Name: Izolacja komórek płuc zawierających retinoidy przez sortowanie komórek (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-04-11T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 47 s
Description: Poznaj izolację komórek płuc zawierających retinoidy przez sortowanie komórek FACS u myszy. Ta metoda ujawnia złożoność metabolizmu retinoidów i ich rolę w ochronie płuc.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca została sfinansowana z grantu z National Institutes of Health/National Heart, Lung, and Blood Institute (NIH/NHLBI) R01 HL171112 (do I.S.), nagrody za rozwój kariery (dla I.S.) od Rutgers Center for Environmental Exposures & Disease ufundowanej przez National Institutes of Health/National Institute of Environmental Health Sciences (NIH/NIEHS) P30 ES005022, oraz fundusze na rozpoczęcie działalności z Rutgers, The State University of New Jersey (do I.S.). Autorzy pragną podziękować personelowi Immune Monitoring and Flow Cytometry Shared Resource w Rutgers Cancer Institute (wspieranym, częściowo, przez finansowanie z NCI-CCSG P30CA072770-5920) za ich wkład w pracę przedstawioną w tym manuskrypcie.

Wszystkie opisane procedury i eksperymenty z udziałem myszy zostały przeprowadzone za zgodą Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) Uniwersytetu Rutgers (IACUC ID: PROTO202200111) zgodnie z kryteriami określonymi w Przewodniku po opiece i użytkowaniu zwierząt laboratoryjnych przygotowanym przez Narodową Akademię Nauk55.
1. Rozważania i przygotowania do eksperymentu
<ol>
	<li>Hodowla i manipulacje zwierzętami 
	UWAGA: W badaniach można wykorzystać trzymiesięczne (10-12 tygodniowe) samce i samice myszy. Lecytyna: myszy z niedoborem acylotransferazy retinolu (Lrat-bicient, Lrat-/- mice56) na tle genetycznym C57BL / 6J i w opisanych eksperymentach wykorzystano rodzeństwo z miotu w tym samym wieku (typ dziki, myszy Lrat+/+). Myszy z ekspresją genu tdTomato w fibroblastach (myszy F-tdT) zostały wygenerowane przez skrzyżowanie myszy z kasetą reporterową tdTomato (B6. Cg-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J, szczep Jackson Lab #007914) z myszami Col1a2-CreER (B6. Cg-Tg(Col1a2-Cre/ERT,-ALPP)7Cpd/2J, szczep Jackson Lab #029567).
	<ol>
		<li>Zastosuj mysi model z ekspresją Cre, jedną z wielu dostępnych opcji oznaczania docelowej populacji komórek in vivo. 
		UWAGA: W zależności od wyboru komórki docelowej, ekspresji Cre, skuteczności rekombinacji za pośrednictwem Cre i specyficzności komórki, badacze mogą wykorzystać dowolny wiarygodny model myszy z ekspresją Cre.</li>
		<li>Ekspresję transgenu tdTomato (po leczeniu tamoksyfenem, jak opisano poniżej) należy oznaczyć fibroblasty Col1a2 +, a następnie wyizolować je z zawiesin jednokomórkowych strawionego płuca, jak opisano poniżej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Rekombinacja za pośrednictwem Cre i aktywacja transgenów in vivo
	<ol>
		<li>Indukować ekspresję Cre u myszy F-tdT poprzez dootrzewnowe (IP) wstrzyknięcie 2 mg tamoksyfenu raz na 24 godziny przez łącznie 5 kolejnych dni.</li>
		<li>Przed wstrzyknięciem zdezynfekować miejsce wstrzyknięcia 70% etanolem. Myszy należy stosować do eksperymentów 1 miesiąc po ostatnim wstrzyknięciu tamoksyfenu.</li>
		<li>Sprawdź skuteczność rekombinacji Cre przed eksperymentami sortowania. Potwierdź skuteczną rekombinację Cre i ekspresję tdTomato, izolując docelową populację komórek fibroblastów płuc od myszy F-tdT leczonych tamoksyfenem przy użyciu kulek magnetycznych anty-Pdgfrα i sortowania komórek aktywowanych magnetycznie (MACS).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie roztworów do wyrobów z tworzyw sztucznych i szkła 
	UWAGA: W przypadku procedur opisanych poniżej należy przestrzegać technik aseptycznych. Procedury obejmujące przygotowanie roztworu, trawienie tkanek i izolację komórek powinny być wykonywane pod kapturem laminarnym. Roztwory należy sterylizować przez filtrację przy użyciu filtra 0,2 μm; Narzędzia chirurgiczne, a także sprzęt laboratoryjny powinny być sterylizowane w autoklawie.
	<ol>
		<li>Pod maską laminarną przygotuj zbilansowany roztwór soli Hanksa (HBSS), wolny od wapnia i magnezu (HBSS bez Ca2+/Mg2+, zawierający 5,3 mM KCl, 0,4 mM KH2PO4, 4,2 mM NaHCO3, 137,9 mM NaCl, 0,3 mM Na2HPO4, 5,6 mM D-Glukoza) do perfuzji płuc (5 ml na mysz). Wysterylizować roztwór za pomocą filtra 0,2 μm i napełnić strzykawkę roztworem.</li>
		<li>Pod maską laminarną przygotować zbilansowany roztwór soli Hanksa z wapniem i magnezem (HBSS z Ca2+/Mg2+, zawierający 1,3 mM CaCl2, 0,5 MgCl2·6H2O, 0,4 mM MgSO4·7H2O, 5,3 mM KCl, 0,4 mM KH2PO4, 4,2 mM NaHCO3, 137,9 mM NaCl, 0,3 mM Na2HPO4, 5,6 mM D-glukozy), zawierające 0,3 mg/ml kolagenazy typu IV i 1 mg/ml dypazy do perfuzji płuc (10 ml na mysz). Wysterylizować roztwór za pomocą filtra 0,2 μm i napełnić strzykawkę roztworem.</li>
		<li>Pod kapturem laminarnym przygotować HBSS z Ca2+/Mg2+, zawierającym 0,3 mg/ml kolagenazy typu IV, 1 mg/ml dyspazy i 5 mg/ml DNazy I do trawienia płuc (10 ml na mysz). Wysterylizować roztwór za pomocą filtra 0,2 μm i napełnić strzykawkę roztworem.</li>
		<li>Pod kapturem laminarnym napełnij naczynie do hodowli komórkowych (35 mm 10 mm, jedno naczynie na każde płuco zebrane od jednej myszy) 2 ml sterylnego HBSS z Ca2+/Mg2+. Umieścić naczynie zawierające HBSS z Ca2+/Mg2+ na lodzie.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Perfuzja płuc, trawienie i zbieranie zawiesiny jednokomórkowej
<ol>
	<li>Znieczulić mysz, podając koktajl znieczulający przez wstrzyknięcie IP, dostarczając dawkę 100 mg/kg ketaminy i 10 mg/kg ksylazyny. 
	UWAGA: Poniższa technika wymaga użycia żywych zwierząt pod narkozą, aby zapobiec krzepnięciu krwi w mikrokrążeniu płuc, które mogłoby ograniczyć dostęp enzymów do obszarów pęcherzyków płucnych, a tym samym znacznie pogorszyć dalszą izolację docelowych populacji komórek.</li>
	<li>Upewnij się, że mysz jest w głębokim stanie nieprzytomności, oceniając reakcję na uszczypnięcie palca u nogi. Brak odpowiedzi wskazuje, że zwierzę jest wystarczająco znieczulone do kolejnych kroków. Usuń luźne włosy i widoczny brud/zanieczyszczenia z pola operacyjnego i wytrzyj pole operacyjne do czysta przy użyciu 70% alkoholu do dezynfekcji.</li>
	<li>Za pomocą sterylnych narzędzi chirurgicznych otwórz jamę brzuszną i klatkę piersiową. Przetnij żebra i przeponę, aby odsłonić płuca i serce. 
	UWAGA: Torakotomia zapewni śmierć, ponieważ spontaniczne oddychanie może już nie wystąpić; Przy prawidłowym wykonaniu ta część zabiegu potrwa do 3 minut od rozpoczęcia zabiegu do torakotomii, po której następuje śmierć zwierzęcia.</li>
	<li>Przeciąć żyłę główną dolną i nałożyć wkładkę chłonną, aby wchłonąć uwolnioną krew.</li>
	<li>Wykonaj fuzję płuc in situ przez prawą komorę serca za pomocą strzykawki o pojemności 10 ml z igłą o wymiarach 25 G X 1" wypełnionej 5 ml sterylnego HBSS bez Ca2 + / Mg2 +. Jeśli perfuzja się powiedzie, tkanka płucna stanie się biała.</li>
	<li>Wykonaj perfuzję płuc in situ za pomocą strzykawki o pojemności 10 ml z igłą 25 G X 1" wypełnionej 10 ml sterylnego HBSS z Ca2 + / Mg2+, zawierającego kolagenazę typu IV (0,3 mg / ml) i dyspazę (1 mg / ml).</li>
	<li>Usunąć płuca i przenieść je do naczynia do hodowli komórkowej (35 mm X 10 mm) z 2 ml sterylnego HBSS z Ca2+/Mg2+.</li>
	<li>Pod laminarnym kapturem wypłucz płuca płuca i zmiel je na małe kawałki za pomocą sterylnego ostrza chirurgicznego (#20, pasuje do uchwytu #4). Przenieść zmielone płuco do probówki o pojemności 15 ml, dodając pierwsze 5 ml HBSS z Ca2 + / Mg2 + zawierającym 0,3 mg / ml kolagenazy typu IV, 1 mg / ml dyspazy i 5 mg / ml DNazy I do tkanki mielonej i przenosząc ją za pomocą pipety serologicznej o pojemności 10 ml. Zebrać i przenieść pozostałe pozostałości tkanek mielonych, myjąc naczynie do hodowli komórkowych pozostałymi 5 ml HBSS z Ca2 + / Mg2 + zawierającym 0,3 mg / ml kolagenazy typu IV, 1 mg / ml dypazy i 5 mg / ml DNazy I.</li>
	<li>Inkubować zmieloną tkankę płucną w HBSS z Ca2+/Mg2+ zawierającym 0,3 mg/ml kolagenazy typu IV, 1 mg/ml dypazy i 5 mg/ml DNazy I na obrotowej wytrząsarce utrzymywanej w temperaturze 37 °C przez 45 minut. W każdym z trzech 15-minutowych odstępów, pod kapturem laminarnym, przepuść zmieloną tkankę 10 razy przez pipetę serologiczną o pojemności 10 ml, aby lepiej dysocjować komórki.</li>
	<li>Przepuść powstałą zawiesinę komórek przez sitko o wielkości 100 μm, aby zebrać pojedyncze komórki do probówki o pojemności 50 ml zawierającej 20 ml roztworu do obrazowania zimnych żywych komórek (sól fizjologiczna zawierająca 20 mM HEPES, pH 7,4) zawierającej mniej niż 5% płodowej surowicy bydlęcej (FBS). Zebrać komórki przez odwirowanie w temperaturze 500 g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Odessać supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w 1 ml buforu do lizy czerwonych krwinek i pozostawić probówkę na 5 minut w temperaturze pokojowej (RT) w celu wyeliminowania erytrocytów. Dodaj 20 ml zimnego roztworu do obrazowania żywych komórek zawierającego mniej niż 5% FBS. Zebrać komórki przez odwirowanie w temperaturze 500 g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Odessać supernatant i ponownie zawiesić osad komórek w 20 ml zimnego roztworu do obrazowania żywych komórek zawierającego mniej niż 5% FBS. Przepuść powstałą zawiesinę komórek przez sitko o wielkości 40 μm, aby zebrać pojedyncze komórki do probówki o pojemności 50 ml zawierającej 20 ml zimnego roztworu do obrazowania żywych komórek zawierającego mniej niż 5% FBS. Zebrać komórki przez odwirowanie w temperaturze 500 g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Odessać supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w 10 ml zimnego roztworu do obrazowania żywych komórek zawierającego mniej niż 5% FBS. Policz komórki i dostosuj stężenie komórek do ~5-10 x 106 komórek / ml.</li>
</ol>
3. Izolacja komórek płuc zawierających retinoidy za pomocą sortowania komórek aktywowanych fluorescencją (FACS)
<ol>
	<li>Pobrać porcję zawiesiny komórkowej i odłożyć ją na bok, aby można ją było wykorzystać jako niebarwioną kontrolę bramkowania. Do pozostałej zawiesiny komórek dodać barwnik żywotności SYTOX Green (rozcieńczenie 1:1000, stężenie końcowe 30 nM).</li>
	<li>Przepuścić zawiesiny komórek przez filtr przymocowany do probówki zbiorczej z polistyrenu o pojemności 5 ml (12 x 75 mm).</li>
	<li>Kontynuuj izolację komórek FACS, sortując żywe, pojedyncze komórki zawierające retinoidy na podstawie ich emisji przy 455 nm. Wykonaj sekwencyjną dyskryminację singletową przy użyciu wykresu dla rozproszenia do przodu (wysokość rozproszenia do przodu/FSC-H w porównaniu z obszarem rozproszenia do przodu/FSC-A). Wyklucz martwe komórki na podstawie charakterystyki rozproszenia (rozproszenie boczne) i barwienia SYTOX Green.</li>
	<li>Bramkować, sortować i zbierać pojedyncze, żywe komórki zawierające retinoidy za pomocą emisji przy 455 nm po wzbudzeniu przy 350 nm. 
	UWAGA: Korzystając z opisanej procedury, z jednego płuca myszy można pobrać około 5·105 komórek płuc zawierających retinoidy.</li>
	<li>Wykonaj analizę danych FACS za pomocą oprogramowania do cytometrii przepływowej.</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Zdolność wykrywania witaminy A w tkankach ludzkich i zwierzęcych oraz jej histologicznej wizualizacji za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej została po raz pierwszy opisana już w latach czterdziestych XX wieku59,60. Zjawisko autofluorescencji retinoidów zostało następnie z powodzeniem zastosowane w badaniach mających na celu zlokalizowanie wysokich stężeń witaminy A w tkankach in vitro61 oraz scharakteryzowanie morfogenezy zwierzę...

Retinoidy (witamina A i jej metabolity) są niezbędnym składnikiem lipidowym mikrośrodowiska pęcherzyków płucnych, a specyficzny dla typu komórki metabolizm i sygnalizacja retinoidów są niezbędne do utrzymania funkcjonalnego zdrowia rozwijającego się i dorosłego płuca1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14. Komórki płuc wykorzystują specyficzne szlaki, co pozwala na efektywne pobieranie krążących retinoidów pochodzących z diety z krwi w postaci retinolu (ROH)15,16,17,18,19, po czym następuje wewnątrzkomórkowa stopniowa konwersja ROH do transkrypcyjnie aktywnego rodzaju retinoidu, kwasu all-trans-retinowego (ATRA)20. Sygnalizacja za pośrednictwem ATRA (lub za pośrednictwem retinoidów) jest osiągana poprzez interakcję ATRA z trzema pokrewnymi receptorami hormonów jądrowych, receptorami kwasu retinowego (RARα, RARβ i RARγ21,22), i jest kluczowa dla regulacji pęcherzyków płucnych23,24,25,26,27,28,29, produkcja środków powierzchniowo czynnych30,31,32,33,34,35, angiogeneza36, przepuszczalność37 i odporność38,39,40. Co ważne, specyficzne komórki płuc, zwłaszcza fibroblasty płuc, mogą gromadzić retinoidy w postaci estrów retinylu (RE), które mogą być przechowywane lub dalej mobilizowane jako ROH w celu przeniesienia do sąsiednich komórek w razie potrzeby1.
Złożoność metabolizmu i sygnalizacji retinoidów, jak również złożoność komórkowa płuc, sprawiają, że badania mające na celu zbadanie metabolizmu retinoidów w płucach in vivo są wyzwaniem. Przedstawiliśmy prosty i solidny protokół izolowania komórek zawierających retinoidy (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 1) z wysoce heterogenicznych populacji komórek płuc poprzez wykorzystanie specyficznej autofluorescencji retinoidów (emisja przy 455 nm po wzbudzeniu przy 350 nm) i poprzez zastosowanie sortowania komórek aktywowanych fluorescencją (FACS). Protokół nie wymaga dodatkowego znakowania komórek, z wyjątkiem barwienia żywotności, jeśli celem badania jest wyizolowanie i scharakteryzowanie pierwotnych żywych komórek płuc na podstawie ich zdolności do przechowywania retinoidów. To znacznie skraca czas przygotowania do sortowania komórek, eliminuje potrzebę dodatkowego barwienia i pozwala na izolowanie wysokich plonów żywotnych komórek pierwotnych. Jeśli jednak celem badania jest wyizolowanie i scharakteryzowanie określonych populacji komórek płuc (fibroblastów, komórek śródbłonka, nabłonka lub komórek odpornościowych), dodatkowe sortowanie komórek można przeprowadzić po znakowaniu posortowanych komórek zawierających retinoidy przeciwciałami specyficznymi dla komórki.
Autofluorescencja retinoidów została wykorzystana w opublikowanych badaniach w celu ustalenia tożsamości komórek zawierających retinoidy i/lub ilościowego określenia obfitości tych komórek w wątrobie<klasa SUP="xref">41,42,43,44, trzustka45,46, nerki41,47, oraz lung41. Co więcej, kilka grup badawczych zgłosiło zastosowanie fluorescencji retinoidów do izolacji za pomocą FACS i badania pierwotnych komórek zawierających retinoidy z żywych tkanek, w tym wątroby44,48,49,50,51,52,53 i lung1. W obecnym protokole pokazujemy, w jaki sposób określone populacje komórek mogą być znakowane in vivo przed wyizolowaniem komórek zawierających retinoidy za pomocą tdTomato (czerwone białko fluorescencyjne). Charakterystyka spektralna tdTomato (emisja przy 581 nm po wzbudzeniu przy 554 nm54) i jasność nie zakłócają autofluorescencji retinoidów, a zatem ułatwiają osiągnięcie specyficzności komórek podczas sortowania. Biorąc pod uwagę krytyczną rolę niezakłóconego metabolizmu retinoidów i sygnalizacji w normalnym mikrośrodowisku pęcherzyków płucnych1, opisana technika izolacji komórek płuc jest użytecznym narzędziem w badaniach na modelach zwierzęcych nad zdrowiem i chorobami płuc w celu uzyskania głębszego wglądu w komórkowe aspekty metabolizmu retinoidów w płucach i komunikację komórkową za pośrednictwem lipidów in vivo.

<table><tbody><tr><td>Pipeta serologiczna 10 ml</td><td>Avantor/VWR</td><td>76452-284</td><td></td></tr><tr><td>100 &micro; m sitko&nbsp;</td><td>Greiner Bio-One</td><td>542000</td><td></td></tr><tr><td>15 ml tubka sokoła</td><td>Corning</td><td>352099</td><td></td></tr><tr><td>40 &micro; m sitko&nbsp;</td><td>Greiner Bio-One</td><td>542040</td><td></td></tr><tr><td>50 ml probówka sokoła</td><td>Corning</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>Naczynie do hodowli komórkowych, 35 mm i ostre; 10 mm</td><td>Corning</td><td>430165</td><td></td></tr><tr><td>Podłoże do sortowania komórek</td><td>Gibco</td><td>A59688DJ</td><td></td></tr><tr><td>Kolagenaza typ IV&nbsp;</td><td>Korporacja Biochemiczna Worthington</td><td>LS004188&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>System sortowania komórek Cytek Aurora&nbsp;</td><td>Cytek Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dispase II</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D4693</td><td></td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DN25</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 5-ml polipropylenowa probówka z okrągłym dnem, 12 mm i 75 mm</td><td>Corning</td><td>352063</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 5-ml polistyrenowa probówka okrągłodenna z nasadką sitkową, 12 mm i ostra 75 mm</td><td></td><td>Corning 352235</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie FlowJo&nbsp;</td><td>Oprogramowanie do cytometrii przepływowej</td> <td>Becton Dickinson</td><td></td></tr><tr><td>HBSS z Ca2+/Mg2+</td><td>Gibco</td><td>14925-092</td><td></td></tr><tr><td>HBSS bez Ca2+/Mg2+</td><td>Gibco</td><td>14175-095</td><td></td></tr><tr><td>Nalgene Sterylne jednorazowe filtry do butelek Rapid-Flow</td><td>ThermoFisher</td><td>595-3320</td><td></td></tr><tr><td>Liza czerwonych krwinek bufor</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R7757</td><td></td></tr><tr><td>SpectroFlo CS oprogramowanie&nbsp;</td><td>Cytek Biosciences</td><td>Wersja 1.3.0&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Projekt chirurgiczny Royaltek Ostrza skalpela chirurgicznego ze stali nierdzewnej</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-079-683</td><td></td></tr><tr><td>SYTOX Zielona plama martwych komórek</td><td>Invitrogen</td><td>S34860</td><td></td></tr><tr><td>Tamoksyfen</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T2859</td><td></td></tr></tbody></table>

izolacja komórek płuc zawierających retinoidy przez sortowanie komórek

Isolation of Lung Retinoid-Containing Cells by Cell Sorting

Retinoidy (witamina A i jej metabolity) są niezbędnym składnikiem lipidowym mikrośrodowiska pęcherzyków płucnych, a specyficzny dla typu komórki metabolizm retinoidów jest niezbędny do utrzymania funkcjonalnego zdrowia rozwijających się i dorosłych płuc. Komórki płuc wykorzystują specyficzne szlaki, co pozwala na efektywne pobieranie krążących retinoidów z krwi w postaci retinolu (ROH), a następnie wewnątrzkomórkową stopniową konwersję ROH do transkrypcyjnie aktywnego rodzaju retinoidu, kwasu all-trans-retinowego (ATRA). Sygnalizacja za pośrednictwem ATRA (lub za pośrednictwem retinoidów) ma kluczowe znaczenie dla regulacji pęcherzyków płucnych, produkcji środków powierzchniowo czynnych, angiogenezy, przepuszczalności i odporności. Co ważne, określone komórki płuc, w tym fibroblasty, mogą gromadzić retinoidy w postaci estrów retinylu (RE), które mogą być magazynowane lub dalej mobilizowane jako ROH w celu przeniesienia do sąsiednich komórek w razie potrzeby. Komórki płuc zawierające retinoidy można wyizolować i pobrać z jednokomórkowej zawiesiny strawionych płuc za pomocą autofluorescencji retinoidów (emisja przy 455 nm po wzbudzeniu przy 350 nm) i stosując sortowanie komórek aktywowane fluorescencją (FACS). Dodatkowe specyficzne dla komórki znakowanie in vivo komórek płuc białkiem czerwonej fluorescencji umożliwia izolację i zbieranie określonych populacji komórek płuc zawierających retinoidy. Pobrane komórki mogą być bezpośrednio analizowane lub hodowane w celu dalszych analiz morfologii komórek, ekspresji genów i reakcji na manipulacje farmakologiczne. Ta technika izolacji i zastosowania jest ważna dla badań na modelach zwierzęcych nad zdrowiem płuc i uszkodzeniem płuc w celu uzyskania głębszego wglądu w komórkowe aspekty metabolizmu retinoidów w płucach i komunikacji komórkowej za pośrednictwem lipidów.

Izolacja komórek płuc zawierających retinoidy 
Płuca myszy (od myszy Lrat+/+ oraz Lrat-/-) poddano trawieniu enzymatycznemu, a przygotowane zawiesiny pojedynczych komórek poddano analizie FACS zgodnie z opisaną powyżej procedurą. Sortowanie komórek i akwizycja danych zostały wykonane na systemie Cytek Aurora™ Cell Sorter sterowanym oprogramowaniem SpectroFlo CS w wersji 1.3.0, przy użyciu dyszy 100 µm i ciśnieniu 15 ps...

Protokół opisany poniżej jest prostym i skutecznym sposobem na izolację komórek zawierających retinoidy z wysoce heterogenicznych populacji komórek płuc poprzez wykorzystanie specyficznej autofluorescencji retinoidów i zastosowanie sortowania komórek aktywowanego fluorescencją.

Izolacja komórek płuc zawierających retinoidy przez sortowanie komórek

Retinoids (vitamin A and its metabolites) are an essential lipid component of the alveolar microenvironment, and cell-type specific retinoid metabolism is ...

Nasze badania koncentrują się na zrozumieniu fizjologicznej roli witaminy A i jej metabolitów, zbiorczo nazywanych retinoidami, w utrzymaniu funkcjonalnego zdrowia płuc osoby dorosłej.Ze względu na wysoce wyspecjalizowany i niejednorodny skład komórkowy płuc, techniki jednokomórkowe, takie jak specyficzne znakowanie komórek, sortowanie i sekwencjonowanie, są niezbędne do badania komunikacji komórkowej za pośrednictwem retinoidów w zdrowiu i chorobie płuc.Nasze badania ujawniły wcześniej niepodejrzewaną złożoność metabolizmu i sygnalizacji retinoidów w płucach dorosłych oraz ich kluczową rolę w ochronie płuc podczas urazów.Nasz protokół umożliwia izolację określonych populacji komórek płuc w oparciu o endogenną autofluorescencję retinoidów i może być łatwo zintegrowany z barwieniem przeciwciał sprzężonych z fluorochromem we wszystkich ekspresjach białek fluorescencyjnych.Nasze badania zmieniają paradygmat w celu zrozumienia mechanizmów metabolizmu witaminy A i jej działania. Wyniki tych badań mogą i będą miały wpływ na obecne strategie, w tym interwencje żywieniowe mające na celu złagodzenie chorób płuc.[Prezenter] Aby rozpocząć, wykonaj test szczypania palca u nogi na znieczulonej myszy, aby sprawdzić poziom utraty przytomności. Usuń luźne włosy i widoczne zabrudzenia z pola operacyjnego. Następnie wytrzyj obszar do czysta za pomocą 70% alkoholu do dezynfekcji. Za pomocą sterylnych narzędzi chirurgicznych otwórz jamę brzuszną i klatkę piersiową. Przetnij żebra i przeponę, aby odsłonić płuca i serce. Następnie odetnij żyłę główną dolną. Zastosuj wkładkę chłonną, aby wchłonąć uwolnioną krew. Wykonaj perfuzję płuc in-situ przez prawą komorę serca za pomocą 5 mililitrów sterylnego HBSS bez wapnia i magnezu. Sprawdź pomyślną perfuzję, obserwując, jak tkanka płucna zmienia kolor na biały. Ponownie przeprowadź perfuzję płuc za pomocą kolejnej 10-mililitrowej strzykawki wypełnionej sterylnym HBSS zawierającym enzymy, wapń i magnez. Teraz usuń płuca i przenieś je do naczynia do hodowli komórkowej zawierającego 2 mililitry sterylnego HBSS z wapniem i magnezem. Pod laminarnym kapturem wypłucz płuca płuca i zmiel je na małe kawałki sterylnym ostrzem chirurgicznym. Dodaj 5 mililitrów enzymu HBSS zawierającego wapń i magnez do rozdrobnionych płuc. Następnie za pomocą 10-mililitrowej pipety serologicznej przenieś zawiesinę do 15-mililitrowej probówki. Umyj naczynie do hodowli komórkowych dodatkowymi 5 mililitrami enzymu zawierającego HBSS. Przenieś roztwór myjący do 15-mililitrowej probówki. Inkubować zmieloną tkankę płucną w enzymie zawierającym HBSS na obracającej się wytrząsarce w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 45 minut. Co 15 minut pipetować zmieloną tkankę 10 razy przez 10-mililitrową pipetę serologiczną wewnątrz okapu laminarnego, aby zwiększyć dysocjację. Zrób to trzy razy. Przepuść powstałą zawiesinę komórek przez 100-mikrometrowe sitko do 50-mililitrowej probówki zawierającej 20 mililitrów zimnego roztworu do obrazowania żywych komórek zawierającego mniej niż 5% FBS. Odwirować komórki w temperaturze 500 g przez 10 minut w temperaturze 4 stopni Celsjusza. Po odessaniu supernatantu ponownie zawieś osad komórkowy w 1 mililitrze buforu do lizy czerwonych krwinek i inkubuj. Gdy erytrocyty ulegną lizie, dodaj 20 mililitrów zimnego roztworu do obrazowania żywych komórek do zawiesiny przed ponownym odwirowaniem. Odessać supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w 20 mililitrach zimnego roztworu do obrazowania żywych komórek. Przepuść powstałą zawiesinę komórek przez 40-mikrometrowe sitko do komórek do 50-mililitrowej probówki zawierającej 20 mililitrów zimnego roztworu do obrazowania żywych komórek. Odwirować zawiesinę komórkową jak poprzednio, aby zebrać komórki. Na koniec odessać supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w 10 mililitrach zimnego roztworu do obrazowania żywych komórek. Policz komórki pod mikroskopem za pomocą hemocytometru i dostosuj stężenie do około 5 do 10 milionów komórek na mililitr. Pobrać porcję przygotowanej zawiesiny komórkowej i odłożyć ją na bok jako niebarwioną kontrolę bramkowania. Dodać cytoekran barwnika żywotności w rozcieńczeniu od 1 do 1000 do pozostałej zawiesiny komórek, aby uzyskać końcowe stężenie 30 nanomolowych. Następnie przymocuj filtr do polistyrenowej 5-mililitrowej rurki zbiorczej. Przepuścić zawiesinę przez filtr. Wykonaj sortowanie komórek aktywowane fluorescencją, aby wyizolować żywe pojedyncze komórki zawierające retinoidy na podstawie ich emisji w odległości 455 nanometrów. Wykonaj sekwencyjną dyskryminację singletów przy użyciu wykresu wysokości rozproszenia do przodu w stosunku do wykresu obszaru rozproszenia do przodu. Wyklucz martwe komórki na podstawie charakterystyki rozproszenia i barwienia cytoekranem. Bramkuj, sortuj i zbieraj pojedyncze żywe komórki zawierające retinoidy na podstawie ich emisji przy 455 nanometrach po wzbudzeniu na 350 nanometrach. Na koniec przeprowadź analizę danych FACS za pomocą oprogramowania do cytometrii przepływowej. Wyraźna populacja żywych pojedynczych komórek o wysokiej autofluorescencji przy 455 nanometrach została wykryta w zawiesinach komórek płucnych myszy typu dzikiego. Ta sama populacja autofluorescencyjna była nieobecna w zawiesinach komórek płuc z nokautem Lrat. Subpopulację fibroblastów tdTomato-dodatnich udało się wyizolować za pomocą systemu znakowania indukowanego przez Cre, co umożliwiło dalsze oddzielenie komórek zawierających retinoidy od tej populacji komórek w oparciu o autofluorescencję. Obecność tdTomato-dodatnich fibroblastów płuc potwierdzono za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej, która wykazała komórki znakowane na czerwono. Obecność retinoidów w posortowanych fibroblastach zwalidowano za pomocą HPLC, identyfikując retinol i estry retinolu. Kropelki lipidów wykryto w fibroblastach zawierających retinoidy.

isolation-of-lung-retinoid-containing-cells-by-cell-sorting

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Opisano metodę otrzymywania wysoce oczyszczonej preparacji komórek dendrytycznych z płuc myszy. Szczególny nacisk położono na izolację podgrupy konwencjonalnych komórek dendrytycznych.

Izolacja komórek dendrytycznych z płuc myszy

Ten film demonstruje procedurę izolowania mysich pierwotnych komórek zwojowych siatkówki (RGC) za pomocą cytometrii przepływowej. Metoda ta pozwala na przyszłe badania RGC, w celu lepszego zrozumienia poważnego spadku ostrości wzroku, który wynika z utraty funkcjonalnych RGC w chorobach neurodegeneracyjnych.

Izolowanie mysich komórek zwojowych siatkówki za pomocą sortowania komórek aktywowanych fluorescencją

Tutaj zapewniamy zoptymalizowany protokół izolacji i klonowania rzadkiej jednostki limfocytów T obwodowych komórek T Vδ1+CD4+, która jest, jak wykazaliśmy ostatnio, pozatymicznym progenitorem limfocytów T αβ. Technika ta pozwala na ilościowe wyizolowanie, sklonowanie i efektywną ekspansję tych komórek w hodowli ex vivo.

Izolacja i hodowla ex vivo limfocytów T Vδ1+CD4+γδ, pozatymicznego progenitora komórek αβT

Ten protokół opisuje technikę izolacji w celu uzyskania pierwotnych mezenchymalnych komórek zrębu rezydujących w płucach od szczurów, poprzez zastosowanie trawienia enzymatycznego, separacji gradientu gęstości, przylegania plastiku i selekcji kulek magnetycznych CD146+.

Izolacja mezenchymalnych komórek zrębowych płuc rezydentnych CD146 + z płuc szczura

Urazom wątroby towarzyszy ekspansja komórek progenitorowych, które reprezentują niejednorodną populację komórek. Nowatorska klasyfikacja tego przedziału komórkowego pozwala na rozróżnienie wielu podzbiorów. Opisana tutaj metoda ilustruje analizę cytometrii przepływowej i izolację różnych podzbiorów o wysokiej czystości, które można wykorzystać do dalszych testów.

Izolacja i wzbogacenie podzbiorów progenitorów wątroby zidentyfikowanych za pomocą nowej kombinacji markerów powierzchniowych

Miliony ludzi cierpią na choroby zwyrodnieniowe siatkówki, które prowadzą do nieodwracalnej ślepoty. Wspólnym elementem wielu z tych chorób jest utrata komórek zwojowych siatkówki (RGC). Ten szczegółowy protokół opisuje izolację pierwotnych mysich RGC przez selekcję dodatnią i ujemną za pomocą cytometrii przepływowej.

Izolacja pierwotnych mysich komórek zwojowych siatkówki (RGC) za pomocą cytometrii przepływowej

Ten artykuł zawiera szczegółową metodologię metod dysocjacji tkanek i frakcjonowania komórkowego, umożliwiając wzbogacenie żywotnych komórek nabłonkowych z bliższych i dalszych obszarów ludzkiego płuca. W tym przypadku podejścia te są stosowane do analizy funkcjonalnej komórek progenitorowych nabłonka płuc poprzez wykorzystanie modeli hodowli organoidów 3D.

Izolacja i wzbogacanie ludzkich komórek progenitorowych nabłonka płuc do hodowli organoidów

Ten protokół opisuje metodę izolacji mysich komórek śródbłonka siatkówki po urodzeniu, zoptymalizowanych pod kątem wydajności, czystości i żywotności komórek. Komórki te nadają się do sekwencjonowania nowej generacji.

Izolacja mysich komórek śródbłonka siatkówki do sekwencjonowania nowej generacji

Chociaż jest to trudne, izolacja komórek śródbłonka płuc jest niezbędna do badań nad zapaleniem płuc. Niniejszy protokół opisuje procedurę wysokowydajnej izolacji komórek śródbłonka makronaczyniowego i mikronaczyniowego o wysokiej czystości.

Izolacja i oczyszczanie komórek śródbłonka mikronaczyniowego i makronaczyniowego z próbek pochodzących z płuc

Przedstawiona tutaj jest powtarzalna, przystępna cenowo i solidna metoda izolacji i ekspansji pierwotnych komórek nabłonka oskrzeli do długoterminowego biobankowania i generowania zróżnicowanych komórek nabłonkowych przez hodowlę na granicy powietrze-ciecz.

Izolowanie komórek nabłonka oskrzeli z wyciętej tkanki płucnej w celu biobankowania i tworzenia dobrze zróżnicowanych kultur granicy faz powietrze-ciecz

Ten protokół szczegółowo opisuje izolację żywych populacji immunologicznych i nieimmunologicznych z płuc myszy w stanie ustalonym i po zakażeniu grypą. Zapewnia również strategie bramkowania do identyfikacji podzbiorów komórek nabłonkowych i szpikowych.

Izolacja żywych populacji komórek szpikowych i nabłonkowych z płuc myszy

Poznaj izolację komórek płuc zawierających retinoidy przez sortowanie komórek FACS u myszy. Ta metoda ujawnia złożoność metabolizmu retinoidów i ich rolę w ochronie płuc.

Izolacja komórek płuc zawierających retinoidy przez sortowanie komórek

Przeglądaj więcej filmów