Name: Edycja epigenomu CRISPR w komórkach ludzkich przy użyciu transfekcji plazmidowego DNA i dostarczania nukleofekcji mRNA (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-05-30T13:40:00.000+00:00
Duration: 7 min 49 s
Description: Poznaj metody edycji epigenomu CRISPR w komórkach ludzkich przy użyciu transfekcji DNA plazmidowego i dostarczania mRNA nukleofekcją. Technika ta umożliwia modulację ekspresji genów bez toksycznych przerwań DNA.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy członkom laboratorium Nuñez, szczególnie Rithu Pattali i Izaiahowi Ornelasowi, za rozwój i optymalizację protokołów opisanych w tym manuskrypcie.

J.K.N. jest wynalazcą patentów związanych z technologiami CRISPRoff/on, zgłoszonych przez Regentów Uniwersytetu Kalifornijskiego.

Protokół ten wyszczególnia dwie różne metody dostarczania przejściowego dla edytorów epigenomu CRISPR: transfekcję plazmidowego DNA i nukleofekcję mRNA. Obie techniki mają unikalne zalety, wady i ogólne rozważania (rysunek 1F).
Transfekcja plazmidowego DNA prowadzi do solidnej ekspresji edytora epigenomu, a my włączamy fuzję BFP do konstruktów edytora epigenomu, która pozwala na wykrywanie i ilościowe określanie skuteczności transfekcji za pomocą cytometrii przepł...

Choć zawartość genomiczna każdej komórki w naszym organizmie jest niemal identyczna, profil transkrypcyjny każdego typu komórek znacząco się różni. Modyfikacje epigenetyczne DNA oraz białek histonowych są kluczowymi regulatorami ekspresji transkrypcyjnej. Transkrypcyjnie aktywna euchromatyna charakteryzuje się odmiennymi znacznikami epigenetycznymi w porównaniu do zwartej, transkrypcyjnie nieaktywnej heterochromatyny. Na przykład regiony heterochromatynowe są definiowane przez represyjne modyfikacje histonów, w tym trimetylację lizyny 9 histonu 3 (H3K9me3), trimetylację lizyny 27 histonu H3 (H3K27me3) oraz metylację DNA cytozyn sąsiadujących z guaninami (CpG) w promotorach genów1. Regiony genomiczne aktywnej ekspresji genów są zazwyczaj definiowane przez acetylację histonów oraz trimetylację lizyny 4 histonu 3 (H3K4me3)1.
Rewolucja CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) dostarczyła bogatego zestawu narzędzi umożliwiających programowane modyfikowanie sekwencji genomicznych. Technologia CRISPR opiera się na prokariotycznym mechanizmie obronnym zdolnym do przecinania kwasów nukleinowych w programowalnych sekwencjach docelowych. Nukleazy CRISPR2,3,4, edytory zasad5,6 oraz edytory prime7,8 mogą zmieniać sekwencję DNA w genomach ssaków poprzez przecinanie DNA i naprawę tych pęknięć. Mimo swojej skuteczności, strategie te mogą powodować pęknięcia DNA w miejscach poza docelowych (off-target)9,10 oraz wielkoskalowe mutacje strukturalne genomu11,12,13,14,15. Alternatywne narzędzia oparte na CRISPR umożliwiają sterowalną modulację aktywacji i represji genów bez zmiany podstawowej sekwencji DNA. Narzędzia te wykorzystują Cas9 z deficytem aktywności nukleazy (dCas9), co pozwala na wiązanie z DNA w miejscach docelowych wyznaczonych przez sekwencję sgRNA, w połączeniu z białkami efektorowymi, które zmieniają krajobraz chromatyny16,17,18. Białka efektorowe, takie jak epigenetyczne „pisarze” (writers), „czytelnicy” (readers) i „wymazywacze” (erasers), mogą być bezpośrednio fuzowane z dCas9 lub rekrutowane za pomocą fuzowanego z dCas9 rusztowania peptydowego, takiego jak SunTag, lub rusztowania RNA w sgRNA, na przykład systemu MS2-MCP16,17,18. Przykładami programowalnych narzędzi kontroli transkrypcji są aktywacja CRISPR (CRISPRa)19,20,21 oraz interferencja CRISPR (CRISPRi)22,23. CRISPRa działa poprzez bezpośrednią rekrutację aparatu transkrypcyjnego, zwiększając docelową ekspresję genów na poziomie transkrypcji19. Z kolei CRISPRi represuje transkrypcję poprzez wprowadzanie H3K9me3, represyjnej marki epigenetycznej22.
Postępy w edycji epigenomu umożliwiły szerokie zastosowanie tych narzędzi w różnych dziedzinach nauki. Fuzje różnych domen efektorowych i białek rozszerzyły zestaw dostępnych edytorów epigenomu18,24,25,26,27,28,29,30. Ponadto edytory epigenomu są wykorzystywane do rozszyfrowania roli modyfikacji epigenetycznych31,32,33,34,35,36, efektorów37,38,39 oraz mutacji efektorów28,40,41 w regulacji genów. W szczególności CRISPRi i CRISPRa są stosowane w genomicznych badaniach funkcjonalnych (screens) dla różnych procesów biologicznych, w tym przeżywalności komórek42 i determinacji losu komórek43,44,45,46,47. Co więcej, edycja epigenomu wykazuje potencjał terapeutyczny w inżynierii komórkowej ex vivo oraz w terapiach in vivo18.
Opisujemy tutaj metody zastosowania dwóch edytorów epigenomu opartych na dCas9 do programowalnej represji transkrypcyjnej w ludzkich liniach komórkowych: CRISPRi22 oraz CRISPRoff48. CRISPRi jest fuzją dCas9 z represyjną domeną KRAB pochodzącą z białka z palcem cynkowym, takiego jak ZNF10 (KOX1) i ZIM322,23. Gdy CRISPRi zostanie skierowany do konkretnego promotora genu, domena KRAB rekrutuje białko SETDB1 (writer H3K9me3), aby zrepresować gen docelowy (Rysunek 1A). W przypadku przejściowej ekspresji CRISPRi, ustanowiona modyfikacja H3K9me3 w locus docelowym nie jest utrzymywana, a ekspresja genu zostaje z czasem przywrócona32,48. Aby przeprowadzić stabilny knockdown za pomocą CRISPRi, na przykład w zastosowaniach genomiki funkcjonalnej, niezbędna jest konstytutywna ekspresja CRISPRi w komórkach wraz z sgRNA. Niedawno zaprojektowano system CRISPRoff w celu programowania dziedzicznego edytowania epigenomu48. CRISPRoff jest pojedynczą białkową fuzją dCas9 z domeną KRAB oraz kompleksem metylotransferazy DNA de novo, DNMT3A i DNMT3L. Przejściowy impuls CRISPRoff w ludzkich komórkach programuje depozycję H3K9me3 oraz metylację DNA w genach docelowych, co prowadzi do długotrwałej represji genów docelowych poprzez utrzymanie metylacji DNA i H3K9me3 (Rysunek 1B)48. Co więcej, zmiany w epigenomie mogą zostać odwrócone. Na przykład gen stabilnie wyciszony przez CRISPRoff może zostać reaktywowany przez TET1-dCas9, który potrafi enzymatycznie usunąć znaki metylacji DNA w locusach docelowych49.
Niniejszy protokół szczegółowo opisuje dwie metody dostarczania dla przejściowej ekspresji edytorów epigenomu: transfekcję plazmidowego DNA oraz nukleofekcję mRNA. Ponadto przedstawiamy sposób wykorzystania cytometrii przepływowej do oceny skuteczności edycji epigenomu w obrębie dwóch genów endogennych, CLTA oraz CD55. Metody te mogą zostać dostosowane i zastosowane w innych eksperymentach z edycji epigenomu przy użyciu dodatkowych edytorów lub mogą służyć do targetowania różnych genów.
<img alt="Schemat wyciszania genów CRISPRi/CRISPRoff; edycja przejściowa, dziedziczna; metoda transfekcji, nukleofekcji." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68089/68089fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Schemat mechanizmu i przebiegu edycji epigenomu za pomocą CRISPRi oraz CRISPRoff. (A) Liniowe schematy transgenu sgRNA i edytora epigenomu CRISPRi. Dodanie CRISPRi i sgRNA umożliwia wprowadzenie represyjnej modyfikacji histonowej H3K9me3 w celu wyciszenia docelowego locus. Najwyższy poziom wyciszenia zostaje osiągnięty wkrótce po dodaniu CRISPRi, a gen docelowy jest zazwyczaj reaktywowany po kilku pasażach. (B) Liniowe schematy transgenu sgRNA i edytora epigenomu CRISPRoff. Dodanie CRISPRoff do komórek celujących w gen zainteresowania prowadzi do wprowadzenia represyjnego H3K9me3 wraz z metylacją DNA w miejscach CpG w celu wyciszenia genu docelowego. Wyciszenie przez CRISPRoff jest dziedziczne – wysoki poziom wyciszenia zostaje osiągnięty wcześnie podczas transfekcji i utrzymuje się przez wiele podziałów komórkowych. (C) Przegląd harmonogramu edycji epigenomu metodą transfekcji. W dniu 0 komórki są wysiewane do transfekcji. W dniu 1 plazmid edytora i przewodnika może zostać wprowadzony do komórek poprzez transfekcję. W dniu 3 komórki zostaną ocenione pod kątem ekspresji BFP za pomocą cytometrii przepływowej. Procent BFP jest wykorzystywany jako czynnik normalizujący do określenia końcowej skuteczności wyciszenia eksperymentu dla każdego warunku. Od dnia 6 komórki są analizowane pod kątem wyciszenia interesującego reportera, ponieważ w tym dniu osiągnięty zostanie najwyższy poziom wyciszenia. (D) Przegląd metody transfekcji, w której plazmidy edytora epigenomu i sgRNA są dodawane do komórek kroplowo. (E) Przegląd harmonogramu edycji epigenomu metodami nukleofekcji. W tym protokole mRNA jest wprowadzane do komórek drogą nukleofekcji w dniu 0. Komórki są oceniane pod kątem wyciszenia w dniu 3 po nukleofekcji za pomocą analizy cytometrii przepływowej. (F) Przegląd protokołu nukleofekcji. Odpowiednie ilości komórek i mRNA są mieszane i dodawane do kuwet nukleofektora. Jeśli sgRNA jest wprowadzane przez nukleofekcję, może zostać również dodane do tej mieszaniny. Kuwety są umieszczane w nukleofektorze i stosuje się odpowiednie kody impulsów, aby wprowadzić mRNA do komórek. Po nukleofekcji komórki są wysiewane i pasażowane w celu analizy w późniejszych dniach. (G) Porównanie strategii transfekcji plazmidowej i nukleofekcji mRNA w edycji epigenomu. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68089/68089fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>

<table><tbody><tr><td>4D-Nucleofector</td><td>Lonza</td><td>AAF-1003</td><td></td></tr><tr><td>96-dołkowe płytki do hodowli tkankowych</td><td>Corning</td><td>3596</td><td></td></tr><tr><td>96-dołkowa płytka dolna w kształcie litery U</td><td>Corning</td><td>351177</td><td></td></tr><tr><td>APC Przeciwciało anty-ludzkie CD55</td><td>BioLegend</td><td>311312</td><td></td></tr><tr><td>BD FACSymphony A1 Cytometr przepływowy</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bleach</td><td>Waxie</td><td></td><td></td></tr><tr><td>11003428432 Wirówka</td><td>Eppendorf</td><td>5425</td><td></td></tr><tr><td>Countess Automatyczny licznik komórek</td><td>Thermo Scientific</td><td>Countess 3</td><td></td></tr><tr><td>Plazmid transfekcji CRISPRoff</td><td>Addgene&nbsp;</td><td></td><td></td>167981</tr><tr><td>Diluent 2 Odczynnik hematologiczny do cytometrii przepływowej (płyn osłonkowy)</td><td>Thermo Scientific</td><td>23-029-361</td><td></td></tr><tr><td>DMEM, Termo Scientific o wysokiej zawartości glukozy</td><td></td><td>11965118</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Gibco</td><td>14-190-250</td><td></td></tr><tr><td>Probówki Eppendorf</td><td>Thomas scientific</td><td>1159M35</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Avantor Seradigm</td><td>89510-186</td><td></td></tr><tr><td>Lonza Walkersville&nbsp; Linia komórkowa SF 4D-Nucleofector X Kit L</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC0281111</td><td></td></tr><tr><td>mMESSAGE mMACHINE&trade; Zestaw do transkrypcji T7 ULTRA</td><td>Thermo Fisher</td><td>AM1345</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM</td><td>Gibco</td><td>31985070</td><td></td></tr><tr><td>probówki paskowe do PCR</td><td>USA Scientific&nbsp;</td><td>1402-4700</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina-Streptomycyna-Glutamina</td><td>Gibco</td><td>10378016</td><td></td></tr><tr><td>plazmid ekspresji pLG1 sgRNA</td><td>Addgene&nbsp;</td><td></td><td></td>217306</tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Gibco</td><td>22-400-105</td><td></td></tr><tr><td>Linia komórkowa SF 96-dołkowy Nucleofector&reg; &nbsp; Zestaw</td><td>Lonza</td><td>V4SC-2096</td><td></td></tr><tr><td>Inkubator do hodowli tkankowych</td><td>PHCbi</td><td>MCO-170AICUVDL-PA</td><td></td></tr><tr><td>Odczynnik do transfekcji TransIT-LTI</td><td>Mirus</td><td>MIR 2306</td><td></td></tr><tr><td>Trypsyna-EDTA (0,25%)</td><td>Gibco</td><td>25200114</td><td></td></tr></tbody></table>

edycja epigenomu crispr w komórkach ludzkich przy użyciu transfekcji plazmidowego dna i dostarczania nukleofekcji mrna

CRISPR Epigenome Editing in Human Cells using Plasmid DNA Transfection and mRNA Nucleofection Delivery

Epigenetyka odnosi się do chemicznych modyfikacji białek histonowych i DNA, które mogą regulować ekspresję genów. Ludzki epigenom zmienia się dynamicznie podczas różnicowania i starzenia się komórek, a wiele chorób jest związanych z nieprawidłowymi wzorcami epigenomu. Ostatnie postępy w dziedzinie CRISPR doprowadziły do opracowania programowalnych narzędzi do edycji modyfikacji epigenetycznych w docelowych loci genomowych, umożliwiając precyzyjne przepisywanie modyfikacji epigenetycznych w komórkach ludzkich. Edytorzy epigenomu oparci na CRISPR polegają na katalitycznie martwym Cas9 w połączeniu z modyfikatorami epigenetycznymi, które ostatecznie skutkują zaprogramowaną represją lub aktywacją docelowych genów w genomach ssaków. W przeciwieństwie do tradycyjnych metod edycji genomu, edycja epigenomu nie wymaga pęknięć DNA ani zmian w sekwencji ludzkiego genomu, a zatem służy jako bezpieczniejsza alternatywa dla kontroli ekspresji genów. W tym protokole zwracamy uwagę na dwie różne metody przeprowadzania edycji epigenomu za pośrednictwem dCas9 w ludzkich liniach komórkowych przy użyciu transfekcji plazmidowego DNA i nukleofekcji mRNA kodujących edytory epigenomu CRISPR. Demonstrujemy programowalną edycję epigenomu w celu przejściowego tłumienia genów za pomocą interferencji CRISPR (CRISPRi) oraz trwałego wyciszania genów na wiele tygodni za pomocą CRISPRoff, fuzji dCas9 z domeną KRAB i kompleksem metylotransferazy DNA de novo. Zapewniamy również wskazówki dotyczące metod ilościowych do pomiaru udanej edycji epigenomu genów docelowych oraz kluczowych kwestii dotyczących tego, jakiego narzędzia do edycji epigenomu użyć, w zależności od kryteriów eksperymentalnych.

W przypadku wszystkich eksperymentów z edycją epigenomu, odpowiednie kontrole są kluczowe dla oceny wydajności edycji epigenomu. Zalecamy stosowanie kontrolnego sgRNA, który nie celuje w żadną sekwencję w ludzkim genomie. Użycie kontroli z przewodnikiem niecelującym (non-targeting guide) daje pewność, że zmiany w locusach docelowych są wynikiem skierowania edytora epigenomu w to miejsce, a nie jedynie nadekspresji edytora epigenomu lub nieswoistego wiązania. Ponadto, w eksperymentach opartych na genach reporterowych, sug...

Protokół opisuje metody edycji epigenomu opartej na CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) w ludzkich liniach komórkowych przy użyciu transfekcji plazmidowego DNA i nukleofekcji mRNA.

Edycja epigenomu CRISPR w komórkach ludzkich przy użyciu transfekcji plazmidowego DNA i dostarczania nukleofekcji mRNA

Epigenetics refers to chemical modifications of histone proteins and DNA that can regulate the expression of genes. The human epigenome is altered ...

Badania te mają na celu zaprojektowanie i dostarczenie edytorów epigenomicznych do komórek ludzkich. Robimy to poprzez fuzję efektorów chromatyny z dCas9 w celu ukierunkowanej modulacji genów bez wprowadzania toksycznych pęknięć DNA. Wyzwania koncentrują się na efektywnym dostarczaniu edytorów epigenomu do komórek i zapewnieniu precyzyjnej swoistości docelowej.Ponadto osiągnięcie stabilnej lub przejściowej represji genów pozostaje trudne. Protokół ten pozwala uniknąć wszelkich mechanizmów rozszczepiania, zmniejszając toksyczność i niestabilność genomu. Opisano w nim dwie metody dostarczania kontrolowanej modulacji ekspresji genów bez trwałych zmian sekwencji DNA.Metody te mogą być stosowane do testowania różnych fuzji z dCas9 oraz do badania podstawowej biologii chromatyny. Obecne edytory epigenomu mogą być wykorzystywane do badań przesiewowych całego genomu i mają potencjał do zastosowań terapeutycznych. Na początek utrzymuj komórki K-562 w kolbie z pożywką RPMI uzupełnioną 10% FBS i penicyliną streptomycyną glutaminą.W dniu nukleofekcji rozmrozić mRNA CRISPRoff w sterylnej probówce mikrowirówkowej bez RNAzy i delikatnie przemieszać probówkę. Użyj dwóch mikrogramów mRNA na 2,0 razy 10 do mocy pięciu komórek w każdym dołku probówki z paskiem PCR umieszczonej na lodzie. Przygotuj roztwór nukleofekcji zgodnie z instrukcjami producenta i pozwól mu ogrzać się do temperatury pokojowej przez 15 minut przed nukleofekcją.Zbierz i policz komórki K-562 za pomocą automatycznego licznika komórek z barwieniem żywym/martwym błękitem trypanowym. W przypadku nukleofekcji w kuwecie paskowej, podwielokrotność około dwa razy 10 do potęgi pięciu komórek na próbkę do sterylnej probówki mikrowirówkowej. Odwirować komórki w temperaturze 500 G przez pięć minut w temperaturze pokojowej.Odrzucić supernatant. Dodać PBS o temperaturze pokojowej do osadu komórkowego i ponownie odwirować przy 500 G przez pięć minut. Odrzucić supernatant.Ponownie zawiesić komórki w odpowiedniej ilości roztworu nukleofektora. Dodaj obliczoną objętość roztworu komórkowego do dwóch mikrogramów roztworu CRISPRoff. Przenieś komórkę i roztwór mRNA do kuwety, upewniając się, że nie tworzą się pęcherzyki, ponieważ może to zagrozić wydajności nukleofekcji.Delikatnie postukaj w nukleokuletę, aby ułożyć komórki na dole. Następnie należy wykonać nukleofekt komórek za pomocą systemu 4D-Nucleofector z odpowiednim kodem impulsowym. Może być konieczne zoptymalizowanie kodu impulsu dla różnych typów komórek.Skonsultuj się z producentem, jeśli potrzebna jest dodatkowa optymalizacja. Po nukleofekcji dodaj 80 mikrolitrów pożywki RPMI do każdej używanej studzienki nukleokuwetu. Przenieść zawiesinę komórek do dołka 24-dołkowej płytki zawierającej 400 mikrolitrów wstępnie podgrzanej pożywki RPMI.Załaduj wszystkie pliki standardu cytometrii przepływowej lub FSC do FlowJo, przeciągając je i upuszczając do nowego arkusza. Kliknij wszystkie próbki, aby rozpocząć tworzenie bramek. Otwórz próbkę kontrolną, klikając dwukrotnie odpowiedni plik.Utwórz bramkę dla aktywnych komórek na wykresie FSC-A i SSC-A za pomocą narzędzia wielokąta. Zakładka aktywnych komórek powinna teraz pojawić się poniżej nazwy próbki na liście wszystkich próbek. Kliknij prawym przyciskiem myszy tę bramkę i wybierz opcję Kopiuj analizę do grupy, aby zastosować tę bramkę do wszystkich próbek.Kliknij dwukrotnie bramkę żywych komórek, aby wybrać tylko żywe komórki. Zmień osie na FSC-H zamiast FSC-A. Narysuj wielokąt do bramki tylko dla pojedynczych komórek.Aby bramkować komórki ekspresji prowadzącej, kliknij dwukrotnie bramkę pojedynczej komórki, aby wybrać tylko pojedyncze komórki. Zmień osie na FSC-A zamiast PE-CF594-A. Narysuj bramkę do prowadnicy wyrażającej komórki za pomocą narzędzia wielokąta.Kliknij dwukrotnie ostatnią bramkę konfiguracyjną, pojedynczą komórkę lub prowadnicę wyrażającą komórki. Jeśli wykonujesz transfekcję plazmidu, w której edytor epigenomu koduje białko niebieskiej fluorescencji lub fuzję BFP, utwórz bramkę dla komórek BFP dodatnich dla próbek drugiego dnia. Utwórz bramkę dla ekspresji reporterowej, wykreślając BB515-A w stosunku do FSC-A w celu identyfikacji i bramki dla komórek ujemnych GFP.Następnie zastosuj tę bramkę do wszystkich próbek. Po zakończeniu konfiguracji bramkowania kliknij edytor tabel w górnym panelu. Przeciągnij populacje do analizy, takie jak komórki dodatnie BFP i ujemne GFP.W panelu edytora tabel kliknij przycisk utwórz tabelę i skopiuj dane przed wklejeniem ich do arkusza kalkulacyjnego w celu obliczenia normalizacji. Teraz odejmij liczbę komórek reporterowo-ujemnych, takich jak ujemne GFP, w próbce kontrolnej od wszystkich innych próbek. Spowoduje to skorygowanie o wyciszenie tła zgłaszającego.Jeśli wykonujesz transfekcję, podziel każdą wartość przez procent komórek dodatnich BFP zmierzonych drugiego dnia, aby znormalizować wszystkie wartości do procentu komórek dodatnich BFP, a następnie pomnóż przez 100. W ten sposób uzyskuje się znormalizowaną wartość wydajności transfekcji edytowanych komórek. Wykreśl dane, aby utworzyć wykresy liniowe, które reprezentują zmiany w całym przebiegu edycji epigenomu.W przypadku wszystkich eksperymentów z edycją epigenomu zaleca się kontrolę przewodnika bez celowania, aby potwierdzić, że zmiany w docelowych loci wynikają z edycji epigenomu, a nie z nadekspresji lub niespecyficznego wiązania edytora epigenomu. Ważne jest, aby wziąć pod uwagę metodę dostarczania edytora epigenomu. Transfekcja plazmidowego DNA lub nukleofekcja mRNA może być preferowana w kontekście eksperymentalnym.Uwzględnienie typu ogniwa, harmonogramu eksperymentu, odczytu dostarczania i skuteczności dostarczania może mieć wpływ na preferowaną metodę dostarczania. Komórki wyrażające wysoki poziom BFP w dwa dni po transfekcji wskazują na udaną transfekcję z edytorem epigenomu. Zarówno CRISPRoff, jak i CRISPRi wykazują szczytowe wyciszenie genu w piątym dniu po transfekcji.W eksperymentach z nukleofekcją mRNA silne wyciszenie genów obserwuje się w trzecim dniu po nukleofekcji za pomocą CRISPRoff.

crispr-epigenome-editing-human-cells-using-plasmid-dna-transfection

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetyka

Ten film demonstruje technikę edycji genomu w ludzkich pluripotencjalnych komórkach macierzystych (hPSC) za pomocą nukleazy palca cynkowego. Ponieważ hPSC mogą być potencjalnie różnicowane w różne typy komórek, technologia ta jest pomocna w badaniach patologicznych i farmakologicznych in vitro w sposób specyficzny dla pacjenta.

Edycja genomu oparta na nukleazie palca cynkowego: technika modyfikacji genomu w ludzkich pluripotencjalnych komórkach macierzystych za pomocą dwuniciowego mechanizmu naprawy zależnego od homologii

Edycja genomu ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych (hPSC) może być przeprowadzona szybko i efektywnie. Przedstawiono tutaj solidną procedurę eksperymentalną inżynierii genetycznej hPSC, której przykładem jest edycja locus AAVS1 w celu ekspresji EGFP i wprowadzenia oporności na antybiotyki.

Opracowanie ludzkich pluripotencjalnych linii komórek macierzystych z edytowanym genomem: od ukierunkowania do izolacji

Ten protokół opisuje przebieg pracy systemu edycji genów opartego na CRISPR/Cas9 do naprawy mutacji punktowych w komórkach ssaków. W tym przypadku stosujemy kombinatoryczne podejście do edycji genów ze szczegółową strategią eksperymentalną do pomiaru powstawania indel w miejscu docelowym - w istocie, analizując mutagenezę na miejscu.

Standardowa metodologia badania mutagenności na miejscu w funkcji naprawy mutacji punktowej katalizowanej przez CRISPR/Cas9 i SsODN w komórkach ludzkich

Wykorzystanie wstępnie złożonego kompleksu rybonukleoproteinowego Cas9 (RNP) to potężna metoda precyzyjnej, efektywnej edycji genomu. W tym miejscu podkreślamy jego użyteczność w szerokim zakresie komórek i organizmów, w tym pierwotnych komórek ludzkich oraz zarówno klasycznych, jak i powstających organizmów modelowych.

Ulepszona edycja genomu za pomocą rybonukleoproteiny Cas9 w różnych komórkach i organizmach

CRISPR-Cas to potężna technologia do inżynierii złożonych genomów roślin i zwierząt. W tym miejscu szczegółowo opisujemy protokół skutecznej edycji ludzkiego genomu przy użyciu różnych endonukleaz Cas. Zwracamy uwagę na ważne kwestie i parametry projektowe, aby zoptymalizować wydajność edycji.

Edycja genomu w liniach komórkowych ssaków przy użyciu CRISPR-Cas

Ukierunkowana edycja epigenomu DNA reprezentuje potężne podejście terapeutyczne. Protokół ten opisuje produkcję, oczyszczanie i koncentrację wektorów lentiwirusowych typu "wszystko w jednym" zawierających transgen CRISPR-dCas9-DNMT3A do zastosowań w edycji epigenomu w neuronach pochodzących z ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (hiPSC).

Platforma wektorów lentiwirusowych do efektywnego dostarczania narzędzi do edycji epigenomu do modeli chorób pochodzących z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych

Prezentowany jest tutaj protokół do efektywnej edycji genów za pośrednictwem rybonukleoproteiny CRISPR/Cas9 w komórkach ssaków za pomocą elektroporacji rurkowej.

CRISPR/Cas9 Precyzyjna edycja genów za pośrednictwem rybonukleoprotein za pomocą elektroporacji rurkowej

Ten protokół zapewnia metodę ułatwiającą generowanie zdefiniowanych heterozygotycznych lub homozygotycznych zmian nukleotydowych za pomocą CRISPR-CAS9 w ludzkich pluripotencjalnych komórkach macierzystych.

Generowanie zdefiniowanych modyfikacji genomowych z wykorzystaniem CRISPR-CAS9 w ludzkich pluripotencjalnych komórkach macierzystych

Tutaj opisujemy szczegółową metodę bezproblemowej edycji genów w ludzkich pluripotencjalnych komórkach macierzystych przy użyciu plazmidu dawcy opartego na piggyBac i mutanta nickazy Cas9. Do eksonu 8 locus czynnika jądrowego hepatocytów 4 alfa (HNF4α) w ludzkich embrionalnych komórkach macierzystych (hESC) wprowadzono dwie mutacje punktowe.

Wprowadzenie mutacji punktowych do ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych przy użyciu płynnej edycji genomu

Dostarczanie edytorów genomu jako RNA jest szczególnie skuteczną metodą modyfikacji genomów komórek pierwotnych ssaków i linii komórkowych. Celem tego protokołu jest dostarczenie edytorów genomu jako mRNA do pierwotnych komórek ssaków i linii komórkowych, po którym następuje ukierunkowane sekwencjonowanie i analiza Illumina w celu ilościowego określenia wyników edycji.

Edycja genomu w pierwotnych komórkach ssaków poprzez elektroporację edytora RNA

Poznaj metody edycji epigenomu CRISPR w komórkach ludzkich przy użyciu transfekcji DNA plazmidowego i dostarczania mRNA nukleofekcją. Technika ta umożliwia modulację ekspresji genów bez toksycznych przerwań DNA.

Edycja epigenomu CRISPR w komórkach ludzkich przy użyciu transfekcji plazmidowego DNA i dostarczania nukleofekcji mRNA

Przeglądaj więcej filmów