Zwalidowany test immunochemiczny do kompleksowego określenia receptora ludzkiego naskórkowego czynnika wzrostu 2 uwalnianego z komórek i związanego z komórkami

Przedstawiamy zwalidowaną kanapkę, ELISA, wykorzystującą nowe przeciwciała monoklonalne, która umożliwia precyzyjną ocenę ilościową związanej i uwolnionej domeny zewnątrzkomórkowej białka HER2 dla komórek hodowanych in vitro i próbek pacjentów.

Protokół odpowiada na potrzebę dokładnego i zwalidowanego testu w celu skorelowania stężenia krążącego białka HER2 z objawami klinicznymi choroby w diagnostyce i badaniach.

Szeroki zakres roboczy testu, różnorodność typów próbek i wiarygodność wyników mogą otworzyć nowe możliwości kompleksowej analizy statusu receptora w modelach in vitro i in vivo.

Opracowany test ELISA zostanie wykorzystany do ilościowego określenia HER2 uwalnianego z tkanek nowotworowych do różnych wydalin z organizmu ludzkiego, takich jak krew, płyny otrzewnowe lub śluz

[Instruktor] Rozpocznij odłączanie komórek za pomocą trypsyny po osiągnięciu 80% zbiegu i zbieraj je do oddzielnej stożkowej rurki o pojemności 15 mililitrów. Po zliczeniu komórek za pomocą automatycznego licznika komórek i zasiewu trzy razy 10 do mocy pięciu komórek na studzienkę na 12-dołkowej płytce z jednym mililitrem pożywki wzrostowej. Inkubuj kulturę w temperaturze 37 stopni Celsjusza w wilgotnej atmosferze zawierającej 5% dwutlenku węgla. Z 24-godzinnej hodowli zebrać pożywkę hodowlaną z jednego dołka każdej linii komórkowej do 1,5 mililitrowej probówki. Odwirować pobrane próbki w temperaturze 10 000 G przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza i przenieść supernatant do nowej probówki w celu przechowywania w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza. Umyj pozostałe komórki w każdej studzience jednym mililitrem zimnego PBS, delikatnie odessać i wyrzucić PBS. Następnie dodaj 200 mikrolitrów buforu RIPA, uzupełnionego 1% inhibitorem proteazy do każdej studzienki i inkubuj przez pięć minut. Teraz zeskrob komórki za pomocą skrobaka do komórek i wymieszaj lizat, pipetując kilka razy w celu homogenizacji. Zbierz zlizowane komórki do nowej probówki i powoli odessaj próbkę do dwumililitrowej strzykawki wyposażonej w igłę o rozmiarze 21 o wymiarach 0,8 na 40 milimetrów. Po zasysaniu od pięciu do 10 razy, odwirować pobrane próbki w temperaturze 10 000 G przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza i przenieść supernatant do nowej probówki w celu przechowywania w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza. Rozcieńczyć przeciwciało wychwytujące anty-HER2 do jednego mikrograma na mililitr w buforze kodującym. Za pomocą pipety wielokanałowej dodać 100 mikrolitrów roztworu przeciwciała wychwytującego do każdej studzienki 96-dołkowej płytki ELISA. Przykryj płytkę folią uszczelniającą. Inkubuj płytkę przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Po całonocnej inkubacji umieścić płytkę w temperaturze pokojowej na poziomej wytrząsarce do mikropłytek na jedną godzinę. Za pomocą myjki do mikropłytek odessać roztwór powlekający i przemyć każdą studzienkę trzykrotnie 300 mikrolitrami PBST. Następnie, za pomocą pipety wielokanałowej, dodaj 100 mikrolitrów buforu blokującego zawierającego 5% odtłuszczonego mleka w proszku w PBS do każdej powlekanej studzienki, aby zablokować niespecyficzne miejsca wiązania. Teraz przygotuj krzywą kalibracyjną i kontrolę dodatnią. Dodaj dwa mikrolitry po jednym miligramie na mililitr, roztwór podstawowy HER2 do 1,998 mikrolitrów PBS, aby uzyskać 1000 nanogramów na mililitr działający standardowo. W przypadku standardu drugiego dodaj 500 mikrolitrów standardowego jednego do 500 mikrolitrów PBS i dokładnie wymieszaj, aby osiągnąć stężenie 50 nanogramów na mililitr. Przygotuj rozcieńczenie szeregowe, aby wygenerować wzorce od trzeciego do siódmego. Następnie należy przygotować próbki matrycy przy użyciu lizatów komórkowych PBS i pożywki hodowlanej wzbogaconej znanymi stężeniami HER2. Rozcieńczone lizaty komórek od jednego do 2000 za pomocą 2,5 mikrolitra lizatu i pięciu mililitrów PBS w celu uzyskania poziomów HER2 poniżej granicy wykrywalności. Aby przygotować roztwór o stężeniu dwóch nanogramów na mililitr, dodaj osiem mikrolitrów standardowego roztworu do 392 mikrolitrów pożywki hodowlanej PBS lub lizatu komórkowego i dokładnie wymieszaj. Za pomocą pipety jednokanałowej dodać 100 mikrolitrów wzorcowej ślepej próby PBS i przetestować próbki, każdą w trzech egzemplarzach, do odpowiednich dołków powlekanej i zablokowanej płytki ELISA. Po godzinie w temperaturze 37 stopni Celsjusza w komorze wilgotnościowej umyj płytkę za pomocą myjki do mikropłytek. Aby wykryć wiązanie przeciwciał, rozcieńczyć biotynylowane przeciwciało wykrywające w PBS do stężenia roboczego jednego mikrograma na mililitr. Następnie, za pomocą pipety wielokanałowej, dodaj 100 mikrolitrów tego wykrywającego roztworu przeciwciał do każdej studzienki. Następnie rozcieńczyć koniugat AVID i HRP od jednego do 40 000 w 40 mililitrach PBST. Za pomocą pipety wielokanałowej dodaj 100 mikrolitrów rozcieńczonego koniugatu do każdej studzienki. Po inkubacji i umyciu płytki za pomocą pipety wielokanałowej dodać 100 mikrolitrów 3,3 5,5 substratu tetrametylobenzydyny do każdej studzienki, aby zainicjować reakcję metryczną barwy. Następnie przykryj płytkę folią uszczelniającą. Inkubuj płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez jedną do pięciu minut, chroniąc ją przed światłem, jednocześnie monitorując rozwój koloru. Po osiągnięciu pożądanej intensywności koloru dodaj 100 mikrolitrów roztworu zatrzymującego do każdej studzienki, aby zakończyć reakcję. Na koniec zmierz absorbancję przy 450 nanometrach za pomocą czytnika mikropłytek. Korzystając z czteroparametrowej krzywej kalibracyjnej, oblicz stężenie próbki na podstawie równania krzywej. Opracowana kanapka, ELISA, wykazała zakres roboczy dla białka HER2 od 1,56 do 100 nanogramów na mililitr, ze współczynnikiem determinacji równym jeden, co wskazuje na doskonałe dopasowanie. Stężenie HER2 w pożywce hodowlanej wzrastało z czasem dla wszystkich badanych linii komórkowych z najwyższymi wartościami po 72 godzinach. Komórki SK-OV-3 i SK-BR-3 wykazywały odpowiednio około dziesięciokrotnie i 50-krotnie wyższe stężenia HER2 w porównaniu z komórkami MDA-MB-231 w pożywce hodowlanej po 24 godzinach. Podobnie, poziomy HER2 w lizatach były około trzykrotnie i pięciokrotnie wyższe odpowiednio dla SK-OV-3 i SK-BR-3. Co ciekawe, pożywka do hodowli komórkowej zawierała 1000 razy niższe stężenia badanego antygenu w porównaniu z białkiem błonowym znajdującym się w lizatach całych komórek.