En face Kriosekcja siatkówki myszy w celu przeprowadzenia wielowymiarowej przestrzennej analizy molekularnej

Siatkówka jest użytecznym modelem do zrozumienia obliczeń neuronalnych. Obliczenia te zależą od specjalnych pozycji komórek. Jednak kompleksowe mapy tego obszaru pozostały nieuchwytne.

W ciągu ostatniej dekady sekwencjonowanie pojedynczych komórek dostarczyło jasnych opisów typów komórek siatkówki. Obecnie transkryptomika przestrzenna zapewnia nowatorski sposób wykorzystania tych opisów w nienaruszonej tkance. Krytycznym wyzwaniem dla stosowania transkryptomiki przestrzennej jest to, że wymaga ona bardzo cienkich odcinków tkanek. Siatkówka jest już dość cienka w płaszczyźnie poziomej, która nas interesuje.

Wynalezienie tej metody do tworzenia cienkich i szybkich odcinków, wykorzystanie transkryptomiki przestrzennej w uczeniu maszynowym do mapowania wszystkich komórek zwojowych siatkówki w tej samej tkance. W ciągu ostatnich 30 lat tylko 17 z 45 komórek zwojowych siatkówki myszy zostało zmapowanych, a ta technika umożliwiła nam zmapowanie ich wszystkich jednocześnie.

[Instruktor] Na początek połóż uświęconą mysz na stole roboczym. Poprowadź skroniowy biegun kuli ziemskiej na rogówce, aby utrzymać orientację i stworzyć słaby punkt do rozwarstwienia. Zanurz kulę ziemską i wyceluj roztwór w naczyniu zawierającym kawałek bibuły filtracyjnej. Za pomocą ostrych kleszczy numer pięć i nożyczek do tęczówki ostrożnie usuń wszystkie mięśnie, powięź, naczynia krwionośne i nerwy z gałki ziemskiej bez nakłuwania twardówki. Umieść końcówkę jednego ostrza nożyczek Iris prostopadle do marki rogówki. Przebij kulę ziemską w tej pozycji. Wykonaj pojedyncze czyste nacięcie przez rogówkę i rąbek, kontynuując w twardówce i siatkówce w kierunku głowy nerwu wzrokowego. Następnie ustaw ostrze prostopadle do początkowego cięcia, około milimetra za rąbkiem. Rozpocznij cięcie promieniście przez twardówkę i siatkówkę. Utrzymuj stałą linię cięcia z tyłu i równolegle do rąbka, używając ostrych kleszczy do prowadzenia i obracania kuli ziemskiej. Jeśli siatkówka i twardówka rozdzielą się, zmień położenie ostrza nożyczek Iris, aby je przeciąć. Oszacuj odległość tylną jeden milimetr za pomocą środkowej szerokości ostrza nożyczek Iris Po zakończeniu cięcia promieniowego równolegle do rąbka sprawdź, czy nie ma pozostałych połączeń siatkówki. Ostrożnie odetnij je nożyczkami do tęczówki, aż przednia i tylna część kuli ziemskiej zostaną oddzielone. Następnie użyj dwóch par ostrych kleszczy numer pięć, aby delikatnie oddzielić przednią i tylną część kuli ziemskiej. U starszych myszy, jeśli przezroczyste włókna łączą soczewkę z miseczką siatkówki, ostrożnie odetnij je nożyczkami Iris, minimalizując separację twardówki siatkówki. Używając bibuły filtracyjnej jako platformy nośnej, przetnij siatkówkę w liść koniczyny, zwany również wzorem żelaznego krzyża za pomocą nożyczek Iris. Powtórz sekcję z drugim okiem. Odetnij końcówkę jednorazowej plastikowej pipety do transferu, aby utworzyć otwór większy niż wypreparowana siatkówka i twardówka. Delikatnie zassać siatkówkę do pipety i umieścić ją na szklanym szkiełku mikroskopowym. Za pomocą chusteczki laboratoryjnej usuń nadmiar roztworu do celowania, aż siatkówka przestanie unosić się i będzie można ją spłaszczyć. Teraz użyj dwóch ostrych kleszczyków numer pięć, aby rozłożyć siatkówkę i ustawić ją płasko z wewnętrzną muszlą oczną skierowaną do góry. Wykonuj wypukłe nacięcia o długości od 0,5 do dwóch milimetrów w każdym segmencie reliefu koniczyny, aby ułatwić spłaszczanie i dostosuj, aby zapobiec składaniu. Usuń pozostały roztwór do celowania, z wyjątkiem płynu przylegającego do siatkówki. Za pomocą szkiełka nakrywkowego szybko dociśnij i przenieś siatkówkę tak, aby twardówka zewnętrzna była skierowana do góry, a wewnętrzna muszla oczna stykała się z szkiełkiem nakrywkowym. Sprawdź, czy siatkówka nie jest zagięta i w razie potrzeby dokonaj regulacji. Dodaj roztwór do celowania, aby ułatwić manipulację, ale usuń nadmiar chusteczką, aby zapobiec zwijaniu się i pozostaw do wyschnięcia na powietrzu przez pięć do 10 sekund. Teraz nałóż pożywkę OCT, aby pokryć siatkówkę. Następnie użyj kleszczyków, aby równomiernie rozprowadzić warstwę na szkiełku nakrywkowym, aby zapobiec flotacji. Błyskawicznie zamroź siatkówkę w pożywce OCT za pomocą metalowej płytki chłodzonej parami ciekłego azotu lub bezpośrednio kontaktując się z suchym lodem. Przechowuj zamrożoną siatkówkę na suchym lodzie do natychmiastowego użycia. Do kriosekcji utwórz kopułę OCT na uchwycie próbki, zajmującą wewnętrzne dwa do trzech pierścieni, jeśli używasz tego samego modelu kriostatu. Dopasuj uchwyt do próbki płasko do powierzchni cięcia. Utwórz lub zanotuj prowadnicę orientacyjną łączącą uchwyt z stolikiem kriostatu. Następnie przytnij kopułę, aby utworzyć płaską powierzchnię równoległą do ostrza. Za pomocą żyletki usuń nadmiar OCT z boku i ostrożnie oddziel siatkówkę od szkiełka nakrywkowego, aby była ruchoma. Zdejmij uchwyt ze stolika i nałóż niewielką kroplę płynu OCT na przygotowaną płaską powierzchnię OCT. Następnie umieść siatkówkę bezpośrednio na płynnym OCT. Użyj wstępnie schłodzonego szkiełka, aby docisnąć i przytrzymać siatkówkę do momentu zamrożenia. Nałóż więcej OCT na siatkówkę i uchwyt, aby zapewnić połączenie. Następnie zamroź zespół w obszarze szybkiego zamrażania kriostatu. W przypadku cięcia ostrożnie przycinaj nadmiar OCT, aż siatkówka będzie widoczna. Użyj żyletki, aby ukształtować krawędzie bloku OCT blisko siatkówki. Kontynuuj przycinanie podczas sprawdzania obecności twardówki. Gdy twardówka jest widoczna, w razie potrzeby dostosuj kąt sceny. Przestań przycinać, gdy twardówka jest w przybliżeniu równomiernie rozłożona na sekcjach. Teraz użyj wstępnie schłodzonych szkiełek i dwóch pędzli malarskich, aby manipulować sekcjami i je zbierać. Umieść palec pod sekcją na około pięć sekund, aż OCT stopi się i przylgnie tkanka do szkiełka. Następnie umieść szkiełko z powrotem na zimnej powierzchni w celu ponownego zamrożenia. Przygotowane szkiełka przechowuj na suchym lodzie do natychmiastowego użycia. Wyraźna immunoreaktywność lub RBPMS w warstwie komórek zwojowych i wyraźne oddzielenie splotów naczyniowych znakowane lektyną pomidorową potwierdziło skuteczne zachowanie laminacji siatkówki i markerów białkowych. Detekcja multipleksowego RNA za pomocą panelu 12-plex RNA Scope z powodzeniem utrzymała strukturę przestrzenną i ujawniła wyraźną ekspresję markerów, takich jak Grm6 i RBPMS, w całym wycinku na powierzchni. Obrazy o wysokiej rozdzielczości potwierdziły wzorce ekspresji pojedynczej komórki dla RBPMS i innych markerów, takich jak Mafb6 i Meis2, walidując lokalizację zarówno białka, jak i RNA w warstwie komórek zwojowych. Równomierny rozkład sygnału w sekcjach liści koniczyny i silne sygnały w przestrzennych danych transkryptomicznych xenium potwierdziły udane profilowanie o wysokiej przepustowości i integralność RNA. Wizualizacja rozdzielczości pojedynczej komórki przy użyciu dopasowanych wzorców ręcznego wykrywania xenium, potwierdzająca niezawodność protokołu na różnych platformach. Markery transkrypcyjne specyficzne dla typu komórki wykazały warstwowy rozkład laminarny w przekroju siatkówki i na mapowaniu twarzy, zachowały swoje położenie na całej głębokości. Szczegółowe zbliżenie warstwy komórek zwojowych potwierdziło dokładne wykrywanie transkryptu przestrzennego w stosunku do barwienia jądrowego DAPI.