Name: Porównawcza analiza proteomiczna całej nerki, rdzenia i kanalików korowych w patogenezie cukrzycowej uszkodzenia nerek u myszy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-05-02T14:35:00.000+00:00
Duration: 10 min 31 s
Description: Poznaj metodę analizy proteomicznej nerki u myszy z cukrzycą. Protokół obejmuje izolację kanalików korowych i rdzenia, spektrometrię masową oraz identyfikację zmian białkowych w cukrzycowej nefropatii.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Praca nad tym projektem była częściowo wspierana funduszami dla MTB (NIH K01DK080951) i TDC (NephCure-Pediatric Nephrology Research Consortium NKI-2023-04) oraz University of Louisville Kidney Disease Program i Proteomics Technology Center (TDC, MTB).

Badania z myszami OVE26 i FVB zostały zatwierdzone przez wytyczne University of Louisville Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC). Transgeniczna samica OVE26 (cukrzyca; Szczep #:005564) i FVB (bez cukrzycy; szczep tła; Myszy szczepu #:001800) zakupiono w Jackson Laboratories (Bar Harbor, ME). Zwierzęta utrzymywano w 12-godzinnym cyklu światło/ciemność w temperaturze 25 °C i zapewniono im swobodny dostęp do wody i pożywienia. Wszystkie badania przeprowadzono na 2-miesięcznych myszach.
1. Model zwierzęcy
<ol>
	<li>Izolacja nerek
	<ol>
		<li>Znieczulenie myszy należy podawać dootrzewnowo 80 mg/kg ketaminy i 12 mg/kg ksylazyny.</li>
		<li>Wykonaj nacięcie brzucha w linii środkowej za pomocą małych nożyczek chirurgicznych i delikatnie przesuń jelita na zewnątrz myszy za pomocą wacików, aby odsłonić żyłę główną.</li>
		<li>Wykonaj małe nacięcie w żyle głównej nad prawą nerką.</li>
		<li>Przepłukać mysz przez lewą komorę 20 ml zimnego roztworu soli fizjologicznej buforowanej zimnymi fosforanami (PBS: pH 7,4; 210 mg/L KH2PO4, 9 g/L NaCl, 726 mg/L Na2HPO4·7H2O) za pomocą pompy perystaltycznej, z szybkością 10 ml/min. 
		UWAGA: Ten etap nie jest wymagany, jeśli włączenie białek i komórek krwi do nerek nie jest czynnikiem krytycznym w dalszych analizach.</li>
		<li>Usuń nerki za pomocą małych nożyczek chirurgicznych. Usuń nadmiar tłuszczu z zewnętrznej strony nerek. Zważ nerki i umieść je w zimnym PBS na lodzie.</li>
		<li>Usunąć torebkę nerkową.</li>
		<li>Umieść nerki na szklanym talerzu lub szalce Petriego ustawionej na lodzie. Wykonaj kilka poprzecznych nacięć przez nerki za pomocą żyletki (<silna klasa="xfig">Ryc. 3), aby uzyskać 3-4 plasterki między górnym i dolnym biegunem nerek.</li>
		<li>Odłóż na bok 1-2 środkowe plastry i dwie tyczki (zakreślone plastry nerki w <silna klasa="xfig">Ryc. 3) z każdej nerki, aby służyły jako próbki "całej nerki". Umieść porcję w probówkach wirówkowych o pojemności 1,5 ml i dodaj lodowaty bufor homogenizacyjny (10% glicerolu, 50 mM HEPES, 100 mM KCl, 2 mM EDTA, 0,1% NP40, 10 mM NaF, 0,25 mM NaVO3, 1x inhibitor proteazy HALTS) w ilości około 10 μl/mg próbki tkanki (na podstawie szacowanej masy wycinków nerki, pochodzącej z nabytej masy nerki). Pozostaw tubkę na lodzie.</li>
		<li>W przypadku pozostałej części środkowych poprzecznych plasterków połóż plasterek płasko i ostrożnie odetnij korę (zewnętrzny 1 mm) z każdego plasterka za pomocą żyletki lub skalpela (<silna klasa="xfig">Rysunek 3, schematyczny przebieg pracy). Utrzymuj korę oddzielnie od obszarów rdzenia w celu protokołu izolacji kanalików korowych (poniżej, krok 1.3).</li>
		<li>Umieścić część wypreparowanego rdzenia w probówkach wirówkowych o pojemności 1,5 ml, dodać lodowaty bufor homogenizacyjny, jak w kroku 1.1.8, i pozostawić probówkę na lodzie.</li>
		<li>Błyskawiczne zamrożenie w ciekłym azocie wszystkich pozostałych całych części nerki i rdzenia nieużywanych do homogenizacji i przechowywać w temperaturze -80 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Alternatywnie, należy zamrozić wszystkie oddzielone całe przedziały nerki i rdzenia i przechowywać je w sposób opisany w kroku 1.1.11. Wyjąć je z magazynu w późniejszym czasie w celu dodania buforu homogenizacyjnego, jak w kroku 1.1.8.</li>
	<li>Izolacja kanalików korowych
	<ol>
		<li>Wypreparowaną korę zmielić na 1-3 mm kawałki na szklanej płytce lub szalce Petriego za pomocą żyletki, tworząc pastę.</li>
		<li>Trawić rozdrobnioną korę w 1 ml kolagenazy typu IA (1 mg/ml) przez 30 minut, w temperaturze 37 °C, w kołyszącej kąpieli wodnej.</li>
		<li>Umieść sitko o pojemności 100 μm na stożkowej probówce o pojemności 50 ml na lodzie.</li>
		<li>Umieścić strawioną zawiesinę korową na sitku o objętości 100 μm i delikatnie przecisnąć przez sitko za pomocą tłoka strzykawki o pojemności 10 ml. Umyj górną część sitka 1 ml PBS, a spód sitka 1 ml PBS.</li>
		<li>Przepuścić filtrat w probówce o pojemności 50 ml przez dodatkowe sitko o pojemności 100 μm, a następnie przemyć górną część sitka 1 ml PBS.</li>
		<li>Przepuścić filtrat przez sitko o wielkości 70 μm umieszczone na stożkowej probówce o pojemności 50 ml na lodzie. Kanaliki przejdą przez to sitko do filtratu (kłębuszki zostaną zatrzymane na sitku o średnicy 70 μm). Umyj sitko 1 ml PBS.</li>
		<li>Odwirować końcowy filtrat o masie 120 × g przez 2 minuty w temperaturze 4 °C. Wyrzucić nadmiar PBS z osadu kanalika.</li>
		<li>Sprawdź czystość osadu kanalików korowych poprzez wizualizację pod mikroskopem, przy użyciu obiektywu 10x. Jeżeli więcej niż 10% frakcji zawiera kłębuszki nerkowe, należy ponownie zawiesić filtrat w 1 ml PBS i przepuścić przez czyste sitko o wielkości 70 μm bez dodatkowego przemywania sitka.</li>
		<li>Rozprowadzić wzbogaconą frakcję kanalikową do probówek wirówkowych o pojemności 1,5 ml i wirować w temperaturze 2000 × g przez 2 minuty w temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant.</li>
		<li>Dodać bufor homogenizacyjny do osadu kanalika, tak jak w przypadku całej nerki i rdzenia (kroki 1.1.8 i 1.1.10).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Homogenizacja tkanek/ekstrakcja białek
	<ol>
		<li>Homogenizować każdy rodzaj próbki w probówkach do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml za pomocą plastikowego tłuczka przeznaczonego do probówek o pojemności 1,5 ml. Jeśli homogenizowana zawiesina jest zbyt gęsta, w razie potrzeby dodać dodatkowy bufor homogenizacyjny.</li>
		<li>Pozostawić homogenizowaną zawiesinę na lodzie na 15 minut, a następnie sonikację na 5 minut w sonikatorze kąpielowym (tylko włącznik/wyłącznik, brak regulowanych ustawień na urządzeniu), z wodą w kąpieli o temperaturze 25 °C. Pozostawić próbki na lodzie na 10 minut.</li>
		<li>Krótko zwirować (1000-1500 obr./min), homogenizować, następnie rozcierać 20 razy pipetą i pozostawić na lodzie na kolejne 15 minut.</li>
		<li>Próbki należy kilkakrotnie rozcierać przed odwirowaniem w temperaturze 13 000 × g przez 20 minut w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Przenieś oczyszczone ekstrakty białkowe do czystych probówek.</li>
		<li>Podwielokrotność 30 μl oczyszczonego ekstraktu do oznaczania białka i przygotowania próbki do analizy metodą spektrometrii mas. Pozostałe próbki należy przechowywać w temperaturze -80 °C.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Protokół trawienia mini kolumny wirowej Suspension-Trap
<ol>
	<li>Trawienie proteolityczne białek na fragmenty tryptyczne do analiz proteomicznych</li>
	<li>Rozcieńczyć ~40-50 μg próbki (przy ~2 μg/ μL) do buforu do lizy próbki (10% w/v dodecylosiarczanu sodu [SDS] w 100 mM wodorowęglanu trietyloamonu (TEA-BC) pH 8,5, 40 mM tris (2-karboksetylo)fosfiny [TCEP]) do końcowej objętości 46 μL.</li>
	<li>Redukcja i alkilacja białek
	<ol>
		<li>Inkubować w temperaturze 65 °C przez 30 minut (końcowe stężenie TCEP wynosi 20 mM).</li>
		<li>Dodać 4 μl 0,5 M jodoacetamidu do wody klasy LC-MS i chromatografii mas (LC-MS) i inkubować w temperaturze pokojowej (RT) w ciemności przez 30 minut (końcowe stężenie jodoacetamidu wynosi 40 mM).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dodać 5 μl 12% w/w kwasu fosforowego do wody klasy LC-MS (rozcieńczyć 141 μl 85% kwasu fosforowego w 859 μl wody na 12% roztwór).
	<ol>
		<li>Alternatywą dla kwasu fosforowego jest użycie kwasu trifluorooctowego lub kwasu mrówkowego, jeśli wykonujesz wzbogacanie fosfopeptydami18.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dodać 350 μl buforu wiążącego zawiesinę-pułapkę (100 mM TEA-BC w 90% v/v metanolu/10% v/v pH wody 7,55).</li>
	<li>Dodaj próbkę do kolumny pułapki zawieszenia. Wirować przy 4 000 × g przez 30 s w temperaturze pokojowej w wirniku o stałym kącie nachylenia, aby przepuścić każdą objętość przez kolumnę.</li>
	<li>Przemyć 4x 400 μL bufora do wiązania zawiesiny. Wirować przy 4 000 x g przez 30 s przy wilgotności względnej w wirniku o stałym kącie nachylenia, aby przepuścić każde płukanie przez kolumnę. 
	UWAGA: Aby pomóc w usuwaniu SDS, po każdym praniu obróć kolumnę w wirniku o 180°.</li>
	<li>Wirować przy 4 000 g przez 1 minutę w temperaturze pokojowej, aby całkowicie usunąć bufor wiążący (zapobiega kapaniu podczas trawienia).</li>
	<li>Przenieść kolumnę pułapki zawiesiny do czystej probówki zbiorczej.</li>
	<li>Dodaj 2,5-5 μg trypsyny w 125 μL 50 mM TEA-BC pH 8,5 w wodzie klasy LC-MS (Trypsin Protease, MS-Grade). Ostateczny stosunek trypsyny do próbki wynosi od 1:20 do 1:10.</li>
	<li>Inkubować w temperaturze 47 °C przez 2 godziny (nie dokręcać nakrętki; preferowany jest mieszalnik termiczny ustawiony na 0 obr./min). Przebicie otworu w nasadce za pomocą igły może zapobiec wzrostowi ciśnienia w górnej komorze pułapki zawiesinowej (zwiększone ciśnienie spowoduje, że roztwór trypsyny będzie kapał przez kolumnę).</li>
	<li>Dodaj 80 μl 50 mM TEA-BC o pH 8,5 do wody klasy LC-MS. Wirować przy 4 000 g w temperaturze pokojowej przez 1 minutę w wirniku o stałym kącie nachylenia, aby przepuścić każdy trawiony materiał przez kolumnę.</li>
	<li>Dodać 80 μl 0,2% v/v kwasu mrówkowego do wody klasy LC-MS. Wirować przy 4 000 g przez 1 minutę w temperaturze pokojowej w wirniku o stałym kącie nachylenia w celu zebrania z trawieniem z kroku 2.11.</li>
	<li>Dodaj 80 μl 50% v/v acetonitrylu do wody klasy LC-MS. Wirować przy 4 000 g przy temperaturze pokojowej przez 1 minutę w wirniku o stałym kącie nachylenia w celu zebrania z trawieniem z kroku 2.11.</li>
	<li>Przechowywać eluat pułapki zawiesiny w temperaturze -80 °C.</li>
	<li>Wysuszyć próbkę w koncentratorze próżniowym.</li>
	<li>Wysuszoną próbkę przechowywać w temperaturze -80 °C.</li>
</ol>
3. Sprzątanie za pomocą kolumny równowagi hydrofilowo-lipofilowej (HLB)
<ol>
	<li>Przygotować roztwory A (2% v/v acetonitrylu/0,1% v/v kwasu mrówkowego) i B (80% v/v acetonitrylu/0,1% v/v kwasu mrówkowego).</li>
	<li>Rozpuścić próbkę w 500 μl roztworu A.</li>
	<li>Umieść kolumnę w kolektorze próżniowym i zastosuj ciśnienie gazu na poziomie ~1-2 ml/min.</li>
	<li>Dodać 500 μl roztworu B do kolumny HLB i opróżnić z prędkością 1-2 ml/min; powtórzyć dwukrotnie.</li>
	<li>Dodać 750 μl roztworu A do kolumny HLB i opróżnić z prędkością 1-2 ml/min; powtórzyć dwukrotnie.</li>
	<li>Umieścić czystą mikroprobówkę o pojemności 2 ml w stojaku pod kolumną HLB, załadować próbkę do 500 μl roztworu A i ciśnienie gazu jak powyżej; przepuścić przepływ do kolumny po raz drugi.</li>
	<li>Umieścić kolumnę HLB nad rurką odpływową, dodać 500 μl roztworu A i ewakuować jak powyżej; powtórzyć dwukrotnie.</li>
	<li>Umieścić kolumnę nad czystą mikroprobówką o pojemności 2 ml, dodać 500 μl roztworu B i opróżnić jak powyżej; powtórzyć dwukrotnie.</li>
	<li>Zamrozić eluat w temperaturze -80 °C, a następnie wysuszyć w koncentratorze próżniowym. Wysuszoną pozostałość przechowywać w temperaturze -80 °C.</li>
	<li>Rozpuścić pozostałość w 20 μl 2% v/v acetonitrylu/0,1% v/v kwasu mrówkowego przed analizą MS. Użyć spektrofotometru, aby oszacować stężenie peptydu przy absorbancji 205 nm.</li>
</ol>
4. Analiza spektrometrii mas
<ol>
	<li>Jednowymiarowa chromatografia cieczowa z odwróconymi fazami (LC)-MS/MS
	<ol>
		<li>Wstrzyknąć równą masę peptydów (~600 ng) na 1-wymiarowy nano-LC i frakcjonować go na kolumnach C18 z odwróconymi fazami.</li>
		<li>Eluować peptydy bezpośrednio do MS przy napięciu rozpylania 1,8 kV, za pomocą rurki przesyłowej jonów utrzymywanej w temperaturze 250 °C.</li>
		<li>Uzyskaj widma w zależnym od danych trybie górnych 20 jonów, w którym najbardziej intensywny fragment MS/MS jest usuwany z kolejki analizy, aby poprawić głębokość mapowania jonów na jonach o niższej obfitości.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. Analiza danych i bioinformatyka
<ol>
	<li>Procedury przetwarzania danych
	<ol>
		<li>Po przypisaniu spektralnym i identyfikacji peptydów i białek w PEAKS 12.0 (oprogramowanie do analizy danych LC-MS/MS), prześlij listy białek do analizy w MetaboAnalyst 6.0 (platforma analizy danych metabolomicznych) przy użyciu podejścia jednoczynnikowej analizy statystycznej (https://www.metaboanalyst.ca/).</li>
		<li>Użyj oprogramowania do analizy danych LC-MS/MS do wyszukiwania i filtrowania widm przy użyciu ścisłych kryteriów współczynnika fałszywych odkryć (FDR) (1% białka i peptydu) w stosunku do bazy danych FASTA recenzowanej przez mysz. 
		UWAGA: Alternatywne programy wyszukiwania, które są łatwo dostępne, obejmują między innymi Maxquant, Proteome Discoverer i inne powszechnie używane opcje.</li>
		<li>Określ karbamidometylację cysteiny jako ustaloną modyfikację. Określić utlenianie metioniny jako modyfikację zmienną.</li>
		<li>Przekonwertuj listy na format wartości rozdzielanych przecinkami (CSV) i etykiety grup/próbek przypisane do każdej kolumny i wiersza. Ten format jest elastyczny na platformie analizy danych metabolomicznych.</li>
		<li>Imputuj brakujące wartości, używając reguły wartości minimalnej 1/5 dla brakujących zmiennych.</li>
		<li>Filtruj dane, aby wykluczyć wysoce zmienne wartości przy użyciu przedziału międzykwartylowego, gdzie jako punkt odcięcia jest używany 40% wariancji.</li>
		<li>Znormalizuj wartości do mediany intensywności, logarytmu10 przekształconego i średniej wyśrodkowanej na potrzeby skalowania. Użyj innych podejść normalizacji, pamiętając, że wyniki mogą się różnić.</li>
		<li>Wykonaj testy T w sposób niesparowany z wartością odcięcia < 0,05. Na tym etapie wykonaj wiele poprawek testowych. 
		UWAGA: W tym badaniu nie przeprowadzono tej korekty dla reprezentatywnego zbioru danych do celów prezentacji danych.</li>
		<li>Wskaż wykresy wulkanów dla 1,5-krotnej zmiany (FC) i p < 0,05.</li>
		<li>Generuj mapy cieplne i wykonuj częściową analizę dyskryminacyjną metodą najmniejszych kwadratów (PLSDA) oraz analizę statystyczną (zmienna o znaczeniu projekcji [VIP]) grup próbek.</li>
		<li>Potencjalni kandydaci do kontynuacji są albo wystarczająco silni, aby przyćmić 1,5FC i p-val < 0,05, albo VIP > 1,0, jak wskazano w analizie PLSDA.</li>
		<li>Wygeneruj diagramy Venna, aby zilustrować różnice w proteomie całej nerki, kanalika i rdzenia u myszy OVE26.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Ding, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidemiological+patterns+of+chronic+kidney+disease+attributed+to+type+2+diabetes+from+1990-2019%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Epidemiological patterns of chronic kidney disease attributed to type 2 diabetes from 1990-2019.</a> Front Endocrinol. 15, 1383777(2024).</li>
<li>Liu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+trends+in+the+burden+of+chronic+kidney+disease+attributable+to+type+2+diabetes%3A+an+age-period-cohort+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes+Obes+Metab%22%5BJournal%5D)">Global trends in the burden of chronic kidney disease attributable to type 2 diabetes: an age-period-cohort analysis.</a> Diabetes Obes Metab. 26 (2), 602-610 (2024).</li>
<li>Xie, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+burden+and+influencing+factors+of+chronic+kidney+disease+due+to+type+2+diabetes+in+adults+aged+20-59+years%2C+1990-2019%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Global burden and influencing factors of chronic kidney disease due to type 2 diabetes in adults aged 20-59 years, 1990-2019.</a> Sci Rep. 13 (1), 20234(2023).</li>
<li>Giunti, S., Barit, D., Cooper, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+diabetic+nephropathy%3A+role+of+hypertension%5BTitle%5D)+AND+%22Hypertension%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of diabetic nephropathy: role of hypertension.</a> Hypertension. 48 (4), 519-526 (2006).</li>
<li>Thomas, M. C., Burns, W. C., Cooper, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tubular+changes+in+early+diabetic+nephropathy%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Chronic+Kidney+Dis%22%5BJournal%5D)">Tubular changes in early diabetic nephropathy.</a> Adv Chronic Kidney Dis. 12 (2), 177-186 (2005).</li>
<li>Thomas, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diabetic+kidney+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Dis+Primers%22%5BJournal%5D)">Diabetic kidney disease.</a> Nat Rev Dis Primers. 1, 15018(2015).</li>
<li>Nath, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tubulointerstitial+changes+as+a+major+determinant+in+the+progression+of+renal+damage%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Kidney+Dis%22%5BJournal%5D)">Tubulointerstitial changes as a major determinant in the progression of renal damage.</a> Am J Kidney Dis. 20 (1), 1-17 (1992).</li>
<li>Bonventre, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Can+we+target+tubular+damage+to+prevent+renal+function+decline+in+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Nephrol%22%5BJournal%5D)">Can we target tubular damage to prevent renal function decline in diabetes.</a> Semin Nephrol. 32 (5), 452-462 (2012).</li>
<li>Powell, D. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Renal+tubulointerstitial+fibrosis+in+OVE26+type+1+diabetic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nephron+Exp+Nephrol%22%5BJournal%5D)">Renal tubulointerstitial fibrosis in OVE26 type 1 diabetic mice.</a> Nephron Exp Nephrol. 111 (1), e11-e19 (2008).</li>
<li>Cummins, T. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+mass+spectrometry+of+diabetic+kidney+tubules+identifies+GRAP+as+a+novel+regulator+of+TGF-beta+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Quantitative mass spectrometry of diabetic kidney tubules identifies GRAP as a novel regulator of TGF-beta signaling.</a> Biochim Biophys Acta. (4), 653-661 (2010).</li>
<li>Barati, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+expression+of+endoplasmic+reticulumstress-response+proteins+in+different+renal+tubule+subtypes+of+OVE26+diabetic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stress+Chaperones%22%5BJournal%5D)">Differential expression of endoplasmic reticulumstress-response proteins in different renal tubule subtypes of OVE26 diabetic mice.</a> Cell Stress Chaperones. 21 (1), 155-166 (2016).</li>
<li>Zheleznova, N. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+proteomic+analysis+reveals+deficiencies+in+oxygen+utilization+in+medullary+thick+ascending+limb+of+Henle+in+the+Dahl+salt-sensitive+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Genomics%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial proteomic analysis reveals deficiencies in oxygen utilization in medullary thick ascending limb of Henle in the Dahl salt-sensitive rat.</a> Physiol Genomics. 44 (17), 829-842 (2012).</li>
<li>Nordquist, L., Palm, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diabetes-induced+alterations+in+renal+medullary+microcirculation+and+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Diabetes+Rev%22%5BJournal%5D)">Diabetes-induced alterations in renal medullary microcirculation and metabolism.</a> Curr Diabetes Rev. 3 (1), 53-65 (2007).</li>
<li>dos Santos, E. A., Li, L. -P., Ji, L., Prasad, P. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+changes+with+diabetes+in+renal+medullary+hemodynamics+as+evaluated+by+fiberoptic+probes+and+BOLD+magnetic+resonance+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Radiol%22%5BJournal%5D)">Early changes with diabetes in renal medullary hemodynamics as evaluated by fiberoptic probes and BOLD magnetic resonance imaging.</a> Invest Radiol. 42 (3), 157-162 (2007).</li>
<li>Cummins, T. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+Mass+Spectrometry+Normalization+in+UrineBiomarker+Analysis+in+Nephrotic+Syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Glomerular+Dis%22%5BJournal%5D)">Quantitative Mass Spectrometry Normalization in UrineBiomarker Analysis in Nephrotic Syndrome.</a> Glomerular Dis. (3), 121-131 (2022).</li>
<li>Carlson, E. C., Audette, J. L., Klevay, L. M., Nguyen, H., Epstein, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrastructural+and+functional+analyses+of+nephropathy+in+calmodulin-induced+diabetic+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Anat+Rec%22%5BJournal%5D)">Ultrastructural and functional analyses of nephropathy in calmodulin-induced diabetic transgenic mice.</a> Anat Rec. 247 (1), 9-19 (1997).</li>
<li>Zheng, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+late-stage+diabetic+nephropathy+in+OVE26+diabetic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Development of late-stage diabetic nephropathy in OVE26 diabetic mice.</a> Diabetes. 53 (12), 3248-3257 (2004).</li>
<li>Wang, F., Veth, T., Kuipers, M., Altelaar, M., Stecker, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+suspension+trapping+method+for+phosphoproteomics+sample+preparation%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Optimized suspension trapping method for phosphoproteomics sample preparation.</a> Anal Chem. 95 (25), 9471-9479 (2023).</li>
<li>Mather, A., Pollock, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glucose+handling+by+the+kidney%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+Int+Suppl%22%5BJournal%5D)">Glucose handling by the kidney.</a> Kidney Int Suppl. 120, S1-S6 (2011).</li>
<li>Ross, B. D., Espinal, J., Silva, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glucose+metabolism+in+renal+tubular+function%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+Int%22%5BJournal%5D)">Glucose metabolism in renal tubular function.</a> Kidney Int. 29 (1), 54-67 (1986).</li>
<li>Roger, F., Martin, P. Y., Rousselot, M., Favre, H., Féraille, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+shrinkage+triggers+the+activation+of+mitogen-activated+protein+kinases+by+hypertonicity+in+the+rat+kidney+medullary+thick+ascending+limb+of+the+Henle%27s+loop%3A+requirement+of+p38+kinase+for+the+regulatory+volume+increase+response%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Cell shrinkage triggers the activation of mitogen-activated protein kinases by hypertonicity in the rat kidney medullary thick ascending limb of the Henle's loop: requirement of p38 kinase for the regulatory volume increase response.</a> J Biol Chem. 274 (48), 34103-34110 (1999).</li>
<li>Yang, J., Lane, P. H., Pollock, J. S., Carmines, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PKC-dependent+superoxide+production+by+the+renal+medullary+thick+ascending+limb+from+diabetic+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Renal+Physiol%22%5BJournal%5D)">PKC-dependent superoxide production by the renal medullary thick ascending limb from diabetic rats.</a> Am J Physiol Renal Physiol. 297 (5), F1220-F1228 (2009).</li>
</ol>

Autorzy nie ujawnili żadnych informacji.

Metody przedstawione w tym podejściu technicznym mają na celu zilustrowanie porównawczej analizy proteomu różnych obszarów nerki. Tutaj wykorzystaliśmy metody izolacji rdzenia i kanalików korowych u myszy z cukrzycą (OVE26) i kontrolną (FVB) oraz przeprowadziliśmy 1-wymiarową analizę LC-MS / MS i bioinformatyczną, aby zilustrować podstawowe różnice w proteomie w każdej części nerki, oprócz proteomu całych nerek.
Izolacja przedziałów nerkowych wymaga starannego wypreparowania kory z dala od rdz...

Przewlekła choroba nerek (PChN) jest poważnym problemem współczesnej medycyny, pochłaniającym ponad 86 miliardów dolarów wydatków na opiekę zdrowotną w samych Stanach Zjednoczonych1. Na całym świecie częstość występowania PChN wzrasta wraz z występowaniem cukrzycy i związanych z nią chorób współistniejących nerek. Blisko 14% populacji USA cierpi na PChN (raport roczny USRDS 2024). Ponadto nefropatia cukrzycowa jest formą PChN i główną przyczyną schyłkowej niewydolności nerek (ESRD), a 60% pacjentów ze schyłkową niewydolnością nerek ma cukrzycę1,2,3. Cukrzyca wpływa na wszystkie struktury nerek i typy komórek nefronów, jednostki funkcjonalnej nerek. Jak pokazano w Rysunek 1, różne porcje nefronów są zawarte w korze nerkowej i obszarach rdzenia. Większość nerek składa się z kanalików. Dysfunkcja kanalików nerkowych i zmiany strukturalne w istotny sposób przyczyniają się do rozwoju nefropatii cukrzycowej (DN), a zmiany te dobrze korelują z tempem pogarszania się funkcji nerek4,5,6,7,8. We wczesnym stadium cukrzycy, w odpowiedzi na zwiększony wychwyt glukozy i związany z tym wychwyt sodu oraz zapotrzebowanie na białka transportowe przez błonę we wszystkich segmentach kanalików, kanaliki ulegają przerostowi. Wraz ze zwiększonym uszkodzeniem mikrokrążenia w późniejszej cukrzycy, kanaliki wykazują atrofię i rozszerzenie, podczas gdy występuje zwłóknienie i ekspansja śródmi<ąższu class="xref">9. Poprzednie badania z naszego laboratorium wykazały zmienione proteomy i obfitość białek odpowiedzi na stres w kanalikach korowych myszy z cukrzycą10,11. Rdzeń jest ważny dla regulacji stężenia moczu, a dysfunkcja podczas choroby nerek jest związana ze stresem oksydacyjnym, a cukrzyca prowadzi do obniżenia ciśnienia tlenu w tym obszarze nerek z powodu zwiększonego zużycia tlenu z aktywności metabolicznej, zwiększonej aktywności białek transportujących błonę i uszkodzenia mikrokrążenia12,13,14.
Zrozumienie szczegółowych mechanizmów rozwoju i progresji DN to ciągły wysiłek, który będzie wymagał nowatorskich i zintegrowanych podejść odwołujących się do modelowania choroby i profilowania molekularnego procesów sygnalizacji, adaptacyjnych zmian w dynamice białek komórkowych oraz precyzyjnego definiowania komórek nerkowych i składników tkanek dotkniętych urazem w przewlekłych warunkach. Proteomika, metabolomika i transkryptomika dają możliwość analitycznego badania mechanizmów molekularnych chorób nerek. Omika to stosunkowo nowa dziedzina, która wykorzystuje podejścia biologii systemowej w celu uzyskania bardziej globalnego zrozumienia systemów biologicznych. Proteomika jest potężnym narzędziem omicznym w nefrologii w ostatnich dziesięcioleciach. Badania nad biomarkerami rozszerzyły się w ciągu ostatnich 20 lat, na co wskazuje wzrost liczby publikacji, chociaż konieczne są szeroko zakrojone prace, aby w pełni wdrożyć te odkrycia do clinic15. Dzięki bardzo różnym populacjom komórek kanalików i odpowiednim rolom funkcjonalnym w korze nerkowej i rdzeniu, analiza proteomiczna całych nerek może maskować unikalne zmiany związane z określonymi strukturami w tych różnych regionach. Dlatego celem tego badania jest wykazanie oddzielenia kory nerkowej i rdzenia, a także oddzielenia kanalików korowych od kłębuszków nerkowych, a następnie szczegółowe protokoły przygotowania ekstraktów białkowych z izolowanych struktur do najnowocześniejszej spektrometrii mas i analiz bioinformatycznych. Mysie modele nefropatii cukrzycowej odgrywają zasadniczą rolę w definiowaniu mechanizmów progresji choroby. W tym badaniu użyliśmy transgenicznej myszy OVE26, u której rozwija się cukrzyca typu I o wczesnym początku i wykazuje cechy wczesnego i późnego stadium DN u ludzi, w tym 1) wczesny wzrost i późniejszy spadek współczynnika filtracji kłębuszkowej, 2) przerost nerek, 3) pogrubienie błony podstawnej kłębuszków nerkowych i rozszerzenie mezangiów, 4) ciężki białkomocz i 5) zwłóknienie cewkowo-śródmiąższowe9, 16,17. Wybrano dwumiesięczne myszy, aby wykazać zmiany proteomiczne w przedziałach kanalików przed jawnymi zmianami strukturalnymi. Jak wcześniej zgłoszono i pokazano w <silna klasa="xfig">Rysunek 2, 2-miesięczne myszy OVE26 wykazują ekspansję kłębuszkowej macierzy mezangialnej (<silna klasa="xfig">Rysunek 2, zielona strzałka) i ciężką białkomocz17, bez jawnych zmian histologicznych w kanalikach proksymalnych (<silna klasa="xfig">Rysunek 2, żółta strzałka) u młodych myszy z cukrzycą. Tutaj przedstawiamy połączone ilościowe podejście proteomiczne do charakterystyki całej nerki, rdzenia i kanalików korowych w celu wyjaśnienia i zilustrowania różnic w proteomie w każdym kompartmencie z cukrzycą.

<table><tbody><tr><td>Kolagenaza typu 1A&nbsp;</td><td>Sygnał miliporowy</td><td>C9891</td><td></td></tr><tr><td>Exploris 480 Orbitrap&nbsp;</td><td>Thermofisher</td><td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/BRE725539</td><td></td></tr><tr><td>Filtr siatkowy MS Falcon Cell, 100 &mikro; m</td><td>VWR</td><td>21008-950</td><td></td></tr><tr><td>Filtr siatkowy Falcon Cell, 70 i mikro; m</td><td>VWR</td><td>21008-952</td><td></td></tr><tr><td>Gibco PBS pH 7,4&nbsp;</td><td>Thermo</td><td>1001023</td><td></td></tr><tr><td>Halt Koktajl inhibitorów proteazy i fosfatazy</td><td>VWR</td><td>PI78440</td><td></td></tr><tr><td>Jodoacetamid</td><td>Sigma Aldrich</td><td>I1149</td><td></td></tr><tr><td>MetaboAnalyst 6.0&nbsp;</td><td>MetaboAnalyst 6.0&nbsp;</td><td>https://www.metaboanalyst.ca/</td> <td>platforma do analizy danych metabolomicznych</td></tr><tr><td>NanoDrop 2000&nbsp;</td><td>Kolumna Thermofisher</td><td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/ND-2000</td><td></td></tr><tr><td>Oasis HLB&nbsp;</td><td>Waters</td><td>186002034</td><td></td></tr><tr><td>PEAKS 12.0</td><td>Bioinformatics Solutions Inc</td><td></td><td>Oprogramowanie do analizy danych LC-MS/MS</td></tr><tr><td>Tłuczek do mikroprobówek 1,5 ml</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC0782485</td><td></td></tr><tr><td>Pułapka do zawieszania (pułapka S)</td><td>Protifi</td><td>C02-micro-10</td><td></td></tr><tr><td>TCEP</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>20490</td><td></td></tr><tr><td>TEABC</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T7408</td><td></td></tr><tr><td>Proteaza trypsynowa, MS-Grade</td> Myjka ultradźwiękowa <td>ThermoFisher Scientific</td><td>90057</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Cole-Parmer&nbsp; &nbsp;</td><td>nr wzoru 0884900</td><td></td></tr></tbody></table>

porównawcza analiza proteomiczna całej nerki, rdzenia i kanalików korowych w patogenezie cukrzycowej uszkodzenia nerek u myszy

Comparative Proteomic Analysis of Whole Kidney, Medulla, and Cortical Tubules in Diabetic Pathogenesis of Kidney Injury in Mice

Definiowanie sekwencji zdarzeń w chorobie nerek jest kamieniem węgielnym praktyki klinicznej w zestawie narzędzi nefrologów. Analizy proteomiczne tkanek są znaczącym podejściem do zrozumienia podstawowych procesów fizjologicznych i molekularnych patofizjologii nerek. Przedstawione przez nas metody i protokoły pozwolą na molekularną dyssekcję nerki w każdym konkretnym obszarze zainteresowania związanym z następstwami choroby. Aby określić wpływ choroby na określone regiony i struktury nerek o unikalnych funkcjach, celem tego protokołu jest zademonstrowanie uproszczonej techniki kompartmentacji nerek myszy i izolacji kanalików korowych nerek w połączeniu z usprawnionymi ilościowymi przepływami pracy proteomicznej bez znaczników. Połączenie tych metod pomoże w identyfikacji zaburzonych wzorców molekularnych w całej nerce, przedziałach rdzeniowych i strukturach kanalików korowych nerek, z ostatecznym i ostatecznym celem proteomiki pojedynczej komórki w kontekstach patologicznych. Zastosowanie tych metod w praktycznie każdym modelu choroby będzie pomocne w określeniu mechanizmów patologii związanych z dysfunkcją nerek.

Ogólnie liczba zidentyfikowanych białek dla każdego typu próbki wynosiła: 1) cała nerka (1438), 2) rdzeń (2145) oraz kanaliki korowe (1859). Po przetwarzaniu danych w programie MetaboAnalyst 6.0, filtrowaniu i imputacji, ostateczna liczba analizowanych zidentyfikowanych białek dla każdego przedziału nerki wyniosła: cała nerka (455), rdzeń (997) i kanaliki korowe (896). Rysunek 4 przedstawia globalne zmiany proteomiczne w nerkach myszy cukrzycowych OVE26. Analiza ilościowa bez znakowania (LFQ...

Tutaj prezentujemy szczegółowy protokół analizy proteomicznej całej nerki, izolowanych kanalików korowych i proteomów rdzeniowych. W badaniu porównano również regionalne proteomy w mysim modelu z cukrzycą i myszach bez cukrzycy.

Porównawcza analiza proteomiczna całej nerki, rdzenia i kanalików korowych w patogenezie cukrzycowej uszkodzenia nerek u myszy

Defining the sequence of events in renal disease is the cornerstone of clinical practice in the nephrologist toolkit. Tissue proteomic analyses are a ...

Jesteśmy zainteresowani zdefiniowaniem zmian molekularnych w nerkach za pomocą spektrometrii mas. Dlatego szczególnie interesuje nas zdefiniowanie tych zmian, gdy są one związane z procesami chorobowymi, takimi jak cukrzyca czy cukrzycowa choroba nerek.Zdefiniowanie związanych z chorobą zmian proteomicznych w określonych regionach nerek i strukturach w komórkach jest trudne podczas analizy ekstraktów z całych nerek, w których białka o średniej i niskiej obfitości są maskowane przez białka o wysokiej obfitości.[Tymoteusz] Jesteśmy zainteresowani charakterystyką tkanek głębokich za pomocą proteomiki w spektrometrii mas i definiowaniem zdarzeń molekularnych, które zmieniają się w nerkach, a szczególnie w kłębuszkach nerkowych, w odpowiedzi na chorobę.Nasze podejścia proteomiczne umożliwiają analizę proteomiczną oddzielonych obszarów i struktur nerek bez konieczności przeprowadzania analiz mikroskopowych lub zaawansowanych umiejętności przeprowadzania sekcji zwłok lub protokołów ekstrakcji określonych próbek białek.Kolejnym logicznym postępem w naszym programie badawczym będzie zdefiniowanie zdarzeń komórkowych, które zachodzą w tych tkankach. Wykorzystamy więc proteomikę pojedynczej komórki, aby określić wpływ na różne składniki komórkowe w nerce, w szczególności w kłębuszkach nerkowych, aby określić, jakie efekty zachodzą w komórkach w odpowiedzi na te konteksty chorobowe.[Narrator] Na początek wypreparuj nerki znieczulonej myszy i umieść nerki na szklanym talerzu lub szalce Petriego ustawionej na lodzie. Za pomocą żyletki wykonaj kilka poprzecznych nacięć przez nerki, aby uzyskać trzy do czterech plasterków między górnym i dolnym biegunem. Zarezerwuj od jednego do dwóch środkowych plasterków i dwóch biegunów z każdej nerki, aby służyły jako próbki całych nerek. Umieść porcję w 1,5 mililitrowej probówce wirówkowej zawierającej lodowaty bufor homogenizacyjny. Trzymając środkowe poprzeczne plastry płasko, ostrożnie odetnij korę za pomocą żyletki lub skalpela. Utrzymuj korę oddzielnie od obszarów rdzenia w celu protokołu izolacji kanalików korowych. Umieść część wypreparowanego rdzenia w 1,5-mililitrowej probówce wirówkowej umieszczonej na lodzie i dodaj lodowaty bufor homogenizacyjny. Za pomocą żyletki zmiel wyciętą korę na kawałki o średnicy od jednego do trzech milimetrów na szklanej płytce lub szalce Petriego, tworząc pastę. Trawić zmieloną korę w jednym mililitrze kolagenazy typu IA przez 30 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza w kołyszącej kąpieli wodnej. Teraz umieść sitko o średnicy 100 mikrometrów na 50-mililitrowej stożkowej rurce ustawionej na lodzie. Przenieść strawioną zawiesinę korową na sitko o średnicy 100 mikrometrów i delikatnie przecisnąć przez sitko za pomocą tłoka 10-mililitrowej strzykawki. Umyj górną część sitka jednym mililitrem PBS. Przepuścić filtrat przez sitko o średnicy 100 mikrometrów, a następnie sitko o średnicy 70 mikrometrów. Wirować końcowy filtrat o masie 120 g przez dwie minuty w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Po odrzuceniu nadmiaru PBS sprawdź czystość osadu kanalików korowych pod mikroskopem za pomocą obiektywu 10x. Jeśli więcej niż 10% frakcji zawiera kłębuszki, ponownie zawiesić osad z jednym mililitrem PBS i przepuścić przez czyste sitko do komórek o średnicy 70 mikrometrów bez dodatkowego płukania. Teraz homogenizuj próbki w 1,5-mililitrowych probówkach wirówkowych za pomocą plastikowego tłuczka. Po 15 minutach sonikować próbkę przez pięć minut w kąpieli sonicznej z wodą o temperaturze 25 stopni Celsjusza. Teraz pozostaw próbki na lodzie na kolejne 10 minut. Krótko zmieszać homogenat i roztrzeszczyć 20 razy za pomocą pipety. Pozostawić próbkę na lodzie na kolejne 15 minut. Po kilkukrotnym potitrowaniu próbki odwirować przy 13 000 g przez 20 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza i przenieść oczyszczone ekstrakty białkowe do czystych probówek. Rozcieńczyć około 40 do 50 mikrogramów próbki w buforze do lizy próbki do końcowej objętości 46 mikrolitrów i inkubować próbkę w temperaturze 65 stopni Celsjusza przez 30 minut. Następnie dodaj cztery mikrolitry 0,5 molowego jodoacetamidu do wody klasy LC/MS i inkubuj w temperaturze pokojowej w ciemności przez 30 minut. Teraz dodaj pięć mikrolitrów 12% wagowo kwasu fosforowego do wody klasy LC / MS, a następnie 350 mikrolitrów buforu wiążącego pułapkę zawiesiny. Dodać próbkę do kolumny pułapki zawiesinowej i odwirować przy 4 000 g przez 30 sekund w temperaturze pokojowej w wirniku o stałym kącie, aby przepuścić każdą objętość przez kolumnę. Przemyć kolumnę czterokrotnie 400 mikrolitrami objętości bufora wiążącego pułapkę zawiesinowy. I wirować przy 4 000 g przez 30 sekund w temperaturze pokojowej w stałym wirniku po każdym myciu. Następnie odwirować kolumnę o masie 4 000 g przez jedną minutę w temperaturze pokojowej, aby całkowicie usunąć bufor wiążący. Teraz przenieś kolumnę pułapki zawiesiny do czystej probówki zbiorczej i dodaj 2,5 do 5 mikrogramów trypsyny w 125 mikrolitrach 50-milimolowego TEABC o pH 8,5 w wodzie klasy LC / MS. Wstrzyknąć peptydy o równej masie na jednowymiarowy nano LC i frakcjonować na kolumnach C18 z odwróconymi fazami. Eluować peptydy bezpośrednio do spektrometru mas przy napięciu rozpylania 1,8 kilowolta z rurką przesyłową jonów utrzymywaną w temperaturze 250 stopni Celsjusza. Pozyskiwanie widm w zależnym od danych trybie jonowym, w którym najbardziej intensywny fragment tandemowej spektrometrii mas jest usuwany z kolejki analizy. Po akwizycji spektralnej prześlij surowe pliki w celu przypisania widma oraz identyfikacji białek i peptydów. Użyj oprogramowania do analizy danych LC-MS/MS peak, aby wyszukiwać i filtrować widma przy użyciu ścisłych kryteriów 1% współczynnika fałszywych odkryć w stosunku do sprawdzonej za pomocą myszy bazy danych FAPSA. Określ karbamidometylację cysteiny jako ustaloną modyfikację i utlenianie metioniny jako modyfikację zmienną i poddaj oprogramowaniu pików w celu przypisania widma oraz identyfikacji peptydów i białek. Konwertuj listy białek do formatu CSV i przypisz etykiety grup lub próbek do każdej kolumny i wiersza. Otwórz oprogramowanie MetaboAnalyst. Prześlij plik CSV i przypisz brakujące wartości, stosując regułę 1/5 wartości minimalnej dla brakujących zmiennych. Filtruj dane, aby wykluczyć bardzo zmienne wartości przy użyciu przedziału międzykwartylowego, stosując 40% odcięcie wariancji. Znormalizuj wartości do mediany intensywności, log 10 przekształć dane i uśrednić środek skalowania. Generuj wykresy wulkanów dla zmiany zagięcia 1,5 i wartości p poniżej 0,05. Generuj mapy cieplne i wykonuj częściową analizę dyskryminacyjną metodą najmniejszych kwadratów (PLS-DA) oraz analizę statystyczną grup prób przy użyciu zmiennej ważności w projekcji. Zidentyfikuj potencjalnych kandydatów do kontynuacji w oparciu o kryteria zmiany krotności przekraczającej 1,5 i wartości p mniejszej niż 0,05 lub zmiennej ważności w projekcji większej niż jeden w analizie PLS-DA. Oceniono globalne zmiany proteomiczne w nerce myszy z cukrzycą OVE26. Znaczna regulacja w górę GAPDH i ALDH6A1 wskazywała na odpowiedzi metaboliczne, podczas gdy MME i CTSA były zdecydowanie obniżone. Warto zauważyć, że wiele białek VIP znaleziono w analizach wykresów wulkanicznych. Hierarchiczne mapy cieplne z grupowaniem grupowym i cechowym dodatkowo zilustrowały różnice w proteomach na grupowych i indywidualnych poziomach białek między nerkami OVE26 i FVB. Analiza proteomiczna kanalików korowych zidentyfikowała Txn2 i Ppef2 jako znacznie regulowane w górę, podczas gdy Lrba i Nhef2 były regulowane w dół u myszy OVE26. Analiza proteomiki rdzeniastej wykazała regulację w górę Phf8 i Skp1 oraz regulację w dół Rhoa i Prx w nerkach OVE26. Porównanie proteomów z całej nerki, kanalików i rdzenia za pomocą diagramu Venna wykazało minimalne nakładanie się tych zestawów danych z zerem lub dwoma wspólnymi kandydatami przy użyciu progów statystycznych.

comparative-proteomic-analysis-whole-kidney-medulla-cortical-tubules

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Mysia izolowana perfundowana nerka (MIPK) to technika utrzymywania nerki myszy w warunkach ex vivo w stanie perfundowanym i funkcjonalnym przez 1 godzinę. i technika chirurgiczna są szczegółowo opisane.

Technika perfuzji nerki izolowanej u myszy

Ten protokół opisuje pełne badanie nerek, które powinno być przeprowadzone na mysich modelach choroby kłębuszków nerkowych. Metody te pozwalają na szczegółową analizę funkcjonalną, strukturalną i mechanistyczną funkcji kłębuszków nerkowych, którą można zastosować do wszystkich mysich modeli choroby kłębuszków nerkowych.

Ocena czynności nerek w mysich modelach choroby kłębuszków nerkowych

Zmodyfikowany model myszy Goldblatt z 2 nerkami i klipsem (2K1C) został opracowany przy użyciu rurki poliuretanowej do zainicjowania zwężenia tętnicy nerkowej, wywołując wzrost ekspresji reniny i uszkodzenie nerek. W tym miejscu opisujemy szczegółową procedurę przygotowania i umieszczenia mankietu na tętnicy nerkowej w celu wygenerowania powtarzalnego i spójnego modelu myszy 2K1C.

Zmodyfikowany mysi model regulacji reniny w zwężeniu tętnicy nerkowej z jedną nerką i jednym klipsem

Ten artykuł przedstawia protokół wykrywania ekspresji mikroRNA w nerkach mysiego modelu ostrego uszkodzenia nerek za pomocą ilościowej reakcji łańcuchowej polimerazy z odwrotną transkrypcją w czasie rzeczywistym. Protokół ten kładzie nacisk na mysi model niedokrwiennego uszkodzenia nerek i staranną ekstrakcję próbek mikroRNA.

Ilościowa metoda wykrywania mikroRNA w nerce mysiego modelu niedokrwiennego uszkodzenia nerki

Ten protokół opisuje metodę wywoływania jednostronnej niedrożności moczowodu (UUO) u myszy w celu zbadania postępu zwłóknienia tkanek w nefropatii obturacyjnej. Obejmuje zabiegi chirurgiczne, opiekę pooperacyjną i metody oceny zwłóknienia.

Model jednostronnej niedrożności moczowodu do badania zwłóknienia śródmiąższowego nerek

W tym artykule przedstawiono model niedokrwiennej CKD z wykorzystaniem jednostronnego IRI nerki z kontralateralną nefrektomią wykonaną dzień przed pobraniem próbki; protokół ten umożliwia ocenę funkcjonalną opartą na surowicy, wysoką przeżywalność oraz powtarzalną patologię PREWKinek w ciągu 28 i 42 dni, zapewniając wszechstronną platformę do badań mechanistycznych i interwencyjnych.

Model myszy przejścia z ostrej do przewlekłej choroby nerek wywołanego niedokrwieniem nerek lub uszkodzeniem reperfuzyjnym

Tutaj prezentujemy protokoły oczyszczania kompleksów białkowych i ich separacji za pomocą niebieskiej natywnej STRONY, a następnie profilowania korelacji białek za pomocą ilościowej spektrometrii mas bez etykiet. Ta metoda jest przydatna do przekształcania interaktomów w odrębne kompleksy białkowe.

Rozwiązywanie kompleksów białkowych oczyszczonych z powinowactwa za pomocą Blue Native PAGE i profilowania korelacji białek

Ludzka siatkówka składa się z funkcjonalnie i molekularnie odrębnych regionów, w tym dołka, plamki żółtej i siatkówki obwodowej. W tym miejscu opisujemy metodę wykorzystującą biopsje stemplowe i ręczne usuwanie warstw tkanek z ludzkiego oka w celu wypreparowania i zebrania tych odrębnych obszarów siatkówki do dalszej analizy proteomicznej.

Rozwarstwienie ludzkiej siatkówki i naczyniówki RPE w celu analizy proteomicznej

Celem protokołu jest przygotowanie hydrolizatu keratyny z piór kurczaka metodą hydrolizy alkaliczno-enzymatycznej oraz sprawdzenie, czy dodanie hydrolizatu keratyny do bazy maści kosmetycznej poprawia funkcję bariery skórnej (zwiększając nawilżenie i zmniejszając przeznaskórkową utratę wody). Testy przeprowadza się na ochotnikach i ochotniczkach.

Przygotowanie hydrolizatu keratyny z piór kurczaka i jego zastosowanie w kosmetyce

Niezgodności w sekwencjach ludzkiego antygenu leukocytarnego (HLA) między parami dawców i biorców narządów są główną przyczyną odrzucenia przeszczepu narządów za pośrednictwem przeciwciał. W tym miejscu przedstawiamy zastosowanie niestandardowych macierzy antygenowych, które są oparte na sekwencjach HLA poszczególnych dawców, do badania alloprzeciwciał HLA przeciwko dawcom u biorców narządów.

Spersonalizowane macierze peptydowe do wykrywania alloprzeciwciał HLA w przeszczepach narządów

Poznaj metodę analizy proteomicznej nerki u myszy z cukrzycą. Protokół obejmuje izolację kanalików korowych i rdzenia, spektrometrię masową oraz identyfikację zmian białkowych w cukrzycowej nefropatii.

Porównawcza analiza proteomiczna całej nerki, rdzenia i kanalików korowych w patogenezie cukrzycowej uszkodzenia nerek u myszy

Przeglądaj więcej filmów