Ustalenie i analiza histologiczna organoidów przełyku modelujących progresję od tkanek prawidłowych do nowotworowych

Nasze badania koncentrują się na inicjacji nowotworu i wczesnej nowotworzeniu nowotworu. Badamy, w jaki sposób normalne komórki przekształcają się w komórki nowotworowe i jak te komórki modyfikują swoje mikrośrodowisko, aby ułatwić nowotworzenie . Obecnie istnieje wiele technologii wykorzystywanych do promowania badań, w tym technologie komórek macierzystych, technologie edycji genów, zaawansowany system hodowli 3D i biomateriały oraz technologie omiki jednokomórkowej i przestrzennej. Największym wyzwaniem, przed którym stoimy, jest utrzymanie organoidów wolnych od bakterii i grzybów. Zanieczyszczenia te wkradają się podczas obchodzenia się z tkankami i transportu, często rujnując nasze kultury.

[Instruktor] Na początek rozmrozić matrycę błony podstawnej i pożywkę do hodowli organoidów ludzkiego przełyku w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Przenieś próbkę tkanki do pięciomililitrowych probówek wirówkowych, a następnie umyj próbkę trzykrotnie buforem do przemywania o temperaturze pokojowej. Za pomocą sterylnych nożyczek zmiel tkankę na jednomilimetrowe fragmenty sześcienne w 1,5-mililitrowych probówkach wirówkowych. Teraz zawieś fragmenty tkanek w jednym mililitrze buforu wytrawiającego. Potrząsaj mieszaniną w temperaturze 37 stopni Celsjusza z prędkością od 50 do 100 obrotów na minutę przez 10 do 20 minut, aby strawić tkankę. Następnie odwiruj mieszaninę w temperaturze 400G przez pięć minut w czterech stopniach Celsjusza. Następnie odrzucić supernatant. Zawiesić osad w 500 mikrolitrach 0,025% trypsyny-EDTA. Inkubować zawiesinę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 10 minut. Następnie dodaj jeden mililitr DMEM uzupełniony 10% płodową surowicą bydlęcą, aby zatrzymać aktywność enzymatyczną. Następnie przepuść zawiesinę przez sterylny filtr o długości 70 mikrometrów i zbierz filtrat do 1,5-mililitrowej probówki wirówkowej. Odwirowywać filtrat przez pięć minut w temperaturze 400 g w czterech stopniach Celsjusza. Ponownie zawiesić komórki w 100 mikrolitrach H-EOCM po odrzuceniu supernatantu. Po ponownym wybudzeniu komórek określ gęstość komórek za pomocą licznika komórek. Następnie przenieś od 5 000 do 15 000 komórek na mililitr do świeżej 1,5-mililitrowej probówki. W przypadku wysiewu organoidów delikatnie zawieś komórki w 50 do 100 mikrolitrach macierzy błony podstawnej. Odpipetować 50 mikrolitrów mieszaniny komórek matrycowych do środka każdej studzienki 24-dołkowej płytki. Inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 30 minut w celu polimeryzacji macierzystej matrycy błony podstawnej. Teraz odpipetuj 500 mikrolitrów wstępnie ogrzanego H-EOCM do każdego dołka, aby pokryć matrycę. Następnie inkubuj płytkę w nawilżonym inkubatorze z 5% dwutlenkiem węgla w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Aby wymienić pożywkę, odessać zużyte podłoże. Uzupełnij każdą studzienkę 500 mikrolitrami świeżego H-EOCM podgrzanego do 37 stopni Celsjusza. Do wykonywania multipleksowego barwienia immunofluorescencyjnego na reparatynizowanych i uwodnionych organoidach. Dodać roztwór blokujący surowicę owczą, aby przykryć organoidy na szkiełku umieszczonym w komorze wilgotnościowej i inkubować szkiełko w temperaturze pokojowej przez 30 minut. Myj szkiełko za pomocą Tween zawierającego PBS przez dwie minuty. Następnie upuść rozcieńczone przeciwciało pierwszorzędowe, aby pokryć obszar organoidu. Inkubować w komorze wilgotnościowej zgodnie z wymaganiami przeciwciał. Po inkubacji umyć szkiełka w PBS-T dwa razy przez dwie minuty przy 80 PMM w komorze termostabilnej. Teraz upuść wtórny roztwór przeciwciała na obszar organoidu i inkubuj w komorze wilgotnościowej w temperaturze pokojowej przez 20 minut. Po inkubacji umyć szkiełka w PBS-T dwa razy przez dwie minuty przy 80 obr./min w komorze termostabilnej. Odpipetować fluorescencyjny roztwór barwnika na umyte szkiełko, aby pokryć obszar organoidu i ponownie inkubować. Po inkubacji umyć szkiełka w PBS-T dwa razy. W przypadku barwienia wielobarwnego powtórz pobieranie antygenu i blokowanie przeciwciał. Następnie upuść dappy roztwór, aby pokryć obszar organoidu. Zanurz szkiełka w wysterylizowanej wodzie na dwie minuty, aby zmyć nadmiar plamy. Dodaj podłoże mocujące zapobiegające blaknięciu i nałóż szkiełko nakrywkowe przed uzyskaniem obrazów cyfrowych. Struktury organoidowe stawały się coraz bardziej zdezorganizowane od stadium normalnego do rakowego, co uwidoczniło się za pomocą barwienia KRT6A. Ekspresja PDL1 stopniowo wzrastała od prawidłowej błony śluzowej przełyku do raka płaskonabłonkowego przełyku.