Name: Częstotliwość i dystrybucja krzyżowania się w mejozie Caenorhabditis elegans za pomocą genotypowania SNP przy użyciu PCR w czasie rzeczywistym (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-07-11T15:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 18 s
Description: Poznaj metodę qPCR do pomiaru częstotliwości krzyżowania w mejozie Caenorhabditis elegans. Uproszczone genotypowanie SNP zwiększa dokładność badań nad regulacją rekombinacji.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Szczepy zostały dzięki uprzejmości Caenorhabditis Genetics Center (CGC), finansowanego przez Biuro Programów Infrastruktury Badawczej NIH (P40 OD010440). Dziękujemy członkom Laboratorium Saito za ich pomocne dyskusje na temat tej pracy. Prace te były wspierane przez Japońskie Towarzystwo Promocji Nauki (JSPS) KAKENHI Grant JP23K05868 dla TTS.

1. Pierwsza krzyżówka genetyczna
<ol>
	<li>Przygotować płytki współpracujące, które zawierają normalne płytki pożywki wzrostu nicieni (NGM) z małą plamką OP50 (średnica ~5 mm) w naczyniu o średnicy 35 mm.</li>
	<li>Dodać trzy hermafrodyty L4 szczepu Bristol N2 (lub mutanty o pochodzeniu bristolskim) i dziewięć młodych dorosłych samców hawajskiego szczepu CB4856 na płytce kryjącej (ryc. 1A). UWAGA: Aby przeanalizować mutanty o wysokiej śmiertelności embrionalnej, konieczne jest użycie zrównoważonych mutantów o pochodzeniu zarówno bristolskim, jak i hawajskim w tej krzyżówce. Aby uzyskać mutanty o pochodzeniu hawajskim, mutanty z Bristolu muszą zostać skrzyżowane ze szczepem hawajskim co najmniej sześć razy, aż wszystkie interesujące miejsca SNP będą miały pochodzenie hawajskie. W rezultacie, hawajski mutant zawiera tło bristolskie tylko w zmutowanym regionie i chromosomie równoważącym.</li>
	<li>Inkubować płytkę przez 1,5 dnia w temperaturze 20 °C, aby połączyć oba szczepy. Przenieś każdy hermafrodytę na nową, indywidualną płytkę NGM za pomocą OP50.</li>
	<li>Umieścić płytki w inkubatorze o temperaturze 20 °C na 1 dzień, aby umożliwić im złożenie zapłodnionych jaj. Przenieś każdy hermafrodytę na nową, indywidualną płytkę NGM za pomocą OP50.</li>
	<li>Umieścić płytki w inkubatorze o temperaturze 20 °C na 1 dzień, aby umożliwić ponowne złożenie zapłodnionych jaj. Usuń hermafrodyty. Przechowywać płytki przez 0,5 - 1 dzień w inkubatorze w temperaturze 20 °C, aby wyhodować potomstwo do L4.</li>
</ol>
2. Drugi krzyż
<ol>
	<li>Wybierz sześć skrzyżowanych L4-hermafrodytów (hybrydy bristolsko-hawajskie) i 12-15 ccIs4251[(pSAK2) myo-3p::GFP::LacZ::NLS + (pSAK4) myo-3p::mitochondrialne GFP + dpy-20(+)] I (TTS24) samce Bristol na nową płytkę kojarzeniową (Figura 1B). UWAGA: Wprowadzony szczep ccIs4251 jest uzyskiwany z Centrum Genetyki Caenorhabditis i musi być krzyżowany ze szczepem N2 typu dzikiego więcej niż sześć razy.</li>
	<li>Przechowywać płytkę przez 1,5 dnia w temperaturze 20 °C w inkubatorze do krycia. Przenieś każdy hermafrodytę na nową płytkę NGM za pomocą OP50.</li>
	<li>Umieścić płytki w inkubatorze o temperaturze 20 °C na 1 dzień, aby umożliwić im złożenie zapłodnionych jaj. Przenieś każdy hermafrodytę na nową, indywidualną płytkę NGM za pomocą OP50.</li>
	<li>Przechowywać płytki przez 1 dzień w inkubatorze o temperaturze 20 °C, aby mogły ponownie złożyć zapłodnione jaja. Przenieś każdy rodzicielski hermafrodyt do probówki PCR z 3 μl buforu do lizy, aby sprawdzić, czy pierwsza krzyżówka się powiodła.</li>
	<li>Sprawdź genotypy rodziców jako hybrydę bristolsko-hawajską metodą PCR w regionie chromosomu V. Oddziel prążki za pomocą 2,5% elektroforezy w żelu agarozowym.<ol>
		<li>W SNP, WBVar01973670, długość amplikonu PCR z genomu Bristolu wynosi 220 pz, a z genomu hawajskiego 196 pz. Jeśli wyniki PCR wskazują, że rodzice są homozygotami bristolskimi, jest to spowodowane samozapłodnieniem pierwszej krzyżówki. Nie używaj potomstwa tych robaków do dalszej analizy.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Kontrola wyrywkowa
<ol>
	<li>Przygotuj bufor do lizy robaków w następujący sposób: 50 mM KCL, 10 mM Tris pH 8,2, 2,5 mM MgCl2, 0,45% IGEPAL CA-630 (NP-40), 0,45% Tween 20 i 0,01% żelatyny. Sterylizować przez filtrację i przechowywać w temperaturze pokojowej. Bezpośrednio przed użyciem dodać 3 μl 20 mg/ml proteinazy K (wH2O) do 1 ml buforu do lizy i przechowywać w podwielokrotnościach w temperaturze -20 °C.</li>
	<li>Sprawdź ekspresję GFP w mięśniu ściany ciała potomków drugiej krzyżówki za pomocą fluorescencyjnego mikroskopu preparacyjnego przed dodaniem robaków do poszczególnych probówek PCR. Powiększenie wynosi 6,1-55x, a zastosowana długość fali to 440-460 nm.</li>
	<li>Wybrać pojedynczego robaka z dodatnim wynikiem GFP i dodać do każdej probówki PCR zawierającej 3 μl buforu do lizy robaków (ryc. 1C). Zbierz łącznie 360 (90 x 4 replikaty biologiczne) dorosłych samców skrzyżowanych przodków w każdej z 360 probówek PCR. UWAGA: Aby uniknąć zbierania samozapłodnionego potomstwa, do pobierania próbek należy wybrać robaki z dodatnim wynikiem GFP. Niekojarzone hermafrodyty młodsze niż L4 są również dostępne do analizy autosomów, ale ponieważ mają różną liczbę chromosomów X, samce i hermafrodyty muszą być zidentyfikowane po dojściu do L4 i pobrane próbki podczas analizy chromosomu X.</li>
	<li>Umieścić próbki w zamrażarce o temperaturze -80 °C na 5 minut. Próbki można przechowywać w temperaturze -80 °C do czasu rozpoczęcia lizy.</li>
	<li>Analizując mutanty o wysokiej śmiertelności embrionalnej, należy zebrać martwe zarodki zamiast żywych larw, aby uzyskać bezstronne wyniki. Do pobrania zarodków należy użyć końcówki pipety z 0,5 μl roztworu chitynazy (20 mg/ml chitynazy, 50 mM NaCl, 70 mM KCl, 2,5 mM MgCl2, 2,5 mM CaCl2). Zbierz zarodki w ciągu 4 godzin od zniesienia. UWAGA: Martwe zarodki złożone ponad 4 godziny temu nie nadają się do analizy PCR, prawdopodobnie z powodu degradacji genomowego DNA.</li>
</ol>
4. Liza próbki
<ol>
	<li>Ustaw probówki PCR w termocyklerze w temperaturze 60 °C na 1 godzinę, a następnie 95 °C na 15 minut. Dodaj 100 μl wody wolnej od nukleaz do każdej probówki i dobrze wymieszaj.</li>
	<li>Próbki należy przechowywać w temperaturze -20 °C do momentu rozpoczęcia genotypowania SNP metodą PCR w czasie rzeczywistym.</li>
</ol>
5. Genotypowanie SNP
<ol>
	<li>Przygotuj mieszaninę w następujący sposób (Rysunek 2). Do probówki o pojemności 1,5 ml dodaj 125 μl Master Mix, 6 μl testu genotypowania SNP (40x), 280 μl wody destylowanej (DW), starter do przodu (450 nM), starter do tyłu (450 nM), sondę 1 (100 nM), sondę 2 (100 nM). UWAGA: Sondy i startery są wymienione w Tabeli 1.</li>
	<li>Dokładnie wymieszać, kilkakrotnie pipetując, aby uzyskać jednolite stężenie. Dodać 4 μl mieszaniny do każdego dołka 96-dołkowej płytki do PCR na podstawie nośnej za pomocą 12-kanałowej mikropipety.</li>
	<li>Dodać 1 μl lizatu zawierającego każdy genomowy DNA do każdej studzienki i kilkakrotnie wymieszać, pipetując.</li>
	<li>Przygotuj kontrole pozytywne, tj. homozygoty bristolskie, homozygoty hawajskie i hybrydy bristolsko-hawajskie, a także trzy kontrole bez matrycy jako kontrole ujemne (ryc. 3A).</li>
	<li>Uszczelnij płytkę optyczną folią samoprzylepną. Dociśnij folię, skupiając się na krawędziach każdej studzienki za pomocą aplikatora.</li>
	<li>Odwirować płytkę na krótko, aby zebrać płyn na dnie i usunąć pęcherzyki powietrza z cieczy.</li>
	<li>Załaduj płytkę na urządzenie do PCR w czasie rzeczywistym. Kliknij przycisk Utwórz nowy eksperyment w oprogramowaniu.</li>
	<li>W ustawieniu Properties (Właściwości) ustaw Typ instrumentu na QuantStudio 1 System, Block type (Typ bloku) na 96-well 0.2 mL Block (Blok) , Experimental type (Typ eksperymentalny) na Genotypowanie, Chemistry (Chemia) na TaqMan Reagents (Odczynniki) i Run mode (Tryb pracy) na Fast (Szybki).</li>
	<li>W ustawieniu Method (Metoda) ustaw Volume (Objętość) na 5 μL (upewniając się, że prawidłowa objętość reakcji jest zgodna z konfiguracją), Cycle Count (Liczba cykli) na 40 cykli (domyślnie). Ustaw ustawienia temperatury i czasu w następujący sposób: Etap wstępnego odczytu w temperaturze 25 °C przez 30 s, Etap wstrzymania (aktywacja enzymatyczna, gorący start) w temperaturze 95 °C przez 20 s, etap PCR w temperaturze 95 °C przez 1 s, 60 °C przez 20 s i etap po odczytie w temperaturze 25 °C przez 30 s.</li>
	<li>W ustawieniu Plate (Płytka) dopasuj pozycje próbek i kontrolek do każdego dołka na ekranie oprogramowania.</li>
	<li>Zapisz eksperyment w urządzeniu USB, załaduj go do instrumentu PCR w czasie rzeczywistym i kliknij przycisk Uruchom .</li>
</ol>
6. Analiza danych
<ol>
	<li>Zapisz wyniki na USB i przenieś je do komputera w celu analizy danych.</li>
	<li>Analizuj dane delta Rn (dRn) w czasie rzeczywistym za pomocą poniższego wzoru, gdzie Rn (znormalizowany reporter) to sygnał fluorescencyjny z barwnika reporterowego, VIC i FAM, znormalizowany przez podzielenie przez sygnał fluorescencyjny pasywnego barwnika referencyjnego, ROX. dRn = Rn - linia bazowa</li>
	<li>Przejrzyj wykres dyskryminacji allelicznej.</li>
	<li>Potwierdź rozdzielenie klastrów (rysunek 3B). Na wykresie dyskryminacji alleli homozygoty bristolskie są zgrupowane w prawym dolnym rogu, hybrydy bristolsko-hawajskie są zgrupowane w prawym górnym rogu, homozygoty hawajskie są zgrupowane w lewym górnym rogu, a kontrole ujemne są zgrupowane w lewym dolnym rogu. Użyj następujących kodów kolorów: Czerwony: allel bristolski Niebieski: allel hawajski Zielony: Heterozygotyczny : Kontrola ujemna</li>
	<li>Wyeksportuj wyniki do pliku arkusza kalkulacyjnego i zbierz dane genotypowania ze wszystkich czterech pozycji SNP. Jeśli na czterech kolejnych pozycjach występują nieokreślone połączenia, należy wykluczyć dane z wartości N. Do analizy należy użyć 90 próbek na płytkę.<ol>
		<li>Zidentyfikuj krzyżówki w następujący sposób: Jeśli SNP na pozycji #1 jest hybrydą bristolsko-hawajską, a pozycje #2-#4 są wszystkimi homozygotami bristolskimi [B/H]-[B/B]-[B/B] lub pozycja #1 jest homozygotą bristolską, a pozycja #2-#4 to wszystkie hybrydy bristolsko-hawajskie [B/B]-[B/H]-[B/H]-[B/H]-[B/H], Wyniki te wskazują na pojedyncze skrzyżowanie między pozycjami #1 i #2 (gdzieś na lewym ramieniu chromosomu). Podobnie w przypadku [B/H]-[B/H]-[B/B]-[B/B] lub [B/B]-[B/B]-[B/H]-[B/H], pojedyncze skrzyżowanie następuje między #2 i #3 (gdzieś w centralnym regionie chromosomu), a w przypadku [B/H]-[B/H]-[B/H]-[B/B] lub [B/B]-[B/B]-[B/B]-[B/H], Pojedyncze skrzyżowanie następuje między #3 i #4 (gdzieś na prawym ramieniu chromosomu). UWAGA: Istnieje sześć wzorów podwójnych zwrotnic. Po lewej i prawej: [B/B]-[B/H]-[B/H]-[B/B] i [B/H]-[B/B]-[B/B]-[B/H], po lewej i pośrodku: [B/B]-[B/H]-[B/B]-[B/B] i [B/H]-[B/H]-[B/H]-[B/H], w środku i po prawej: [B/B]-[B/B]-[B/H]-[B/B] i [B/H]-[B/H]-[B/B]-[B/H].</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
7. Analiza statystyczna
<ol>
	<li>Wstaw wartości do oprogramowania SPSS Statistics (IBM). W celu porównania rozkładu krzyżowania w lewym ramieniu, regionie centralnym i prawym ramieniu chromosomów, wstaw 82 chromosomy ze skrzyżowaniem w lewym ramieniu, 20 chromosomów ze skrzyżowaniem w regionie centralnym i 68 chromosomów ze skrzyżowaniem w prawym ramieniu.</li>
	<li>Wykonaj korektę ANOVA i Bonferroniego i określ istotność statystyczną za pomocą dwustronnej wartości p. Wykonaj tyle porównań, ile potrzeba, na przykład lewa ręka kontra środek lub WT kontra mutant.</li>
</ol>

<ol><li>Jones, G., Kleckner, N., Zickler, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Meiosis+through+three+centuries%5BTitle%5D)+AND+%22Chromosoma%22%5BJournal%5D)">Meiosis through three centuries.</a> Chromosoma. 133 (2), 93-115 (2024).</li>
<li>Hassold, T. J., Hunt, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Missed+connections%3A+Recombination+and+human+aneuploidy%5BTitle%5D)+AND+%22Prenat+Diagn%22%5BJournal%5D)">Missed connections: Recombination and human aneuploidy.</a> Prenat Diagn. 41 (5), 584-590 (2021).</li>
<li>Barnes, T. M., Kohara, Y., Coulson, A., Hekimi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Meiotic+recombination%2C+noncoding+DNA+and+genomic+organization+in+caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Meiotic recombination, noncoding DNA and genomic organization in caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 141 (1), 159-179 (1995).</li>
<li>Lim, J. G., Stine, R. R., Yanowitz, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Domain-specific+regulation+of+recombination+in+Caenorhabditis+elegans+in+response+to+temperature%2C+age%2C+and+sex%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Domain-specific regulation of recombination in Caenorhabditis elegans in response to temperature, age, and sex.</a> Genetics. 180 (2), 715-726 (2008).</li>
<li>Rockman, M. V., Kruglyak, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recombinational+landscape+and+population+genomics+of+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Recombinational landscape and population genomics of Caenorhabditis elegans.</a> PLoS Genet. 5 (3), e1000419(2009).</li>
<li>Brenner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genetics+of+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">The genetics of Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 77 (1), 71-94 (1974).</li>
<li>Li, W., Yanowitz, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atm+and+atr+influence+meiotic+crossover+formation+through+antagonistic+and+overlapping+functions+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Atm and atr influence meiotic crossover formation through antagonistic and overlapping functions in Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 212 (2), 431-443 (2019).</li>
<li>Rose, A. M., Baillie, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+temperature+and+parental+age+on+recombination+and+nondisjunction+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">The effect of temperature and parental age on recombination and nondisjunction in Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 92 (2), 409-418 (1979).</li>
<li>Villeneuve, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cis-acting+locus+that+promotes+crossing+over+between+X+chromosomes+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">A cis-acting locus that promotes crossing over between X chromosomes in Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 136 (3), 887-902 (1994).</li>
<li>Youds, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rtel-1+enforces+meiotic+crossover+interference+and+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Rtel-1 enforces meiotic crossover interference and homeostasis.</a> Science. 327 (5970), 1254-1258 (2010).</li>
<li>Emmons, S. W., Yesner, L., Ruan, K. S., Katzenberg, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+a+transposon+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Evidence for a transposon in Caenorhabditis elegans.</a> Cell. 32 (1), 55-65 (1983).</li>
<li>Williams, B. D., Schrank, B., Huynh, C., Shownkeen, R., Waterston, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genetic+mapping+system+in+Caenorhabditis+elegans+based+on+polymorphic+sequence-tagged+sites%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">A genetic mapping system in Caenorhabditis elegans based on polymorphic sequence-tagged sites.</a> Genetics. 131 (3), 609-624 (1992).</li>
<li>Hillers, K. J., Villeneuve, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromosome-wide+control+of+meiotic+crossing+over+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Chromosome-wide control of meiotic crossing over in C. elegans.</a> Curr Biol. 13 (18), 1641-1647 (2003).</li>
<li>Wicks, S. R., Yeh, R. T., Gish, W. R., Waterston, R. H., Plasterk, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+gene+mapping+in+Caenorhabditis+elegans+using+a+high-density+polymorphism+map%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Rapid gene mapping in Caenorhabditis elegans using a high-density polymorphism map.</a> Nat Genet. 28 (2), 160-164 (2001).</li>
<li>Campos, T. L., Korhonen, P. K., Sternberg, P. W., Gasser, R. B., Young, N. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Predicting+gene+essentiality+in+Caenorhabditis+elegans+by+feature+engineering+and+machine-learning%5BTitle%5D)+AND+%22Comput+Struct+Biotechnol+J%22%5BJournal%5D)">Predicting gene essentiality in Caenorhabditis elegans by feature engineering and machine-learning.</a> Comput Struct Biotechnol J. 18, 1093-1102 (2020).</li>
<li>Fay, D., Bender, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Snps%3A+Introduction+and+two-point+mapping%5BTitle%5D)+AND+%22WormBook%22%5BJournal%5D)">Snps: Introduction and two-point mapping.</a> WormBook. , (2008).</li>
<li>Hwang, H. Y., Wang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+genetic+mapping+using+insertion-deletion+polymorphisms+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Fast genetic mapping using insertion-deletion polymorphisms in Caenorhabditis elegans.</a> Sci Rep. 11 (1), 11017(2021).</li>
<li>Davis, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+single+nucleotide+polymorphism+mapping+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Rapid single nucleotide polymorphism mapping in C. elegans.</a> BMC Genomics. 6, 118(2005).</li>
<li>Livak, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Allelic+discrimination+using+fluorogenic+probes+and+the+5%27+nuclease+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Genet+Anal%22%5BJournal%5D)">Allelic discrimination using fluorogenic probes and the 5' nuclease assay.</a> Genet Anal. 14 (5-6), 143-149 (1999).</li>
<li>Li, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+tumor+suppressor+BRCA1-BARD1+complex+localizes+to+the+synaptonemal+complex+and+regulates+recombination+under+meiotic+dysfunction+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">The tumor suppressor BRCA1-BARD1 complex localizes to the synaptonemal complex and regulates recombination under meiotic dysfunction in Caenorhabditis elegans.</a> PLoS Genet. 14 (11), e1007701(2018).</li>
<li>Saito, T. T., Lui, D. Y., Kim, H. M., Meyer, K., Colaiacovo, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interplay+between+structure-specific+endonucleases+for+crossover+control+during+Caenorhabditis+elegans+meiosis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Interplay between structure-specific endonucleases for crossover control during Caenorhabditis elegans meiosis.</a> PLoS Genet. 9 (7), e1003586(2013).</li>
<li>Saito, T. T., Youds, J. L., Boulton, S. J., Colaiacovo, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caenorhabditis+elegans+him-18%2Fslx-4+interacts+with+slx-1+and+xpf-1+and+maintains+genomic+integrity+in+the+germline+by+processing+recombination+intermediates%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Caenorhabditis elegans him-18/slx-4 interacts with slx-1 and xpf-1 and maintains genomic integrity in the germline by processing recombination intermediates.</a> PLoS Genet. 5 (11), e1000735(2009).</li>
<li>Longo, M. C., Berninger, M. S., Hartley, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+uracil+DNA+glycosylase+to+control+carry-over+contamination+in+polymerase+chain+reactions%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Use of uracil DNA glycosylase to control carry-over contamination in polymerase chain reactions.</a> Gene. 93 (1), 125-128 (1990).</li>
<li>Kutyavin, I. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3%27-minor+groove+binder-DNA+probes+increase+sequence+specificity+at+pcr+extension+temperatures%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">3'-minor groove binder-DNA probes increase sequence specificity at pcr extension temperatures.</a> Nucleic Acids Res. 28 (2), 655-661 (2000).</li>
<li>Hammarlund, M., Davis, M. W., Nguyen, H., Dayton, D., Jorgensen, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterozygous+insertions+alter+crossover+distribution+but+allow+crossover+interference+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Heterozygous insertions alter crossover distribution but allow crossover interference in Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 171 (3), 1047-1056 (2005).</li>
<li>Hodgkin, J., Horvitz, H. R., Brenner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nondisjunction+mutants+of+the+nematode+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Nondisjunction mutants of the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 91 (1), 67-94 (1979).</li>
<li>Meneely, P. M., Farago, A. F., Kauffman, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crossover+distribution+and+high+interference+for+both+the+X+chromosome+and+an+autosome+during+oogenesis+and+spermatogenesis+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Crossover distribution and high interference for both the X chromosome and an autosome during oogenesis and spermatogenesis in Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 162 (3), 1169-1177 (2002).</li>
<li>Nabeshima, K., Villeneuve, A. M., Hillers, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromosome-wide+regulation+of+meiotic+crossover+formation+in+Caenorhabditis+elegans+requires+properly+assembled+chromosome+axes%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Chromosome-wide regulation of meiotic crossover formation in Caenorhabditis elegans requires properly assembled chromosome axes.</a> Genetics. 168 (3), 1275-1292 (2004).</li>
<li>Phillips, C. M., Dernburg, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+family+of+zinc-finger+proteins+is+required+for+chromosome-specific+pairing+and+synapsis+during+meiosis+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">A family of zinc-finger proteins is required for chromosome-specific pairing and synapsis during meiosis in C. elegans.</a> Dev Cell. 11 (6), 817-829 (2006).</li>
<li>Mancera, E., Bourgon, R., Brozzi, A., Huber, W., Steinmetz, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+mapping+of+meiotic+crossovers+and+non-crossovers+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">High-resolution mapping of meiotic crossovers and non-crossovers in yeast.</a> Nature. 454 (7203), 479-485 (2008).</li>
<li>Qi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+meiotic+crossovers+and+gene+conversion+by+whole-genome+sequencing+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Characterization of meiotic crossovers and gene conversion by whole-genome sequencing in Saccharomyces cerevisiae.</a> BMC Genomics. 10, 475(2009).</li>
<li>Miller, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+whole-chromosome+analysis+of+meiotic+recombination+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22G3+%28Bethesda%29%22%5BJournal%5D)">A whole-chromosome analysis of meiotic recombination in Drosophila melanogaster.</a> G3 (Bethesda). 2 (2), 249-260 (2012).</li>
<li>Carlton, P. M., Farruggio, A. P., Dernburg, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+link+between+meiotic+prophase+progression+and+crossover+control%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">A link between meiotic prophase progression and crossover control.</a> PLoS Genet. 2 (2), e12(2006).</li>
<li>Tsai, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Meiotic+crossover+number+and+distribution+are+regulated+by+a+dosage+compensation+protein+that+resembles+a+condensin+subunit%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Meiotic crossover number and distribution are regulated by a dosage compensation protein that resembles a condensin subunit.</a> Genes Dev. 22 (2), 194-211 (2008).</li>
<li>Bhalla, N., Wynne, D. J., Jantsch, V., Dernburg, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zhp-3+acts+at+crossovers+to+couple+meiotic+recombination+with+synaptonemal+complex+disassembly+and+bivalent+formation+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Zhp-3 acts at crossovers to couple meiotic recombination with synaptonemal complex disassembly and bivalent formation in C. elegans.</a> PLoS Genet. 4 (10), e1000235(2008).</li>
<li>Yokoo, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cosa-1+reveals+robust+homeostasis+and+separable+licensing+and+reinforcement+steps+governing+meiotic+crossovers%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Cosa-1 reveals robust homeostasis and separable licensing and reinforcement steps governing meiotic crossovers.</a> Cell. 149 (1), 75-87 (2012).</li>
<li>Almanzar, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Meiotic+DNA+exchanges+in+C.+elegans+are+promoted+by+proximity+to+the+synaptonemal+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Life+Sci+Alliance%22%5BJournal%5D)">Meiotic DNA exchanges in C. elegans are promoted by proximity to the synaptonemal complex.</a> Life Sci Alliance. 6 (4), e202301906(2023).</li>
<li>De Los Santos, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mus81%2Fmms4+endonuclease+acts+independently+of+double-holliday+junction+resolution+to+promote+a+distinct+subset+of+crossovers+during+meiosis+in+budding+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">The mus81/mms4 endonuclease acts independently of double-holliday junction resolution to promote a distinct subset of crossovers during meiosis in budding yeast.</a> Genetics. 164 (1), 81-94 (2003).</li>
<li>Saito, T. T., Colaiacovo, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+crossover+frequency+and+distribution+during+meiotic+recombination%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Symp+Quant+Biol%22%5BJournal%5D)">Regulation of crossover frequency and distribution during meiotic recombination.</a> Cold Spring Harb Symp Quant Biol. 82, 223-234 (2017).</li>
<li>Zalevsky, J., Macqueen, A. J., Duffy, J. B., Kemphues, K. J., Villeneuve, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crossing+over+during+Caenorhabditis+elegans+meiosis+requires+a+conserved+mutS-based+pathway+that+is+partially+dispensable+in+budding+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Crossing over during Caenorhabditis elegans meiosis requires a conserved mutS-based pathway that is partially dispensable in budding yeast.</a> Genetics. 153 (3), 1271-1283 (1999).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

W tym miejscu wprowadziliśmy metodę pomiaru częstotliwości i dystrybucji krzyżowania w mejozie C. elegans w oparciu o genotypowanie SNP skrzyżowanych przodków z hybrydy bristolsko-hawajskiej. Podczas gdy konwencjonalna metoda snip-SNP (RFLP) wymaga elektroforezy żelowej po PCR, a detekcja prążków DNA wymaga systemu dokumentacji żelu14,18, genotypowanie SNP za pomocą testu nukleazy 5' przy użyciu PCR w czasie rzeczywistym nie wymaga pracochłonnej procedur...

Powstawanie krzyżówek między chromosomami homologicznymi jest niezbędne do prawidłowej segregacji chromosomów, a także do generowania różnorodności genetycznej1. Błędy w tworzeniu krzyża powodują aneuploidię, która może prowadzić do niepłodności, poronienia i wad wrodzonych2. Częstotliwość krzyżowania różni się w zależności od regionu chromosomu, typu mutacji, wieku i płci, co podkreśla potrzebę dokładnego pomiaru częstotliwości krzyżowania w każdym z tych warunków 3,4,5. Ogólnym celem tej metody jest dokładny pomiar częstotliwości krzyżowania się każdej domeny chromosomowej, a tym samym dokładne określenie rozkładu krzyżówek na całej długości chromosomu C. elegans.
Tradycyjnie, mapowanie dwupunktowe przy użyciu markerów morfologicznych było używane do pomiaru częstotliwości krzyżowania 6,7,8,9,10. U C. elegans fenotypy przysadziste, niskie, grube (Dpy) i nieskoordynowane ruchy (Unc) są często wykorzystywane do tworzenia map chromosomów6. Zaletami tej metody są jej niski koszt i możliwość analizy wielu potomstwa. Do wad tych metod należy ograniczenie wyboru interesujących nas loci oraz brak możliwości wykorzystania letalnych progenii, ponieważ ich fenotypy nie są widoczne. Aby przezwyciężyć niedogodności związane z wyborem miejsca, transpozony Tc1 zostały wykorzystane jako markery dla miejsc znakowanych sekwencją polimorficzną (STS)11,12. Tc1 można wykryć za pomocą PCR i elektroforezy. Podczas gdy standardowy szczep Bristol N2 miał 30 kopii transpozonu Tc1, izolaty C. elegans z Bergerac we Francji (RW7000 i DP13) miały 500 kopii Tc1. W związku z tym liczba i dystrybucja transpozonów Tc1 różni się między izolatami, co służy do analizy chromosomów potomstwa robaków hybrydowych między izolatami metodą PCR. Następnie SNP wykorzystano również do pomiaru częstotliwości i rozkładu krzyżowania13,14. SNP między szczepami Bristol N2 i Hawaiian CB4856 pojawiał się co 1000 pz15,16. SNP są wykrywane jako polimorfizmy długości fragmentów restrykcyjnych (RFLP) za pomocą PCR, trawienia restrykcyjnego i elektroforezy. Ostatnio zaproponowano małe miejsca insercji/delecji (InDel), a także SNP między Bristol N2 a hawajskim CB4856 jako bardziej wydajne markery17. Jednak pomiar częstotliwości krzyżowania za pomocą Tc1, RFLP i InDel wymaga pracochłonnych procesów, takich jak PCR, leczenie enzymami restrykcyjnymi i elektroforeza. Jeśli każdy proces nie zostanie zoptymalizowany w analizie na dużą skalę, wyniki mogą zostać błędnie zinterpretowane ze względu na takie czynniki, jak dokładność PCR, rodzaj zastosowanego enzymu restrykcyjnego, wydajność rozszczepienia DNA oraz przejrzystość i separacja prążków podczas elektroforezy. Natomiast proponowana metoda wykorzystuje genotypowanie SNP za pomocą PCR w czasie rzeczywistym, aby ułatwić dokładną i precyzyjną kwantyfikację.
Krzyżówki nie są losowo rozmieszczone wzdłuż chromosomów. U C. elegans pojedyncze skrzyżowania mają tendencję do częstszego tworzenia się w ramionach i są tłumione w środku 3,5. Dwupunktowe mapowanie morfologiczne nie jest w stanie określić, gdzie występują krzyżówki poza genami markerowymi. I odwrotnie, mapowanie SNP pozwala na zwiększenie liczby markerów i wykazano, że ułatwia określenie dokładnego regionu skrzyżowania wzdłuż całego chromosomu 5,14,18. W tym badaniu wykorzystaliśmy granice domen chromosomalnych zaproponowane przez Rockmana i Kruyglyaka5 i wybraliśmy cztery SNP do analizy: na obu końcach chromosomu i na obu końcach granicy centrum/ramienia.
Korzystając z poprzednich metod, zaproponowaliśmy dokładną i szybką metodę wykrywania SNP za pomocą PCR w czasie rzeczywistym przy użyciu TaqMan, nukleazy 5'19 do pomiaru skrzyżowania między lewym ramieniem, centrum i prawym ramieniem każdego chromosomu. Przewagą naszej metody nad alternatywnymi technologiami, w porównaniu z wcześniejszymi badaniami 20,21,22, jest dokładność i prostota. Metoda ta jest metodą analizy krzyżowej qPCR dla C. elegans i jest szeroko stosowana przez naukowców zajmujących się mejozą.

<table><tbody><tr><td>101-1000&mu; l Końcówka do pipet</td><td>Najlepszy zawodnik</td><td>Numer katalogowy 111-N-Q</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór 0,5 mol/I-EDTA (pH 8,0)</td><td>Teski Nacalai</td><td>14347-21</td><td></td></tr><tr><td>10mol/I-roztwór wodorotlenku sodu</td><td>Teski Nacalai</td><td>94611-45</td><td></td></tr><tr><td>10X Zielony Bufor DreamTaq</td><td>Thermo Fisher Naukowy&nbsp;</td><td>EP0713 powiedział:</td><td></td></tr><tr><td>10&mu; L, długa końcówka, granduated</td><td>FUKAEKASEI, WATSON</td><td>110-207C</td><td></td></tr><tr><td>200&mu; L, końcówka standardowa, z podziałką</td><td>FUKAEKASEI, WATSON</td><td>110-705C</td><td></td></tr><tr><td>Agar w proszku</td><td>Teski Nacalai</td><td>01028-14</td><td></td></tr><tr><td>Agarozy</td><td>PH Japonia</td><td>PH108 powiedział:</td><td></td></tr><tr><td>Autoklaw TOMY model ES-215 Wysokociśnieniowy sterylizator parowy</td><td>TOMY SEIKO</td><td>ES-215</td><td></td></tr><tr><td>Bacto Pepton Enzymatyczne Trawienie Białka</td><td>Thermo Fisher Naukowy&nbsp;</td><td>211677</td><td></td></tr><tr><td>Kwas borowy</td><td>Teski Nacalai</td><td>05215-05</td><td></td></tr><tr><td>Caenorhabditis elegans Bristol typu dzikiego&nbsp;</td><td>Centrum Genetyki Caenorhabditis</td><td>N2</td><td></td></tr><tr><td>Caenorhabditis elegans Hawajski typ dziki</td><td>Centrum Genetyki Caenorhabditis</td><td>Zobacz materiał CB4856</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek wapnia</td><td>Teski Nacalai</td><td>06729-55</td><td></td></tr><tr><td>ccIs4251 [(pSAK2) myo-3p::GFP::LacZ::NLS + (pSAK4) myo-3p::mitochondrialny GFP + dpy-20(+)] I</td><td>Laboratorium Saito</td><td>Zobacz materiał TTS24</td><td>Oryginalnie z PD4251</td></tr><tr><td>Cholesterol</td><td>Teski Nacalai</td><td>08721-62</td><td></td></tr><tr><td>Niestandardowe testy genotypowania TaqMan SNP</td><td>Thermo Fisher Naukowy&nbsp;</td><td>4332077</td><td></td></tr><tr><td>Mieszanina roztworów deoksynukleotydów (dNTP)</td><td>Laboratoria biologiczne w Nowej Anglii</td><td>N04470 powiedział:</td><td></td></tr><tr><td>DigPrint Doc Tablet DP-T130z</td><td>Narzędzia biologiczne</td><td>DP-T130z</td><td></td></tr><tr><td>Wodorofosforan di-potasu</td><td>Teski Nacalai</td><td>28726-05</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop preparacyjny</td><td>Nikon</td><td>SMZ-745 C-DS</td><td></td></tr><tr><td>Polimeraza DNA Dream Taq</td><td>Thermo Fisher Naukowy&nbsp;</td><td>EP0713 powiedział:</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór bromku etydyny</td><td>Teski Nacalai</td><td>14631-94</td><td></td></tr><tr><td>Wstęp do przodu dla WBVar01973670</td><td>Identyfikator IDT</td><td>103988736</td><td>atgtctcacccaaggttgaa powiedział:</td></tr><tr><td>żelatyna</td><td>Teski Nacalai</td><td>166-31</td><td></td></tr><tr><td>Gilson PIPETMAN Klasyczna pipeta</td><td>Thermo Fisher Naukowy&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>IGEPAL CA-630</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>18896</td><td></td></tr><tr><td>Siarczan magnezu siedmiowodny</td><td>Teski Nacalai</td><td>21003-75</td><td></td></tr><tr><td>MicroAmp Optyczny 96-dołkowy talerz reacton</td><td>Thermo Fisher Naukowy&nbsp;</td><td>N8010560</td><td></td></tr><tr><td>Optyczna folia adhedowa MicroAmp</td><td>Thermo Fisher Naukowy&nbsp;</td><td>4311971</td><td></td></tr><tr><td>Wzmacniacz MiniAmp&nbsp; Cykler termiczny</td><td>Thermo Fisher Naukowy&nbsp;</td><td>Wzmacniacz MiniAmp</td><td></td></tr><tr><td>Poziomy system elektroforezy Mini-Sub Cell GT, taca 7 x 10 cm</td><td>Laboratoria Bio-Rad</td><td>1704466</td><td></td></tr><tr><td>Nichipet EXII</td><td>Nichiryo powiedział:</td><td>00-NPX2-2</td><td></td></tr><tr><td>Zasilacz EXII MULTI</td><td>Nichiryo powiedział:</td><td>00-NPM-12VP</td><td></td></tr><tr><td>Pippete Mate NEO</td><td>Nichiryo powiedział:</td><td>00-PMNEO</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek potasu</td><td>Teski Nacalai</td><td>285-38</td><td></td></tr><tr><td>Diwodorofosforan potasu</td><td>Teski Nacalai</td><td>28720-65</td><td></td></tr><tr><td>Proteinaza K</td><td>Thermo Fisher Naukowy&nbsp;</td><td>EO0491 powiedział:</td><td></td></tr><tr><td>System QuantStudio 1 do PCR w czasie rzeczywistym, 96-dołkowy, 0,2 ml</td><td>Thermo Fisher Naukowy&nbsp;</td><td>Numer katalogowy A40426</td><td></td></tr><tr><td>Szybko ładowana fioletowa drabinka DNA 1kb plus</td><td>Laboratoria biologiczne w Nowej Anglii</td><td>N0550S</td><td></td></tr><tr><td>Odwrotny podkład dla WBVar01973670</td><td>Identyfikator IDT</td><td>103988737</td><td>tggctactcctagtcactga powiedział:</td></tr><tr><td>Chlorki sodu</td><td>Teski Nacalai</td><td>31319-45</td><td></td></tr><tr><td>TaqPath ProAmp Master Mix</td><td>Thermo Fisher Naukowy&nbsp;</td><td>A30866 (wersja angielska)</td><td></td></tr><tr><td>Naczynie TC 35, standardowe</td><td>SARSTEDT (w języku angielskim)</td><td>83.3900</td><td></td></tr><tr><td>Tris (hydroksymetylo)aminometan</td><td>Teski Nacalai</td><td>35406-75</td><td></td></tr><tr><td>Baza Trizma</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>&nbsp; T1503-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Animacja 20</td><td>Odczynnik Yoneyama</td><td>03706</td><td></td></tr><tr><td>WormStuff Pick do robaków</td><td>Genesee Scientific</td><td>59-AWP (Język angielski)</td><td></td></tr><tr><td>Końcówki do wybierania robaków WormStuff (90/10% Pt/IR, 30 gauge)</td><td>Genesee Scientific</td><td>59-30PI36</td><td></td></tr></tbody></table>

częstotliwość i dystrybucja krzyżowania się w mejozie caenorhabditis elegans za pomocą genotypowania snp przy użyciu pcr w czasie rzeczywistym

Frequency and Distribution of Crossovers in Caenorhabditis elegans Meiosis by SNP Genotyping using Real-time PCR

Caenorhabditis elegans jest doskonałym organizmem modelowym do badania mejozy. Oprócz ogólnych zalet, takich jak krótki cykl rozrodczy, wiele potomstwa i przezroczyste ciało do obrazowania, istnieje sześć par homologicznych chromosomów holocentrycznych. Istnieje silna interferencja zwrotnicy i regulacja dystrybucji zwrotnicy. Aby zmierzyć częstotliwość krzyżowania, opracowano mapowanie markerów widzialnych, mapowanie snip-SNP oraz kwantyfikację markerów cytologicznych jako prekursorów powstawania krzyżówek. W tym miejscu wprowadzamy zmodyfikowaną metodę genotypowania SNP w celu pomiaru częstotliwości i dystrybucji krzyżowania w oogenezie C. elegans . Ta metoda może pominąć pracochłonne etapy trawienia restrykcyjnego i elektroforezy żelowej oraz uniknąć niejednoznacznej oceny nieprzeciętych prążków DNA. Genotypowanie polimorfizmu pojedynczego nukleotydu (SNP) przeprowadza się przy użyciu hybrydowego szczepu Bristol/Hawaiian. Krzyżowanie hermafrodytów z samcami wykazującymi ekspresję mio-3p::GFP pozwala nam skupić się na oogenezie. Pojedynczy lizat robaka wytwarza wystarczającą matrycę DNA dla wszystkich sześciu chromosomów. Oparte na egzonukleazie 5' sondy chemiczne TaqMan i specyficzne dla SNP spoiwo z małym rowkiem (MGB) pozwalają na precyzyjne wykrywanie SNP przy szybkości genotypowania wynoszącej około 97,7%. Wykorzystujemy dokładną detekcję SNP do pomiaru częstotliwości krzyżowania się u C. elegans. Metoda ta może być również stosowana do określenia częstości krzyżowania u mutantów męskich lub mutantów z wadami krzyżowymi, a także do bardziej szczegółowych interwałów chromosomowych.

Wykryliśmy cztery miejsca SNP na chromosomie II u C. elegans za pomocą testu genotypowania SNP w celu ilościowego określenia tworzenia krzyżówek na całej długości chromosomu, w lewym ramieniu, w regionie centralnym i w prawym ramieniu. Wykrywanie SNP odbywa się zgodnie z instrukcjami producenta. Mieszanka główna zawiera polimerazę DNA Taq, termolabilną uracylo-N-glikozylazę (UNG), dNTP z dUTP i pasywny referencyjny barwnik ROX. Polimeraza DNA Taq jest aktywowana w temperaturze 95 °C, co umożliwia zahamowanie nie...

Protokół ten zapewnia metodę pomiaru częstotliwości i dystrybucji krzyżowania podczas mejozy u Caenorhabditis elegans. Do określenia pochodzenia chromosomów wykorzystano genotypowanie polimorfizmu pojedynczego nukleotydu za pomocą PCR w czasie rzeczywistym. Mapowanie 4-punktowe pozwoliło określić rozkłady krzyżowe regionów lewego, środkowego i prawego ramienia każdego chromosomu.

Częstotliwość i dystrybucja krzyżowania się w mejozie Caenorhabditis elegans za pomocą genotypowania SNP przy użyciu PCR w czasie rzeczywistym

Caenorhabditis elegans is an excellent model organism for studying meiosis. In addition to general advantages, such as a short reproductive cycle, many ...

Nasze badania koncentrują się na regulacji rekombinacji mejotycznej w Caenorhabditis elegans. Pytanie, na które staramy się odpowiedzieć, dotyczy tego, w jaki sposób częstotliwość i dystrybucja krzyżowania są regulowane na poziomie molekularnym podczas mejozy. Genotypowanie SNP jest jedną z podstawowych metod pomiaru częstości krzyżowania się u C. elegans.Jest powszechnie określany jako snip-SNP, w tym PCR, trawienie restrykcyjne i elektroforeza żelowa. Tego rodzaju wieloetapowe podejście do genotypowania SNP jest pracochłonne i czasami niedokładne. Dlatego naszym obecnym wyzwaniem eksperymentalnym jest zmodyfikowanie go w prostą i dokładną metodę.Nasza metoda jest podejściem opartym na qPCR do wykrywania kombinacji wielu zwrotnic. Może być szeroko stosowany w mutantach genetycznych, różnych płciach i różnych ograniczeniach wzrostu. Aby rozpocząć, zdobądź wymagane hermafrodyty do zabiegu.Umieść trzy hermafrodyty w stadium L4 ze szczepu Bristol N2 lub z mutantów na tle Bristolu, wraz z dziewięcioma młodymi dorosłymi hawajskimi samcami CB4856, na płycie godowej. Inkubuj płytkę łączącą przez 1,5 dnia w temperaturze 20 stopni Celsjusza, aby umożliwić krycie między dwoma szczepami. Po inkubacji przenieś każdy hermafrodytę na nową pojedynczą pożywkę wzrostową nicieni wysianą bakteriami OP50.Do drugiej krzyżówki wybierz sześć hermafrodytów skrzyżowanych w stadium L4, które są hybrydami bristolsko-hawajskimi i przenieś je na nową płytkę kojarzeniową wraz z 12 do 15 samcami TTS24 Bristol przenoszącymi układ transgenów ccIs4251. Inkubuj płytkę przez 1,5 dnia w temperaturze 20 stopni Celsjusza, aby umożliwić krycie. Po inkubacji przenieść każdy hermafrodytę na pojedynczą płytkę pożywki wzrostowej nicieni zawierającą OP50.Inkubuj nową płytkę w temperaturze 20 stopni Celsjusza przez jeden dzień, aby umożliwić hermafrodytom złożenie zapłodnionych jaj. Po jednym dniu przenieś każdy hermafrodytę ponownie na nową pojedynczą płytkę z OP50. Sprawdź genotypy robaków rodzicielskich jako hybrydy bristolskie lub hawajskie za pomocą PCR w regionie chromosomu piątego.Oddziel wzmocnione pasma, wykonując elektroforezę na 2,5% żelu agarozowym. Po sprawdzeniu ekspresji GFP wybierz pojedynczego robaka GFP-dodatniego i umieść go w probówce PCR wstępnie załadowanej trzema mikrolitrami buforu do lizy robaków. Następnie umieść probówkę w zamrażarce o temperaturze minus 80 stopni Celsjusza na cztery lub pięć minut przed lizą.W celu lizy ustaw probówkę PCR w termocyklerze i uruchom program w temperaturze 60 stopni Celsjusza przez godzinę, a następnie w temperaturze 95 stopni Celsjusza przez 15 minut. Po cyklu termicznym dodaj 100 mikrolitrów wody wolnej od nukleaz do każdej probówki i dokładnie wymieszaj. Teraz przygotuj mieszaninę zawierającą bufor, sondy i startery.Dokładnie wymieszać roztwór, kilkakrotnie pipetując. Za pomocą 12-kanałowej mikropipety dozować cztery mikrolitry mieszaniny do każdej studzienki 96-dołkowej płytki PCR umieszczonej na podstawie. Następnie dodaj jeden mikrolitr lizatu zawierającego genomowe DNA do każdej studzienki i kilkakrotnie odpipetuj zawartość, aby dokładnie wymieszać.Uszczelnij płytkę optyczną folią samoprzylepną. Użyj aplikatora, aby mocno docisnąć folię, szczególnie wokół krawędzi każdej studzienki. Krótko odwirować zamkniętą płytkę, aby zebrać płyn na dnie i usunąć wszelkie pęcherzyki powietrza.Teraz załaduj płytkę do urządzenia do PCR w czasie rzeczywistym. Na ekranie oprogramowania kliknij przycisk Utwórz nowy eksperyment. Po dostosowaniu ustawień kliknij przycisk uruchom, aby zainicjować protokół.Przejrzyj wykres dyskryminacji alleli wygenerowany na podstawie danych, aby zwizualizować grupowania genotypów. Zidentyfikuj genotypy na podstawie ich pozycji dla homozygot bristolskich, hybryd bristolsko-hawajskich, homozygot hawajskich i kontroli negatywnych. Zwróć uwagę na zastosowane kody kolorystyczne: czerwony dla Bristolu, niebieski dla Hawajów, zielony dla heterozygotycznych i dla kontroli negatywnej.Na koniec zbadaj wzorce SNP, aby zidentyfikować zwrotnice. Na przykład heterozygota bristolsko-hawajska, homozygota bristolska, homozygota bristolska, homozygota bristolska wskazuje na pojedyncze skrzyżowanie między pozycjami pierwszą i drugą. Chromosom drugi został podzielony na trzy regiony, lewe ramię, centrum i prawe ramię, przy użyciu czterech wybranych markerów polimorfizmu pojedynczego nukleotydu.Częstość krzyżowania w lewym ramieniu chromosomu drugiego była znacznie wyższa i wynosiła 23,90 centimorganów w porównaniu z regionem środkowym w wieku 5,80 centimorganów. Częstotliwość skrzyżowania w prawym ramieniu była również znacznie wyższa i wynosiła 19,80 centymorganów w porównaniu z regionem środkowym. Nie zaobserwowano istotnej różnicy między częstotliwościami skrzyżowania lewego i prawego ramienia.

frequency-distribution-crossovers-caenorhabditis-elegans-meiosis-snp

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetyka

Ten film opisuje technikę szybkiego badania pojedynczego nicienia pod kątem markera genetycznego za pomocą badania przesiewowego PCR. W przykładowym protokole przeprowadzamy badania przesiewowe pod kątem edycji genomu opartej na CRISPR.

PCR z pojedynczym robakiem: metoda ekstrakcji i amplifikacji genomowego DNA

Ten protokół opisuje szybką i mało materiałochłonną procedurę integracji transgenicznych układów pozachromosomalnych z genomem Caenorhabditis elegans za pomocą promieniowania ultrafioletowego (UV). Co więcej, protokół ten jest szczególnie odpowiedni dla linii transgenicznych, które przesyłają macierze pozachromosomalne z dużą szybkością.

Szybki protokół integracji macierzy pozachromosomalnych o wysokiej szybkości transmisji z genomem C. elegans

Optogenetyczna mutageneza losowa z wykorzystaniem histonów-miniSOG u C. elegans

Ta metoda pozwala na generowanie tetraploidalnych i triploidalnych nicieni Caenorhabditis z dowolnego szczepu diploidalnego. Szczepy poliploidalne wygenerowane tą metodą zostały wykorzystane do badania interakcji chromosomów w profazie mejotycznej, a metoda ta jest przydatna do badania ważnych podstawowych pytań w biologii komórki, rozwoju, ewolucji i raka.

Manipulacja ploidalnością u Caenorhabditis elegans

Tutaj prezentujemy metodę inżynierii genomu C. elegans przy użyciu rybonukleoprotein CRISPR-Cas9 i szablonów naprawy zależnych od homologii.

Szybki i łatwy proces generowania punktowych mutantów genomowych u C. elegans przy użyciu rybonukleoprotein CRISPR/Cas9

Tutaj prezentujemy szczegółowy protokół identyfikacji zdarzeń rekombinacji homologicznej, które wystąpiły w embrionalnych komórkach macierzystych myszy za pomocą Southern blotting i/lub PCR. Przykładem tej metody jest generowanie modeli myszy zastępujących genetyczną miozynę II bez mięśni przy użyciu tradycyjnej technologii celowania opartej na embrionalnych komórkach macierzystych opartej na rekombinacji homologicznej.

Identyfikacja zdarzeń rekombinacji homologicznej w embrionalnych komórkach macierzystych myszy przy użyciu Southern blotting i reakcji łańcuchowej polimerazy

W tym artykule opisany jest protokół o wysokiej przepustowości do szybkiego i niezawodnego określania poziomów ekspresji genów w pojedynczych lub zbiorczych próbkach C. elegans. Protokół ten nie wymaga izolacji RNA i wytwarza cDNA bezpośrednio z próbek. Może być używany razem z wysokoprzepustowymi, multipleksowanymi, nanofluidycznymi platformami qPCR w czasie rzeczywistym.

Wysokoprzepustowy ilościowy RT-PCR w pojedynczych i masowych próbkach C. elegans przy użyciu technologii nanofluidycznej

Ten protokół może być używany do przeprowadzania badań ekologicznych na dużą skalę nicieni Caenorhabditis. Podstawową zaletą tej metody jest sprawna organizacja i analiza danych ekologicznych i molekularnych związanych z nicieniami zebranymi z natury.

Wysoce skalowalne podejście do przeprowadzania badań ekologicznych nicieni Caenorhabditis

Opisano protokół, który wykorzystuje laserową mikrodysekcję do izolowania pojedynczych tkanek nicieni do sekwencjonowania RNA. Protokół nie wymaga zestawów narzędzi genetycznych specyficznych dla danego gatunku, co pozwala na porównywanie profili ekspresji genów między różnymi gatunkami na poziomie próbek jednotkankowych.

Mikrodysekcja laserowa do zastosowań jednotkankowych niezależnych od gatunku

To jest powszechnie stosowana metoda do sekcji gonad C. elegans, po której następuje pęknięcie zamrażające, która wytwarza próbki linii zarodkowej do immunofluorescencji poprzez barwienie przeciwciał, lub do prostego barwienia DAPI w celu wizualizacji DNA. Protokół ten okazał się skuteczny w przypadku studentów studiów licencjackich w laboratorium badawczym i w ramach badań licencjackich opartych na kursach.

C. elegans (C. elegans) Rozwarstwienie gonad i pęknięcie zamrażające do barwienia immunofluorescencyjnego i DAPI

Przedstawiamy tutaj szybki i prosty protokół ATAC-seq do zaimplementowania w całym robaku Caenorhabditis elegans na etapie L4, używając tylko 30 µL pelletu z dżdżownic.

Analiza dostępności chromatiny w całym Caenorhabditis elegans larw L4

Poznaj metodę qPCR do pomiaru częstotliwości krzyżowania w mejozie Caenorhabditis elegans. Uproszczone genotypowanie SNP zwiększa dokładność badań nad regulacją rekombinacji.

Częstotliwość i dystrybucja krzyżowania się w mejozie Caenorhabditis elegans za pomocą genotypowania SNP przy użyciu PCR w czasie rzeczywistym (Wideo) | JoVE Journal

Częstotliwość i dystrybucja krzyżowania się w mejozie Caenorhabditis elegans za pomocą genotypowania SNP przy użyciu PCR w czasie rzeczywistym

Przeglądaj więcej filmów