35 (12), 1485-1494 (2014).</li>
<li>Jacquemont, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+synthesis+levels+are+increased+in+a+subset+of+individuals+with+fragile+X+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Genet%22%5BJournal%5D)">Protein synthesis levels are increased in a subset of individuals with fragile X syndrome.</a> Hum Mol Genet. 27 (12), 2039-2051 (2018).</li>
<li>Bowser, D. N., Khakh, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ATP+excites+interneurons+and+astrocytes+to+increase+synaptic+inhibition+in+neuronal+networks%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">ATP excites interneurons and astrocytes to increase synaptic inhibition in neuronal networks.</a> J Neurosci. 24 (39), 8606-8620 (2004).</li>
<li>Schmunk, G., Boubion, B. J., Smith, I. F., Parker, I., Gargus, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shared+functional+defect+in+IP3R-mediated+calcium+signaling+in+diverse+monogenic+autism+syndromes%5BTitle%5D)+AND+%22Transl+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Shared functional defect in IP3R-mediated calcium signaling in diverse monogenic autism syndromes.</a> Transl Psychiatry. 5 (9), e643-e710 (2015).</li>
<li>Peteri, U. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+the+human+pluripotent+stem-cell-derived+astrocyte+model+with+forebrain+identity%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Sci%22%5BJournal%5D)">Generation of the human pluripotent stem-cell-derived astrocyte model with forebrain identity.</a> Brain Sci. 11 (2), 209(2021).</li>
<li>Alvarez-Mora, M. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impaired+mitochondrial+function+and+dynamics+in+the+pathogenesis+of+FXTAS%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Impaired mitochondrial function and dynamics in the pathogenesis of FXTAS.</a> Mol Neurobiol. 54 (9), 6896-6902 (2017).</li>
<li>Giulivi, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+dysfunction+in+autism%5BTitle%5D)+AND+%22JAMA%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial dysfunction in autism.</a> JAMA. 304 (21), 2389-2396 (2010).</li>
<li>Anitha, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain+region-specific+altered+expression+and+association+of+mitochondria-related+genes+in+autism%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Autism%22%5BJournal%5D)">Brain region-specific altered expression and association of mitochondria-related genes in autism.</a> Mol Autism. 3 (1), 12(2012).</li>
<li>Teves, J. M. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parkinson%27s+disease+skin+fibroblasts+display+signature+alterations+in+growth%2C+redox+homeostasis%2C+mitochondrial+function%2C+and+autophagy%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Parkinson's disease skin fibroblasts display signature alterations in growth, redox homeostasis, mitochondrial function, and autophagy.</a> Front Neurosci. 11, 737(2018).</li>
<li>Yao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+bioenergetic+deficit+precedes+Alzheimer%27s+pathology+in+female+mouse+model+of+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial bioenergetic deficit precedes Alzheimer's pathology in female mouse model of Alzheimer's disease.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 106 (34), 14670-14675 (2009).</li>
<li>Sonntag, K. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Late-onset+Alzheimer%27s+disease+is+associated+with+inherent+changes+in+bioenergetics+profiles%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Late-onset Alzheimer's disease is associated with inherent changes in bioenergetics profiles.</a> Sci Rep. 7 (1), 14038(2017).</li>
</ol>

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

W tym miejscu opisujemy metodę generowania ludzkich astrocytów pochodzących z iPSC, które służą jako platforma testowa do charakteryzowania zmian funkcjonalnych wywołanych przez FXS. Te astrocyty są funkcjonalnie zdolne do życia w hodowli i wykazują różne właściwości, o czym świadczy szereg pomiarów przeprowadzonych w niniejszym badaniu. Kluczowym krokiem w tym protokole jest wstępna konwersja iPSC do kortykosfery przy użyciu metody enzymatycznego liftingu. Na tym etapie kluczowe znaczenie ma optymalizacja czasu inkubacj...

Zespół łamliwego chromosomu X (FXS), powszechna dziedziczna forma niepełnosprawności intelektualnej i zaburzenia ze spektrum autyzmu (ASD), jest spowodowany brakiem kruchej rybonukleoproteiny przekaźnika X (FMRP) wytwarzanej przez gen łamliwej rybonukleoproteiny X przekaźnika 1 (FMR1) (OMIM: #300624, https://www.omim.org/entry/300624). FMRP odgrywa rolę w regulacji translacji mRNA, tworzeniu i transporcie granulek mRNA oraz regulacji ekspresji genów za pośrednictwem mikroRNA1. Tak więc utrata FMRP wpływa nie tylko na rozwój mózgu, ale także na funkcjonowanie mózgu osoby dorosłej. Zarówno poziomy transkryptu mRNA FMR1, jak i barwienie immunologiczne FMRP w mózgu wykazały wysoką ekspresję neuronalną, a także znaczącą ekspresję w komórkach glejowych2. Jednak zdecydowana większość wcześniejszych badań na zwierzęcych modelach FXS koncentrowała się przede wszystkim na neuronach i aberracjach w ich funkcji. W związku z tym niewiele wiadomo na temat roli gleju w FXS3. Tradycyjnie uważane za komórki "pasywnego wsparcia"4, istnieje coraz więcej dowodów na to, że astrocyty odgrywają kluczową rolę w pośredniczeniu w szerokim zakresie funkcji neuronalnych5,6, w tym promowanie synaptogenezy7, udoskonalanie rozwijających się obwodów neuronowych8 oraz recykling neuroprzekaźników9. Równolegle istnieje coraz więcej dowodów na rolę astrocytów w patogenezie choroby, a wiele schorzeń neurologicznych wiąże się z dysfunkcją astrocytów10.
Podczas gdy większość wcześniejszych prac z wykorzystaniem zwierzęcych modeli FXS skupiała się na identyfikacji i walidacji różnych celów molekularnych w neuronach do leczenia FXS, te przedkliniczne wyniki nie zawsze prowadziły do pomyślnych wyników klinicznych. Co więcej, niepowodzenia w ostatnich badaniach klinicznych również podkreślają potrzebę stosowania systemów modelowych opartych na ludziach. Modele zaburzeń neurologicznych oparte na komórkach mózgowych pochodzących z ludzkich komórek macierzystych oferują potężną strategię wypełniania tej luki między mechanistycznymi spostrzeżeniami z badań na zwierzętach a ograniczonym sukcesem w zakresie wyników klinicznych dla pacjentów. Jednak tylko garstka z tych badań koncentrowała się na astrocytach i to głównie na astrocytach pochodzenia rdzeniowego. To z kolei jest istotne w świetle badań pokazujących, że struktura i funkcja astrocytów różnią się w zależności od regionu mózgu11,12. W związku z tym lepsze zrozumienie zmian wywołanych chorobą w ludzkich astrocytach musi również uwzględniać te specyficzne dla regionu mózgu różnice w astrocytach. Jednak modele zaburzeń neurorozwojowych wykorzystujące astrocyty pochodzące z ludzkich komórek macierzystych, które są specyficzne dla przodomózgowia, pozostają stosunkowo słabo zbadane13. Stąd, aby zacząć zajmować się tymi lukami, opisujemy protokoły generowania astrocytów specyficznych dla przodomózgowia z indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC) pochodzących od pacjenta przenoszących mutacje FXS; Ponadto pokazujemy, że astrocyty są funkcjonalne i wykazują zmieniony metabolizm.

<table><tbody><tr><td>1-Tioglycerol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6145</td><td></td></tr><tr><td>Accutase&nbsp; roztwór</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6964</td><td>Pożywka do oddzielania komórek enzymatycznych&nbsp;</td></tr><tr><td>Sól magnezowa adenozyno-5&prime;-trifosforanu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9187</td><td></td></tr><tr><td>Advanced DMEM/F-12</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>12634010</td><td></td></tr><tr><td>Antybiotyk-Przeciwgrzybicza (100x)</td><td>Suplement ThermoFisher Scientific</td><td>15240062</td><td></td></tr><tr><td>B-27 (50x), bez surowicy</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>Albumina</td> <td>surowicy bydlęcejSigma-Aldrich</td><td>A9418</td><td></td></tr><tr><td>Chemicznie zdefiniowany koncentrat lipidowy</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11905031</td><td></td></tr><tr><td>Kolagenaza typu IV, proszek</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>17104019</td><td></td></tr><tr><td>Deoksyrybonukleaza I</td><td>Worthington Biochemical Corporation</td><td>LK003170</td><td></td></tr><tr><td>Dimetylosulfotlenek</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>Dispase II, proszek</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>17105041</td><td></td></tr><tr><td>DPBS, bez wapnia, bez magnezu</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>14190144</td><td></td></tr><tr><td>Essential 8 Medium</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A1517001</td><td></td></tr><tr><td>FXS1, FXS2&nbsp;</td><td>Instytut Badań Medycznych Coriell&nbsp;</td><td>GM07072, GM05848</td><td>Komórki pacjenta FXS</td></tr><tr><td>Suplement GlutaMAX</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>35050061</td><td>substytut glutaminy</td></tr><tr><td>Mieszanka składników odżywczych Ham's F-12</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11765054</td><td></td></tr><tr><td>Zdrowe komórki kontrolne&nbsp;</td><td>Centrum Medyczne Cedars-Sinai&nbsp;</td><td>ND30625</td><td>zdrowych komórek kontrolnych&nbsp;</td></tr><tr><td>Heparyna sól sodowa z błony śluzowej jelit świń</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3149</td><td></td></tr><tr><td>IMDM</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>12440053</td><td></td></tr><tr><td>Insulina, ludzka</td><td>Roche</td><td>11376497001</td><td></td></tr><tr><td>LDN 193189&nbsp;</td><td>Stratech Scientific</td><td>S2618-SEL</td><td></td></tr><tr><td>Czynnik hamujący białaczkę ludzki</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L5283</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel&nbsp; Matryca błony podstawnej o obniżonym współczynniku wzrostu (GFR)</td><td>Corning</td><td>354230</td><td></td></tr><tr><td>MEM Roztwór aminokwasów endogennych (100x)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11140050</td><td></td></tr><tr><td>Mysz FGF-basic (FGF-2/bFGF) Rekombinowane białko</td><td>Peprotech</td><td>450-33</td><td></td></tr><tr><td>Mr. Frosty Pojemnik do zamrażania ThermoFisher</td><td>Scientific</td><td>5100-0001</td><td>Cryobox</td></tr><tr><td>N-2 Suplement (100x)</td> <td>ThermoFisher Scientific</td><td>17502048</td><td></td></tr><tr><td>N-acetylo-L-cysteina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9165</td><td></td></tr><tr><td>Pożywka neurobazalna</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>21103049</td><td></td></tr><tr><td>Nunc Biobank i probówki kriogeniczne do hodowli komórkowych</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>377267</td><td></td></tr><tr><td>Nunc Hodowla komórkowa 6-dołkowa</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>140675</td><td></td></tr><tr><td>System dysocjacji papainy</td><td>Worthington Biochemical Corporation</td><td>LK003150</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina-Streptomycyna</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinowane ludzkie białko CNTF, CF&nbsp;</td><td>R& D Systems</td><td>257-NT-010</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinowane ludzkie białko EGF, CF</td><td>R& D Systems</td><td>236-EG-01M</td><td></td></tr><tr><td>Suplement RevitaCell (100x)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A2644501</td><td></td></tr><tr><td>SB431542</td> Analizator <td>Tocris</td><td>1614</td><td></td></tr><tr><td>Seahorse XFe24&nbsp;</td>Zestaw do testów wysiłkowych <td>Agilent Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Seahorse XF Cell Mito</td><td>Agilent Technologies</td><td>103015-100</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do testów wysiłkowych glikolizy Seahorse XF</td><td>Agilent Technologies</td><td>103020-100</td><td></td></tr><tr><td>Naczynia do hodowli tkankowych-100 cm</td><td>Biostar Lifetech</td><td>TCD000100</td><td></td></tr><tr><td>Transferyna</td><td>Roche</td><td>10652202001</td><td></td></tr><tr><td>maszynka do golenia VWR Ostrza</td><td>VWR International</td><td>55411-050</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>przeciwciała&nbsp; </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało pierwszorzędowe<</td><td>strong>Company</td><td>Numer katalogowy</td><td>Rozcieńczenie</td></tr><tr><td>Oct4 (C-10)</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-5279</td><td>Rozcieńczenie: 1:250 Przeciwciało drugorzędowe: kozia anty-mysia IgG, Alexa Fluor 568</td></tr><tr><td>Nanog</td><td>R & D Systems</td><td>AF1997</td><td>Rozcieńczenie: 1:100 Przeciwciało drugorzędowe: IgG anty-kozi osła, Alexa Fluor 488</td></tr><tr><td>Vimentin</td><td>Abcam</td><td>Ab5733</td><td>Rozcieńczenie: 1:500 Przeciwciało drugorzędowe: Kozia anty-IgY kurczaka, Alexa Fluor 488</td></tr><tr><td>NFIA</td><td>Abcam</td><td>Ab41851</td><td>Rozcieńczenie: 1:500 Przeciwciało drugorzędowe: Kozia anty-królicza IgG, Alexa Fluor 568</td></tr><tr><td>GFAP-cy3</td><td>Sigma</td><td>C9205</td><td>Rozcieńczenie: 1:500 Przeciwciało drugorzędowe: NA</td></tr><tr><td>GFAP</td><td>DAKO</td><td>Z0334</td><td>Rozcieńczenie: 1:500 Przeciwciało drugorzędowe: Kozia anty-królicza IgG, Alexa Fluor 568</td></tr><tr><td>S100 i beta;</td><td>DAKO</td><td>IR504</td><td>Rozcieńczenie: 1:500 Przeciwciało drugorzędowe: przeciwciało anty-królicze IgG, przeciwciało antyjądrowe Alexa Fluor 488</td></tr><tr><td>, klon 235-1</td><td>Merck Millipore</td><td>MAB1281</td><td>Rozcieńczenie: 1:1000 Przeciwciało drugorzędowe: Kozia anty-mysia IgG1, Alexa Fluor 555</td></tr><tr><td>Przeciwciała drugorzędowe&nbsp; </td><td></td><td></td><td>Rozcieńczenie</td></tr><tr><td>Goat anty-mysie IgG, Alexa Fluor 568</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp;</td><td>A11004</td><td>1:1000</td></tr><tr><td>Osioł anty-kozi IgG, Alexa Fluor 488</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp;</td><td>A11055</td><td>1:1000</td></tr><tr><td>Koza anty-Chicken IgY, Alexa Fluor 488</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp;</td><td>A11039</td><td>1:1000</td></tr><tr><td>Kozia anty-królicza IgG, Alexa Fluor 568</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp;</td><td>A11011</td><td>1:1000</td></tr><tr><td>Kozia anty-królicza IgG, Alexa Fluor 488</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp;</td><td>A11034</td><td>1:1000</td></tr><tr><td>Kozia anty-mysia IgG1, Alexa Fluor 555</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp;</td><td>A21127</td><td>1:1000</td></tr></tbody></table>

wytwarzanie i charakterystyka indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych astrocytów pochodzących z komórek macierzystych, pozbawionych kruchej rybonukleoproteiny przekaźnika x

Generation and Characterization of Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Astrocytes Lacking Fragile X Messenger Ribonucleoprotein

Zespół łamliwego chromosomu X (FXS), główna dziedziczna przyczyna zaburzeń ze spektrum autyzmu i niepełnosprawności intelektualnej, był intensywnie badany przy użyciu modeli gryzoni. Ostatnio systemy modelowe pochodzące z ludzkich komórek macierzystych zostały również wykorzystane do uzyskania mechanistycznego wglądu w patofizjologię FXS. Jednak badania te koncentrowały się prawie wyłącznie na neuronach. Co więcej, pomimo coraz większej liczby dowodów na kluczową rolę gleju w funkcjonowaniu neuronów w zdrowiu i chorobie, niewiele wiadomo o tym, jak FXS wpływa na ludzkie astrocyty.
Dlatego w tym badaniu udało nam się opracować protokół, który rejestruje kluczowe czasoprzestrzenne kamienie milowe rozwoju mózgu i dostosowuje się również do procesu glejogenezy. Razem daje to użyteczne ramy do badania zaburzeń neurorozwojowych. Po pierwsze, ukształtowaliśmy indukowane przez człowieka pluripotencjalne komórki macierzyste w linii neuroektodermalnej z podwójnym supresorem matek przeciwko hamowaniu dekapentaplegii (SMAD) i małymi cząsteczkami. Następnie wykorzystaliśmy specyficzne czynniki wzrostu i cytokiny do wygenerowania komórek progenitorowych astrocytów pochodzących od pacjenta (CTRL) i FXS. Leczenie APC neurotroficznym czynnikiem rzęskowym, cytokiną różnicującą, regulowało i prowadziło komórki progenitorowe w kierunku dojrzewania astrocytarnego, dając specyficzne dla gleju fibrylarne astrocyty wykazujące ekspresję białka kwasowego.
Stwierdziliśmy, że te astrocyty są funkcjonalne, o czym świadczą ich reakcje wapniowe na aplikację ATP, i wykazują rozregulowany metabolizm glikolityczny i mitochondrialny w FXS. Podsumowując, odkrycia te stanowią użyteczną platformę eksperymentalną pochodzenia ludzkiego do badania autonomicznych i nieautonomicznych komórek konsekwencji zmian w funkcji astrocytarnej spowodowanych zaburzeniami neurorozwojowymi.

Kolonie ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (hiPSC) utrzymywano z użyciem komercyjnie dostępnego zdefiniowanego medium i barwiono immunocytochemicznie w kierunku markerów pluripotencji, Oct4 i Nanog (Rycina 1B). APC z linii FXS i CTRL wykazywały porównywalnie wysokie proporcje komórek immunopozytywnych dla wimentyny i NFIA (Rycina 1C,D). Stwierdzono, że APC pochodzące z hiPSC zdrowych o...

Tutaj opisujemy protokół, który ułatwia różnicowanie ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych w funkcjonalne astrocyty specyficzne dla przodomózgowia. Umożliwia to badania nad rolą komórek glejowych w patogenezie zaburzeń neurorozwojowych, takich jak zespół łamliwego chromosomu X, oraz modelowanie innych zaburzeń mózgu.

Wytwarzanie i charakterystyka indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych astrocytów pochodzących z komórek macierzystych, pozbawionych kruchej rybonukleoproteiny przekaźnika X

Fragile X syndrome (FXS), a leading inherited cause of autism spectrum disorder and intellectual disability, has been studied extensively using rodent ...

Praca ta koncentruje się na czterech ludzkich astrocytach specyficznych dla mózgu i ich zmianach w wyniku zaburzeń neurorozwojowych, takich jak zespół łamliwego chromosomu X. Wcześniejsze prace wykorzystywały modele zwierzęce do badania głównie neuronów, więc ta praca nadaje nowy wymiar temu obszarowi badań.Mechanistyczne spostrzeżenia z badań na zwierzętach spotkały się z ograniczonym sukcesem klinicznym. Głównym wyzwaniem jest uzyskanie podobnych informacji na temat neuronów i astrocytów pochodzenia ludzkiego.W ramach naszego protokołu udało się wygenerować funkcjonalne astrocyty specyficzne dla wiatru, które wykazują rozregulowany, glikolityczny i mitochondrialny metabolizm w zespole łamliwego chromosomu X, umożliwiając badania nad rolą komórek glejowych w biologii choroby. Pomimo coraz większej liczby dowodów na kluczową rolę gleju w funkcjonowaniu neuronów w zdrowiu i chorobie, niewiele wiadomo na temat wpływu ludzkich astrocytów na zaburzenia neurorozwojowe, takie jak zespół łamliwego chromosomu X.Patrząc w przyszłość, będziemy opierać się na tych ramach, aby zbadać, w jaki sposób astrocyty i ich interakcje z neuronami są zmieniane przez chorobę, a następnie, jak można je skorygować za pomocą interwencji terapeutycznych.[Instruktor] Na początek pokryj naczynie z sześcioma pęczniejącymi Matrigelem rozcieńczonym w stosunku 1 do 60 w zaawansowanym DMMF 12. Panierowane naczynie przechowuj w temperaturze od dwóch do ośmiu stopni Celsjusza. W dniu hodowli należy usunąć materiał powlekający z naczynia i dodać jeden mililitr kompletnego niezbędnego podłoża ósemkowego wraz z inhibitorem skał o końcowym stężeniu jednego X. Umieścić naczynie w inkubatorze. Ustaw na 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla przed dodaniem ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych lub IPSC. Wysiewaj ludzkie IPSC w kompletnej, niezbędnej ósemce z inhibitorem skał o końcowym stężeniu jednego X, aby zwiększyć przyleganie kolonii. Następnego dnia należy wymienić kompletną ósemkę zasadniczą na świeżą pożywkę, pozbawioną inhibitora skały. Kontynuuj codzienne uzupełnianie pożywki, aż komórki osiągną 80% konfluencji, co zajmuje około czterech do pięciu dni. Gdy kolonie osiągną 80% konfluencji, dodaj mieszaninę kolagenazy i dypazy, aby enzymatycznie oderwać je od naczynia. Gdy kolonie zaczną się podnosić, wyjmij naczynie z inkubatora i dodaj dwa mililitry DPBS, aby zneutralizować aktywność enzymu. Za pomocą DPBS zeskrobać kolonie i zebrać zawiesinę do stożkowej probówki o pojemności 15 mililitrów, używając szerokiej deski 10 mililitrowej pipety serologicznej. Następnie, za pomocą 10-mililitrowej pipety serologicznej, delikatnie rozetrzeć zawiesinę dwa do trzech razy, aby rozbić kolonie. Pozwól koloniom się osiedlić. Po około dwóch minutach odessać mieszaninę enzymów DPBS, pozostawiając około jednego mililitra płynu w probówce. Następnie dodaj dwa mililitry DPBS do probówki i wymieszaj, delikatnie stukając, aby ponownie zawiesić kolonie. Pozwól im się uspokoić i powtórz ten proces dwa razy, aby usunąć resztki enzymu. Po usunięciu supernatantu ponownie zawiesić kolonie w jednym mililitrze kompletnej pożywki z ośmiu niezbędnych składników i umieścić je w świeżo przygotowanym naczyniu pokrytym Matrigelem. Enzymatycznie podnieś indukowane przez człowieka pluripotencjalne komórki macierzyste, jak opisano wcześniej. Umieść je na nieprzylegającym 100-milimetrowym naczyniu do hodowli zawiesiny z chemicznie zdefiniowanym podłożem. Umieść zawiesinę komórek na wytrząsarce orbitalnej z prędkością 40 obrotów na minutę przez siedem dni w warunkach normoksyjnych, aby ułatwić rozwój sfer korowych. Ósmego dnia przenieś kulki korowe do pożywki proliferacyjnej komórek i utrzymuj je przez siedem dni. Aby wywołać specyfikację glejową, inkubuj sfery korowe w pożywce wzbogacającej glej przez dwa tygodnie, aby uzyskać wczesne sfery glejowe. W celu dojrzewania wczesnych sfer glejowych zastąp podstawowy czynnik wzrostu fibroblastów H 20 nanogramami na mililitr czynnika hamującego białaczkę i utrzymuj kulki przez cztery tygodnie.Po czterech tygodniach w pożywce do dojrzewania kontynuuj utrzymywanie kulek w pożywce do wzbogacania gleju przez dłuższy czas. Aby zapobiec agregacji i utracie żywotności, kulki gleju należy mechanicznie siekać co dwa tygodnie za pomocą sterylnego ostrza przemysłowego. Zastąp całe podłoże DNazą, aby usunąć fragmenty DNA powstałe w wyniku siekania. Następnie rozdziel sfery gleju na mono warstwy komórek progenitorowych astrocytów za pomocą zestawu do dysocjacji papainy. Umieść zdysocjowane komórki na kulturze komórkowej, potraktowanej przylegającej misce wstępnie pokrytej Matrigelem w rozcieńczeniu od 1 do 80. Rozmnażaj komórki progenitorowe astrocytów w pożywce wzbogacającej glej, aż osiągną 80% zbiegalności. Przejście komórek usuwa zużyte podłoże i zbiera je w stożkowej probówce. Dodaj pożywkę enzymatyczną do oddzielania komórek do komórek i odczekaj od jednej do dwóch minut. Gdy komórki zaczną się odłączać, dodaj zużytą pożywkę, aby zneutralizować aktywność enzymu. Zebrać zawiesinę komórkową i odwirować przy 800 G przez dwie minuty. Po odrzuceniu supernatantu ponownie zawiesić komórki w pożywce wzbogacającej glej. Płytkę około 10 razy 10 do mocy sześciu komórek na studzienkę na naczyniu pokrytym Matrigelem w rozcieńczeniu od jednego do 80. W celu kriokonserwacji ponownie zawiesić osad komórkowy w zimnej mieszaninie 90% pożywki do proliferacji kul korowych i 10% krioprotektantu. Przenieś ponownie zawieszone komórki do fiolek kriogenicznych. Natychmiast przenieś fiolki kriogeniczne do pudełka kriogenicznego i przechowuj w zamrażarce w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza przez noc. Następnego dnia przenieś wszystkie fiolki kriogeniczne do zbiornika z ciekłym azotem w celu długotrwałego przechowywania. Scharakteryzuj zdysocjowane komórki progenitorowe astrocytów przez barwienie immunologiczne markerami Vimenton i czynnika jądrowego IAM. Aby potwierdzić czteroobszarową specyficzność mózgu ludzkich APC pochodzących z IPSC, przeprowadź analizę QPCR w czasie rzeczywistym dla ludzkiej skrzynki widelcowej G1 i ludzkiej skrzynki homeo, B4. Różnicuj APC w astrocyty i pożywkę różnicowania astrocytarnego przez 14 dni. Umieść astrocyty na 35-milimetrowym szklanym dnie, o gęstości pięć razy 10 do mocy trzech komórek na naczynie, aby zmierzyć ich odpowiedź na adenozyno-pięciotrifosforan. Pozwól komórkom przylegać do szklanego dna przez 24 godziny. Umyj przylegające komórki trzykrotnie zrównoważonym roztworem soli Hanka bez wapnia. Następnie inkubować komórki w pożywce hodowlanej zawierającej diureide metryczny o stosunku pięciu mikromolów 2:00 AM i 0,02% pluronu F127 przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej. Po dwukrotnym umyciu komórek pożywką hodowlaną, zastąp pożywkę dwumilimolowym roztworem wapnia zawierającym zrównoważony roztwór soli Hanka. Zobrazuj komórki z prędkością dwóch klatek na sekundę, używając 60-krotnego obiektywu zanurzeniowego w oleju na odwróconym mikroskopie z kompensacją zwierciedli. Na koniec zarejestruj odpowiedzi wapnia wywołane ATP po dodaniu ATP w końcowym stężeniu pięciu milimoli po 25 sekundach. Ludzkie kolonie IPSC wykazywały ekspresję markerów pluripotencjalnych opt four i nano, co potwierdzono barwieniem immunologicznym. APC pochodzące z zespołu łamliwego chromosomu X i linii kontrolnych wykazywały porównywalne proporcje komórek dodatnich wimentyny i NFIA. Komórki progenitorowe astrocytów z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych indukowanych przez człowieka zarówno z grupy kontrolnej, jak i zespołu łamliwego chromosomu X wykazywały regulację w górę Fox G1 w porównaniu z HOXB4, co wskazuje na tożsamość przodomózgowia. Astrocyty pochodzące z ludzkich linii zespołu łamliwego chromosomu X IPSC wykazywały zmniejszoną liczbę ekspresji GFAP. Astrocyty kontrolne i zespół łamliwego chromosomu X wykazywały stany przejściowe wapnia indukowane przez ATP, ale liczba osób reagujących była znacznie niższa w astrocytach zespołu łamliwego chromosomu X. Szczytowa amplituda pierwszego przejściowego wapnia wywołanego ATP była znacznie niższa w astrocytach zespołu łamliwego chromosomu X w porównaniu z komórkami kontrolnymi. Ludzkie astrocyty zespołu łamliwego chromosomu X pochodzące z IPSC wykazały wzrost glikolizy, zdolności glikolitycznej i rezerw glikolitycznych, ale wykazały znaczny spadek maksymalnego oddychania w porównaniu z astrocytami kontrolnymi.

generation-characterization-human-induced-pluripotent-stem-cell

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Film demonstruje metodę generowania astrosfer z komórek progenitorowych z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych. Polega na wzroście i proliferacji komórek macierzystych z pożywkami zawierającymi czynniki wzrostu i inhibitory kinaz. Komórki te następnie agregują się i różnicują w astrocyty, tworząc astrosfery.

Generowanie i utrzymywanie astrosfer przy użyciu ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych

Astrocyty zostały uznane za wszechstronne komórki uczestniczące w podstawowych procesach biologicznych, które są niezbędne do prawidłowego rozwoju i funkcjonowania mózgu oraz naprawy ośrodkowego układu nerwowego. Tutaj przedstawiamy szybką procedurę uzyskiwania czystych hodowli astrocytów myszy w celu zbadania biologii tej głównej klasy komórek ośrodkowego układu nerwowego.

Izolacja i hodowla astrocytów korowych myszy

Astrocyty są jednymi z najważniejszych kluczowych graczy w ośrodkowym układzie nerwowym (OUN). W tym miejscu przedstawiamy praktyczną metodę protokołu hodowli astrocytów w hipokampie płciowym w celu zbadania mechanizmów leżących u podstaw funkcji astrocytów u młodych noworodków płci męskiej i żeńskiej po niedokrwieniu in vitro.

Różnice płci w astrocytach hipokampa myszy po niedokrwieniu in vitro

Modyfikujemy i wdrażamy wcześniej opublikowany protokół opisujący szybkie, powtarzalne i efektywne różnicowanie ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (hiPSC) w pobudzające neurony korowe12. W szczególności nasza modyfikacja pozwala na kontrolę gęstości komórek neuronalnych i wykorzystanie ich na układach mikroelektrod do pomiaru właściwości elektrofizjologicznych na poziomie sieci.

Szybkie różnicowanie neuronalne indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych do pomiaru aktywności sieci na układach mikroelektrod

Opisujemy protokół przeprogramowania fibroblastów pochodzących z ludzkiej skóry w indukowane neuronalne komórki progenitorowe (iNPC), a następnie ich różnicowanie w indukowane astrocyty (iAs). Metoda ta prowadzi do szybkiego i powtarzalnego generowania iNPC i iA w dużych ilościach.

Modelowanie in vitro chorób neurologicznych z wykorzystaniem bezpośredniej konwersji z fibroblastów do neuronalnych komórek progenitorowych i różnicowania w astrocyty

Opracowaliśmy metodę, która wzbogaca i izoluje ludzkie populacje astrocytów ze świeżo zamrożonej tkanki do wykorzystania w dalszych analizach molekularnych.

Izolacja populacji astrocytów dorosłych ludzi ze świeżo zamrożonej kory mózgowej przy użyciu sortowania jąder aktywowanych fluorescencją

Opisujemy metodę różnicowania rdzenia kręgowego, indukowanych przez człowieka astrocytów i neuronów pochodzących z pluripotencjalnych źródeł oraz ich wspólnej hodowli do zapisu elektrofizjologicznego.

Stworzenie platformy elektrofizjologicznej do modelowania ALS z wykorzystaniem specyficznych regionalnie astrocytów i neuronów pochodzących z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych

Opisano dwie powiązane metody wizualizacji zdarzeń subkomórkowych wymaganych do transmisji synaptycznej. Protokoły te umożliwiają monitorowanie w czasie rzeczywistym dynamiki napływu presynaptycznego wapnia i fuzji błony pęcherzyków synaptycznych przy użyciu obrazowania żywych komórek neuronów hodowanych in vitro.

Fluorescencyjny pomiar funkcji synaptycznych w czasie rzeczywistym w modelach stwardnienia zanikowego bocznego

Tutaj opisujemy szczegółowy protokół generowania wysoce wzbogaconych kultur astrocytów pochodzących z różnych regionów ośrodkowego układu nerwowego myszy po urodzeniu i ich bezpośredniej konwersji w funkcjonalne neurony przez wymuszoną ekspresję czynników transkrypcyjnych.

Izolacja i bezpośrednie przeprogramowanie neuronów astrocytów myszy

My, opierając się na wiedzy z biologii rozwojowej i opublikowanych badaniach, opracowaliśmy zoptymalizowany protokół do efektywnego generowania neuronów dopaminergicznych A9 śródmózgowia zarówno z ludzkich embrionalnych komórek macierzystych, jak i ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych, co byłoby przydatne do modelowania chorób i terapii zastępczej w chorobie Parkinsona.

Ukierunkowane różnicowanie neuronów dopaminergicznych z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych

Poznaj protokół różnicowania ludzkich komórek iPSC w czynnościowe astrocyty przedmózgowiowe. Metoda umożliwia badanie roli komórek glejowych w zaburzeniach neurorozwojowych, takich jak zespół kruchej chromosomu X.

Wytwarzanie i charakterystyka indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych astrocytów pochodzących z komórek macierzystych, pozbawionych kruchej rybonukleoproteiny przekaźnika X (Wideo) | JoVE Journal

Wytwarzanie i charakterystyka indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych astrocytów pochodzących z komórek macierzystych, pozbawionych kruchej rybonukleoproteiny przekaźnika X

Przeglądaj więcej filmów