Name: Ustalenie i analiza histologiczna organoidów przełyku modelujących progresję od tkanek prawidłowych do nowotworowych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-05-30T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 57 s
Description: Poznaj metodę hodowli organoidów przełyku i analizy histologicznej w badaniach nowotworowych. Technika umożliwia obserwację zmian morfologicznych i ekspresji markerów molekularnych podczas progresji od tkanek prawidłowych do nowotworowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują wszystkim pacjentom i lekarzom biorącym udział w badaniach w Szpitalu Onkologicznym, Chińskiej Akademii Nauk Medycznych (CAMS) i Peking Union Medical College (PUMC). Badanie to jest finansowane przez Narodową Fundację Nauk Przyrodniczych Chin (82203156 do Południowej Walii), Narodowy Kluczowy Program Badawczo-Rozwojowy Chin (2023YFC3503200 do S.Z.) oraz Fundusz Innowacji Nauk Medycznych Chińskiej Akademii Nauk Medycznych (2023-I2M-QJ-002 do S.Z.). Rysunek 1 jest tworzony za pomocą BioRender.com.

To badanie zostało zatwierdzone przez Institutional Review Board of the Cancer Hospital, Chinese Academy of Medical Sciences (Zatwierdzenia nr 20/069–2265, 22/221-3423 i 23/305-4047). Próbki tkanki przełyku uzyskano od pacjentów poddawanych zabiegom chirurgicznym lub wczesnym badaniom przesiewowym w kierunku raka płaskonabłonkowego przełyku (ESCC) w Szpitalu Onkologicznym Chińskiej Akademii Nauk Medycznych w latach 2021-2024 w celu ustalenia ludzkich organoidów przełyku. Żaden z pacjentów włączonych do tego badania nie otrzymał chemioterapii ani radioterapii przed pobraniem próbki. Uzyskano świadomą zgodę od wszystkich uczestników, a odpowiednie informacje kliniczne uzyskano z dokumentacji medycznej. Pełna lista odczynników i sprzętu użytego w tym badaniu znajduje się w Tabeli Materiałów.
1. Przygotowanie organoidów nabłonka przełyku
<ol>
	<li>Przygotowanie pożywki kondycjonowanej L-WRN
	<ol>
		<li>Przygotowanie linii komórkowej L-WRN
		<ol>
			<li>Rozmrozić linię komórkową L-WRN (przechowywanie w temperaturze -80 °C) w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C przez 1-2 minuty. Wymieszać z 5 ml wstępnie podgrzanej podstawowej pożywki hodowlanej (DMEM uzupełniony 10% FBS).</li>
			<li>Odwirować mieszaninę przy 200 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej (RT).</li>
			<li>Odrzucić supernatant. Ponownie zawiesić komórki za pomocą 2-3 ml świeżej, wstępnie podgrzanej pożywki selekcyjnej (DMEM zawierającej 10% FBS, 0,5 mg/ml higromycyny B i 0,5 mg/ml G-418). 
			UWAGA: Podłoże należy przechowywać w temperaturze 4 °C (maksymalne przechowywanie 1 miesiąc).</li>
			<li>Przenieść komórki do 10 cm naczynia hodowlanego zawierającego pożywkę selekcyjną. Hodować komórki w temperaturze 37 °C w inkubatorze z wilgotnością 5% CO2 .</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Pasaż linii komórkowej L-WRN
		<ol>
			<li>Dysocjuj zlewające się komórki za pomocą 0,025% trypsyny-EDTA (1-2 min w 37 °C) i podziel w stosunku 1:2.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Odbiór pożywki kondycjonowanej L-WRN
		<ol>
			<li>Zastąp pożywkę hodowlaną podstawową pożywką przy 80% zbiegu komórek. Przenieść supernatant do probówki wirówkowej.</li>
			<li>Przefiltruj przez membranę 0,22 μm, aby wyeliminować zanieczyszczenia komórkowe. Zebrać filtrat w postaci pożywki kondycjonowanej L-WRN. 
			UWAGA: Utrzymuj pożywkę kondycjonowaną L-WRN w temperaturze 4 °C (1 tydzień) lub -80 °C (6 miesięcy).</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Preparat z pożywki do hodowli organoidów przełykowych u ludzi (H-EOCM)
	<ol>
		<li>Przygotowanie H-EOCM
		<ol>
			<li>Zwirować pożywkę kondycjonowaną L-WRN (objętość 1,5 ml) po 4 godzinach równowagi w temperaturze 4 °C.</li>
			<li>Połącz Advanced DMEM/F12 z tymi dodatkami, aby stworzyć H-EOCM: 3% pożywki kondycjonowanej L-WRN, 1× Anti-Anti, 1× L-glutaminy, 1× suplementu N2, 1× suplementu B27, 0,15 mM HEPES, 40 ng/ml EGF, 10 μM Y-27632 i 50 μM A83-01. 
			UWAGA: H-EOCM należy przechowywać w stanie zamrożonym w temperaturze -20°C przez sześć miesięcy.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie przedeksperymentalne
	<ol>
		<li>Rozmrażać H-EOCM, utrzymując go w temperaturze 4 °C przez 4 godziny.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Ustanowienie ludzkiego organoidu przełyku
<ol>
	<li>Przygotowanie materiałów
	<ol>
		<li>Rozmrozić matrycę błony podstawnej i H-EOCM w temperaturze 4 °C. Wysterylizuj nożyczki chirurgiczne i pęsetę do następnego eksperymentu.</li>
		<li>Wstępnie schłodzić końcówki pipet do temperatury 4 °C. Podgrzej płytkę 24-dołkową do temperatury 37 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przetwarzanie tkanek i izolacja komórek 
	UWAGA: Tkanka nowotworowa ESCC, zmiany dysplastyczne (≤2 cm od brzegu guza) i dopasowana normalna tkanka przełyku (≥5 cm od brzegu guza) pobrano od tych samych osób z ESCC, które przeszły resekcję chirurgiczną. Ponadto wieloetapowe próbki przełyku uzyskano za pomocą programu wczesnego wykrywania i badań przesiewowych ESCC, jak opisano w naszych poprzednich badaniach6,7.
	<ol>
		<li>Trzykrotnie oczyścić próbkę buforem do przemywania w temperaturze pokojowej (PBS zawierającym 1×Anti-Anti i 0,15 mM HEPES) w probówkach wirówkowych o pojemności 5 ml. 
		UWAGA: Umyj próbki więcej niż trzy razy, aby zmniejszyć ryzyko zanieczyszczenia.</li>
		<li>Zmiel tkankę na 1 mm3 fragmenty za pomocą sterylnych nożyczek. Przenieść fragmenty do probówek wirówkowych o pojemności 1,5 ml.</li>
		<li>Zawiesić próbkę z 1 ml buforu do wytrawiania i wstrząsać nią w temperaturze 37 °C, 50-100 obr./min, przez 10-20 minut w celu strawienia tkanki.</li>
		<li>Odwirować mieszaninę przy 400 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant.</li>
		<li>Zawiesić osad w 500 μl 0,025% trypsyny-EDTA. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 10 minut. Dodaj 1 ml DMEM uzupełnionego 10% FBS, aby zatrzymać aktywność enzymatyczną.</li>
		<li>Przepuścić zawiesinę przez sterylny filtr o średnicy 70 μm. Zebrać filtrat w probówce wirówkowej o pojemności 1,5 ml.</li>
		<li>Odwirować filtrat przez 5 minut przy 400 x g w temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant. Ponownie zawiesić komórki za pomocą 100 μl H-EOCM.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Siew organoidów
	<ol>
		<li>Określ gęstość komórek, a następnie przygotuj świeżą probówkę wirówkową o pojemności 1,5 ml z 5 000-15 000 komórek w zawiesinie.</li>
		<li>Wirować przez 5 minut przy 400 x g w temperaturze 4 °C. Ostrożnie odsysać supernatant. Delikatnie równomiernie zawiesić komórki w 50-100 μl macierzy błony podstawnej. 
		UWAGA: Przechowuj matrycę membrany podstawnej w temperaturze 4 °C, aby uniknąć zestalenia.</li>
		<li>Dodaj 50 μl matrycy błony podstawnej z wymieszanymi komórkami do środka każdej 24-dołkowej płytki. Polimeryzować matrycę błony podstawnej w inkubacji w temperaturze 37 °C (czas trwania 30 minut).</li>
		<li>Dodać 500 μl wstępnie ogrzanego H-EOCM (37 °C) w celu pokrycia matrycy błony podstawnej. Hodować organoidy w nawilżonym inkubatorze o stężeniu 5%CO2 w temperaturze 37 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wymiana medium
	<ol>
		<li>Odessać zużyte podłoże i uzupełnić 500 μl świeżego H-EOCM (podgrzanego do 37 °C). 
		UWAGA: H-EOCM należy wymieniać w odstępach 3-dniowych.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Pasaż organoidów
<ol>
	<li>Przygotowanie materiałów
	<ol>
		<li>Rozmrozić matrycę membrany podstawnej i H-EOCM w temperaturze 4 °C. Wstępnie schłodzić końcówki pipet do temperatury 4 °C. Wstępnie podgrzać płytkę 24-dołkową do temperatury 37 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Trawienie organoidów
	<ol>
		<li>Delikatnie wyjmij podłoże H-EOCM. Dodać 500 μl wstępnie schłodzonego buforu pasażowego (Advanced DMEM/F12 zawierającego 1× Anti-Anti i 0,15 mM HEPES, wstępnie schłodzonego do 4 °C) do studzienki, aby stopić matrycę membrany podstawnej.</li>
		<li>Połączyć matrycę błony podstawnej z buforem przejściowym w probówce wirówkowej o pojemności 1,5 ml. Przemyć studzienkę 500 μl wstępnie schłodzonego buforu pasażowego i zebrać bufor w celu odzyskania pozostałych organoidów.</li>
		<li>Odwirować bufor przez 5 minut przy 400 x g w temperaturze 4 °C. Delikatnie zassać supernatant. Dodać 500 μl rekombinowanej trypsyny do probówki i inkubować do trawienia enzymatycznego (37 °C, 15 min). Wznawianie w odstępach 5-minutowych.</li>
		<li>Odwirować przefermentowaną próbkę (400 x g, 5 min, 4 °C). Odrzucić supernatant. Powtórz kroki 3.2.6 i 3.2.7. Ponownie zawiesić komórki w 100 μl H-EOCM.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Siew organoidów
	<ol>
		<li>W przypadku wysiewu organoidów powtórz krok 2.3.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Zamrażanie i odzyskiwanie organoidów
<ol>
	<li>Zamrażanie organoidów
	<ol>
		<li>W celu przygotowania materiałów powtórz krok 2.1.</li>
		<li>W celu wytrawienia organoidów powtórzyć krok 3.2.</li>
		<li>Zamrażanie organoidów
		<ol>
			<li>Określ gęstość komórek, a następnie przygotuj świeżą probówkę wirówkową o pojemności 1,5 ml z 10 000 komórek w zawiesinie.</li>
			<li>Odwirować próbki o sile 400 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Ostrożnie odessać supernatant.</li>
			<li>Ponownie zawiesić komórki za pomocą 500-1000 μl pożywki do kriokonserwacji. Przenieś do nowej krioprobówki. Zamrozić krioprobówkę w temperaturze -80 °C na 24 godziny. Archiwizacja w systemie przechowywania ciekłego azotu w celu przedłużonej konserwacji.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Rozmrażanie organoidów zamrażających
	<ol>
		<li>Aby przygotować materiały, powtórz krok 2.1.</li>
		<li>Rozmrażanie organoidów zamrażających
		<ol>
			<li>Szybko rozmrozić krioprobówkę w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C przez 2-3 minuty. Przenieść zamrożony materiał do 9 ml wstępnie podgrzanej kultury podstawowej (37 °C) i równomiernie zawiesić komórki.</li>
			<li>Odwirowywać zawiesinę komórek przez 5 minut przy 400 x g (w temperaturze pokojowej). Ostrożnie odessać supernatant.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Siew organoidów
		<ol>
			<li>Aby wysiać organoidy, powtórz krok 2.3.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. Analiza histologiczna organoidu
<ol>
	<li>Przygotowanie skrawków zatopionych w parafinie
	<ol>
		<li>Przygotowanie materiałów
		<ol>
			<li>Wysterylizować 50 ml matrycy do zatapiania (roztwór wodny: 2% agar + 2,5% żelatyna) w kolbie o pojemności 250 ml w autoklawie. Podwielokrotność 5 ml do probówek wirówkowych o pojemności 15 ml. Przechowywać w temperaturze pokojowej.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Mocowanie organoidów
		<ol>
			<li>Powtórz kroki 3.2.1-3.2.2. Zawiesić osad z 1 ml buforu pasażowego w świeżej probówce o pojemności 1,5 ml.</li>
			<li>Wirować przy 400 x g w temperaturze 4 °C przez 5 min. Usunąć supernatant. Zawiesić organoidy w 500 μl 4% paraformaldehydu (PFA). Inkubować w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę lub w temperaturze 4 °C przez co najmniej 6 godzin.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Osadzanie organoidów
		<ol>
			<li>Odwirować mieszaninę (400 x g, 5 min, RT). Usunąć supernatant. Dodać 1 ml buforu pasażowego do probówki i ponownie zawiesić wytrącanie.</li>
			<li>Odwirować mieszaninę (400 x g, 5 min, RT). Usunąć supernatant.</li>
			<li>Umieścić jedną probówkę (15 ml) z pożywką (5 ml) w łaźni wodnej (100 ml, pojemnik 150 ml). Kuchenka mikrofalowa z maksymalną mocą, aż woda zacznie wrzeć. 
			UWAGA: Odkręć nakrętkę tubki 15 ml przed podgrzewaniem w kuchence mikrofalowej.</li>
			<li>Zawiesić organoidy za pomocą 50 μl żelu do zatapiania w probówce wirówkowej o pojemności 1,5 ml. Schłodzić probówkę do temperatury 4 °C, aż żel całkowicie stwardnieje.</li>
			<li>Przenieś zestalony żel do 70% etanolu. Przechowywać w temperaturze 4 °C.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Przygotowanie bloku parafinowego
		<ol>
			<li>Odwodnić żel za pomocą serii etanolu (30% → 50% → 70% → 80% → 95% → 100%), 30 minut na stężenie.</li>
			<li>Zestalony żel umieścić w przezroczystym ksylenie na 30 minut. Zestalony żel zanurzyć w parafinie i zatopić za pomocą podgrzanej stacji parafinowej.</li>
			<li>Pokrój plastry o grubości 4 μm za pomocą mikrotomu. Zamontuj na szkiełkach i susz w temperaturze 65 °C przez 1 godzinę. Przechowywać w suchych warunkach.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Barwienie immunohistochemiczne (IHC) wycinków organoidów
	<ol>
		<li>Deparafinacja i nawilżenie
		<ol>
			<li>Podgrzewać plastry w środku do czyszczenia tkanek w temperaturze 65 °C przez 40 minut. Zanurzyć szkiełko w świeżym środku do czyszczenia tkanek w temperaturze pokojowej na 20 minut.</li>
			<li>Przetworzyć szkiełka przez szklane tace zawierające etanol: zanurzyć w 100% etanolu na 10 minut i powtórzyć raz, następnie przenieść do 95% etanolu na 5 minut, następnie 85% etanolu na 5 minut, następnie 75% etanolu na 5 minut, a na koniec umieścić w 4% PFA na 10 minut.</li>
			<li>Dodaj wysterylizowaną wodę do komory termostabilnej i trzymaj 5 minut na wytrząsarce z prędkością 80 obr./min. Powtórz ten krok dwukrotnie.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Pobieranie antygenu
		<ol>
			<li>Dodaj roztwór do pobierania antygenu Tris-EDTA (pH 9,0) do komory termostabilnej, aby zanurzyć szkiełka. Podgrzewaj w kuchence mikrofalowej komorę termostabilną zawierającą szkiełka z maksymalną intensywnością (700 W, 3 min) aż do wrzenia. Podgrzewaj w kuchence mikrofalowej na niskim poziomie mocy (70 W, 15 min) i schładzaj do temperatury pokojowej.</li>
			<li>Myć w wodzie destylowanej przez 2 minuty na shakerze z prędkością 80 obr./min. Powtórz dwa razy. Zakreśl położenie organoidów pisakiem histologicznym.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Blokowanie peroksydazy
		<ol>
			<li>Upuść roztwór blokujący peroksydazę, aby pokryć obszar próbki. Inkubować w komorze wilgotnościowej w temperaturze pokojowej przez 20 minut.</li>
			<li>Przenieś szkiełka do komory termostabilnej. Prać w PBST (PBS + 0,1% Tween 20) przez 2 minuty przy 80 obr./min. Powtórz dwa razy.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Inkubacja przeciwciał pierwotnych
		<ol>
			<li>Delikatnie zetrzyj nadmiar kropelek PBST na szkiełkach. 
			UWAGA: Unikaj dotykania organoidów na szkiełkach.</li>
			<li>Upuść rozcieńczone przeciwciało pierwszorzędowe, aby pokryć obszar organoidu. Inkubować w komorze wilgotnościowej przez 2 godziny w temperaturze pokojowej lub 8-14 godzin w temperaturze 4 °C. Powtórzyć ten krok.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Inkubacja przeciwciał wtórnych
		<ol>
			<li>Powtórz krok 5.2.4.1. Upuść rozcieńczone przeciwciało drugorzędowe HRP, aby pokryć obszar organoidu. Inkubować w komorze wilgotnościowej w temperaturze pokojowej przez 20 minut. Powtórz ten krok.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Barwienie DAB (3,3′-diaminozydyna)
		<ol>
			<li>Powtórz krok 5.2.4.1. Upuść 1× DAB, aby pokryć obszar organoidów. Inkubować w komorze wilgotnościowej w temperaturze pokojowej, aż kolor zmieni kolor na brązowy.</li>
			<li>Zanurz szkiełka w wodzie destylowanej na 5-10 sekund, aby zakończyć zmianę koloru. Powtórz ten krok.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Barwienie hematoksyną
		<ol>
			<li>Barwienie w hematoksylinie przez 5-8 min. Różnicowanie w 1% kwasowym alkoholu (1% HCl w 70% alkoholu) przez 5-10 s.</li>
			<li>Zanurz szkiełka w wodzie destylowanej na 5-10 s. Powtórz ten krok.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>odwodnienie
		<ol>
			<li>Przepuść szkiełka przez szklane tace w kolejności sekwencyjnej: zanurz w 75% etanolu na 5 minut, przenieś do 85% etanolu na 5 minut, przenieś do 95% etanolu na 5 minut, a następnie dwa oddzielne zanurzenia w 100% etanolu na 10 minut każde, a na koniec umieść w ksylenie na dwa kolejne 20-minutowe okresy.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Montaż na suwaku
		<ol>
			<li>Dodaj ksylen do neutralnej gumy, aż stanie się przezroczysta. Lekko wysuszyć na powietrzu. Następnie upuść gumę z ksylenem, aby pokryć obszar organoidu.</li>
			<li>Nałożyć szkiełko nakrywkowe. Zeskanuj i przeanalizuj slajd.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Barwienie immunofluorescencyjne multipleksowe (mIF)
	<ol>
		<li>W celu odparafinowania i nawilżenia powtórzyć krok 5.2.1.</li>
		<li>W przypadku blokowania peroksydazy powtórzyć krok 5.2.3.</li>
		<li>W celu pobrania antygenu powtórzyć krok 5.2.3.</li>
		<li>Blokowanie surowicy owczej.
		<ol>
			<li>Powtórz krok 5.2.4.1. Dodaj roztwór blokujący surowicę owczą, aby pokryć obszar organoidu. Inkubować w komorze wilgotnościowej w temperaturze pokojowej przez 30 minut.</li>
			<li>Myć w PBST przez 2 minuty. Powtórz dwukrotnie.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>W przypadku inkubacji przeciwciał pierwotnych powtórzyć krok 5.2.4.</li>
		<li>W przypadku inkubacji przeciwciał wtórnych powtórzyć krok 5.2.4.1.
		<ol>
			<li>Upuść specyficzny roztwór przeciwciała wtórnego, aby pokryć obszar organoidu. Inkubować w komorze wilgotnościowej w temperaturze pokojowej przez 20 minut. Powtórz krok 5.2.3.2. 
			UWAGA: Chroń szkiełka przed światłem od tego kroku do końca eksperymentu.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Barwienie barwnikiem fluorescencyjnym
		<ol>
			<li>Powtórz krok 5.3.4.1. Upuść roztwór barwnika fluorescencyjnego, aby pokryć obszar organoidu.</li>
			<li>Inkubować w komorze wilgotnościowej w temperaturze pokojowej przez 10-20 minut. Powtórzyć krok 5.2.3.2.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>W przypadku barwienia wielokrotnego powtórz kroki 5.3.3-5.3.7.</li>
		<li>Barwienie DAPI
		<ol>
			<li>Powtórz krok 5.2.4.1. Upuść roztwór DAPI, aby pokryć obszar organoidu. Powtórz krok 5.2.3.2. Następnie powtórz krok 5.3.4.2.</li>
			<li>Zanurz szkiełka w wysterylizowanej wodzie na 2 minuty.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Montaż na suwaku
		<ol>
			<li>Upuść podłoże mocujące zapobiegające blaknięciu, aby pokryć obszar organoidu. Nałożyć szkiełko nakrywkowe.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Pobieraj obrazy cyfrowe za pomocą skanera slajdów i analizuj je.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Zhang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+initiation+and+early+tumorigenesis%3A+Molecular+mechanisms+and+interventional+targets%5BTitle%5D)+AND+%22Signal+Transduct+Target+Ther%22%5BJournal%5D)">Tumor initiation and early tumorigenesis: Molecular mechanisms and interventional targets.</a> Signal Transduct Target Ther. 9 (1), 149(2024).</li>
<li>Sánchez-Danés, A., Blanpain, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deciphering+the+cells+of+origin+of+squamous+cell+carcinomas%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">Deciphering the cells of origin of squamous cell carcinomas.</a> Nat Rev Cancer. 18 (9), 549-561 (2018).</li>
<li>Abnet, C. C., Arnold, M., Wei, W. -Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidemiology+of+esophageal+squamous+cell+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Epidemiology of esophageal squamous cell carcinoma.</a> Gastroenterology. 154 (2), 360-373 (2018).</li>
<li>Bray, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+cancer+statistics+2022%3A+Globocan+estimates+of+incidence+and+mortality+worldwide+for+36+cancers+in+185+countries%5BTitle%5D)+AND+%22CA+Cancer+J+Clin%22%5BJournal%5D)">Global cancer statistics 2022: Globocan estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries.</a> CA Cancer J Clin. 74 (3), 229-263 (2024).</li>
<li>Lin, D. -C., Wang, M. -R., Koeffler, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+and+epigenomic+aberrations+in+esophageal+squamous+cell+carcinoma+and+implications+for+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Genomic and epigenomic aberrations in esophageal squamous cell carcinoma and implications for patients.</a> Gastroenterology. 154 (2), 374-389 (2018).</li>
<li>Chen, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelial+cells+activate+fibroblasts+to+promote+esophageal+cancer+development%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Epithelial cells activate fibroblasts to promote esophageal cancer development.</a> Cancer Cell. 41 (5), 903-918.e8 (2023).</li>
<li>Chang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+alterations+driving+precancerous+to+cancerous+lesions+in+esophageal+cancer+development%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Genomic alterations driving precancerous to cancerous lesions in esophageal cancer development.</a> Cancer Cell. 41 (12), 2038-2050.e5 (2023).</li>
<li>Lo, Y. -H., Karlsson, K., Kuo, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Applications+of+organoids+for+cancer+biology+and+precision+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cancer%22%5BJournal%5D)">Applications of organoids for cancer biology and precision medicine.</a> Nat Cancer. 1 (8), 761-773 (2020).</li>
<li>Loewa, A., Feng, J. J., Hedtrich, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+disease+models+in+drug+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Human disease models in drug development.</a> Nat Rev Bioeng. 1 (8), 545-559 (2023).</li>
<li>Tang, X. -Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+organoids+in+basic+research+and+clinical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Signal+Transduct+Target+Ther%22%5BJournal%5D)">Human organoids in basic research and clinical applications.</a> Signal Transduct Target Ther. 7 (1), 168(2022).</li>
<li>Xu, H., Jiao, D., Liu, A., Wu, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+organoids%3A+Applications+in+cancer+modeling+and+potentials+in+precision+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22J+Hematol+Oncol%22%5BJournal%5D)">Tumor organoids: Applications in cancer modeling and potentials in precision medicine.</a> J Hematol Oncol. 15 (1), 58(2022).</li>
<li>Yan, H. H. N., Chan, A. S., Lai, F. P. -L., Leung, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoid+cultures+for+cancer+modeling%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Organoid cultures for cancer modeling.</a> Cell Stem Cell. 30 (7), 917-937 (2023).</li>
<li>Jiang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishing+mouse+and+human+oral+esophageal+organoids+to+investigate+the+tumor+immune+response%5BTitle%5D)+AND+%22Dis+Model+Mech%22%5BJournal%5D)">Establishing mouse and human oral esophageal organoids to investigate the tumor immune response.</a> Dis Model Mech. 17 (1), dmm050319(2024).</li>
<li>Drost, J., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoids+in+cancer+research%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">Organoids in cancer research.</a> Nat Rev Cancer. 18 (7), 407-418 (2018).</li>
<li>Ko, K. -P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Key+genetic+determinants+driving+esophageal+squamous+cell+carcinoma+initiation+and+immune+evasion%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Key genetic determinants driving esophageal squamous cell carcinoma initiation and immune evasion.</a> Gastroenterology. 165 (3), 613-628.e20 (2023).</li>
<li>Kornepati, A. V. R., Vadlamudi, R. K., Curiel, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Programmed+death+ligand+1+signals+in+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">Programmed death ligand 1 signals in cancer cells.</a> Nat Rev Cancer. 22 (3), 174-189 (2022).</li>
<li>Jiang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+the+tumor+microenvironment+in+PD-L1%2FPD-1-mediated+tumor+immune+escape%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cancer%22%5BJournal%5D)">Role of the tumor microenvironment in PD-L1/PD-1-mediated tumor immune escape.</a> Mol Cancer. 18 (1), 10(2019).</li>
<li>Magré, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+organoid-immune+co-culture+models+for+cancer+research%3A+From+oncoimmunology+to+personalized+immunotherapies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunother+Cancer%22%5BJournal%5D)">Emerging organoid-immune co-culture models for cancer research: From oncoimmunology to personalized immunotherapies.</a> J Immunother Cancer. 11 (5), e006290(2023).</li>
<li>Kijima, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+organoids+reveal+therapy+resistance+of+esophageal+and+oropharyngeal+squamous+cell+carcinoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Gastroenterol+Hepatol%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional organoids reveal therapy resistance of esophageal and oropharyngeal squamous cell carcinoma cells.</a> Cell Mol Gastroenterol Hepatol. 7 (1), 73-91 (2019).</li>
<li>Fujii, M., Sekine, S., Sato, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decoding+the+basis+of+histological+variation+in+human+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">Decoding the basis of histological variation in human cancer.</a> Nat Rev Cancer. 24 (2), 141-158 (2024).</li>
<li>Zhao, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Methods+Primers%22%5BJournal%5D)">Organoids.</a> Nat Rev Methods Primers. 2 (1), 94(2022).</li>
<li>Tong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patient-derived+organoids+in+precision+cancer+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Med%22%5BJournal%5D)">Patient-derived organoids in precision cancer medicine.</a> Med. 5 (11), 1351-1377 (2024).</li>
<li>Grönholm, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patient-derived+organoids+for+precision+cancer+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Patient-derived organoids for precision cancer immunotherapy.</a> Cancer Res. 81 (12), 3149-3155 (2021).</li>
<li>Sun, C. -P., Lan, H. -R., Fang, X. -L., Yang, X. -Y., Jin, K. -T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoid+models+for+precision+cancer+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Organoid models for precision cancer immunotherapy.</a> Front Immunol. 13, 770465(2022).</li>
<li>Kobayashi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+origin+and+contribution+of+cancer-associated+fibroblasts+in+colorectal+carcinogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">The origin and contribution of cancer-associated fibroblasts in colorectal carcinogenesis.</a> Gastroenterology. 162 (3), 890-906 (2022).</li>
<li>Du, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+stemness+of+cancer+stem+cells+to+fight+colorectal+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Cancer+Biol%22%5BJournal%5D)">Targeting stemness of cancer stem cells to fight colorectal cancers.</a> Semin Cancer Biol. 82, 150-161 (2022).</li>
<li>Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+development+and+disease+with+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Modeling development and disease with organoids.</a> Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).</li>
<li>Camp, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+cerebral+organoids+recapitulate+gene+expression+programs+of+fetal+neocortex+development%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Human cerebral organoids recapitulate gene expression programs of fetal neocortex development.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (51), 15672-15677 (2015).</li>
<li>Lau, H. C. H., Kranenburg, O., Xiao, H., Yu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoid+models+of+gastrointestinal+cancers+in+basic+and+translational+research%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Gastroenterol+Hepatol%22%5BJournal%5D)">Organoid models of gastrointestinal cancers in basic and translational research.</a> Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 17 (4), 203-222 (2020).</li>
<li>Han, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Landscape+of+human+organoids%3A+Ideal+model+in+clinics+and+research%5BTitle%5D)+AND+%22The+Innovation%22%5BJournal%5D)">Landscape of human organoids: Ideal model in clinics and research.</a> The Innovation. 5 (3), 100620(2024).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych konfliktów finansowych ani konfliktów interesów.

Ustalenie i analiza histologiczna organoidów stanowią znaczący postęp w modelowaniu progresji guza. Protokół oferuje znaczące korzyści w porównaniu z istniejącymi metodami badania nowotworzenia20. W przeciwieństwie do tradycyjnych systemów hodowli komórkowych 2D, organoidy utrzymują złożoną trójwymiarową architekturę i niejednorodność komórkową, które lepiej odzwierciedlają warunki in vivo. W porównaniu z modelami zwierzęcymi, organoidy pochodzące z tkanek ludzkich dokładniej reprezentują...

Nowotworzenie to złożony, wieloetapowy proces charakteryzujący się postępującymi zmianami molekularnymi i morfologicznymi w komórkach1,2. Rak płaskonabłonkowy przełyku (ESCC), powszechny nowotwór złośliwy o złym rokowaniu3,4, ilustruje ten stopniowy postęp przez cztery odrębne etapy: normalna błona śluzowa, śródnabłonkowa neoplazja o niskim stopniu złośliwości (LGIN), śródnabłonkowa neoplazja wysokiego stopnia (HGIN) i rak inwazyjny5. Na tych etapach komórki nabłonkowe wykazują dynamiczne zmiany we wzorcach ekspresji molekularnej i organizacji przestrzennej, którym towarzyszą systematyczne zmiany w morfologii tkanki w miarę jej przechodzenia ze stanu normalnego do złośliwego6,7. Pomimo postępów w zrozumieniu patogenezy ESCC, brak modeli eksperymentalnych, które wiernie odwzorowywałyby przestrzenne i czasowe aspekty ewolucji nowotworu – umożliwiając jednocześnie systematyczne analizy histologiczne i molekularne – utrudnia głębsze mechanistyczne zrozumienie progresji choroby i rozwoju terapeutycznego.
Chociaż unieśmiertelnione linie komórek nowotworowych 2D wniosły znaczący wkład w zrozumienie onkogenezy, są one z natury ograniczone w odtwarzaniu biologicznej złożoności i patologicznych cech rodzimych nowotworów8. Modele zwierzęce, choć zapewniają kontekst in vivo, często słabo przewidują reakcje ludzi ze względu na różnice specyficzne dla gatunku9. W przeciwieństwie do tego, organoidy pojawiły się jako transformacyjna platforma przedkliniczna, która wiernie zachowuje heterogeniczność, architekturę i funkcjonalność komórek ludzkich tkanek10,11,12,13. Jako modele przedkliniczne, organoidy lepiej oddają charakterystykę nowotworów pierwotnych, umożliwiając szczegółowe badanie kluczowych zdarzeń molekularnych i zmian komórkowych podczas progresji nowotworu14. Na przykład Chen i in. wykorzystali organoidy przełyku pochodzące od pacjentów z różnych etapów ESCC, aby wyjaśnić interakcje nabłonkowo-fibroblastowe, ostatecznie potwierdzając oś sygnalizacyjną ANXA1-FPR2 jako krytyczny czynnik patogenezy ESCC6. Podobnie, Ko i in. wykorzystali genetycznie zmodyfikowane organoidy przełyku do zidentyfikowania kluczowych determinantów genetycznych napędzających inicjację ESCC i unikanie odporności, pokazując, w jaki sposób modele organoidowe mogą skutecznie podsumować cechy choroby i ujawnić nowe cele terapeutyczne15.
Obecna metodologia rozwiązuje istotne problemy w modelowaniu raka przełyku, ustanawiając powtarzalny protokół generowania wieloetapowych organoidów ESCC, które odzwierciedlają histologiczny postęp od normalnego nabłonka do raka inwazyjnego. System ten integruje zoptymalizowane warunki hodowli przy użyciu pożywki kondycjonowanej L-WRN w celu utrzymania pnia nabłonka, w połączeniu ze znormalizowanymi protokołami przetwarzania histologicznego i analizy immunofluorescencji multipleksowej (mIF), zapewniając idealną platformę do podłużnej analizy zmian przestrzennych i molekularnych podczas nowotworzenia. W porównaniu z alternatywnymi technikami, takimi jak hodowle 2D, ta platforma organoidowa w unikalny sposób zachowuje architekturę tkanki, umożliwiając wizualizację przestrzennie zorganizowanych markerów molekularnych, w tym białka immunologicznego punktu kontrolnego PD-L1 (CD274), które pośredniczy w unikaniu odporności guza poprzez hamowanie odpowiedzi limfocytów T16,17,18oraz marker proliferacji Ki-67. Protokół umożliwia organoidom normalne przechodzenie tkanek przełykowych i przedrakowych, pomagając naukowcom zbudować ciągły model organoidów od normalnej tkanki do nowotworu19. Umożliwiając szczegółową analizę zmian przestrzennych i molekularnych podczas nowotworzenia, protokół ten oferuje naukowcom potężne narzędzie do zrozumienia mechanizmów leżących u podstaw rozwoju i progresji raka, co może prowadzić do ulepszenia strategii terapeutycznych.
Ta metodologia jest szczególnie odpowiednia dla badaczy badających kancerogenezę nabłonka, interakcje mikrośrodowiska guza lub reakcje terapeutyczne w ESCC i pokrewnych nowotworach płaskonabłonkowych. Jego modułowa konstrukcja umożliwia adaptację do badania innych markerów molekularnych lub szlaków sygnałowych, pod warunkiem, że zostaną włączone odpowiednie etapy walidacji. Oferując ustandaryzowaną, ale elastyczną platformę, protokół ten ma na celu postęp w badaniach przedklinicznych w biologii nowotworów i przyspieszenie przełożenia mechanistycznych spostrzeżeń na terapie celowane.

<table><tbody><tr><td>0,22 &m; m filtr</td><td>Merck</td><td>Cat#SLGPR33RB</td><td></td></tr><tr><td>24-dołkowa płytka</td><td>Corning</td><td>Cat#3524</td><td></td></tr><tr><td>4% Paraformaldehyd</td><td>Beyotime</td><td>Cat# P0099</td><td></td></tr><tr><td>70 &mu; m sterylne sitko</td><td>Falcon</td><td>Cat#352350</td><td></td></tr><tr><td>A83-01</td><td>Tocris Bioscience</td><td>Cat# 2939</td><td></td></tr><tr><td>Advanced DMEM/F12</td><td>Gibco</td><td>Cat# 12634028</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>Solarbio</td><td>Cat# A8190</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Anti (Antibiotic-Antimycotic)</td><td>Gibco</td><td>Cat# 15240062</td><td></td></tr><tr><td>B-27 suplement</td><td>Gibco</td><td>Cat# 17504044</td><td></td></tr><tr><td>Inkubator CO2</td><td>Thermo&nbsp;</td><td>Kot#371GPCN</td><td></td></tr><tr><td>Kolagenaza IV</td><td>Gibco</td><td>Cat# 17104019</td><td></td></tr><tr><td>Cryostor</td><td>STEMCELL</td><td>Cat# 07930</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Corning</td><td>Cat# 10-013-CV</td><td></td></tr><tr><td>EGF</td><td>Gibco</td><td>Cat# PHG0313</td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca</td><td>Cell Technologies</td><td>Cat# 30070</td><td></td></tr><tr><td>G-418</td><td>Sigma</td><td>Cat# A1720</td><td></td></tr><tr><td>Żelatyna</td><td>Solarbio</td><td>Cat# G8061</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX</td><td>Gibco</td><td>Cat# 35050061</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>Corning</td><td>Cat# 354230</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do barwienia HE</td><td>Beijing Yili Fine Chemicals Co., Ltd</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Gibco</td><td>Cat# 15630080</td><td></td></tr><tr><td>Pióro histologiczne</td><td>Zsbio</td><td>Cat#ZLI-9305</td><td></td></tr><tr><td>Hygromycyna B</td><td>Sigma</td><td>Cat# 400050</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do barwienia immunohistochemicznego</td><td>ZSGB-BIO</td><td>PV-8000</td><td></td></tr><tr><td>L-WRN</td><td>ATCC</td><td>CRL-3276; RRID:CVCL_DA06</td><td></td></tr><tr><td>Suplement N-2</td><td>Gibco</td><td>Cat# 17502048</td><td></td></tr><tr><td>Neutralna guma&nbsp;</td><td>Zsbio</td><td>Cat#ZLI-9555</td><td></td></tr><tr><td>Opal 5-kolorowy ręczny zestaw IHC</td><td>PANOVUE</td><td>Cat# 10144100100</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>MeilunBio</td><td>Cat#MA0015</td><td></td></tr><tr><td>Monoklon królika anty-PD-L1</td><td>CST</td><td>Cat# 13684; RRID:AB_2687655</td><td></td></tr><tr><td>Królik Poliklonalny anty-Ki67</td><td>Abcam</td><td>Cat# ab16667; RRID:AB_302459</td><td></td></tr><tr><td>Królik Poliklonalny anty-KRT6A</td><td>Proteintech</td><td>Cat# 10590-1-AP; RRID: AB_2134306</td><td></td></tr><tr><td>Surowica owcza</td><td>Zsbio</td><td>Cat#ZLI-9056</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE Express</td><td>Gibco</td><td>Cat# 12604021</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE-EDTA</td><td>Gibco</td><td>Cat#15400-054</td><td></td></tr><tr><td>Skaner obrazu całego slajdu</td><td>Hamamatsu</td><td>Cat#C13210</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632</td><td>Selleck Chemicals</td><td>Cat# S1049</td><td></td></tr></tbody></table>

ustalenie i analiza histologiczna organoidów przełyku modelujących progresję od tkanek prawidłowych do nowotworowych

Establishment and Histological Analysis of Esophageal Organoids Modeling the Progression from Normal to Cancerous Tissues

Organoidy stały się kluczowym narzędziem do pogłębiania wiedzy na temat nowotworzenia i terapii raka. Generując ludzkie modele organoidowe reprezentujące różne stadia guza i przeprowadzając analizy histologiczne, możliwe jest głębsze zrozumienie zmian w morfologii komórki, architekturze przestrzennej i ekspresji kluczowych markerów molekularnych w miarę postępu guza. W badaniu przedstawiono kompleksowy protokół tworzenia i hodowli organoidów płaskonabłonkowych przełyku. Ponadto protokół określa metody oceny wzorców ekspresji i organizacji przestrzennej krytycznych cząsteczek w organoidach, wykorzystując techniki takie jak utrwalanie, osadzanie i barwienie. Dzięki temu protokołowi zidentyfikowano znaczące zmiany w strukturze przestrzennej komórek nabłonka płaskonabłonkowego przełyku oraz w ekspresji różnych biomarkerów nowotworowych podczas nowotworzenia. Protokół ułatwia budowę i analizę histologiczną organoidów, umożliwiając naukowcom badanie architektury przestrzennej i zmian molekularnych komórek nabłonkowych na różnych etapach nowotworzenia i interwencji terapeutycznej.

Niniejszy protokół opisuje pobieranie próbek organoidów oraz analizę histologiczną na różnych etapach tumorigenezy ESCC (Rycina 1). Poprzez pobranie próbek prawidłowej błony śluzowej przełyku, wewnątrznabłonkowej neoplazji niskiego stopnia (LGIN), wewnątrznabłonkowej neoplazji wysokiego stopnia (HGIN) oraz tkanek nowotworowych od pacjentów z ESCC, można stworzyć organoidy reprezentujące różne stadia tumorigenezy. Ponadto przeprowadzono zatopienie tych organoidów w parafinie i ich sekcjonowan...

Niniejszy protokół opisuje tworzenie i analizę histologiczną modeli organoidów przełyku, które reprezentują różne etapy progresji nowotworu. Metoda ta umożliwia naukowcom badanie zmian w morfologii komórek, organizacji przestrzennej i wzorcach ekspresji markerów molekularnych podczas przejścia od tkanek normalnych do nowotworowych.

Ustalenie i analiza histologiczna organoidów przełyku modelujących progresję od tkanek prawidłowych do nowotworowych

Organoids have emerged as a pivotal tool for advancing the understanding of tumorigenesis and cancer therapy. By generating human organoid models ...

Nasze badania koncentrują się na inicjacji nowotworu i wczesnej nowotworzeniu nowotworu. Badamy, w jaki sposób normalne komórki przekształcają się w komórki nowotworowe i jak te komórki modyfikują swoje mikrośrodowisko, aby ułatwić nowotworzenie . Obecnie istnieje wiele technologii wykorzystywanych do promowania badań, w tym technologie komórek macierzystych, technologie edycji genów, zaawansowany system hodowli 3D i biomateriały oraz technologie omiki jednokomórkowej i przestrzennej. Największym wyzwaniem, przed którym stoimy, jest utrzymanie organoidów wolnych od bakterii i grzybów. Zanieczyszczenia te wkradają się podczas obchodzenia się z tkankami i transportu, często rujnując nasze kultury.[Instruktor] Na początek rozmrozić matrycę błony podstawnej i pożywkę do hodowli organoidów ludzkiego przełyku w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Przenieś próbkę tkanki do pięciomililitrowych probówek wirówkowych, a następnie umyj próbkę trzykrotnie buforem do przemywania o temperaturze pokojowej. Za pomocą sterylnych nożyczek zmiel tkankę na jednomilimetrowe fragmenty sześcienne w 1,5-mililitrowych probówkach wirówkowych. Teraz zawieś fragmenty tkanek w jednym mililitrze buforu wytra

establishment-histological-analysis-esophageal-organoids-modeling

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Badania nad rakiem

Ten manuskrypt opisuje produkcję, charakterystykę i potencjalne zastosowania konstruktu przełyku 3D wykonanego z normalnego pierwotnego ludzkiego fibroblastu przełyku i płaskonabłonkowych komórek nabłonkowych umieszczonych w pozbawionym komórek rusztowaniu wieprzowym. Wyniki wskazują na tworzenie się dojrzałego nabłonka warstwowego podobnego do normalnego ludzkiego przełyku.

Produkcja, charakterystyka i potencjalne zastosowania 3D modelu błony śluzowej przełyku dla człowieka opartego na inżynierii tkankowej

Ten protokół opisuje metody subhodowli i kriokonserwacji organoidów gruczolakoraka przełyku z trawieniem pojedynczych komórek i bez niego, aby umożliwić badaczom wybór odpowiednich strategii w oparciu o ich eksperymentalny projekt.

Subkultura i kriokonserwacja organoidów gruczolakoraka przełyku: plusy i minusy trawienia pojedynczych komórek

Ten protokół omawia podejście do generowania organoidów nabłonkowych z pierwotnej normalnej i nowotworowej tkanki sutkowej poprzez wirowanie różnicowe. Ponadto dołączono instrukcje dotyczące trójwymiarowej hodowli, a także obrazowania immunofluorescencyjnego osadzonych organoidów.

Generowanie i obrazowanie organoidów nabłonkowych myszy i ludzi z normalnej i nowotworowej tkanki sutka bez pasażowania

Ten protokół opisuje kluczowe kroki do wygenerowania i scharakteryzowania mysich organoidów 3D ustno-przełykowych, które reprezentują normalne, przednowotworowe i płaskonabłonkowe zmiany rakowokomórkowe wywołane przez chemiczną kancerogenezę.

Modelowanie raka płaskonabłonkowego jamy ustnej i przełyku w organoidach 3D

Współhodowle organoidów i fibroblastów dostarczają modelu do badania niszy komórek macierzystych in vivo. W tym miejscu opisano protokół dla kokultur organoidów i fibroblastów przełyku. Dodatkowo obrazowanie całego mocowania służy do wizualizacji interakcji fibroblast-organoid.

Charakterystyka funkcjonalna i wizualizacja fibroblastów przełyku przy użyciu kokultur organoidowych

Organoidy pochodzące od pacjentów żołądkowych znajdują coraz większe zastosowanie w badaniach, jednak brakuje formalnych protokołów do generowania ludzkich organoidów żołądkowych z jednokomórkowych trawień o standaryzowanej gęstości wysiewu. W protokole przedstawiono szczegółową metodę wiarygodnego tworzenia organoidów żołądka z tkanki biopsyjnej uzyskanej podczas endoskopii górnego odcinka kręgosłupa.

Ustalenie i charakterystyka organoidów żołądkowych pochodzących od pacjenta z biopsji łagodnego ciała żołądka i nabłonka antralnego

Tutaj dostępny jest protokół hodowli ludzkich organoidów przełykowych i kultury na granicy faz powietrze-ciecz. Kultura granicy faz powietrze-ciecz organoidów przełyku może być wykorzystana do badania wpływu cytokin na barierę nabłonkową przełyku.

Trójwymiarowe modele hodowli komórkowych w celu zbadania bariery nabłonkowej w eozynofilowym zapaleniu przełyku

Protokół ten opisuje metodę jednoczesnej izolacji organoidów nowotworowych, fibroblastów związanych z rakem (CAF) oraz fibroblastów niezwiązanych z nowotworem (CF) u tego samego pacjenta z rakiem płaskonabłonkowym przełyku (ESCC). Wykorzystanie tych materiałów dopasowanych do pacjentów mogłoby uniknąć problemów związanych z zmiennością między pacjentami i zapewnić odpowiednią platformę eksperymentalną dla badań ESCC.

Ustanowienie organoidów nowotworowych, fibroblastów związanych z rakiem oraz odpowiedników fibroblastów u tego samego pacjenta z rakiem przełyku

Obecność nowotworowych komórek macierzystych (CSC) w mięsakach kostnych została ostatnio powiązana z ich patogenezą. W artykule przedstawiono izolację CSCs z pierwotnych kultur komórkowych uzyskanych z ludzkich biopsji konwencjonalnego kostniakomięsaka (OS) z wykorzystaniem zdolności CSC do wzrostu w warunkach niezakaźnych.

Ustanowienie hodowli nowotworowych komórek macierzystych z ludzkiego konwencjonalnego kostniakomięsaka

Model zwierzęcy jest potrzebny do rozszyfrowania roli krążących komórek nowotworowych (CTC) w promowaniu kolonizacji płuc podczas przerzutów raka. W tym miejscu opracowaliśmy i z powodzeniem przeprowadziliśmy test in vivo, aby przetestować wymóg składania polimerycznej fibronektyny (polyFN) na CTC w celu kolonizacji płuc.

Opracowanie testu kolonizacji płuc do wizualizacji krążących komórek nowotworowych w tkankach płuc

Poznaj metodę hodowli organoidów przełyku i analizy histologicznej w badaniach nowotworowych. Technika umożliwia obserwację zmian morfologicznych i ekspresji markerów molekularnych podczas progresji od tkanek prawidłowych do nowotworowych.

Ustalenie i analiza histologiczna organoidów przełyku modelujących progresję od tkanek prawidłowych do nowotworowych

Przeglądaj więcej filmów