Izolacja i hodowla pierwotnych komórek Müllera siatkówki od szczurów Sprague-Dawley (SD)

Protokół ten opisuje izolację i hodowlę pierwotnych komórek Müllera siatkówki od szczurów Sprague-Dawley SD, co może pomóc w badaniach siatkówki w społeczności naukowej. Protokół obejmuje rozwarstwienie siatkówki, ekstrakcję i identyfikację implantu ślimakowego oraz kluczowe kwestie kontrolne. Protokół ten ustanawia wydajną, ustandaryzowaną i kosztowną metodę wydobywania i odzyskiwania RMC z legalnych stojaków SD. Model RMC może być używany do symulacji stanów patologicznych, takich jak cukrzyca, normalność i wspomaganie działania leków.

[Narrator] Na początek wlej roztwór D-Hanka do dwóch 10-centymetrowych szklanych naczyń hodowlanych. Po eutanazji i dezynfekcji nowonarodzonego szczura SD umieść go na sterylnym zakrzywionym naczyniu. Za pomocą pęsety do zębów rozerwij skórę powieki wzdłuż szpary powiekowej, aby odsłonić gałkę oczną szczura. Trzymaj bezzębną pęsetę otwartą i równoległą do szpary powiekowej, aby docisnąć oczodół. Po dotarciu do nerwu wzrokowego i odsłonięciu gałki ocznej zamknij pęsetę, aby podnieść i usunąć gałkę oczną. Teraz umieść gałkę oczną w szklanym naczyniu hodowlanym z roztworem D-Hanka. Przepłucz gałkę oczną i przenieś ją do innego naczynia ze świeżym roztworem D-Hanka. Następnie za pomocą zakrzywionych mikrokleszczyków okulistycznych delikatnie przymocuj obszar między rogówką a nerwem wzrokowym, aby odsłonić rogówkę. Przebij połączenie twardówkowe rogówki za pomocą mikro nożyczek rogówkowych i przetnij wzdłuż rąbka w okrężny sposób. Wykonaj dwa symetryczne nacięcia twardówki o długości około dwóch milimetrów przed zwolnieniem kleszczy i ponownym zaciśnięciem na styku nerwu wzrokowego i twardówki. Następnie użyj drugich kleszczy, aby delikatnie docisnąć w pobliżu korzenia nerwu wzrokowego, kierując nacisk w kierunku interfejsu nerwu wzrokowego rogówki. Kiedy pojawi się tkanka soczewki, usuń ją ostrożnie i kontynuuj naciskanie, aż pojawi się tkanka siatkówki. Za pomocą kleszczy przenieś oddzieloną tkankę siatkówki do innego sterylnego naczynia hodowlanego. Otwórz pokrywkę naczynia hodowlanego i użyj pipety z jednomililitrową końcówką, aby pipetować tkankę siatkówki w górę iw dół około 15 razy, aby rozbić ją na małe kawałki. Następnie inkubuj tkankę z jednym mililitrem 0,25% trypsyny w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez pięć minut. Wyjmij naczynie hodowlane z inkubatora i umieść je na czystej ławce. Dodaj dwa mililitry kompletnej pożywki i delikatnie odpipetować, aby zatrzymać trawienie. Teraz przefiltruj zawiesinę komórek przez nylonowe sito o oczkach 300 do 15-mililitrowej wirówki dwa. Umyj naczynie hodowlane przygotowanym PBS i zbierz pozostałą zawiesinę. Następnie wirować probówkę o masie 878 G przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Po odwirowaniu odessać i wyrzucić supernatant. Zawiesić osad w dwóch mililitrach kompletnej pożywki i ponownie odwirować przy 878 G przez pięć minut w celu oczyszczenia komórek. Po odrzuceniu supernatantu ponownie zawiesić komórki w dwóch mililitrach kompletnego podłoża. Wziąć kolbę T25 z trzema mililitrami kompletnej pożywki i dodać jeden mililitr zawiesiny komórek. Potrząsnąć kolbą na krzyż przed umieszczeniem jej w inkubatorze. Po 48 godzinach inkubacji wyjąć kolbę z inkubatora i umieścić ją na czystej ławce. Wyrzuć zużytą pożywkę i umyj powierzchnię przylegającą do komórek trzykrotnie jednym mililitrem PBS, który zawiera 1% penicyliny i streptomycynę. Następnie dodaj pięć mililitrów świeżej, kompletnej pożywki i kontynuuj inkubację, aż zbieg komórek przekroczy 90%. Umyj komórki trzykrotnie jednym mililitrem PBS zawierającym 1% penicyliny streptomycyny. Następnie inkubuj komórki z jednym mililitrem 0,25% roztworu EDTA trypsyny przez jedną minutę i 30 sekund. Teraz obserwuj kolbę pod odwróconym mikroskopem. Kiedy komórki wydają się okrągłe, oderwane i zaczynają unosić się na wodzie, dodaj dwa mililitry kompletnej pożywki hodowlanej do kolby, aby zakończyć trawienie. Następnie za pomocą pipety zasysaj zawiesinę komórek i przenieś całą zawiesinę komórek do 15-mililitrowej probówki wirówkowej. Przepłukać ściankę kolby dwoma mililitrami PBS zawierającego 1% penicyliny streptomycyny i dodać ją do tej samej probówki. Odwirować probówkę o sile 878 G przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w odpowiedniej objętości kompletnego podłoża. Na koniec przejdź komórki w stosunku jeden do dwóch lub jeden do trzech, w zależności od potrzeb. Komórki Müllera siatkówki drugiego pasażu lub RMC wykazywały morfologię w kształcie gwiazdy lub wrzeciona z okrągłymi lub owalnymi jądrami i obfitą cytoplazmą. Barwienie hematoksyliną i eozyną ujawniło wrzecionowate i gwiaździste komórki z obfitą różową cytoplazmą i centralnie położonymi owalnymi jądrami połączonymi drobnymi nitkowatymi strukturami. Barwienie immunofluorescencyjne RMC wykazało silną czerwoną fluorescencję w komórkach znakowanych dla syntetazy glutaminy i akwaporyny-4 oraz jasnozieloną fluorescencję dla CRALBP, Kir4.1 i wimentyny. NeuN, kontrola ujemna nie została wykryta w analizie immunofluorescencyjnej potwierdzającej swoistość izolacji RMC. Analiza cytometrii przepływowej wykazała, że 98,7% komórek było dodatnich na syntetazę glutaminy, a 97% na CRALBP, co wskazuje na wysoką czystość RMC.