Izolacja komórek płuc zawierających retinoidy przez sortowanie komórek

Nasze badania koncentrują się na zrozumieniu fizjologicznej roli witaminy A i jej metabolitów, zbiorczo nazywanych retinoidami, w utrzymaniu funkcjonalnego zdrowia płuc osoby dorosłej.

Ze względu na wysoce wyspecjalizowany i niejednorodny skład komórkowy płuc, techniki jednokomórkowe, takie jak specyficzne znakowanie komórek, sortowanie i sekwencjonowanie, są niezbędne do badania komunikacji komórkowej za pośrednictwem retinoidów w zdrowiu i chorobie płuc.

Nasze badania ujawniły wcześniej niepodejrzewaną złożoność metabolizmu i sygnalizacji retinoidów w płucach dorosłych oraz ich kluczową rolę w ochronie płuc podczas urazów.

Nasz protokół umożliwia izolację określonych populacji komórek płuc w oparciu o endogenną autofluorescencję retinoidów i może być łatwo zintegrowany z barwieniem przeciwciał sprzężonych z fluorochromem we wszystkich ekspresjach białek fluorescencyjnych.

Nasze badania zmieniają paradygmat w celu zrozumienia mechanizmów metabolizmu witaminy A i jej działania. Wyniki tych badań mogą i będą miały wpływ na obecne strategie, w tym interwencje żywieniowe mające na celu złagodzenie chorób płuc.

[Prezenter] Aby rozpocząć, wykonaj test szczypania palca u nogi na znieczulonej myszy, aby sprawdzić poziom utraty przytomności. Usuń luźne włosy i widoczne zabrudzenia z pola operacyjnego. Następnie wytrzyj obszar do czysta za pomocą 70% alkoholu do dezynfekcji. Za pomocą sterylnych narzędzi chirurgicznych otwórz jamę brzuszną i klatkę piersiową. Przetnij żebra i przeponę, aby odsłonić płuca i serce. Następnie odetnij żyłę główną dolną. Zastosuj wkładkę chłonną, aby wchłonąć uwolnioną krew. Wykonaj perfuzję płuc in-situ przez prawą komorę serca za pomocą 5 mililitrów sterylnego HBSS bez wapnia i magnezu. Sprawdź pomyślną perfuzję, obserwując, jak tkanka płucna zmienia kolor na biały. Ponownie przeprowadź perfuzję płuc za pomocą kolejnej 10-mililitrowej strzykawki wypełnionej sterylnym HBSS zawierającym enzymy, wapń i magnez. Teraz usuń płuca i przenieś je do naczynia do hodowli komórkowej zawierającego 2 mililitry sterylnego HBSS z wapniem i magnezem. Pod laminarnym kapturem wypłucz płuca płuca i zmiel je na małe kawałki sterylnym ostrzem chirurgicznym. Dodaj 5 mililitrów enzymu HBSS zawierającego wapń i magnez do rozdrobnionych płuc. Następnie za pomocą 10-mililitrowej pipety serologicznej przenieś zawiesinę do 15-mililitrowej probówki. Umyj naczynie do hodowli komórkowych dodatkowymi 5 mililitrami enzymu zawierającego HBSS. Przenieś roztwór myjący do 15-mililitrowej probówki. Inkubować zmieloną tkankę płucną w enzymie zawierającym HBSS na obracającej się wytrząsarce w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 45 minut. Co 15 minut pipetować zmieloną tkankę 10 razy przez 10-mililitrową pipetę serologiczną wewnątrz okapu laminarnego, aby zwiększyć dysocjację. Zrób to trzy razy. Przepuść powstałą zawiesinę komórek przez 100-mikrometrowe sitko do 50-mililitrowej probówki zawierającej 20 mililitrów zimnego roztworu do obrazowania żywych komórek zawierającego mniej niż 5% FBS. Odwirować komórki w temperaturze 500 g przez 10 minut w temperaturze 4 stopni Celsjusza. Po odessaniu supernatantu ponownie zawieś osad komórkowy w 1 mililitrze buforu do lizy czerwonych krwinek i inkubuj. Gdy erytrocyty ulegną lizie, dodaj 20 mililitrów zimnego roztworu do obrazowania żywych komórek do zawiesiny przed ponownym odwirowaniem. Odessać supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w 20 mililitrach zimnego roztworu do obrazowania żywych komórek. Przepuść powstałą zawiesinę komórek przez 40-mikrometrowe sitko do komórek do 50-mililitrowej probówki zawierającej 20 mililitrów zimnego roztworu do obrazowania żywych komórek. Odwirować zawiesinę komórkową jak poprzednio, aby zebrać komórki. Na koniec odessać supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w 10 mililitrach zimnego roztworu do obrazowania żywych komórek. Policz komórki pod mikroskopem za pomocą hemocytometru i dostosuj stężenie do około 5 do 10 milionów komórek na mililitr. Pobrać porcję przygotowanej zawiesiny komórkowej i odłożyć ją na bok jako niebarwioną kontrolę bramkowania. Dodać cytoekran barwnika żywotności w rozcieńczeniu od 1 do 1000 do pozostałej zawiesiny komórek, aby uzyskać końcowe stężenie 30 nanomolowych. Następnie przymocuj filtr do polistyrenowej 5-mililitrowej rurki zbiorczej. Przepuścić zawiesinę przez filtr. Wykonaj sortowanie komórek aktywowane fluorescencją, aby wyizolować żywe pojedyncze komórki zawierające retinoidy na podstawie ich emisji w odległości 455 nanometrów. Wykonaj sekwencyjną dyskryminację singletów przy użyciu wykresu wysokości rozproszenia do przodu w stosunku do wykresu obszaru rozproszenia do przodu. Wyklucz martwe komórki na podstawie charakterystyki rozproszenia i barwienia cytoekranem. Bramkuj, sortuj i zbieraj pojedyncze żywe komórki zawierające retinoidy na podstawie ich emisji przy 455 nanometrach po wzbudzeniu na 350 nanometrach. Na koniec przeprowadź analizę danych FACS za pomocą oprogramowania do cytometrii przepływowej. Wyraźna populacja żywych pojedynczych komórek o wysokiej autofluorescencji przy 455 nanometrach została wykryta w zawiesinach komórek płucnych myszy typu dzikiego. Ta sama populacja autofluorescencyjna była nieobecna w zawiesinach komórek płuc z nokautem Lrat. Subpopulację fibroblastów tdTomato-dodatnich udało się wyizolować za pomocą systemu znakowania indukowanego przez Cre, co umożliwiło dalsze oddzielenie komórek zawierających retinoidy od tej populacji komórek w oparciu o autofluorescencję. Obecność tdTomato-dodatnich fibroblastów płuc potwierdzono za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej, która wykazała komórki znakowane na czerwono. Obecność retinoidów w posortowanych fibroblastach zwalidowano za pomocą HPLC, identyfikując retinol i estry retinolu. Kropelki lipidów wykryto w fibroblastach zawierających retinoidy.