Name: En face Kriosekcja siatkówki myszy w celu przeprowadzenia wielowymiarowej przestrzennej analizy molekularnej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-07-08T12:40:00.000+00:00
Duration: 8 min 57 s
Description: Poznaj metodę kriosekcji siatkówki myszy w celu przeprowadzenia analizy przestrzennej transkryptomiki. Technika ta umożliwia kompleksowe mapowanie komórek zwojowych siatkówki z zachowaniem ich lokalizacji przestrzennej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Human Immune Monitoring Shared Resource (RRID:SCR_021985) przy University of Colorado Cancer Center (P30CA046934) za ich fachową pomoc w obsłudze platformy 10X Xenium. Prace te były wspierane przez Narodowe Instytuty Zdrowia (R01EY035293).

Wszystkie eksperymenty zostały przeprowadzone zgodnie i za zgodą Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) oraz odpowiednimi wytycznymi instytucjonalnymi zatwierdzającymi te metody nadzorowane przez University of Colorado. Wszystkie kroki związane z wykorzystywaniem zwierząt i eutanazją muszą być zgodne z lokalnymi przepisami i pozwoleniami eksperymentalnymi. Wszystkie myszy były trzymane pod standardową opieką w akredytowanej placówce weterynaryjnej z bezpłatnym dostępem do jedzenia i wody. Ta technika kriosekcji en face opiera się na standardowych technikach preparacji siatkówki zoptymalizowanych dla myszy C57BL/6. Do opracowania tej techniki wykorzystano około 150 myszy obojga płci w wieku od 6 tygodni do 2 lat. Ostatnia przedstawiona tutaj technika ma wskaźnik sukcesu wynoszący około 95%, niezależnie od cech demograficznych myszy. Należy pamiętać, że jeśli temperatura nie jest podana dla danego stopnia, przewiduje się temperaturę pokojową około 20-25 °C. Roztwory bez podanej temperatury będą działać, jeśli zostaną schłodzone, a zatem zakres temperatur roboczych dla roztworów wynosi 4-25 °C.
1. Sekcja
<ol>
	<li>Znieczulij mysz izofluranem i zweryfikuj znieczulenie za pomocą uszczypnięcia palca u nogi lub postępuj zgodnie z lokalnymi zasadami i przepisami, aby wywołać i potwierdzić znieczulenie, ponieważ inne metody są równie odpowiednie.</li>
	<li>Poddaj mysz eutanazji przez zwichnięcie szyjki macicy: jedną ręką zabezpiecz głowę myszy, a drugą podstawę ogona, a następnie pociągnij w przeciwnych kierunkach. Dokonać wtórnej eutanazji przez ścięcie.</li>
	<li>Oznacz biegun skroniowy kuli ziemskiej na rogówce, aby zachować orientację i stworzyć słaby punkt do rozwarstwienia (<silna klasa="xfig">Rysunek 2B i <silna klasa="xfig">Rysunek 3A).</li>
	<li>Zanurz kulę ziemską w roztworze Amesa w naczyniu zawierającym kawałek bibuły filtracyjnej (większy niż kula ziemska, ale mniejszy niż naczynie). 
	UWAGA: Stosowanie roztworów innych niż Ames spowoduje pogorszenie stanu siatkówki (<silna klasa="xfig">Rysunek 4A).</li>
	<li>Używając ostrych kleszczyków #5 i nożyczek do tęczówki, ostrożnie usuń wszystkie mięśnie, powięź, naczynia krwionośne i nerwy z kuli ziemskiej (<silna klasa="xfig">Rysunek 2E,F i <silna klasa="xfig">Rysunek 3B) bez nakłuwania twardówki (<silna klasa="xfig">Rysunek 2D). 
	UWAGA: Nakłucie twardówki na tym etapie (<silna klasa="xfig">Rysunek 4B) spowoduje przepuklinę tkanki (<silna klasa="xfig">Rysunek 4C).</li>
	<li>Umieść końcówkę jednego ostrza nożyczek tęczówki prostopadle do marki rogówki, a nożyczki równolegle do głowy nerwu wzrokowego. Przebij kulę ziemską w tej pozycji (<silna klasa="xfig">Rysunek 3C,D).</li>
	<li>Wykonaj pojedyncze czyste nacięcie przez rogówkę i rąbek, kontynuując do twardówki i siatkówki w kierunku głowy nerwu wzrokowego (<silna klasa="xfig">Rysunek 3E). 
	UWAGA: Nie przecinaj głowy nerwu wzrokowego, ponieważ twardówka i siatkówka rozdzielą się. Dokładna długość tego nacięcia będzie się różnić w zależności od wielkości kuli ziemskiej, która może się znacznie różnić między starymi i młodymi zwierzętami, a także w niektórych liniach Cre w stosunku do zwierząt typu dzikiego. Zalecamy pozostawienie około 1 mm tkanki między najgłębszym zakresem tego nacięcia a głową nerwu wzrokowego.</li>
	<li>Ustaw ostrze prostopadle do początkowego cięcia (<silna klasa="xfig">Rysunek 3F,G), około 1 mm za rąbkiem (<silna klasa="xfig">Rysunek 2C). Rozpocznij cięcie promieniście przez twardówkę i siatkówkę.
	<ol>
		<li>Utrzymuj stałą linię cięcia z tyłu i równolegle do rąbka, używając ostrych kleszczy do prowadzenia i obracania kuli ziemskiej. Chociaż minimalizacja cięć jest idealna, priorytetem jest utrzymanie czystej ścieżki promieniowej. Jeśli siatkówka i twardówka rozdzielają się, zmień położenie ostrza nożyczek do tęczówki, aby je przeciąć. 
		UWAGA: Cięcie w rąbku może spowodować oddzielenie siatkówki od twardówki podczas ekstrakcji soczewki. Dopuszczalne są małe cięcia i rotacje. Unikaj stosowania siły, aby go zabezpieczyć, ponieważ grozi to przepukliną siatkówki.</li>
		<li>Oszacuj odległość tylną 1 mm za pomocą środkowej szerokości ostrza nożyczek do tęczówki. W razie niepewności skieruj się w stronę bardziej tylnej pozycji, ponieważ połączenie siatkówki z rąbkiem zakrzywia się wewnętrznie. Bardziej tylne cięcie ułatwia płaską ekstrakcję siatkówki.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Po wykonaniu promieniowego cięcia równolegle do rąbka należy sprawdzić, czy nie ma pozostałych połączeń siatkówki. Ostrożnie odetnij je nożyczkami do tęczówki, aż przednia i tylna część kuli ziemskiej zostaną oddzielone.</li>
	<li>Używając dwóch par ostrych kleszczyków #5, delikatnie oddziel przednią i tylną część kuli ziemskiej (<silna klasa="xfig">Rysunek 3H). U starszych myszy przezroczyste włókna mogą łączyć soczewkę z miseczką siatkówki; Ostrożnie odetnij je nożyczkami do tęczówki, minimalizując separację siatkówki i twardówki. 
	UWAGA: Soczewka powinna pozostać przymocowana do rąbka i rogówki.</li>
	<li>Używając bibuły filtracyjnej jako platformy nośnej, przetnij siatkówkę w liść koniczyny (znany również jako żelazny krzyż) za pomocą nożyczek do tęczówki (<silna klasa = "xfig">Rysunek 3I-K). 
	UWAGA: Nacięcia liści koniczyny powinny być krótsze niż pierwotne nacięcie orientacyjne początkowo wykonane przez rąbek, jeśli pożądane jest rejestrowanie orientacji za pomocą tego plasterka. Zalecamy zmniejszenie rozmiaru tych trzech nowych promieniowych nacięć, aby były o około 1-2 mm krótsze niż pierwotne nacięcie. Jeśli do orientacji zostanie użyta inna cecha, taka jak gradient opsyny, właściwe jest, aby wszystkie nacięcia miały tę samą długość, zawsze zachowując około 1 mm tkanki między najgłębszą częścią nacięcia a głową nerwu wzrokowego, aby zapobiec oddzieleniu siatkówki i twardówki.</li>
	<li>Powtórz sekcję z drugim okiem. Aby zminimalizować martwicę, należy całkowicie usunąć przednią komorę drugiego oka w ciągu 10 minut od eutanazji.</li>
</ol>
2. Kriokonserwacja
<ol>
	<li>Przygotuj jednorazową plastikową pipetę do przenoszenia, przecinając końcówkę, aby utworzyć otwór większy niż wypreparowana siatkówka i twardówka (zwana dalej siatkówką).</li>
	<li>Delikatnie zassać siatkówkę do pipety i umieścić ją na szklanym szkiełku mikroskopowym. Za pomocą chusteczki laboratoryjnej ostrożnie usuń nadmiar roztworu Amesa wokół siatkówki, aż przestanie on swobodnie unosić się i będzie można go spłaszczyć.</li>
	<li>Za pomocą dwóch ostrych kleszczyków #5 rozłóż siatkówkę i ustaw ją płasko z wewnętrzną muszlą oczną skierowaną do góry. W zależności od wielkości tkanki, wykonaj 0,5-2 mm nacięcia reliefowe w każdym segmencie koniczyny, aby jeszcze bardziej spłaszczyć siatkówkę, ostrożnie dostosowując tkankę, aby zapobiec fałdowaniu się (<silna klasa = "xfig" >Ryc. 5A). Usuń dodatkowy roztwór Amesa, aż płyn pozostanie tylko w sąsiedztwie siatkówki.</li>
	<li>Za pomocą szkiełka nakrywkowego szybko naciśnij i przenieś siatkówkę (<silna klasa = "xfig" >Ryc. 5B) wraz z otaczającym ją płynem tak, aby zewnętrzna twardówka była skierowana do góry, a wewnętrzna muszla oczna stykała się ze szkiełkiem nakrywkowym, to znaczy, że komórki zwojowe siatkówki będą skierowane do góry (<silna klasa = "xfig" >Ryc. 5C).</li>
	<li>Sprawdź, czy siatkówka nie jest zagięta i dokonaj regulacji w razie potrzeby; dodaj roztwór Amesa, aby ułatwić manipulację. Ponieważ nadmiar płynu spowoduje zwijanie się tkanki, użyj chusteczki laboratoryjnej, aby usunąć cały nadmiar roztworu Amesa i pozostaw siatkówkę do wyschnięcia na powietrzu przez 5-10 s. 
	UWAGA: Nieumożliwienie krótkiego wyschnięcia powietrzem może losowo spowodować separację tkanek od OCT podczas kriosekcji. Nadmierne wysuszenie powietrzem może prowadzić do uszkodzenia tkanek związanego z kryształami soli.</li>
	<li>Nałóż pożywkę OCT, aby pokryć siatkówkę i użyj kleszczy, aby równomiernie rozprowadzić tę warstwę na szkiełku nakrywkowym, zapobiegając flotacji siatkówki. Odczekaj 30 sekund, aby medium OCT przeniknęło do siatkówki.</li>
	<li>Błyskawiczne zamrożenie siatkówki w OCT (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 5D) za pomocą metalowej płytki chłodzonej pośrednio parami ciekłego azotu lub poprzez bezpośredni kontakt z suchym lodem.</li>
	<li>Siatkówki należy przechowywać na suchym lodzie w przypadku natychmiastowego użycia lub w zamrażarce o temperaturze -80 °C w plastikowej torbie lub pojemniku zawierającym środki osuszające, jeśli przechowuje się je przez dłuższy czas.</li>
</ol>
3. Kriosekcja
<ol>
	<li>Ustaw komorę kriostatu na -18 °C i stage na -12 °C. Umieść siatkówkę w komorze, aby zrównoważyć temperaturę.</li>
	<li>Utwórz kopułę OCT na uchwycie do próbek. Jeśli używasz tego samego modelu kriostatu, upewnij się, że ta kopuła zajmuje wewnętrzne 2-3 pierścienie. Po zamrożeniu przytnij kopułę OCT, aby utworzyć płaską powierzchnię stage równoległą do ostrza na uchwycie, aby zachować płaskość laminarną (<silna klasa = "xfig">Rysunek 6A).</li>
	<li>Utwórz lub zanotuj prowadnicę orientacyjną odnoszącą uchwyt do stolika kriostatu. 
	UWAGA: W zalecanym przez nas modelu kriostatu prowadnica orientacyjna jest centralną linią wytrawioną w pozycji godziny 12 nad uchwytem uchwytu, podczas gdy sam uchwyt ma trójkątne wycięcie na najbardziej zewnętrznym pierścieniu. Razem odnosimy się do tych funkcji jako do przewodnika orientacyjnego. Jeśli Twój kriostat nie ma takich funkcji, zalecamy użycie markera permanentnego do wykonania własnego.</li>
	<li>Przygotuj siatkówkę do transferu za pomocą żyletki, usuwając nadmiar OCT otaczającego siatkówkę z boku, a następnie ostrożnie oddzielając siatkówkę od szkiełka nakrywkowego, aby była ruchoma.</li>
	<li>Zdejmij uchwyt ze stolika i nałóż niewielką kroplę płynu OCT na przygotowaną płaską powierzchnię stolika OCT.</li>
	<li>Umieść siatkówkę bezpośrednio na płynnym OCT. Używając wstępnie schłodzonego (-18 °C) szkiełka podstawowego, dociśnij i przytrzymaj siatkówkę przy stoliku OCT przez 10-30 s, aż do zamrożenia.</li>
	<li>Nałóż dodatkowe OCT na siatkówkę i etap, aby zapewnić całkowite połączenie. Zamroź w obszarze szybkiego zamarzania kriostatu. Inkubuj etap siatkówki/OCT w kriostacie przez co najmniej 30 minut, aby zapewnić całkowite wiązanie.</li>
	<li>Rozpocznij sekcję:
	<ol>
		<li>Ostrożnie przycinaj nadmiar OCT, aż siatkówka stanie się widoczna (<silna klasa="xfig">Rysunek 6B). Użyj żyletki, aby usunąć nadmiar OCT z krawędzi bloków. 
		UWAGA: Zawsze chowaj stolik przed wznowieniem cięcia po ręcznym, promieniowym przycinaniu. Do przycinania plastrów en face zalecamy użycie tej samej grubości cięcia, jaka zostanie użyta dla żądanych sekcji; Jednak grubość przycinania może wynosić od 10 μm do 100 μm w zależności od preferencji użytkownika.</li>
		<li>Kontynuuj przycinanie, sprawdzając sekcje pod kątem obecności twardówki. Gdy twardówka jest widoczna, dostosuj kąt stage zgodnie z potrzebami. Kontynuuj przycinanie, aż sekcje wykażą równomierny rozkład twardówki, co zapewni optymalną płaskość i maksymalną powierzchnię liści koniczyny w każdej sekcji.</li>
		<li>Zbierz skrawki tkanek (<silna klasa="xfig">Rysunek 6C). 
		UWAGA: Optymalna grubość będzie zależeć od przeprowadzanego końcowego testu i musi być zgodna z tym protokołem. Na przykład, jeśli stosowany jest 10X Xenium, zalecamy sekcje o grubości 20 μm. Natomiast w przypadku 10X Visium bardziej odpowiednie są sekcje o grubości 15 μm.</li>
		<li>Użyj wstępnie schłodzonych slajdów i manipuluj sekcjami za pomocą dwóch pędzli.</li>
		<li>Umieść palec pod sekcją, aż OCT się rozpuści, a tkanka przylega (około 5 s).</li>
		<li>Umieść szkiełko z powrotem na zimnej powierzchni w celu ponownego zamrożenia tkanek. 
		UWAGA: W przypadku zbierania skrawków na małych obszarach (np. w przypadku Xenium) może być konieczne wielokrotne cykle zamrażania i rozmrażania. Chociaż nie ma to wpływu na techniki oparte na sondzie, może mieć wpływ na jakość RNA w przypadku bezstronnych podejść do sekwencjonowania.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Szkiełka należy przechowywać na suchym lodzie do natychmiastowego użycia, w temperaturze -20 °C dla RNAscope następnego dnia i w temperaturze -80 °C dla długotrwałego przechowywania.</li>
</ol>
4. Wykrywanie celów i mikroskopia
UWAGA: Chociaż technika ta jest kompatybilna z innymi metodami profilowania molekularnego, szczegółowo opisujemy RNAscope jako jeden z potwierdzonych przykładów.
<ol>
	<li>Przygotowanie próbki:
	<ol>
		<li>Wyjmij szkiełka z przechowywania w temperaturze -80 °C i ogrzej w temperaturze -20 °C przez 1 godz. 
		UWAGA: Szkiełka można przechowywać w temperaturze -20 °C do 12 godzin przed rozpoczęciem reszty tej procedury, ale nie należy ich pozostawiać w temperaturze -20 °C zbyt długo, aby zminimalizować degradację RNA.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Szybko podgrzewaj szkiełka w temperaturze 37 °C przez 10 s.</li>
	<li>Utrwal chusteczkę, zanurzając szkiełka w świeżym 4% PFA na 30 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Dokładnie umyj szkiełka za pomocą 1x PBS.</li>
	<li>Odwodnienie tkanek za pomocą serii etanolowej: 50% etanolu przez 5 min, 70% etanolu przez 5 minut, 100% etanolu przez 5 minut, świeży 100% etanol przez 5 min. 
	UWAGA: Jest to krytyczny etap kontroli jakości przy montażu tkanek. Jeśli podczas odwodnienia dojdzie do odwarstwienia tkanki, oznacza to zachodzenie OCT na sąsiednie odcinki podczas montażu. Staranne przycinanie nadmiaru OCT podczas cięcia i montażu zapobiega temu problemowi.</li>
	<li>Przygotowanie bariery:
	<ol>
		<li>Suszyć szkiełka na blacie przez 5 minut w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Za pomocą hydrofobowego pisaka barierowego narysuj barierę wokół każdego odcinka tkanki. Pozostaw barierę do całkowitego wyschnięcia na 5 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Detekcja molekularna:
	<ol>
		<li>Zastosuj leczenie proteazą IV w celu przepuszczalności tkanek.</li>
		<li>Postępuj zgodnie z protokołem producenta dla hybrydyzacji sondy docelowej (2 godziny w 40 °C), etapów wzmocnienia sygnału (trzy wzmacniacze sekwencyjne), wykrywania fluoroforu (cztery sekwencyjne rundy do barwienia trójpleksowego).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Obrazowania:
	<ol>
		<li>Wykonaj barwienie jądrowe DAPI przed każdym montażem szkła nakrywkowego.</li>
		<li>Zamontuj pokrywę za pomocą środka montażowego zapobiegającego blaknięciu.</li>
		<li>Obraz za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej z odpowiednimi zestawami filtrów.</li>
		<li>W przypadku wykrywania multipleksowego przechwyć to samo pole we wszystkich czterech rundach wykrywania w celu rejestracji obliczeniowej.</li>
		<li>Utrzymuj spójne ustawienia ekspozycji między rundami, aby uzyskać dokładne porównanie sygnału. 
		UWAGA: Szczegółowe informacje na temat implementacji RNAscope można znaleźć w protokołach producenta (patrz tabela materiałów). W przypadku w pełni zautomatyzowanych platform, takich jak Xenium, postępuj zgodnie ze wszystkimi krokami protokołu producenta dokładnie tak, jak podano. W przypadku wszystkich protokołów należy przewidzieć, że niepowodzenie spowodowane oderwaniem tkanki najprawdopodobniej wystąpi podczas wczesnego etapu odwodnienia lub mycia, z powodu nakładania się OCT, jak zauważono w tym przykładowym protokole.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Baden, T., Euler, T., Berens, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Understanding+the+retinal+basis+of+vision+across+species%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Understanding the retinal basis of vision across species.</a> Nat Rev Neurosci. 21 (1), 5-20 (2020).</li>
<li>Heukamp, A. S., Warwick, R. A., Rivlin-Etzion, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Topographic+variations+in+retinal+encoding+of+visual+space%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Topographic variations in retinal encoding of visual space.</a> Annu Rev Vis Sci. 6, 237-259 (2020).</li>
<li>Collin, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+web-based+archive+for+topographic+maps+of+retinal+cell+distribution+in+vertebrates%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Exp+Optom%22%5BJournal%5D)">A web-based archive for topographic maps of retinal cell distribution in vertebrates.</a> Clin Exp Optom. 91 (1), 85-95 (2008).</li>
<li>Budoff, S. A., Poleg-Polsky, A. GraSP gene targets to hierarchically infer sub-classes with CuttleNet. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBudoff%2C+SA+%22bioRxiv%22">bioRxiv</a>. , (2024).</li>
<li>Rheaume, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+cell+transcriptome+profiling+of+retinal+ganglion+cells+identifies+cellular+subtypes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Single cell transcriptome profiling of retinal ganglion cells identifies cellular subtypes.</a> Nat Commun. 9 (1), 2759(2018).</li>
<li>Tran, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+profiles+of+retinal+ganglion+cells+differing+in+resilience+to+injury+reveal+neuroprotective+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Single-cell profiles of retinal ganglion cells differing in resilience to injury reveal neuroprotective genes.</a> Neuron. 104 (6), 1039-1055.e12 (2019).</li>
<li>Yan, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+retinal+cell+atlas%3A+Molecular+identification+of+over+sixty+amacrine+cell+types%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Mouse retinal cell atlas: Molecular identification of over sixty amacrine cell types.</a> J Neurosci. 40 (27), 5177-5195 (2020).</li>
<li>Bleckert, A., Schwartz, G. W., Turner, M. H., Rieke, F., Wong, R. O. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visual+space+is+represented+by+nonmatching+topographies+of+distinct+mouse+retinal+ganglion+cell+types%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Visual space is represented by nonmatching topographies of distinct mouse retinal ganglion cell types.</a> Curr Biol. 24 (3), 310-315 (2014).</li>
<li>Holmgren, C. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visual+pursuit+behavior+in+mice+maintains+the+pursued+prey+on+the+retinal+region+with+least+optic+flow%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Visual pursuit behavior in mice maintains the pursued prey on the retinal region with least optic flow.</a> eLife. 10, e70838(2021).</li>
<li>Tapia, M. L., Nascimento-dos-Santos, G., Park, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subtype-specific+survival+and+regeneration+of+retinal+ganglion+cells+in+response+to+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Subtype-specific survival and regeneration of retinal ganglion cells in response to injury.</a> Front Cell Dev Biol. 10, 956279(2022).</li>
<li>Berchuck, S. I., Mukherjee, S., Medeiros, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estimating+rates+of+progression+and+predicting+future+visual+fields+in+glaucoma+using+a+deep+variational+autoencoder%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Estimating rates of progression and predicting future visual fields in glaucoma using a deep variational autoencoder.</a> Sci Rep. 9 (1), 18113(2019).</li>
<li>de Gainza, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+trajectory+of+glaucoma+progression+in+2-dimensional+structural-functional+space%5BTitle%5D)+AND+%22Ophthalmol+Glaucoma%22%5BJournal%5D)">The trajectory of glaucoma progression in 2-dimensional structural-functional space.</a> Ophthalmol Glaucoma. 3 (6), 466-474 (2020).</li>
<li>Choi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+organization+of+the+mouse+retina+at+single+cell+resolution+by+MERFISH%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Spatial organization of the mouse retina at single cell resolution by MERFISH.</a> Nat Commun. 14 (1), 4929(2023).</li>
<li>Kremers, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Super-resolution+STED+imaging+in+the+inner+and+outer+whole-mount+mouse+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Super-resolution STED imaging in the inner and outer whole-mount mouse retina.</a> Front Ophthalmol. 3, 1126338(2023).</li>
<li>Simon, P., Thanos, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combined+methods+of+retrograde+staining%2C+layer-separation+and+viscoelastic+cell+stabilization+to+isolate+retinal+ganglion+cells+in+adult+rats%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Combined methods of retrograde staining, layer-separation and viscoelastic cell stabilization to isolate retinal ganglion cells in adult rats.</a> J Neurosci Methods. 83 (2), 113-124 (1998).</li>
<li>Lindqvist, N., Vidal-Sanz, M., Hallböök, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+cell+RT-PCR+analysis+of+tyrosine+kinase+receptor+expression+in+adult+rat+retinal+ganglion+cells+isolated+by+retinal+sandwiching%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res+Brain+Res+Protoc%22%5BJournal%5D)">Single cell RT-PCR analysis of tyrosine kinase receptor expression in adult rat retinal ganglion cells isolated by retinal sandwiching.</a> Brain Res Brain Res Protoc. 10 (2), 75-83 (2002).</li>
<li>Fontaine, V., Kinkl, N., Sahel, J., Dreyfus, H., Hicks, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Survival+of+purified+rat+photoreceptors+in+vitro+is+stimulated+directly+by+fibroblast+growth+factor-2%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Survival of purified rat photoreceptors in vitro is stimulated directly by fibroblast growth factor-2.</a> J Neurosci. 18 (23), 9662-9672 (1998).</li>
<li>Sandu, C., Hicks, D., Felder-Schmittbuhl, M. -P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rat+photoreceptor+circadian+oscillator+strongly+relies+on+lighting+conditions%3A+Molecular+clock+in+rat+photoreceptors%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Rat photoreceptor circadian oscillator strongly relies on lighting conditions: Molecular clock in rat photoreceptors.</a> Eur J Neurosci. 34 (3), 507-516 (2011).</li>
<li>Jaeger, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circadian+organization+of+the+rodent+retina+involves+strongly+coupled%2C+layer-specific+oscillators%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Circadian organization of the rodent retina involves strongly coupled, layer-specific oscillators.</a> FASEB J. 29 (4), 1493-1504 (2015).</li>
<li>Hecht, R. M., Shi, Q., Garrett, T. R., Sivyer, B., Morgans, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Split+retina+as+an+improved+flatmount+preparation+for+studying+inner+nuclear+layer+neurons+in+vertebrate+retina%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Split retina as an improved flatmount preparation for studying inner nuclear layer neurons in vertebrate retina.</a> J Vis Exp. (203), e65757(2024).</li>
<li>Budoff, S. A., Poleg-Polsky, A. A Complete spatial map of mouse retinal ganglion cells reveals density and gene expression specializations. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBudoff%2C+SA+%22bioRxiv%22">bioRxiv</a>. , (2025).</li>
</ol>

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Przedstawiona tutaj metoda rozwiązuje krytyczną barierę techniczną w biologii przestrzennej siatkówki, umożliwiając wytwarzanie cienkich przekrojów en face odpowiednich dla nowoczesnych technologii profilowania molekularnego. Najbardziej krytyczne kroki w protokole koncentrują się na obchodzeniu się z tkankami podczas wstępnej sekcji oraz precyzyjnej kontroli temperatury i nawodnienia podczas kriokonserwacji i sekcji. Pomyślne wdrożenie zależy w szczególności od osiągnięcia prawidłowego spłaszczenia tkanki przed...

Neurony siatkówki rozwinęły topografie przestrzenne, które ułatwiają przetwarzanie informacji, co u wielu gatunków skutkuje dużymi specjalizacjami, takimi jak dołki, obszar centralny i smugi1,2,3. W przeciwieństwie do dobrze poznanej różnorodności rozmieszczenia fotoreceptorów, specjalizacja przestrzenna wyjścia siatkówki, utworzonego przez komórki zwojowe siatkówki (RGC), jest mniej jasna. W przypadku większości gatunków rozmieszczenie przestrzenne RGC jest całkowicie nieznane. Nawet w przypadku myszy, prawdopodobnie jednego, jeśli nie najlepiej zbadanego modelu funkcji wzrokowych kręgowców, mniej niż jedna trzecia podtypów RGC została zmapowana za pomocą tradycyjnych technik, takich jak immunohistochemistry whole mount2. Techniki te zawodzą, ponieważ większość podtypów RGC nie ma specyficznego markera genetycznego. Zamiast tego do dokładnej klasyfikacji RGC potrzebne są bardziej wymiarowe informacje molekularne4 za pomocą sekwencjonowania RNA pojedynczej komórki5,6,7.
Informacje o rozmieszczeniu RGC są ważne, ponieważ topografie obserwowane u myszy wykazują wyraźne korelacje ekologiczne między umiejscowieniem RGC a funkcją wzrokową. Najbardziej uderzającym przykładem jest organizacja przestrzenna ɑON-S RGC, które skupiają się w siatkówce skroniowej. Ten region otrzymuje obraz prey8 podczas zachowań łowieckich9. Docenia się również fakt, że podtypy RGC są w różny sposób podatne na chorobę10, a niektóre powszechne choroby, takie jak jaskra, mają komponent przestrzenny w ich postępowaniu11,12. W związku z tym ważnym pytaniem, przed którym stoi ta dziedzina, jest: jaka jest organizacja przestrzenna podtypów RGC, gdy kafelkują one siatkówkę1? Ta luka w wiedzy ogranicza obecnie wgląd w inne wizualnie sterowane zachowania i choroby.
Przedmiotem obecnej metody jest wypełnienie tych luk w wiedzy molekularnej poprzez podejście do kriosekcji en face, które zachowuje relacje przestrzenne, umożliwiając jednocześnie analizę molekularną o wysokiej rozdzielczości. Nowoczesne platformy sekwencjonowania przestrzennego, takie jak Xenium firmy 10X, stanowią przełomowy postęp w profilowaniu molekularnym, oferując bezprecedensowy wgląd w organizację tkanek i interakcje komórkowe. Jednak platformy te, wraz z technikami o niższej pleksacji, takimi jak RNAscope, i metodami sekwencjonowania przestrzennie kodowanego kreskowo, takimi jak Visium, mają wspólne ograniczenie techniczne: wymagają skrawków tkanek cieńszych niż 20 μm. Wymóg ten stanowi szczególne wyzwanie dla tkanki siatkówki, która zwykle mierzy 200 μm grubości.
Do tej pory badacze opierali się głównie na przekrojach poprzecznych przy stosowaniu tych technologii do tkanki siatkówki13. Podczas gdy przekroje czynne skutecznie ujawniają relacje molekularne w warstwach jądrowych i pleksikształtnych w kontekście obwodów pionowych, są one mniej odpowiednie do uchwycenia szerszych rozkładów przestrzennych komórek siatkówki, które tradycyjnie ujawniały całe preparaty wierzchowców8. Ostatnie próby przekroju en face były ograniczone przez ograniczenia grubości sekcji, przy czym badania wykazały tylko 50 μm przekrojów14-zbyt grube dla nowoczesnych platform analizy molekularnej o wysokiej pleksie. Inne historyczne podejścia, które zostały wdrożone do badania poszczególnych blaszek siatkówki, ale nie są kompatybilne z nowoczesnymi technikami sekwencjonowania przestrzennego, obejmują trawienie enzymatyczne w połączeniu z dysocjacją mechaniczną15,16, lub same dysocjacje mechaniczne17,18,19,20. W tym miejscu przedstawiamy nowatorską technikę kriosekcji zaprojektowaną specjalnie dla cienkiej, zakrzywionej tkanki siatkówki, która pokonuje te ograniczenia. Krótko mówiąc, nasza metoda polega na ekstrakcji tylnej komory oka, wykonaniu nacięć reliefowych zarówno przez siatkówkę, jak i twardówkę, spłaszczeniu tkanki z wewnętrzną siatkówką do szkła nakrywkowego, osadzeniu tkanki w OCT, a na końcu kriosekcji od zewnętrznej do wewnętrznej siatkówki (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1). Nasza metoda utrzymuje relacje przestrzenne podczas wytwarzania skrawków wystarczająco cienkich (<20 μm) dla wysokowymiarowych narzędzi biologii przestrzennej, co zostało potwierdzone przez udane wdrożenie zarówno z ręcznym RNAscope (12 celów), jak i zautomatyzowaną platformą Xenium (300 celów), wykazując kompatybilność w różnych skalach złożoności analizy molekularnej.

<table><tbody><tr><td>Ames&prime; Medium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A1420-10X1L</td><td>Konkretna marka nie jest ważna</td></tr><tr><td>Beadsmith Thread Zap, Thread Burner</td><td>The Beadsmith Store</td><td>7.90524E+11</td><td>Można stosować alternatywne kauteryzatory</td></tr><tr><td>Kriostat</td><td>Leica</td><td>cm1950</td><td>Ważne kwestie to oddzielnie kontrolowana głośność w zależności od temperatury sceny.</td></tr><tr><td>Suchy lód</td><td>NA</td><td>NA</td><td>NA</td></tr><tr><td>Fine Science Tools Dumont #5 Kleszcze</td><td>Fine Science Tools 1129500</td><td>NC9889584</td><td>Konkretna marka nieważna</td></tr><tr><td>Fisher Healthcare Tissue-Plus OCT Compound</td><td>Fisher Scientific</td><td>23-730-571</td><td>Konkretna marka nieważna</td></tr><tr><td>Fisherbrand Wysoka precyzja prosta, smukła pęseta punktowa</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-000-127</td><td>Konkretna marka nie jest ważna</td></tr><tr><td>Fisherbrand Standardowe nożyczki preparacyjne</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-951-20</td><td>Konkretna marka nie jest ważna</td></tr><tr><td>Fisherbrand Superfrost Plus Szkiełka mikroskopowe</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-037-246</td><td>Konkretna marka nie jest ważna</td></tr><tr><td>Integra Miltex Noyes Nożyczki do tęczówki</td><td>Integra Miltex 181510</td><td>12-460-278</td><td>Konkretna marka nie jest ważna</td></tr><tr><td>Mikroskop epifluorescencyjny z wirującym dyskiem Olympus IX81</td><td>Dla rysunku 7</td>RNAscope HiPlex ACDBio Prostokątne okulary nakrywkowe Fisher Scientific 12-541-033 Konkretna marka nieważna Wodorowęglan sodu Sigma-Aldrich S6014-25G Konkretna marka nieważna Thermo Scientific Nunc Naczynia ze szklanym dnem Fisher <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> Naukowy</td><td>12-567-400</td><td>Konkretna marka nieważna</td></tr><tr><td>Światowy instrument precyzyjny Precyzyjny mikroskop trójokularowy stereo z zoomem (IV) na stojaku na wysięgniku</td><td>Światowy instrument precyzyjny PZMTIVBS</td><td>50-253-8607</td><td>Konkretna marka nie jest ważna</td></tr><tr><td>Mikroskop epifluorescencyjny Zeiss Axio Imager.M2&nbsp;</td><td></td><td></td><td>Możliwość przekroju optycznego (dla rysunku 8)</td></tr></tbody></table>

en face kriosekcja siatkówki myszy w celu przeprowadzenia wielowymiarowej przestrzennej analizy molekularnej

En face Cryosectioning of Mouse Retina for High-dimensional Spatial Molecular Analysis

Złożona struktura laminarna siatkówki stanowi poważne wyzwanie dla kompleksowego przestrzennego mapowania molekularnego. Obecne techniki badania architektury tkankowej i interakcji molekularnych są ograniczone przez ograniczenia techniczne, które naruszają relacje przestrzenne lub ograniczają profilowanie molekularne. Istniejące metody, takie jak przekrój poprzeczny, preparaty całego montażu, dysocjacje chemiczne lub mechaniczne oraz grube przekroje en face, albo zaburzają integralność tkanki, tracą krytyczny kontekst przestrzenny, albo, najczęściej, są po prostu niekompatybilne z wysokowymiarowymi platformami sekwencjonowania przestrzennego.
To badanie wprowadza technikę kriosekcji, która wytwarza cienkie (<20 μm) przekroje en face, zachowując jednocześnie relacje przestrzenne niezbędne do mapowania rozkładów komórek siatkówki. Metoda ta pozwala zachować integralność RNA i architekturę tkankową, jednocześnie generując skrawki kompatybilne z wysokoprzepustowymi platformami analizy molekularnej. Integralność RNA jest zachowana, ponieważ technika ta tnie świeżo zamrożoną tkankę, którą producenci przestrzennych platform transkryptomicznych oficjalnie popierają w odniesieniu do tkanki postfiksowej. Walidujemy to podejście przy użyciu wielu metod profilowania molekularnego, wykazując udaną integrację zarówno z ręczną hybrydyzacją RNAscope in situ (12 celów), jak i sekwencjonowaniem przestrzennym Xenium (300 celów). Technika ta konsekwentnie zachowuje architekturę tkankową we wszystkich próbkach, zachowując jednocześnie jakość RNA odpowiednią dla tych wrażliwych zastosowań molekularnych.
Ten postęp metodologiczny umożliwia nowe badania nad rozkładem typów komórek siatkówki, gradientami molekularnymi na blaszkach oraz przestrzennymi aspektami patologii siatkówki. Wszechstronność i kompatybilność tej techniki z nowoczesnymi platformami biologii przestrzennej stanowią podstawę do kompleksowego mapowania molekularnego złożonej organizacji komórkowej siatkówki.

Pomyślna implementacja niniejszego protokołu pozwala na uzyskanie nienaruszonych przekrojów siatkówki en face, odpowiednich do wielu metod profilowania molekularnego, przy jednoczesnym zachowaniu relacji przestrzennych na powierzchni siatkówki. Wykazujemy użyteczność protokołu poprzez systematyczne podejście walidacyjne, przechodząc od konwencjonalnej immunohistochemii, przez manualną detekcję multipleksową RNA, aż po zautomatyzowane wysokoprzepustowe profilowanie molekularne.
Wstępna...

Siatkówka wykazuje złożoną organizację przestrzenną w całej swojej strukturze laminarnej. Nowoczesna transkryptomika przestrzenna i techniki sekwencjonowania wymagają wycinków tkanek o grubości < 20 μm, co ogranicza ich zastosowanie w badaniach siatkówki. Ta świeżo zamrożona metoda kriosekcji pozwala uzyskać cienkie przekroje siatkówki myszy, zachowując jednocześnie płaskie relacje przestrzenne, umożliwiając kompleksowe mapowanie molekularne blaszek.

En face Kriosekcja siatkówki myszy w celu przeprowadzenia wielowymiarowej przestrzennej analizy molekularnej

The complex laminar structure of the retina presents significant challenges for comprehensive spatial molecular mapping. Current techniques for ...

Siatkówka jest użytecznym modelem do zrozumienia obliczeń neuronalnych. Obliczenia te zależą od specjalnych pozycji komórek. Jednak kompleksowe mapy tego obszaru pozostały nieuchwytne.W ciągu ostatniej dekady sekwencjonowanie pojedynczych komórek dostarczyło jasnych opisów typów komórek siatkówki. Obecnie transkryptomika przestrzenna zapewnia nowatorski sposób wykorzystania tych opisów w nienaruszonej tkance. Krytycznym wyzwaniem dla stosowania transkryptomiki przestrzennej jest to, że wymaga ona bardzo cienkich odcinków tkanek. Siatkówka jest już dość cienka w płaszczyźnie poziomej, która nas interesuje.Wynalezienie tej metody do tworzenia cienkich i szybkich odcinków, wykorzystanie transkryptomiki przestrzennej w uczeniu maszynowym do mapowania wszystkich komórek zwojowych siatkówki w tej samej tkance. W ciągu ostatnich 30 lat tylko 17 z 45 komórek zwojowych siatkówki myszy zostało zmapowanych, a ta technika umożliwiła nam zmapowanie ich wszystkich jednocześnie.[Instruktor] Na początek połóż uświęconą mysz na stole roboczym. Poprowadź skroniowy biegun kuli ziemskiej na rogówce, aby utrzymać orientację i stworzyć słaby punkt do rozwarstwienia. Zanurz kulę ziemską i wyceluj roztwór w naczyniu zawierającym kawałek bibuły filtracyjnej. Za pomocą ostrych kleszczy numer pięć i nożyczek do tęczówki ostrożnie usuń wszystkie mięśnie, powięź, naczynia krwionośne i nerwy z gałki ziemskiej bez nakłuwania twardówki. Umieść końcówkę jednego ostrza nożyczek Iris prostopadle do marki rogówki. Przebij kulę ziemską w tej pozycji. Wykonaj pojedyncze czyste nacięcie przez rogówkę i rąbek, kontynuując w twardówce i siatkówce w kierunku głowy nerwu wzrokowego. Następnie ustaw ostrze prostopadle do początkowego cięcia, około milimetra za rąbkiem. Rozpocznij cięcie promieniście przez twardówkę i siatkówkę. Utrzymuj stałą linię cięcia z tyłu i równolegle do rąbka, używając ostrych kleszczy do prowadzenia i obracania kuli ziemskiej. Jeśli siatkówka i twardówka rozdzielą się, zmień położenie ostrza nożyczek Iris, aby je przeciąć. Oszacuj odległość tylną jeden milimetr za pomocą środkowej szerokości ostrza nożyczek Iris Po zakończeniu cięcia promieniowego równolegle do rąbka sprawdź, czy nie ma pozostałych połączeń siatkówki. Ostrożnie odetnij je nożyczkami do tęczówki, aż przednia i tylna część kuli ziemskiej zostaną oddzielone. Następnie użyj dwóch par ostrych kleszczy numer pięć, aby delikatnie oddzielić przednią i tylną część kuli ziemskiej. U starszych myszy, jeśli przezroczyste włókna łączą soczewkę z miseczką siatkówki, ostrożnie odetnij je nożyczkami Iris, minimalizując separację twardówki siatkówki. Używając bibuły filtracyjnej jako platformy nośnej, przetnij siatkówkę w liść koniczyny, zwany również wzorem żelaznego krzyża za pomocą nożyczek Iris. Powtórz sekcję z drugim okiem. Odetnij końcówkę jednorazowej plastikowej pipety do transferu, aby utworzyć otwór większy niż wypreparowana siatkówka i twardówka. Delikatnie zassać siatkówkę do pipety i umieścić ją na szklanym szkiełku mikroskopowym. Za pomocą chusteczki laboratoryjnej usuń nadmiar roztworu do celowania, aż siatkówka przestanie unosić się i będzie można ją spłaszczyć. Teraz użyj dwóch ostrych kleszczyków numer pięć, aby rozłożyć siatkówkę i ustawić ją płasko z wewnętrzną muszlą oczną skierowaną do góry. Wykonuj wypukłe nacięcia o długości od 0,5 do dwóch milimetrów w każdym segmencie reliefu koniczyny, aby ułatwić spłaszczanie i dostosuj, aby zapobiec składaniu. Usuń pozostały roztwór do celowania, z wyjątkiem płynu przylegającego do siatkówki. Za pomocą szkiełka nakrywkowego szybko dociśnij i przenieś siatkówkę tak, aby twardówka zewnętrzna była skierowana do góry, a wewnętrzna muszla oczna stykała się z szkiełkiem nakrywkowym. Sprawdź, czy siatkówka nie jest zagięta i w razie potrzeby dokonaj regulacji. Dodaj roztwór do celowania, aby ułatwić manipulację, ale usuń nadmiar chusteczką, aby zapobiec zwijaniu się i pozostaw do wyschnięcia na powietrzu przez pięć do 10 sekund. Teraz nałóż pożywkę OCT, aby pokryć siatkówkę. Następnie użyj kleszczyków, aby równomiernie rozprowadzić warstwę na szkiełku nakrywkowym, aby zapobiec flotacji. Błyskawicznie zamroź siatkówkę w pożywce OCT za pomocą metalowej płytki chłodzonej parami ciekłego azotu lub bezpośrednio kontaktując się z suchym lodem. Przechowuj zamrożoną siatkówkę na suchym lodzie do natychmiastowego użycia. Do kriosekcji utwórz kopułę OCT na uchwycie próbki, zajmującą wewnętrzne dwa do trzech pierścieni, jeśli używasz tego samego modelu kriostatu. Dopasuj uchwyt do próbki płasko do powierzchni cięcia. Utwórz lub zanotuj prowadnicę orientacyjną łączącą uchwyt z stolikiem kriostatu. Następnie przytnij kopułę, aby utworzyć płaską powierzchnię równoległą do ostrza. Za pomocą żyletki usuń nadmiar OCT z boku i ostrożnie oddziel siatkówkę od szkiełka nakrywkowego, aby była ruchoma. Zdejmij uchwyt ze stolika i nałóż niewielką kroplę płynu OCT na przygotowaną płaską powierzchnię OCT. Następnie umieść siatkówkę bezpośrednio na płynnym OCT. Użyj wstępnie schłodzonego szkiełka, aby docisnąć i przytrzymać siatkówkę do momentu zamrożenia. Nałóż więcej OCT na siatkówkę i uchwyt, aby zapewnić połączenie. Następnie zamroź zespół w obszarze szybkiego zamrażania kriostatu. W przypadku cięcia ostrożnie przycinaj nadmiar OCT, aż siatkówka będzie widoczna. Użyj żyletki, aby ukształtować krawędzie bloku OCT blisko siatkówki. Kontynuuj przycinanie podczas sprawdzania obecności twardówki. Gdy twardówka jest widoczna, w razie potrzeby dostosuj kąt sceny. Przestań przycinać, gdy twardówka jest w przybliżeniu równomiernie rozłożona na sekcjach. Teraz użyj wstępnie schłodzonych szkiełek i dwóch pędzli malarskich, aby manipulować sekcjami i je zbierać. Umieść palec pod sekcją na około pięć sekund, aż OCT stopi się i przylgnie tkanka do szkiełka. Następnie umieść szkiełko z powrotem na zimnej powierzchni w celu ponownego zamrożenia. Przygotowane szkiełka przechowuj na suchym lodzie do natychmiastowego użycia. Wyraźna immunoreaktywność lub RBPMS w warstwie komórek zwojowych i wyraźne oddzielenie splotów naczyniowych znakowane lektyną pomidorową potwierdziło skuteczne zachowanie laminacji siatkówki i markerów białkowych. Detekcja multipleksowego RNA za pomocą panelu 12-plex RNA Scope z powodzeniem utrzymała strukturę przestrzenną i ujawniła wyraźną ekspresję markerów, takich jak Grm6 i RBPMS, w całym wycinku na powierzchni. Obrazy o wysokiej rozdzielczości potwierdziły wzorce ekspresji pojedynczej komórki dla RBPMS i innych markerów, takich jak Mafb6 i Meis2, walidując lokalizację zarówno białka, jak i RNA w warstwie komórek zwojowych. Równomierny rozkład sygnału w sekcjach liści koniczyny i silne sygnały w przestrzennych danych transkryptomicznych xenium potwierdziły udane profilowanie o wysokiej przepustowości i integralność RNA. Wizualizacja rozdzielczości pojedynczej komórki przy użyciu dopasowanych wzorców ręcznego wykrywania xenium, potwierdzająca niezawodność protokołu na różnych platformach. Markery transkrypcyjne specyficzne dla typu komórki wykazały warstwowy rozkład laminarny w przekroju siatkówki i na mapowaniu twarzy, zachowały swoje położenie na całej głębokości. Szczegółowe zbliżenie warstwy komórek zwojowych potwierdziło dokładne wykrywanie transkryptu przestrzennego w stosunku do barwienia jądrowego DAPI.

en-face-cryosectioning-mouse-retina-for-high-dimensional-spatial

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Technika sekcji przedstawia enukleację oka myszy w celu utrwalenia tkanki do fenotypowania w badaniach wysokoprzepustowych.

Enukleacja oka myszy w celu zdalnego wysokoprzepustowego fenotypowania

Źródło: Wang, Z., et al. Przezźrenicowe dwufotonowe obrazowanie in vivo siatkówki myszy.  J. Vis. Exp. (2021). Ten film przedstawia technikę obrazowania siatkówki in vivo przy użyciu mikroskopii dwufotonowej. Znieczulone myszy są przygotowywane do obrazowania poprzez zabezpieczenie głowy, nałożenie lubrykantu do oczu i umieszczenie szkiełka nakrywkowego na oku. Komórki zwojowe siatkówki (RGC) eksprymujące białka fluorescencyjne są najpierw wizualizowane za pomocą epifluorescencji w celu...

Dwufotonowe obrazowanie in vivo siatkówki myszy

Tutaj opisujemy protokół powtarzalnej mikrodysekcji laserowej (LCM) do izolowania siatki beleczkowej (TM) do dalszej analizy RNA. Możliwość analizowania zmian w ekspresji genów w TM pomoże w zrozumieniu mechanizmów molekularnych leżących u podstaw chorób oczu związanych z TM.

Laserowe wychwytywanie mikrodysekcji siatki beleczkowej o wysokiej czystości z oczu myszy do analizy ekspresji genów

Pokazujemy trzy różne techniki przygotowania tkanek do immunohistochemicznej wizualizacji mikrokrążeń siatkówki szczura, tj. kriosekcje, całe wierzchowania i hipotoniczne izolowanie sieci naczyniowej.

Kriowycinki siatkówki, całe wierzchowania i hipotoniczne izolowane preparaty naczyniowe do immunohistochemicznej wizualizacji perycytów mikronaczyniowych

Ten raport opisuje kompleksowe metody przygotowania zamrożonych wycinków siatkówki myszy do immunohistochemii (IHC).  Opisane metody obejmują rozwarstwienie tylnej części gałki ocznej, utrwalanie paraformaldehydu, osadzanie w pożywkach o optymalnej temperaturze cięcia (OCT) i orientację tkanki, cięcie i barwienie immunologiczne.

Przygotowanie kriosekcji siatkówki myszy do immunohistochemii

Obrazowanie in vivo jest potężnym narzędziem do badania biologii w zdrowiu i chorobie. Protokół ten opisuje obrazowanie przezźrenicowe siatkówki myszy za pomocą standardowego mikroskopu dwufotonowego. Zademonstrowano również różne metody obrazowania in vivo, które umożliwiają fluorescencyjne znakowanie wielu kohort komórkowych siatkówki.

Przezźrenicowe dwufotonowe obrazowanie in vivo siatkówki myszy

Ten protokół przedstawia dwie techniki izolowania subkomórkowych przedziałów fotoreceptorów mysich pręcików do analizy białek. Pierwsza metoda wykorzystuje żywe siatkówki i celulozową bibułę filtracyjną do oddzielenia zewnętrznych segmentów pręcika, podczas gdy druga wykorzystuje liofilizowane siatkówki i taśmę klejącą do odklejania wewnętrznych i zewnętrznych warstw segmentów pręcika.

Dwie metody peelingu do izolacji przedziałów komórek fotoreceptorowych w siatkówce myszy w celu analizy białek

Ten protokół opisuje szczegółowe etapy wstępnego wdrażania mikroskopii immunoelektronowej, skupiając się na badaniu obwodów synaptycznych i lokalizacji białek w siatkówce.

Badanie obwodów siatkówki i lokalizacji molekularnej poprzez wstępne osadzenie mikroskopii immunoelektronowej

Perycyty w unaczynieniu siatkówki zostały zbadane za pomocą barwienia immunofluorescencyjnego z receptorem czynnika wzrostu pochodzenia płytkowego β po retro-orbitalnym wstrzyknięciu fluorescencyjnej lektyny pomidorowej. Znakowaną siatkówkę poddano dalszej obróbce metodą oczyszczania tkanek i zamontowano w całości w celu wizualizacji trójwymiarowych widoków perycytów otaczających naczynia krwionośne siatkówki pod mikroskopem konfokalnym.

Wizualizacja 3D perycytów naczyniowych siatkówki myszy za pomocą immunostainingu

Opisano protokół przygotowania kriosekcji siatkówki myszy i przeprowadzania barwienia immunologicznego na fotoreceptorach. Artykuł ten umożliwia naukowcom konsekwentne wytwarzanie zamrożonych skrawków siatkówki myszy z dobrze zachowaną morfologią i wysokiej jakości wynikami barwienia immunologicznego.

Kriosekcja i barwienie immunologiczne siatkówki myszy

Poznaj metodę kriosekcji siatkówki myszy w celu przeprowadzenia analizy przestrzennej transkryptomiki. Technika ta umożliwia kompleksowe mapowanie komórek zwojowych siatkówki z zachowaniem ich lokalizacji przestrzennej.

En face Kriosekcja siatkówki myszy w celu przeprowadzenia wielowymiarowej przestrzennej analizy molekularnej

Przeglądaj więcej filmów