Name: Zwalidowany test immunochemiczny do kompleksowego określenia receptora ludzkiego naskórkowego czynnika wzrostu 2 uwalnianego z komórek i związanego z komórkami (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-05-09T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 28 s
Description: Poznaj walidowaną metodę ELISA do precyzyjnego oznaczania białka HER2 uwalnianego z komórek i związanego z komórkami. Technika ta umożliwia ilościowe badanie receptora w próbkach klinicznych i wspiera diagnostykę onkologiczną.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Badanie było wspierane przez fundusze z grantu Narodowego Centrum Badań i Rozwoju STRATEGMEDII/269364/5/NCBR/2015 oraz grantu UE, Horyzont 2020 SME Instrument nr 783818.

1. Hodowla ludzkich komórek nowotworowych
<ol>
	<li>Hodować linie MDA-MB-231, SK-BR-3 oraz SK-OV-3 w pożywce Dulbecco's Modified Eagle's zawierającej 4,5 g/L ᴅ-glukozy (DMEM-HG), uzupełnionej o 2 mM ʟ-glutaminy i 10% (v/v) inaktywowanego ciepłem FBS. Inkubować hodowle w temperaturze 37 °C w atmosferze z dodatkiem 5% CO2 w warunkach zwiększonej wilgotności.</li>
	<li>Po osiągnięciu przez hodowlę konfluencji na poziomie ~80%, odseparować komórki poprzez trypsynizację i zebrać je do oddzielnych probówek stożkowych o pojemności 15 mL.</li>
	<li>Policzyć komórki za pomocą automatycznego licznika komórek i zasiać je do eksperymentu na płytki 12-dołkowe w gęstości 3 × 105 komórek na dołek w 1 mL pożywki wzrostowej. Inkubować hodowle w temperaturze 37 °C w atmosferze z dodatkiem 5% CO2 w warunkach zwiększonej wilgotności. 
	UWAGA: Zasiać jeden dołek dla każdego punktu czasowego eksperymentu. Zarówno pożywka po hodowli, jak i lizaty komórkowe zostaną wykorzystane w dalszej analizie.</li>
</ol>
2. Pobieranie i przygotowanie próbek
<ol>
	<li>Z hodowli 24-godzinnej pobrać pożywkę z jednej studni dla każdej linii komórkowej do probówki 1,5 mL.</li>
	<li>Odwirywać pobrane próbki przy 10 000 × g przez 10 min w temperaturze 4 °C. Przenieść supernatant do nowej probówki i przechowywać w temperaturze -20 °C w celu późniejszego oznaczenia poziomu wydzielonego ECD HER2.</li>
	<li>Przemyć pozostałe na płytce komórki 1 mL zimnego PBS, delikatnie odessać i usunąć PBS.</li>
	<li>Do każdej studni dodać 200 µL buforu RIPA (z dodatkiem 1% inhibitora proteaz) i inkubować przez 5 min. Zebrać komórki za pomocą skrobaka komórkowego i wymieszać poprzez kilkukrotne pipetowanie w celu homogenizacji lizatu.</li>
	<li>Zebrać zlizowane komórki do nowej probówki i powoli wciągnąć do strzykawki 2 mL z igłą (G21 / 0,8 mm × 40 mm). Powtórzyć etap aspiracji 5-10 razy, aby dodatkowo rozbić komórki.</li>
	<li>Odwirywać pobrane próbki przy 10 000 x g przez 10 min w temperaturze 4 °C. Przenieść supernatant do nowej probówki i przechowywać w temperaturze -20 °C w celu późniejszego oznaczenia frakcji białka HER2 związanej z komórkami.</li>
	<li>Powtórzyć pobieranie pożywki i materiału komórkowego zgodnie z opisanymi krokami przygotowania dla pozostałych punktów czasowych – 48 h i 72 h hodowli.</li>
</ol>
3. Wykonanie testu ELISA w układzie kanapkowym w celu oznaczenia HER2
<ol>
	<li>Przygotowanie buforów.
	<ol>
		<li>Bufor do powlekania: Przygotować 0,1 M roztwór NaHCO3, rozpuszczając 0,42 g NaHCO3 w 50 mL wody destylowanej i dokładnie mieszając. Doprowadzić pH do wartości 9,6 za pomocą 3 M NaOH.</li>
		<li>Bufor blokujący: Przygotować 5% roztwór odtłuszczonego mleka w proszku (NFDM) w PBS, dodając 0,5 g mleka w proszku do blokowania do 10 mL PBS i dokładnie mieszając.</li>
		<li>Bufor płuczący: Przygotować fosforanowo-solny bufor z Tween 20 (PBST), dodając 0,5 mL 0,05% Tween-20 do 1000 mL PBS i mieszając (unikając nadmiernego pienienia).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Biotynylacja przeciwciała detekcyjnego.
	<ol>
		<li>Biotynylatować 50-200 µg detekcyjnego przeciwciała anty-HER2 (klon 70.21.73.67) przy użyciu komercyjnego zestawu do znakowania biotyną zgodnie z instrukcjami producenta. 
		UWAGA: Niezawodność i powtarzalność procesu biotynylacji opierają się na pomiarze końcowego stężenia białka otrzymanego przeciwciała oraz porównaniu produktu między partiami.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Powlekanie płytki.
	<ol>
		<li>Rozcieńczyć przeciwciało wychwytujące anty-HER2 (klon 70.27.58) do stężenia 1 µg/mL w buforze do powlekania. Do powlekania jednej płytki należy użyć 6,5 mL roztworu przeciwciała wychwytującego.</li>
		<li>Za pomocą pipety wielokanałowej dodać 100 µL roztworu przeciwciała wychwytującego (przygotowanego w kroku 3.3.1) do każdego dołka na 96-dołkowej płytce ELISA. 
		UWAGA: Należy unikać najbardziej zewnętrznych dołków płytki (np. A1, H12), aby zmniejszyć zmienność spowodowaną efektem brzegowym. Zewnętrzne dołki powinny zostać wypełnione wodą destylowaną w celu zapewnienia stabilnych warunków reakcji.</li>
		<li>Przykryć płytkę folią uszczelniającą.</li>
		<li>Inkubować płytkę przez noc (O/N) w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Po inkubacji nocnej pozostawić płytkę w temperaturze pokojowej (RT) na poziomym wstrząsarze do mikro płytek (20-30 obr./min z kątem nachylenia 4°-6°) przez 1 h.</li>
		<li>Za pomocą myjki do mikro płytek odessać roztwór do powlekania i wypłukać płytkę trzy razy buforem płuczącym (3 x 300 µL PBST na dołek).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Blokowanie płytki.
	<ol>
		<li>Za pomocą pipety wielokanałowej dodać 100 µL buforu blokującego (5% NFDM w PBS) do każdego powleczonego dołka w celu zablokowania nieswoistych miejsc wiązania.</li>
		<li>Przykryć płytkę folią uszczelniającą.</li>
		<li>Inkubować płytkę przez 1 h w temperaturze 37 °C w komorze wilgotnościowej.</li>
		<li>Za pomocą myjki do mikro płytek odessać roztwór blokujący i wypłukać płytkę trzy razy buforem płuczącym (3 x 300 µL PBST na dołek).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie krzywej kalibracyjnej i kontroli dodatniej (Rysunek 2).
	<ol>
		<li>Przygotować roboczy roztwór standardowy antygenu HER2, dodając 2 µL roztworu zapasowego o stężeniu 1 mg/mL do 1998 µL PBS, aby uzyskać stężenie HER2 wynoszące 0,001 mg/mL (1000 ng/mL).</li>
		<li>Rozcieńczyć roboczy roztwór standardowy (WSS), dodając 200 µL roztworu do 1800 µL PBS, aby otrzymać roztwór standardowy 1 (STD 1).</li>
		<li>Przygotować kolejne sześć standardów (STD 2-STD 7) poprzez rozcieńczenia seryjne STD 1 w PBS (Rysunek 2).
		<ol>
			<li>STD 2: Dodać 500 µL STD 1 do 500 µL PBS i dokładnie wymieszać, aby przygotować stężenie 50 ng/mL.</li>
			<li>STD 3: Dodać 500 µL STD 2 do 500 µL PBS i dokładnie wymieszać, aby przygotować stężenie 25 ng/mL.</li>
			<li>STD 4: Dodać 500 µL STD 3 do 500 µL PBS i dokładnie wymieszać, aby przygotować stężenie 12,5 ng/mL.</li>
			<li>STD 5: Dodać 500 µL STD 4 do 500 µL PBS i dokładnie wymieszać, aby przygotować stężenie 6,25 ng/mL.</li>
			<li>STD 6: Dodać 500 µL STD 5 do 500 µL PBS i dokładnie wymieszać, aby przygotować stężenie 3,125 ng/mL.</li>
			<li>STD 7: Dodać 500 µL STD 6 do 500 µL PBS i dokładnie wymieszać, aby przygotować stężenie 1,5625 ng/mL.</li>
			<li>STD 8: Dodać 500 µL PBS, aby przygotować stężenie 0 ng/mL.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Kontrola dodatnia: Rozcieńczyć STD 1, dodając 100 µL roztworu STD 1 do 900 µL PBS, aby uzyskać roztwór HER2 o stężeniu białka 10 ng/mL.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie próbek do doświadczeń z odzyskiem (spike and recovery).
	<ol>
		<li>Przygotować próbki matrycy (PBS, lizaty komórkowe i pożywkę hodowlaną) wzbogacone znanym stężeniem białka HER2. Rozcieńczyć lizaty komórkowe 1:2000, dodając 2,5 µL odpowiedniego lizatu komórkowego do 5 mL PBS, aby uzyskać matrycę próbki z poziomem HER2 poniżej LOD metody.</li>
		<li>Do wzbogacania próbek matrycy użyć WSS (1000 ng/mL) oraz STD1 (100 ng/mL).</li>
		<li>Dla każdej matrycy przygotować 6 próbek o stężeniach 0, 2, 5, 10, 30 i 50 ng/mL.</li>
		<li>Aby przygotować 0 ng/mL, dodać 400 µL PBS/pożywki hodowlanej/lizatu komórkowego.</li>
		<li>Aby przygotować 2 ng/mL, dodać 8 µL STD1 do 392 µL PBS/pożywki hodowlanej/lizatu komórkowego i dokładnie wymieszać.</li>
		<li>Aby przygotować 5 ng/mL, dodać 20 µL STD1 do 380 µL PBS/pożywki hodowlanej/lizatu komórkowego i dokładnie wymieszać.</li>
		<li>Aby przygotować 10 ng/mL, dodać 4 µL WSS do 396 µL PBS/pożywki hodowlanej/lizatu komórkowego i dokładnie wymieszać.</li>
		<li>Aby przygotować 30 ng/mL, dodać 12 µL WSS do 388 µL PBS/pożywki hodowlanej/lizatu komórkowego i dokładnie wymieszać.</li>
		<li>Aby przygotować 50 ng/mL, dodać 20 µL WSS do 380 µL PBS/pożywki hodowlanej/lizatu komórkowego i dokładnie wymieszać.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dodanie próbek, ślepej próby i standardów.
	<ol>
		<li>Za pomocą pipety jednokanałowej dodać 100 µL standardów, ślepej próby (PBS) oraz badanych próbek (lizatów komórkowych i pożywki hodowlanej) do odpowiednich dołków. 
		UWAGA: Zaleca się wykonywanie każdej próbki w trzech powtórzeniach.</li>
		<li>Przykryć płytkę folią uszczelniającą.</li>
		<li>Inkubować płytkę przez 1 h w temperaturze 37 °C w komorze wilgotnościowej.</li>
		<li>Za pomocą myjki do mikro płytek odessać roztwór i wypłukać płytkę trzy razy buforem płuczącym (3 x 300 µL PBST na dołek).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Detekcja wiązania przeciwciał.
	<ol>
		<li>Rozcieńczyć biotynilowane przeciwciało detekcyjne (klon 70.21.73.67) w PBS do roboczego stężenia 1 µg/mL. Dla jednej płytki należy użyć 6,5 mL roboczego roztworu przeciwciała detekcyjnego.</li>
		<li>Za pomocą pipety wielokanałowej dodać 100 µL roboczego roztworu przeciwciała detekcyjnego do każdego dołka.</li>
		<li>Przykryć płytkę folią uszczelniającą.</li>
		<li>Inkubować płytkę przez 1 h w temperaturze 37 °C w komorze wilgotnościowej.</li>
		<li>Za pomocą myjki do mikro płytek odessać roztwór i wypłukać płytkę trzy razy buforem płuczącym (3 x 300 µL PBST na dołek).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dodanie koniugatu Awidyna-HRP.
	<ol>
		<li>Rozcieńczyć komercyjnie dostępny koniugat Awidyna-HRP 1:40 000, dodając 1 µL koniugatu enzymatycznego do 40 mL PBST.</li>
		<li>Za pomocą pipety wielokanałowej dodać 100 µL rozcieńczonego koniugatu do każdego dołka.</li>
		<li>Przykryć płytkę folią uszczelniającą.</li>
		<li>Inkubować płytkę przez 1 h w temperaturze 37 °C w komorze wilgotnościowej.</li>
		<li>Za pomocą myjki do mikro płytek odessać roztwór i wypłukać płytkę trzy razy buforem płuczącym (3 x 300 µL PBST na dołek).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Reakcja kolorymetryczna.
	<ol>
		<li>Za pomocą pipety wielokanałowej dodać 100 µL substratu 3,3′,5,5′-Tetrametylobenzydyny (TMB) do każdego dołka.</li>
		<li>Przykryć płytkę folią uszczelniającą.</li>
		<li>Inkubować płytkę przez 1-5 min w temperaturze 37 °C w ciemności, monitorując rozwój barwy.</li>
		<li>Gdy barwa osiągnie oczekiwany poziom, dodać 100 µL roztworu stopującego, aby zakończyć reakcję. 
		UWAGA: Oczekiwany poziom odpowiada intensywnemu niebieskiemu kolorowi w dołkach zawierających próbki o wysokim stężeniu analitycznego.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Pozyskiwanie i analiza danych.
	<ol>
		<li>Zmierzyć absorbancję przy 450 nm za pomocą czytnika mikro płytek.</li>
		<li>Korzystając z 4-parametrycznej krzywej kalibracyjnej, obliczyć stężenie próbek na podstawie równania krzywej.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
<img alt="Schemat procesu ELISA; powlekanie przeciwciałami, blokowanie, inkubacja próbek; mAb a-HER2; detekcja HRP." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68204/68204fig1v5.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Schemat opracowanego przepływu pracy dla testu sandwich ELISA przeciwko HER2. Przegląd kluczowych etapów procedury sandwich ELISA. Obejmują one krytyczne kroki (zaznaczone czerwoną ramką), takie jak powlekanie płytki wychwytującym przeciwciałem anty-HER2 70.27.58, dodanie próbek (standardów krzywej, ślepej próby, próbek eksperymentalnych lizatów komórkowych lub pożywki hodowlanej) oraz wiązanie detekującego przeciwciała anty-HER2 70.21.73.67. Analiza kończy się detekcją sygnału i analizą danych, w której sygnał kolorymetryczny jest kwantyfikowany za pomocą czytnika mikropłytek w celu określenia stężenia docelowego antygenu. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68204/68204fig1v5large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Schemat procesu rozcieńczeń seryjnych, przedstawiający malejące stężenia w ośmiu probówkach." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68204/68204fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Schemat przedstawiający przygotowanie roztworów wzorcowych do krzywej kalibracyjnej. Rozcieńczenia seryjne rekombinowanego białka HER2 są przygotowywane w celu wygenerowania krzywej kalibracyjnej w zakresie stężeń 1,56-100 ng/mL (fiolki STD 1-STD 7). Dodatkowo dołączono próbkę kontrolną ujemną bez białka HER2 (STD 8). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68204/68204fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>

<ol><li>Subbiah, V., Kurzrock, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Debunking+the+delusion+that+precision+oncology+is+an+illusion%5BTitle%5D)+AND+%22Oncologist%22%5BJournal%5D)">Debunking the delusion that precision oncology is an illusion.</a> Oncologist. 22 (8), 881-882 (2017).</li>
<li>Swain, S. M., Shastry, M., Hamilton, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+HER2positive+breast+cancer%3A+advances+and+future+directions%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">Targeting HER2positive breast cancer: advances and future directions.</a> Nat Rev Drug Discov. 22 (2), 101-126 (2023).</li>
<li>McLemore, L. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HER2+testing+in+breast+cancers%3A+comparison+of+assays+and+interpretation+using+ASCO%2FCAP+2013+and+2018+guidelines%5BTitle%5D)+AND+%22Breast+Cancer+Res+Treat%22%5BJournal%5D)">HER2 testing in breast cancers: comparison of assays and interpretation using ASCO/CAP 2013 and 2018 guidelines.</a> Breast Cancer Res Treat. 187 (1), 95-104 (2021).</li>
<li>Iqbal, N., Iqbal, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+epidermal+growth+factor+receptor+2+%28HER2%29+in+cancers%3A+overexpression+and+therapeutic+implications%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Int%22%5BJournal%5D)">Human epidermal growth factor receptor 2 (HER2) in cancers: overexpression and therapeutic implications.</a> Mol Biol Int. 2014, 852748(2014).</li>
<li>Tsé, C., Gauchez, A. S., Jacot, W., Lamy, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HER2+shedding+and+serum+HER2+extracellular+domain%3A+biology+and+clinical+utility+in+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Treat+Rev%22%5BJournal%5D)">HER2 shedding and serum HER2 extracellular domain: biology and clinical utility in breast cancer.</a> Cancer Treat Rev. 38 (2), 133-142 (2012).</li>
<li>Reix, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+prospective+study+to+assess+the+clinical+utility+of+serum+HER2+extracellular+domain+in+breast+cancer+with+HER2+overexpression%5BTitle%5D)+AND+%22Breast+Cancer+Res+Treat%22%5BJournal%5D)">A prospective study to assess the clinical utility of serum HER2 extracellular domain in breast cancer with HER2 overexpression.</a> Breast Cancer Res Treat. 160 (2), 249-259 (2016).</li>
<li>Di Gioia, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serum+HER2+supports+HER2testing+in+tissue+at+the+time+of+primary+diagnosis+of+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Chim+Acta%22%5BJournal%5D)">Serum HER2 supports HER2testing in tissue at the time of primary diagnosis of breast cancer.</a> Clin Chim Acta. 430, 86-91 (2014).</li>
<li>Carney, W. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+the+circulating+levels+of+the+HER2%2Fneu+oncoprotein+in+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Breast+Cancer%22%5BJournal%5D)">Monitoring the circulating levels of the HER2/neu oncoprotein in breast cancer.</a> Clin Breast Cancer. 5 (2), 105-116 (2004).</li>
<li>Azar, F. P., Fatemeh, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Value+of+serum+human+epidermal+growth+factor+receptor+2+%28HER2%29%2Fneu+testing+in+breast+cancer+patients+to+maximize+detection+of+HER2%2Fneupositive+patients+and+susceptibility+to+trastuzumab%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Biochem%22%5BJournal%5D)">Value of serum human epidermal growth factor receptor 2 (HER2)/neu testing in breast cancer patients to maximize detection of HER2/neupositive patients and susceptibility to trastuzumab.</a> Clin Biochem. 44 (13), (2011).</li>
<li>Pandey, I., Misra, V., Pandey, A., Verma, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+HER2%2Fneu+in+gastric+adenocarcinoma+and+its+correlation+with+serum+HER2%2Fneu+level+and+Ecadherin+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Indian+J+Pathol+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Expression of HER2/neu in gastric adenocarcinoma and its correlation with serum HER2/neu level and Ecadherin expression.</a> Indian J Pathol Microbiol. 65 (1), 35-41 (2022).</li>
<li>Agnon, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ELISA+assay+employing+epitopespecific+monoclonal+antibodies+to+quantify+circulating+HER2+with+potential+application+in+monitoring+cancer+patients+undergoing+therapy+with+trastuzumab%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">ELISA assay employing epitopespecific monoclonal antibodies to quantify circulating HER2 with potential application in monitoring cancer patients undergoing therapy with trastuzumab.</a> Sci Rep. 10 (1), 3016(2020).</li>
<li>Antos, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+unique+monoclonal+antibodies+and+immunochemical+assay+for+comprehensive+determination+of+the+cellbound+and+soluble+HER2+in+different+biological+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">The unique monoclonal antibodies and immunochemical assay for comprehensive determination of the cellbound and soluble HER2 in different biological samples.</a> Sci Rep. 14 (1), 3978(2024).</li>
<li>Andreasson, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+practical+guide+to+immunoassay+method+validation%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Neurol%22%5BJournal%5D)">A practical guide to immunoassay method validation.</a> Front Neurol. 6, 179(2015).</li>
<li>Perrier, A., Gligorov, J., Lefèvre, G., Boissan, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+extracellular+domain+of+HER2+in+serum+as+a+biomarker+of+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Invest%22%5BJournal%5D)">The extracellular domain of HER2 in serum as a biomarker of breast cancer.</a> Lab Invest. 98 (6), 696-707 (2018).</li>
<li>Van Gorkom, T., van Arkel, G. H. J., Voet, W., Thijsen, S. F. T., Kremer, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Consequences+of+the+edge+effect+in+a+commercial+enzymelinked+immunosorbent+assay+for+the+diagnosis+of+Lyme+neuroborreliosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Consequences of the edge effect in a commercial enzymelinked immunosorbent assay for the diagnosis of Lyme neuroborreliosis.</a> J Clin Microbiol. 59 (8), e0328020(2021).</li>
<li>Sadok, I., Rachwał, K., Staniszewska, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+quantification+of+selected+kynurenines+analyzed+by+liquid+chromatographymass+spectrometry+in+medium+collected+from+cancer+cell+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Simultaneous quantification of selected kynurenines analyzed by liquid chromatographymass spectrometry in medium collected from cancer cell cultures.</a> J Vis Exp. 159, e61031(2020).</li>
<li>Giordani, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+changing+patterns+in+HER2+addiction+by+liquid+biopsy+in+advanced+breast+cancer+patients%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Clin+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Monitoring changing patterns in HER2 addiction by liquid biopsy in advanced breast cancer patients.</a> J Exp Clin Cancer Res. 43 (1), 182(2024).</li>
<li>Wu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+and+monitoring+HER2+expression+in+breast+cancer+during+trastuzumab+therapy+with+a+peptide+probe+99mTcHYNICH10F%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Nucl+Med+Mol+Imaging%22%5BJournal%5D)">Imaging and monitoring HER2 expression in breast cancer during trastuzumab therapy with a peptide probe 99mTcHYNICH10F.</a> Eur J Nucl Med Mol Imaging. 47 (11), 2613-2623 (2020).</li>
<li>NinioMany, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((miR125a+induces+HER2+expression+and+sensitivity+to+trastuzumab+in+triplenegative+breast+cancer+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Oncol%22%5BJournal%5D)">miR125a induces HER2 expression and sensitivity to trastuzumab in triplenegative breast cancer lines.</a> Front Oncol. 10, 191(2020).</li>
</ol>

D.L., A.A., A.M., M.S. deklarują wsparcie finansowe ze strony SDS Optic S.A.; A.A, A.M., M.S. deklarują akcjonariat SDS Optic S.A.

Wśród krytycznych elementów w konstruowaniu testu ELISA typu sandwich znajdują się przeciwciała wychwytujące, które są unieruchomione na płytce i przyczyniają się do swoistości i czułości testu. W prezentowanym teście wykorzystaliśmy jako przeciwciało wychwytujące nowe białko monoklonalne (HER2/70.27.58) wygenerowane i scharakteryzowane we własnym zakresie. Przeciwciało miało unikalną sekwencję CDR (region określający komplementarność) i w oparciu o powinowactwo prezentowało czułość ED50 przy 0,0922 nM1...

Sukces nowoczesnych terapii często odnosi się do medycyny precyzyjnej, która opiera się na dokładnej identyfikacji pacjentów wrażliwych na terapię1. Wśród tych terapii znajdują się leki anty-HER2 ukierunkowane na receptor z nadekspresją na różnych nowotworach, w tym piersi, endometrium, żołądka, płuc i innych. Dostępnych jest kilka leków ukierunkowanych na HER2 z potwierdzonymi korzyściami u pacjentów z nowotworami HER2-dodatnimi, w tym HER2-low type2. Potwierdzenie statusu HER2-dodatniego ma kluczowe znaczenie dla identyfikacji potencjalnych pacjentów, którzy odpowiedzieli na leczenie; Pozostaje jednak wyzwaniem, zwłaszcza w grupie HER2-low.
Złoty standard metod w warunkach klinicznych, rutynowo stosowanych do testowania HER2, obejmuje immunohistochemiczną (IHC) ekspresję białka i amplifikację genu HER2 metodą fluorescencji in situ (FISH). Dodatkowo test Oncotype DX służy do ekspresji mRNA HER2. Biopsja tkanek wymagana w przypadku tych metod sprawia, że określenie kwalifikacji pacjenta do odpowiedniego leczenia i jego potencjalnej odpowiedzi na leczenie jest niepewne. Pomimo zaktualizowanych wytycznych Amerykańskiego Towarzystwa Onkologii Klinicznej (ASCO) i College of American Pathologists (CAP) z 2018 r. w celu zmniejszenia zmienności między jednostkami testowymi, zgodność HER2 pozostaje przedmiotem poprawy3.
HER2 jest protoonkogenem należącym do rodziny receptorów naskórkowego czynnika wzrostu (EGFR), którego nadekspresja i aktywacja w stanach patologicznych prowadzi do agresywnego wyniku lub przyczynia się do złego rokowania4. HER2 jest białkiem modułowym o masie 185 kDa zakotwiczonym w błonie komórkowej, które zawiera cytoplazmatyczną kinazę tyrozynową i domenę zewnątrzkomórkową (ECD). HER2 ECD może być wydalany z komórek, aby zostać uwolniony do macierzy zewnątrzkomórkowej5 jako białko wolne od komórek, dalej krążące we krwi. Zwiększona ekspresja HER2 może być odzwierciedlona przez wyższy poziom krążącego ECD, co stanowi cenny marker predykcyjny i prognostyczny 6,7, zastępczy marker odpowiedzi na leczenie8, lub jako metoda uzupełniająca IHC w celu identyfikacji pacjentów kwalifikujących się do leczenia anty-HER29. Wyzwaniem pozostaje jednak ustalenie korelacji między ekspresją HER2 w guzie a ogólnoustrojowym poziomem receptora we krwi, który mógłby mieć znaczenie kliniczne.
Uwolniony HER2 ECD może być określony ilościowo za pomocą testu immunoenzymatycznego (ELISA)10. Test ELISA kanapkowy to podejście, które wykorzystuje dwa specyficzne przeciwciała wiążące różne epitopy na tym samym antygenie docelowym. Umożliwia dokładny pomiar rozpuszczonych białek w łatwo dostępnym materiale biologicznym na bazie krwi i płynu (tzw. płynna biopsja). Pomimo obecności testów zatwierdzonych przez Agencję ds. Żywności i Leków (FDA), istnieją kontrowersje co do użyteczności diagnostyki HER2 ECD5 oraz wartości granicznej dla podwyższonego poziomu HER2 we krwi. Potrzebne są dalsze badania z wykorzystaniem zwalidowanych metod i jednolicie akceptowanych progów, aby potwierdzić stosowalność testów11.
Kluczowymi składnikami każdego testu ELISA są wychwytywanie (unieruchomienie na płytce i określenie specyficzności i czułości testu) oraz wykrywanie przeciwciał (dodanych po nałożeniu próbek) przeciwciała (<silna klasa="xfig">Rysunek 1). W niniejszym raporcie przedstawiamy protokół ELISA oparty na niedawno opracowanych nowych przeciwciałach monoklonalnych (mAb) anty-HER2 ECD, które zostały wygenerowane, oczyszczone na kolumnie powinowactwa i dokładnie scharakteryzowane, oraz prezentują unikalne sekwencje12. Opracowany test ELISA, który wykorzystuje te niestandardowe przeciwciała, wykazuje swoją przydatność do dokładnej kwantyfikacji białka HER2 związanego z błoną komórkową i uwalnianego do pożywki hodowlanej w celu kompleksowej oceny statusu receptora. Test może być wykorzystany w testach przedklinicznych oraz do wspierania trwających badań. Wydajność testu została następnie przetestowana na próbkach biologicznych różnego pochodzenia, w tym na homogenatach surowicy i tkanki12, aby pokazać potencjał w rozwoju badań, diagnostyki i nowatorskich metod leczenia anty-HER2 w przyszłości.

<table><tbody><tr><td>Zestaw do etykietowania biotyny-NH2</td><td>Abnova</td><td>KA0003</td><td></td></tr><tr><td>Blotting Grade, mleko w proszku, o niskiej zawartości tłuszczu</td><td>Roth</td><td>T145.1</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka do liczenia komórek do licznika komórek TC10/TC20, dwukomorowe</td><td>Bio-Rad</td><td>145-0011</td><td></td></tr><tr><td>Płytki do hodowli komórkowych</td><td>Biologix</td><td>07-6012</td><td></td></tr><tr><td>Skrobaki do komórek</td><td>Biologix</td><td>70-1250</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka</td><td>Ohaus</td><td>30130868</td><td></td></tr><tr><td>Szafa bezpieczeństwa biologicznego klasy II - Telstar Bio II Advance 6</td><td>Telstar</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Przezroczyste 96-dołkowe płytki płaskodenne</td><td>Termo Fisher</td><td>442404</td><td></td></tr><tr><td>Bezpieczne dla kultur inkubatory CO2 - Touch 190S</td><td>Leec</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Sultlenek dimetylu&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>DMEM - wysoka glukoza</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D0822</td><td></td></tr><tr><td>Czytnik płytek ELISA</td><td>BioTek</td><td>800TSUVI</td> FBS Standard, płodowa <td></td></tr><tr><td>surowica bydlęca</td><td>PAN Biotech</td><td>P30-19375</td><td></td></tr><tr><td>Suszarka laboratoryjna z wymuszonym obiegiem</td><td>BINDER</td><td>9090-0018</td><td></td></tr><tr><td>HRP-Avidin</td><td>Thermo Fisher</td><td>43-4423</td><td></td></tr><tr><td>Ludzkie białko Her2 / ErbB2, Fc Tag, premium klasa</td><td>AcroBIOSYSTEMS</td><td>HER2-H5253</td><td></td></tr><tr><td>Myjka mikropłytkowa do mycia immunologicznego</td><td>Bio-Rad</td><td>170-7009</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór L-glutaminy</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G7513</td><td></td></tr><tr><td>mAb a-HER2 (klon 70.21.73.67)</td><td>SDS Optic</td><td>BIO-ABH-2</td><td></td></tr><tr><td>mAb a-HER2 (klon 70.27.58)</td><td>SDS Optic</td><td>BIO-ABH-1</td><td></td></tr><tr><td>MDA-MB-231 Linia komórkowa</td><td>ATCC</td><td>HTB-26</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>POCH</td><td>810530115</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>POCH</td><td>BA0981118</td><td></td></tr><tr><td>Koktajl inhibitorów proteazy</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P8340</td><td></td></tr><tr><td>Bufor RIPA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>R0278</td><td></td></tr><tr><td>ROTI Fair PBS</td><td>Roth</td><td>1111.2</td><td></td></tr><tr><td>SK-BR-3 [SKBR3] Linia komórkowa</td><td>ATCC</td><td>HTB-30</td><td></td></tr><tr><td>SK-OV-3 [SKOV-3; SKOV3] Linia komórkowa</td><td>ATCC</td><td>HTB-77</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór zatrzymujący 1x</td><td>Abcam</td><td>ab210900</td><td></td></tr><tr><td>TC20 Automatyczny licznik komórek</td><td>Bio-rad</td><td>1450102</td><td></td></tr><tr><td>podłoże TMB 1x</td><td>Abcam</td><td>ab210902</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P9416</td><td></td></tr><tr><td>Vortex</td><td>Ohaus</td><td>30392117</td><td></td></tr><tr><td>Wytrząsarka o ruchu falowym</td><td>Ohaus</td><td>30391968</td><td></td></tr></tbody></table>

zwalidowany test immunochemiczny do kompleksowego określenia receptora ludzkiego naskórkowego czynnika wzrostu 2 uwalnianego z komórek i związanego z komórkami

Validated Immunochemical Assay for Comprehensive Determination of the Human Epidermal Growth Factor Receptor 2 Released from and Bound to Cells

Receptor ludzkiego naskórkowego czynnika wzrostu 2 (HER2) jest dobrze znanym markerem raka. Stał się bardzo skutecznym celem diagnostycznym i terapeutycznym, zwłaszcza w przypadku raka piersi i innych typów nowotworów wykazujących ekspresję HER2. W klinice stosuje się złoty standard immunohistochemicznych metod diagnostycznych wykorzystujących swoiste przeciwciała anty-HER2 do pomiaru poziomu ekspresji receptora związanego z błoną. Rozpuszczalna domena zewnątrzkomórkowa (ECD) HER2, która jest uwalniana z komórek wykazujących nadekspresję, krąży we krwi i może odzwierciedlać ekspresję tkankową receptora. Istnieje potrzeba dokładnych i zwalidowanych testów w celu skorelowania stężenia krążącego białka HER2 z objawami klinicznymi choroby.
Nasz zespół opracował i zatwierdził nowatorski test immunoenzymatyczny (ELISA) do ilościowego oznaczania domeny ECD HER2 związanej z błoną i uwolnionej z komórek. W teście wykorzystuje się dwa unikalne przeciwciała monoklonalne specyficzne dla HER2 opracowane wcześniej. Zakres ilościowy obejmuje stężenie HER2 od 1,56-100 ng/ml, które jest oczekiwane dla komórek nowotworowych hodowanych in vitro i wykazuje czułość na poziomie 0,5 ng/ml. Zadowalająca precyzja i dokładność testu wewnątrz- i międzytestowego oraz dokładność sprawiają, że ma ona zastosowanie do oznaczania ilościowego HER2 w różnych typach próbek biologicznych, w tym w pożywce do hodowli komórkowych, surowicy i tkance guza stałego. W tym miejscu skupiamy się na kompleksowym określeniu receptorów związanych i wydzielanych przez komórki nowotworowe hodowane in vitro. W pracy przedstawiono krok po kroku protokół oznaczania ilościowego białka HER2, który można wykorzystać do badania różnych linii komórkowych, krwi i tkanek.

Walidacja testu ELISA typu sandwich 
Nowo opracowany test wymaga procedury walidacyjnej. Ważne parametry walidacji obejmują liniowość, precyzję oraz granice wykrywalności, tj. dolną granicę wykrywalności (LLOD) oraz górną granicę wykrywalności. W poprzedniej publikacji przeprowadziliśmy dokładną walidację metody. Liniowość testu ELISA została sprawdzona przy użyciu próbek pozornych dla niskich (2, 5, 10 ng/mL), średnio wysokich (30 ng/mL) oraz znacznie zwiększonych (50 ng/mL) stężeń antygenu rozcieńcz...

Prezentujemy zwalidowany test ELISA z użyciem nowych przeciwciał monoklonalnych anty-HER2. Test ten umożliwia precyzyjne określenie ilościowe związanego z komórkami i uwolnionego białka HER2 z komórek hodowanych in vitro i innych próbek, w tym krwi i tkanek.

Zwalidowany test immunochemiczny do kompleksowego określenia receptora ludzkiego naskórkowego czynnika wzrostu 2 uwalnianego z komórek i związanego z komórkami

Human epidermal growth factor receptor 2 (HER2) is a well-established cancer marker. It became a very successful diagnostic and therapeutic target, ...

Przedstawiamy zwalidowaną kanapkę, ELISA, wykorzystującą nowe przeciwciała monoklonalne, która umożliwia precyzyjną ocenę ilościową związanej i uwolnionej domeny zewnątrzkomórkowej białka HER2 dla komórek hodowanych in vitro i próbek pacjentów.Protokół odpowiada na potrzebę dokładnego i zwalidowanego testu w celu skorelowania stężenia krążącego białka HER2 z objawami klinicznymi choroby w diagnostyce i badaniach.Szeroki zakres roboczy testu, różnorodność typów próbek i wiarygodność wyników mogą otworzyć nowe możliwości kompleksowej analizy statusu receptora w modelach in vitro i in vivo.Opracowany test ELISA zostanie wykorzystany do ilościowego określenia HER2 uwalnianego z tkanek nowotworowych do różnych wydalin z organizmu ludzkiego, takich jak krew, płyny otrzewnowe lub śluz.[Instruktor] Rozpocznij odłączanie komórek za pomocą trypsyny po osiągnięciu 80% zbiegu i zbieraj je do oddzielnej stożkowej rurki o pojemności 15 mililitrów. Po zliczeniu komórek za pomocą automatycznego licznika komórek i zasiewu trzy razy 10 do mocy pięciu komórek na studzienkę na 12-dołkowej płytce z jednym mililitrem pożywki wzrostowej. Inkubuj kulturę w temperaturze 37 stopni Celsjusza w wilgotnej atmosferze zawierającej 5% dwutlenku węgla. Z 24-godzinnej hodowli zebrać pożywkę hodowlaną z jednego dołka każdej linii komórkowej do 1,5 mililitrowej probówki. Odwirować pobrane próbki w temperaturze 10 000 G przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza i przenieść supernatant do nowej probówki w celu przechowywania w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza. Umyj pozostałe komórki w każdej studzience jednym mililitrem zimnego PBS, delikatnie odessać i wyrzucić PBS. Następnie dodaj 200 mikrolitrów buforu RIPA, uzupełnionego 1% inhibitorem proteazy do każdej studzienki i inkubuj przez pięć minut. Teraz zeskrob komórki za pomocą skrobaka do komórek i wymieszaj lizat, pipetując kilka razy w celu homogenizacji. Zbierz zlizowane komórki do nowej probówki i powoli odessaj próbkę do dwumililitrowej strzykawki wyposażonej w igłę o rozmiarze 21 o wymiarach 0,8 na 40 milimetrów. Po zasysaniu od pięciu do 10 razy, odwirować pobrane próbki w temperaturze 10 000 G przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza i przenieść supernatant do nowej probówki w celu przechowywania w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza. Rozcieńczyć przeciwciało wychwytujące anty-HER2 do jednego mikrograma na mililitr w buforze kodującym. Za pomocą pipety wielokanałowej dodać 100 mikrolitrów roztworu przeciwciała wychwytującego do każdej studzienki 96-dołkowej płytki ELISA. Przykryj płytkę folią uszczelniającą. Inkubuj płytkę przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Po całonocnej inkubacji umieścić płytkę w temperaturze pokojowej na poziomej wytrząsarce do mikropłytek na jedną godzinę. Za pomocą myjki do mikropłytek odessać roztwór powlekający i przemyć każdą studzienkę trzykrotnie 300 mikrolitrami PBST. Następnie, za pomocą pipety wielokanałowej, dodaj 100 mikrolitrów buforu blokującego zawierającego 5% odtłuszczonego mleka w proszku w PBS do każdej powlekanej studzienki, aby zablokować niespecyficzne miejsca wiązania. Teraz przygotuj krzywą kalibracyjną i kontrolę dodatnią. Dodaj dwa mikrolitry po jednym miligramie na mililitr, roztwór podstawowy HER2 do 1,998 mikrolitrów PBS, aby uzyskać 1000 nanogramów na mililitr działający standardowo. W przypadku standardu drugiego dodaj 500 mikrolitrów standardowego jednego do 500 mikrolitrów PBS i dokładnie wymieszaj, aby osiągnąć stężenie 50 nanogramów na mililitr. Przygotuj rozcieńczenie szeregowe, aby wygenerować wzorce od trzeciego do siódmego. Następnie należy przygotować próbki matrycy przy użyciu lizatów komórkowych PBS i pożywki hodowlanej wzbogaconej znanymi stężeniami HER2. Rozcieńczone lizaty komórek od jednego do 2000 za pomocą 2,5 mikrolitra lizatu i pięciu mililitrów PBS w celu uzyskania poziomów HER2 poniżej granicy wykrywalności. Aby przygotować roztwór o stężeniu dwóch nanogramów na mililitr, dodaj osiem mikrolitrów standardowego roztworu do 392 mikrolitrów pożywki hodowlanej PBS lub lizatu komórkowego i dokładnie wymieszaj. Za pomocą pipety jednokanałowej dodać 100 mikrolitrów wzorcowej ślepej próby PBS i przetestować próbki, każdą w trzech egzemplarzach, do odpowiednich dołków powlekanej i zablokowanej płytki ELISA. Po godzinie w temperaturze 37 stopni Celsjusza w komorze wilgotnościowej umyj płytkę za pomocą myjki do mikropłytek. Aby wykryć wiązanie przeciwciał, rozcieńczyć biotynylowane przeciwciało wykrywające w PBS do stężenia roboczego jednego mikrograma na mililitr. Następnie, za pomocą pipety wielokanałowej, dodaj 100 mikrolitrów tego wykrywającego roztworu przeciwciał do każdej studzienki. Następnie rozcieńczyć koniugat AVID i HRP od jednego do 40 000 w 40 mililitrach PBST. Za pomocą pipety wielokanałowej dodaj 100 mikrolitrów rozcieńczonego koniugatu do każdej studzienki. Po inkubacji i umyciu płytki za pomocą pipety wielokanałowej dodać 100 mikrolitrów 3,3 5,5 substratu tetrametylobenzydyny do każdej studzienki, aby zainicjować reakcję metryczną barwy. Następnie przykryj płytkę folią uszczelniającą. Inkubuj płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez jedną do pięciu minut, chroniąc ją przed światłem, jednocześnie monitorując rozwój koloru. Po osiągnięciu pożądanej intensywności koloru dodaj 100 mikrolitrów roztworu zatrzymującego do każdej studzienki, aby zakończyć reakcję. Na koniec zmierz absorbancję przy 450 nanometrach za pomocą czytnika mikropłytek. Korzystając z czteroparametrowej krzywej kalibracyjnej, oblicz stężenie próbki na podstawie równania krzywej. Opracowana kanapka, ELISA, wykazała zakres roboczy dla białka HER2 od 1,56 do 100 nanogramów na mililitr, ze współczynnikiem determinacji równym jeden, co wskazuje na doskonałe dopasowanie. Stężenie HER2 w pożywce hodowlanej wzrastało z czasem dla wszystkich badanych linii komórkowych z najwyższymi wartościami po 72 godzinach. Komórki SK-OV-3 i SK-BR-3 wykazywały odpowiednio około dziesięciokrotnie i 50-krotnie wyższe stężenia HER2 w porównaniu z komórkami MDA-MB-231 w pożywce hodowlanej po 24 godzinach. Podobnie, poziomy HER2 w lizatach były około trzykrotnie i pięciokrotnie wyższe odpowiednio dla SK-OV-3 i SK-BR-3. Co ciekawe, pożywka do hodowli komórkowej zawierała 1000 razy niższe stężenia badanego antygenu w porównaniu z białkiem błonowym znajdującym się w lizatach całych komórek.

validated-immunochemical-assay-for-comprehensive-determination-human

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Badania nad rakiem

Test uwalniania chromu, powszechnie stosowana metoda wykrywania aktywności cytotoksycznych limfocytów T, posiada kilka ograniczeń. W niniejszym artykule, wykorzystując antygenowo specyficzne limfocyty T CD8 oraz linię komórkową raka piersi u ludzi SKBR3, zbadano podejście oparte na impedancji pod kątem zdolności do wykrywania śmierci komórek.

Wyznaczenie optymalnej aktywności cytotoksycznej ludzkich limfocytów T CD8 specyficznych dla Her2neu poprzez porównanie testu uwalniania Cr51 z systemem xCELLigence

W ostatnich latach testy oparte na żywych komórkach były z powodzeniem wykorzystywane do wykrywania przeciwciał przeciwko antygenom powierzchniowym i konformacyjnym. W tym miejscu opisano metodę wykorzystującą wysokoprzepustową cytometrię przepływową, umożliwiającą analizę dużych kohort pacjentów. Wykrycie nowych przeciwciał poprawi diagnostykę i leczenie zaburzeń o podłożu immunologicznym.

Wysokoprzepustowy test cytometrii przepływowej oparty na komórkach do wykrywania przeciwciał przeciwko receptorowi N-metylo-D-asparaginianu lub receptorowi dopaminy-2 w ludzkiej surowicy

Ten protokół opisuje znakowanie receptora naskórkowego czynnika wzrostu (EGFR) na komórkach fibroblastów COS7, a następnie korelacyjną mikroskopię świetlną i elektronową całych komórek w stanie uwodnionym. Etykieta zawierała fluorescencyjne kropki kwantowe. Protokół może być wykorzystany do badania stechiometrii EGFR na poziomie pojedynczej cząsteczki.

Badanie stechiometrii receptora naskórkowego czynnika wzrostu w nienaruszonych komórkach przy użyciu mikroskopii korelacyjnej

Opisujemy prosty test biologiczny oparty na komórkach do wykrywania, ilościowego określania i monitorowania aktywności członków rodziny ligandów czynnika wzrostu śródbłonka naczyniowego. Test wykorzystuje receptory chimeryczne ulegające ekspresji w linii komórkowej zależnej od czynnika, aby zapewnić półilościową lub ilościową ocenę wiązania receptora i sieciowania przez ligand.

Prosty test biologiczny do oceny czynników wzrostu śródbłonka naczyń krwionośnych

Ogniskowanie izoelektryczne kapilarne to oparta na przeciwciałach, ultraczuła, wysokoprzepustowa technika, umożliwiająca szczegółową charakterystykę białek i ich izoform z bardzo małych próbek biologicznych. Poniżej opisano protokół wykrywania i oznaczania ilościowego określonych białek i ich izoform w sposób zautomatyzowany i zrobotyzowany.

Wysoce czułe i ilościowe wykrywanie białek i ich izoform metodą kapilarnego ogniskowania izoelektrycznego

Przeciwciała, które wiążą się z docelowymi receptorami na powierzchni komórki, mogą powodować zmiany konformacji i grupowania. Te dynamiczne zmiany mają implikacje dla charakterystyki rozwoju leków w komórkach docelowych. Protokół ten wykorzystuje mikroskopię konfokalną i spektroskopię korelacji obrazów za pomocą ImageJ/FIJI w celu ilościowego określenia zakresu grupowania receptorów na powierzchni komórki.

Mikroskopia konfokalna ujawnia agregację receptorów na powierzchni komórki za pomocą spektroskopii korelacji obrazu

Tutaj prezentujemy metodę cytometrii przepływowej opartej na komórkach do wykrywania przeciwciał neutralizujących lub innych czynników, które zakłócają pobieranie przez komórkę enzymatycznych terapii zastępczych w ludzkiej matrycy, takich jak płyn mózgowo-rdzeniowy (CSF) lub ludzka surowica.

Wykrywanie przeciwciał, które neutralizują wychwyt komórkowy enzymatycznych terapii zastępczych za pomocą testu komórkowego

Opisujemy ilościowy system testów cytolizy in vitro w czasie rzeczywistym, aby ocenić siłę działania limfocytów T z chimerycznym receptorem antygenu ukierunkowanych na płynne i lite komórki nowotworowe. Protokół ten można rozszerzyć w celu oceny innych komórek efektorowych układu odpornościowego, a także leczenia skojarzonego.

Test siły działania w czasie rzeczywistym dla chimerycznych limfocytów T receptora antygenowego ukierunkowanych na stałe i hematologiczne komórki nowotworowe

Koniecznym krokiem w rozwoju aptameru przeciwnowotworowego jest przetestowanie jego wiązania z celem. Demonstrujemy test oparty na cytometrii przepływowej w celu zbadania tego wiązania, podkreślając znaczenie włączenia aptameru kontroli ujemnej i komórek rakowych, które są dodatnie lub ujemne dla tego konkretnego białka.

Test wiązania białek powierzchniowych komórek oparty na cytometrii przepływowej do oceny selektywności i swoistości aptameru przeciwnowotworowego

Tutaj prezentujemy protokół dla testu cytotoksyczności zależnej od przeciwciał za pośrednictwem komórek (ADCC) przy użyciu zestawu do testów biologicznych ADCC. Metoda ta stanowi cenne narzędzie do wyjaśnienia mechanizmu ADCC i oceny potencjału terapeutycznego przeciwciał w immunoterapii nowotworów.

Ocena zależnej od przeciwciał cytotoksyczności komórkowej w komórkach nowotworowych za pomocą testu biologicznego reporterowej cytotoksyczności zależnej od przeciwciał komórkowych

Poznaj walidowaną metodę ELISA do precyzyjnego oznaczania białka HER2 uwalnianego z komórek i związanego z komórkami. Technika ta umożliwia ilościowe badanie receptora w próbkach klinicznych i wspiera diagnostykę onkologiczną.

Zwalidowany test immunochemiczny do kompleksowego określenia receptora ludzkiego naskórkowego czynnika wzrostu 2 uwalnianego z komórek i związanego z komórkami (Wideo) | JoVE Journal

Zwalidowany test immunochemiczny do kompleksowego określenia receptora ludzkiego naskórkowego czynnika wzrostu 2 uwalnianego z komórek i związanego z komórkami

Przeglądaj więcej filmów