Ulepszone dostarczanie i ekspresja genów za pomocą dokostnego wstrzykiwania nanocząstek chitozanu Enkapsulowane plazmidy edytora zasad adeninowych
16 maja 2025
W tym miejscu przedstawiamy podejście do terapii genowej, które dostarcza chitozan pokryty ABE bezpośrednio do szpiku kostnego poprzez wstrzyknięcie doszpikowe.
Proponujemy metodę terapii genowej, która bezpośrednio dostarcza chitozan edytora na bazie adeniny do szpiku kostnego poprzez wstrzyknięcie doszpikowe. Skuteczność transfekcji egzogennych plazmidów do zwierząt doświadczalnych jest stosunkowo niska, a wprowadzenie plazmidów do długotrwałej ekspresji genów może być zakłócone przez układ odpornościowy. Używamy chitozanu do kapsułkowania plazmidów edytorskich na bazie adeniny i bezpośrednio dostarczamy kompleks do szpiku kostnego myszy poprzez wstrzyknięcie doszpikowe, dzięki czemu nadaje się on do chorób spowodowanych nieprawidłową funkcją osteoklastów.
Nasz protokół oferuje wysoką wydajność transfekcji, niewielkie uszkodzenia biologiczne i wysoką wydajność ekspresji genów. Nasza nowatorska strategia jest odpowiednia nie tylko w przypadku chorób spowodowanych nieprawidłową funkcją osteoklastów, ale ma również znaczny potencjał w zakresie rozwoju terapii genowej. Na początek umieść uświęconą mysz na stole roboczym.
Za pomocą nożyczek chirurgicznych i pęsety usuń kość piszczelową i usuń całą otaczającą tkankę mięśniową. Namocz oczyszczoną piszczel w PBS i umyj, aż pozostanie tylko kość. Pobrać jeden mililitr PBS do strzykawki i przepłukać komórki szpiku kostnego z jednego końca kości piszczelowej, aż kość stanie się całkowicie biała.
Następnie zbierz zawiesinę komórkową do probówki. Odwirować go w temperaturze 800 g w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez pięć minut. Po odpipetowaniu supernatantu dodać do osadu 500 mikrolitrów buforu do lizy czerwonych krwinek.
Po minucie dodaj jeden mililitr buforu separacyjnego, aby zakończyć lizę. Ponownie odwirować zawiesinę w temperaturze 800 G w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez pięć minut. Usunąć supernatant i umieścić powstałe osady komórkowe na lodzie do późniejszego wykorzystania.
W celu transfekcji chitozanu rozpuść cztery miligramy chitozanu w 20 mililitrach roztworu kwasu octowego. Dostosuj pH do 5,5 za pomocą 10 molowego wodorotlenku sodu. Następnie dozować 500 mikrolitrów roztworu chitozanu do pojedynczych probówek do mikrowirówek.
Teraz dodaj dwa, trzy, cztery i pięć mikrogramów plazmidów ABE do pojedynczych probówek. Rozpuść plazmidy w 500 mikrolitrach 30-milimolowego siarczanu sodu. Następnie wymieszaj 500 mikrolitrów roztworu plazmidu z 500 mikrolitrami roztworu chitozanu w odpowiednich probówkach.
Inkubować probówki w łaźni wodnej w temperaturze od 50 do 55 stopni Celsjusza przez 15 minut. Wiruj każdą probówkę przez 15 do 30 sekund i pozostaw je w spokoju na 30 minut. W celu scharakteryzowania należy przeanalizować średnicę i potencjał zeta chitozanu przy użyciu dynamicznego rozpraszania światła.
Utrzymuj stężenie chitozanu na poziomie 0,1 miligrama na mililitr w wodzie podwójnie destylowanej. Następnie odlej 0,1 miligrama na mililitr próbki chitozanu na chip krzemowy. Dodać 20 mikrolitrów zawieszonych próbek na siatkach o oczkach 200 i inkubować.
Odwirować zawiesinę komórek szpiku kostnego w temperaturze 800 G w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez pięć minut. Odrzucić supernatant, a następnie dodać 500 mikrolitrów lizatu czerwonych krwinek. Po minucie dodaj jeden mililitr buforu separacyjnego, aby zatrzymać reakcję.
Następnie policz liczbę komórek za pomocą licznika komórek. Następnie przenieś 1 milion komórek do nowej mikroprobówki wirówkowej. Po ponownym odwirowaniu odpipetować supernatant i ponownie zawiesić komórki w 500 mikrolitrach PBS.
Przenieś zawieszone komórki do probówki do cytometrii przepływowej i zmierz wydajność transfekcji za pomocą cytometrii przepływowej. W celu wstrzyknięcia do jamy szpiku kostnego należy unieruchomić znieczuloną mysz w pozycji leżącej na stole operacyjnym. Użyj taśmy klejącej, aby zabezpieczyć przednią kończynę na miejscu.
Zdezynfekuj tylną część kości piszczelowej za pomocą wacika nasączonego alkoholem. Następnie załaduj roztwór plazmidu do jednomililitrowej strzykawki wyposażonej w igłę o rozmiarze 26. Usunąć wszelkie pęcherzyki powietrza i utrzymywać strzykawkę w gotowości do wstrzyknięcia.
Następnie dotknij i ustabilizuj goleń myszy palcami. Ustawić igłę do wstrzykiwań tak, aby weszła do trzonu piszczelowego z płaskowyżu piszczelowego w pobliżu stawu kolanowego. Teraz obrócić igłę równolegle do kości piszczelowej, wprowadzić do jamy szpiku kostnego i wstrzykiwać powoli przez trzy sekundy.
Po wstrzyknięciu należy powoli wyjmować igłę przez trzy sekundy. Natychmiast zdezynfekuj miejsce wkłucia za pomocą wacika nasączonego alkoholem, aby zatamować krwawienie. Umieść mysz w ciepłym otoczeniu w temperaturze 37 stopni Celsjusza, aby ułatwić jej regenerację.
Nanocząstki utworzone za pomocą plazmidów ABE i GRNA miały jednolitą morfologię sferyczną i wąski rozkład wielkości o średniej wielkości 202,9 nanometrów. Potencjał zeta 2,77 miliwolta i wskaźnik polidyspersyjności 0,22. Plazmid ABE osadzony w chitozanie znacznie wzmocnił sygnał fluorescencyjny w komórkach szpiku kostnego, co wskazuje na wyższą skuteczność transfekcji w porównaniu z grupą kontrolną.
Cytometria przepływowa potwierdziła, że plazmid ABE kodowany chitozanem osiągnął wysoką skuteczność transfekcji w komórkach szpiku kostnego. Przy szczytowej skuteczności 51,2% obserwowanej przy dawce czterech mikrogramów, podczas gdy trzy mikrogramy zapewniały równowagę wysokiej wydajności 47,2%, sekwencjonowanie Sangera i PCR genomowego DNA komórek szpiku kostnego ujawniło edycję genów in vivo w miejscu docelowym A1 ze skutecznością 14,27% i w miejscu A2 ze skutecznością 10,69%.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
To badanie przedstawia nowatorską metodę terapii genowej, która wykorzystuje chitosan do dostarczania plazmidów z edytorem opartym na adeninie bezpośrednio do szpiku kostnego poprzez wstrzyknięcie dokościowe. Podejście to ma na celu poprawę efektywności transfekcji i ekspresji genów, minimalizując jednocześnie uszkodzenia biologiczne.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Terapia genowa
- Dostarczanie do szpiku kostnego
- Transfekcja plazmidów
Tło
- Terapia genowa stoi wobec wyzwań związanych z niską efektywnością transfekcji.
- Odpowiedzi immunologiczne mogą utrudniać długotrwałą ekspresję genów.
- Chitosan jest biokompatybilnym materiałem nadającym się do dostarczania leków.
- Nieprawidłowe funkcjonowanie osteoklastów wiąże się z różnymi chorobami.
Cel badania
- Poprawić dostarczanie plazmidów do szpiku kostnego.
- Poprawić efektywność ekspresji genów w komórkach docelowych.
- Opracować metodę nadającą się do leczenia chorób związanych z osteoklastami.
Zastosowane metody
- Kapsułkowanie plazmidów z edytorem opartym na adeninie w chitosan.
- Wstrzyknięcie dokościowe do szpiku kostnego myszy.
- Ocena efektywności transfekcji i wpływu biologicznego.
- Ocenie poziomów ekspresji genów w czasie.
Główne wyniki
- Osiągnięto wysoką efektywność transfekcji przy minimalnym uszkodzeniu biologicznym.
- Zaobserwowano znaczącą ekspresję genów w szpiku kostnym.
- Metoda jest skuteczna w przypadku chorób spowodowanych nieprawidłową funkcją osteoklastów.
- Ta strategia pokazuje potencjał dla szerszych zastosowań w terapii genowej.
Wnioski
- System dostarczania oparty na chitosan jest obiecującym podejściem w terapii genowej.
- Wstrzyknięcie dokościowe zapewnia bezpośredni sposób docelowania do szpiku kostnego.
- To badanie otwiera drogi do leczenia różnych zaburzeń genetycznych.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Efficient gene delivery to bone marrow remains a bottleneck in preclinical gene therapy and disease modeling, limiting predictive confidence in target validation and mechanistic studies. The use of chitosan nanoparticles for intraosseous delivery of adenine base editor plasmids directly addresses transfection efficiency and immune evasion challenges. This approach enables robust in vivo gene editing, supporting translational continuity and risk-adjusted advancement in bone and osteoclast-related disease research portfolios.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct interrogation of gene function in bone marrow cells for mechanistic de-risking.
- Supports functional validation of osteoclast-related targets through efficient in vivo editing.
- Improves predictive confidence in disease-relevant gene modulation studies.
Screening & Assay Development
- Facilitates preparation of validated bone marrow cell systems for downstream screening workflows.
- Delivers reproducible and quantifiable transfection efficiency, supporting assay standardization.
- Enables reliable evaluation of gene editing outcomes via flow cytometry and sequencing readouts.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant models for osteoclast dysfunction and bone pathology studies.
- Provides continuity from gene editing in discovery to preclinical validation of therapeutic hypotheses.
- Reduces biological ambiguity in translational biomarker development for bone-targeted therapies.
Pipeline & Workflow Integration
This intraosseous chitosan nanoparticle delivery method integrates at the interface of early discovery and preclinical model development, enabling direct gene editing in bone marrow for target validation and mechanistic studies.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification in bone and osteoclast biology.
- Screening: Provides reproducible, quantitative transfection and editing metrics for assay readiness.
- Analytics: Enables flow cytometry and sequencing-based measurement of editing efficiency and gene expression.
- Translational Research: Bridges discovery and preclinical validation in disease-relevant bone models.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for gene delivery and editing in bone marrow research.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in bone-targeted gene studies.
- Operational Value: Delivers standardized, scalable, and reproducible gene delivery to bone marrow cells.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision quality and capital efficiency in osteoclast and bone disease portfolios.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of gene therapy and disease model programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in nanoparticle formulation and intraosseous injection techniques.
- Needs access to flow cytometry, dynamic light scattering, and sequencing infrastructure.
- Demands cross-team standardization for reproducible transfection and editing assessment.
- Adaptation may be needed for different animal models or target tissues.
- Efficiency and immune response considerations must be evaluated for translational scalability.
