Edycja epigenomu CRISPR w komórkach ludzkich przy użyciu transfekcji plazmidowego DNA i dostarczania nukleofekcji mRNA
30 maja 2025
Protokół opisuje metody edycji epigenomu opartej na CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) w ludzkich liniach komórkowych przy użyciu transfekcji plazmidowego DNA i nukleofekcji mRNA.
Badania te mają na celu zaprojektowanie i dostarczenie edytorów epigenomicznych do komórek ludzkich. Robimy to poprzez fuzję efektorów chromatyny z dCas9 w celu ukierunkowanej modulacji genów bez wprowadzania toksycznych pęknięć DNA. Wyzwania koncentrują się na efektywnym dostarczaniu edytorów epigenomu do komórek i zapewnieniu precyzyjnej swoistości docelowej.
Ponadto osiągnięcie stabilnej lub przejściowej represji genów pozostaje trudne. Protokół ten pozwala uniknąć wszelkich mechanizmów rozszczepiania, zmniejszając toksyczność i niestabilność genomu. Opisano w nim dwie metody dostarczania kontrolowanej modulacji ekspresji genów bez trwałych zmian sekwencji DNA.
Metody te mogą być stosowane do testowania różnych fuzji z dCas9 oraz do badania podstawowej biologii chromatyny. Obecne edytory epigenomu mogą być wykorzystywane do badań przesiewowych całego genomu i mają potencjał do zastosowań terapeutycznych. Na początek utrzymuj komórki K-562 w kolbie z pożywką RPMI uzupełnioną 10% FBS i penicyliną streptomycyną glutaminą.
W dniu nukleofekcji rozmrozić mRNA CRISPRoff w sterylnej probówce mikrowirówkowej bez RNAzy i delikatnie przemieszać probówkę. Użyj dwóch mikrogramów mRNA na 2,0 razy 10 do mocy pięciu komórek w każdym dołku probówki z paskiem PCR umieszczonej na lodzie. Przygotuj roztwór nukleofekcji zgodnie z instrukcjami producenta i pozwól mu ogrzać się do temperatury pokojowej przez 15 minut przed nukleofekcją.
Zbierz i policz komórki K-562 za pomocą automatycznego licznika komórek z barwieniem żywym/martwym błękitem trypanowym. W przypadku nukleofekcji w kuwecie paskowej, podwielokrotność około dwa razy 10 do potęgi pięciu komórek na próbkę do sterylnej probówki mikrowirówkowej. Odwirować komórki w temperaturze 500 G przez pięć minut w temperaturze pokojowej.
Odrzucić supernatant. Dodać PBS o temperaturze pokojowej do osadu komórkowego i ponownie odwirować przy 500 G przez pięć minut. Odrzucić supernatant.
Ponownie zawiesić komórki w odpowiedniej ilości roztworu nukleofektora. Dodaj obliczoną objętość roztworu komórkowego do dwóch mikrogramów roztworu CRISPRoff. Przenieś komórkę i roztwór mRNA do kuwety, upewniając się, że nie tworzą się pęcherzyki, ponieważ może to zagrozić wydajności nukleofekcji.
Delikatnie postukaj w nukleokuletę, aby ułożyć komórki na dole. Następnie należy wykonać nukleofekt komórek za pomocą systemu 4D-Nucleofector z odpowiednim kodem impulsowym. Może być konieczne zoptymalizowanie kodu impulsu dla różnych typów komórek.
Skonsultuj się z producentem, jeśli potrzebna jest dodatkowa optymalizacja. Po nukleofekcji dodaj 80 mikrolitrów pożywki RPMI do każdej używanej studzienki nukleokuwetu. Przenieść zawiesinę komórek do dołka 24-dołkowej płytki zawierającej 400 mikrolitrów wstępnie podgrzanej pożywki RPMI.
Załaduj wszystkie pliki standardu cytometrii przepływowej lub FSC do FlowJo, przeciągając je i upuszczając do nowego arkusza. Kliknij wszystkie próbki, aby rozpocząć tworzenie bramek. Otwórz próbkę kontrolną, klikając dwukrotnie odpowiedni plik.
Utwórz bramkę dla aktywnych komórek na wykresie FSC-A i SSC-A za pomocą narzędzia wielokąta. Zakładka aktywnych komórek powinna teraz pojawić się poniżej nazwy próbki na liście wszystkich próbek. Kliknij prawym przyciskiem myszy tę bramkę i wybierz opcję Kopiuj analizę do grupy, aby zastosować tę bramkę do wszystkich próbek.
Kliknij dwukrotnie bramkę żywych komórek, aby wybrać tylko żywe komórki. Zmień osie na FSC-H zamiast FSC-A. Narysuj wielokąt do bramki tylko dla pojedynczych komórek.
Aby bramkować komórki ekspresji prowadzącej, kliknij dwukrotnie bramkę pojedynczej komórki, aby wybrać tylko pojedyncze komórki. Zmień osie na FSC-A zamiast PE-CF594-A. Narysuj bramkę do prowadnicy wyrażającej komórki za pomocą narzędzia wielokąta.
Kliknij dwukrotnie ostatnią bramkę konfiguracyjną, pojedynczą komórkę lub prowadnicę wyrażającą komórki. Jeśli wykonujesz transfekcję plazmidu, w której edytor epigenomu koduje białko niebieskiej fluorescencji lub fuzję BFP, utwórz bramkę dla komórek BFP dodatnich dla próbek drugiego dnia. Utwórz bramkę dla ekspresji reporterowej, wykreślając BB515-A w stosunku do FSC-A w celu identyfikacji i bramki dla komórek ujemnych GFP.
Następnie zastosuj tę bramkę do wszystkich próbek. Po zakończeniu konfiguracji bramkowania kliknij edytor tabel w górnym panelu. Przeciągnij populacje do analizy, takie jak komórki dodatnie BFP i ujemne GFP.
W panelu edytora tabel kliknij przycisk utwórz tabelę i skopiuj dane przed wklejeniem ich do arkusza kalkulacyjnego w celu obliczenia normalizacji. Teraz odejmij liczbę komórek reporterowo-ujemnych, takich jak ujemne GFP, w próbce kontrolnej od wszystkich innych próbek. Spowoduje to skorygowanie o wyciszenie tła zgłaszającego.
Jeśli wykonujesz transfekcję, podziel każdą wartość przez procent komórek dodatnich BFP zmierzonych drugiego dnia, aby znormalizować wszystkie wartości do procentu komórek dodatnich BFP, a następnie pomnóż przez 100. W ten sposób uzyskuje się znormalizowaną wartość wydajności transfekcji edytowanych komórek. Wykreśl dane, aby utworzyć wykresy liniowe, które reprezentują zmiany w całym przebiegu edycji epigenomu.
W przypadku wszystkich eksperymentów z edycją epigenomu zaleca się kontrolę przewodnika bez celowania, aby potwierdzić, że zmiany w docelowych loci wynikają z edycji epigenomu, a nie z nadekspresji lub niespecyficznego wiązania edytora epigenomu. Ważne jest, aby wziąć pod uwagę metodę dostarczania edytora epigenomu. Transfekcja plazmidowego DNA lub nukleofekcja mRNA może być preferowana w kontekście eksperymentalnym.
Uwzględnienie typu ogniwa, harmonogramu eksperymentu, odczytu dostarczania i skuteczności dostarczania może mieć wpływ na preferowaną metodę dostarczania. Komórki wyrażające wysoki poziom BFP w dwa dni po transfekcji wskazują na udaną transfekcję z edytorem epigenomu. Zarówno CRISPRoff, jak i CRISPRi wykazują szczytowe wyciszenie genu w piątym dniu po transfekcji.
W eksperymentach z nukleofekcją mRNA silne wyciszenie genów obserwuje się w trzecim dniu po nukleofekcji za pomocą CRISPRoff.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy protokół opisuje metody wprowadzania edytorów epigenomicznych do ludzkich komórek z wykorzystaniem technik opartych na systemie CRISPR. Poprzez fuzję efektorów chromatyny z dCas9 można osiągnąć celowaną modulację genów bez wywoływania toksycznych pęknięć DNA.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Genetyka
- Biologia komórki
Wprowadzenie
- Efektywne dostarczanie edytorów epigenomu do komórek stanowi istotne wyzwanie.
- Utrzymanie precyzyjnej specyficzności celu jest kluczowe dla skutecznej modulacji genów.
- Osiągnięcie stabilnej lub przejściowej represji genów może być trudne.
- Niniejszy protokół eliminuje mechanizmy przecinania, aby zredukować toksyczność i niestabilność genomową.
Cel badania
- Zaprojektowanie i dostarczenie edytorów epigenomicznych do komórek ludzkich.
- Umożliwienie celowanej modulacji genów bez toksycznych pęknięć DNA.
- Opracowanie metod kontrolowanej modulacji ekspresji genów.
Zastosowane metody
- Transfekcja plazmidowego DNA
- Nukleofekcja mRNA
- Fuzja efektorów chromatyny z dCas9
- Unikanie mechanizmów cięcia
Główne wyniki
- Skuteczne wprowadzenie edytorów epigenomu do komórek ludzkich.
- Celowana modulacja genów osiągnięta bez wprowadzania pęknięć w DNA.
- Zaobserwowano redukcję toksyczności i niestabilności genomicznej.
- Metody te pozwalają na kontrolowaną modulację ekspresji genów.
Wnioski
- Niniejszy protokół przedstawia skuteczne metody edycji epigenomu.
- Odnosi się on do kluczowych wyzwań w technikach modulacji genów.
- Przyszłe zastosowania mogą usprawnić podejścia w terapii genowej.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla Przemysłu
Edycja epigenomu oparta na systemie CRISPR umożliwia programowalną, specyficzną dla locus regulację genów w komórkach ludzkich bez wprowadzania pęknięć w DNA, co zmniejsza niestabilność genomową i toksyczność. Podejście to wspiera wczesne etapy odkrywania i walidacji celów poprzez umożliwienie precyzyjnej, odwracalnej modulacji ekspresji genów, ułatwiając analizę mechanistyczną i funkcjonalną szlaków istotnych dla rozwoju chorób. Zgodność protokołu zarówno z transfekcją plazmidowego DNA, jak i nukleofekcją mRNA rozszerza jego użyteczność w różnych systemach komórkowych i ramach czasowych eksperymentów.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju bioprzemysłu
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Umożliwia funkcjonalną analizę mechanizmów regulacji genów bez trwałej modyfikacji genomu.
- WspieraB ograniczanie ryzyka mechanistycznego poprzez odróżnienie bezpośrednich efektów epigenetycznych od toksyczności poza celowej.
- Ułatwia szybką, odwracalną represję lub aktywację genów w celu wyjaśnienia szlaków sygnałowych.
- Zapewnia platformę do testowania wielu fuzji dCas9-efektor w systemach istotnych dla przebiegu chorób.
Przesiewy i opracowywanie testów
- Przygotowuje zwalidowane modele komórkowe do późniejszego przesiewu związków poprzez epigenetyczną modulację ekspresji genów.
- Umożliwia ilościową ocenę wydajności edycji z wykorzystaniem cytometrii przepływowej i normalizacji reportera.
- Wspiera powtarzalne i skalowalne przepływy pracy dla wysokoprzepustowego przesiewu edytorów epigenomu.
- Pozwala na normalizację i korektę tła w celu zapewnienia wiarygodnych wyników testu.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Umożliwia modelowanie stabilnego lub przejściowego wyciszania genów w kontekście progresji choroby i interwencji terapeutycznej.
- Jest zgodne ze strategiami biomarkerów translacyjnych, umożliwiając trwałą represję genów (CRISPRoff) lub modulację przejściową (CRISPRi).
- Zapewnia ciągłość procesu od etapu odkryć po walidację przedkliniczną, unikając trwałych zmian genomowych.
- Zmniejsza ryzyko wystąpienia zakłócającej niestabilności genomowej w modelach przedklinicznych.
Integracja potoku i przepływu pracy
Niniejszy protokół wpisuje się w proces od odkrycia do badań przedklinicznych, umożliwiając sterowaną hipotezą modulację genów, opracowywanie testów oraz modelowanie translacyjne bez konieczności trwałej edycji genomu.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez zerowych oraz analizę szlaków sygnałowych poprzez ukierunkowaną, odwracalną regulację genów.
- Przesiewanie: Zapewnia ilościowe, powtarzalne odczyty w celu standaryzacji analiz i oceny związków.
- Analityka: Dostarcza znormalizowane pomiary z korekcją tła, służące do porównywania warunków edycji i metod dostarczania.
- Badania translacyjne: Umożliwia modelowanie regulacji epigenetycznej istotnej dla przebiegu chorób i odpowiedzi terapeutycznej.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Oferuje modułową, adaptowalną platformę dla różnorodnych celów genowych i typów komórek w programach B+R.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną w walidacji celu i zmniejsza niejednoznaczność mechanistyczną.
- Wartość operacyjna: Poprawia standaryzację, powtarzalność i skalowalność procesów modulacji genów.
- Wartość strategiczna: Usprawnia podejmowanie decyzji go/no-go oraz efektywność kapitałową poprzez minimalizację ryzyka biologicznego na późnych etapach.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację i rozwój celów genowych w oparciu o dowody funkcjonalne z uwzględnieniem dostosowania do ryzyka.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w projektowaniu CRISPR, hodowli komórkowej oraz analizie cytometrii przepływowej.
- Wymaga dostępu do aparatury do nukleofekcji i oprogramowania analitycznego do ilościowych odczytów.
- Wymaga standaryzacji strategii bramkowania i procedur normalizacji pomiędzy zespołami.
- Musi zostać dostosowany do typu komórek, metody dostarczania i harmonogramu eksperymentalnego w zależności od potrzeb projektu.
- Kluczowe dla wiarygodnej interpretacji jest uwzględnienie wydajności dostarczania oraz kontroli reporterowych.
