Modyfikacja enzymatyczna i cytometria przepływowa oceny białek powierzchniowych drożdży

Badania te koncentrują się na badaniu chemicznych modyfikacji białek, które decydują o zachowaniu komórek. W tym przypadku celem jest zrozumienie preferencji i kinetyki enzymów modyfikujących różne substraty.

Po raz pierwszy wykazano zdolność do defosforylacji cząsteczki substratu znajdującej się na powierzchni drożdży. Odkrycie to otwiera możliwości uogólnionego mapowania kinetycznego modyfikacji enzymatycznych, które wcześniej nie były dostępne. Badania te dotyczą wyzwań związanych ze zrozumieniem interakcji substratów enzymatycznych. Zazwyczaj do tego typu oceny wymagane są lizaty komórkowe lub niestandardowe peptydy. W tym przypadku alternatywą dla FasL jest zastosowanie substratów z drożdżami.

Protokół ten rozwija tradycyjne wyświetlanie powierzchni drożdży w kierunku analizy tego, co normalnie byłoby wewnątrzkomórkowymi reakcjami enzymatycznymi w przestrzeni zewnątrzkomórkowej, umożliwiając analizę FasL tych zwykle trudnych do oceny interakcji.

Protokół ten umożliwia badanie preferencji substratowych różnych enzymów za pomocą metod wysokoprzepustowych oraz przeprowadzanie badań kinetycznych za pomocą prostego odczytu.

[Instruktor] Na początek rozmrozić porcję przygotowanych komórek drożdży na lodzie. Dodaj 0,5 do 1,5 mikrograma plazmidowego DNA zawierającego konstrukt wyświetlacza drożdży bezpośrednio do komórek. Następnie dodaj 0,5 mililitra roztworu transformacyjnego lub sterylnego 50% glikolu polietylenowego i 0,1-molowego roztworu octanu litu. Dokładnie połączyć mieszaninę komórek, plazmidowego DNA i roztworu transformacyjnego przez pipetowanie. Mieszaninę transformacyjną inkubować statycznie przez 30 do 60 minut w temperaturze 30 stopni Celsjusza i wirować mieszaninę w odstępach 15-minutowych. Zbierz komórki, odwirowując w temperaturze 1000G. Przygotuj 14-mililitrową probówkę hodowlaną z 4,5 mililitrami wzrostu komórek drożdży zawierających plazmid lub pożywki SDCAA. Ponownie zawiesić komórki zawierające pożądany plazmid w 500 mikrolitrach SDCAA i zaszczepić przygotowane 4,5 mililitra pożywki. Ostrożnie rozprowadzić 50 mikrolitrów z pięciu mililitrów zaszczepionej kultury na płytce SDCAA, nie przekłuwając ślimaka. Inkubować statycznie w temperaturze 30 stopni Celsjusza przez 48 godzin, aby określić wydajność transformacji. Teraz inkubuj pięć mililitrów kultury komórkowej SDCAA w inkubatorze z wytrząsaniem w temperaturze 30 stopni Celsjusza i 300 obr./min przez co najmniej 18 godzin. Monitoruj gęstość optyczną przy 600 nanometrach po 16 godzinach i powtórz ponownie po 20 godzinach. Gdy próbka osiągnie gęstość optyczną nieprzekraczającą sześciu, odwirować kulturę przez trzy minuty w temperaturze 2500 G i wyrzucić supernatant bez naruszania osadu drożdżowego. Ponownie zawiesić osad drożdży w indukcji ekspresji białka lub pożywce SRGCAA do końcowej gęstości optycznej przy 600 nanometrach mniejszych niż jeden. Inkubować kulturę drożdży w inkubatorze z wytrząsaniem w temperaturze 30 stopni Celsjusza i 300 obr./min przez co najmniej osiem godzin, ale nie dłużej niż 24 godziny. Następnie zmierz gęstość optyczną przy 600 nanometrach, aby określić gęstość komórek. Przygotuj bufor roboczy dla próbek, rozcieńczając 2X roboczy roztwór buforowy w stosunku jeden do dwóch wodą dejonizowaną w fiolce o pojemności 1,7 mililitra. Dodaj odpowiednią objętość kultury drożdży wymaganą do odzyskania dwóch milionów komórek drożdży do 1,7-mililitrowej fiolki dla każdej próbki. Wirować fiolkę przez jedną minutę w temperaturze 4500 G i za pomocą mikropipety ostrożnie usunąć i wyrzucić supernatant jako odpad niebezpieczny biologicznie. Ponownie zawiesić granulowane komórki w jednym mililitrze PBSA przed powtórzeniem wirowania i usuwania supernatantu. Trzymaj to na boku. Przygotować rekombinowany ludzki roztwór SHP-2 o końcowym stężeniu 1,000 nanomoli w całkowitej objętości reakcyjnej 20 mikrolitrów. Następnie dodaj 7,7 miligrama DTT do 10 mililitrów dejonizowanej wody w 15-mililitrowej stożkowej probówce, aby utworzyć pięciomilimolowy roztwór DTT. Teraz weź granulowane komórki i ponownie zawieś je w buforze roboczym, tak aby końcowa objętość reakcji wynosiła 20 mikrolitrów na próbkę. Dodać dwa mikrolitry pięciomilimolowego roztworu DTT do każdej próbki, aby uzyskać końcowe stężenie DTT 0,5 milimola. Dodaj przygotowaną objętość SHP-2 do każdej próbki, aby uzyskać końcową objętość 20 mikrolitrów i delikatnie wymieszaj za pomocą mikropipety. Owinąć pokrywki fiolek z próbką preparatem Parafilm, aby zapobiec wyciekom lub zanieczyszczeniu krzyżowemu. Próbki należy inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez dwie godziny na wirniku ze stałą prędkością. Po wyjęciu próbek z wirnika należy zatrzymać reakcję, dodając jeden mililitr PBSA do każdej próbki przed ich ponownym odwirowaniem przez jedną minutę. Następnie odrzucić supernatant. Ponownie zawiesić granulowane próbki w 20-mikrolitrowej mieszance odpowiadających im odczynników pierwotnych i inkubować przez 20 minut w temperaturze pokojowej. Po 20 minutach odwirować próbki o sile 4500 G przez jedną minutę i wyrzucić supernatant jako odpad niebezpieczny biologicznie. Umyj komórki raz, zawieszając je ponownie w jednym mililitrze PBSA przed ponownym odwirowaniem komórek. Teraz ponownie zawiesić próbki w 20-mikrolitrowej mieszance odpowiadających im odczynników wtórnych i inkubować przez 15 minut w ciemności. Po odwirowaniu próbek i odrzuceniu supernatantu, należy ponownie przepłukać komórki PBSA przed ich ponownym odwirowaniem. Następnie ponownie zawiesić umyte próbki w 300 do 500 mikrolitrach PBSA i przenieść je do pięciomililitrowych probówek polistyrenowych w celu analizy cytometrii przepływowej. Po przygotowaniu cytometru kliknij Plik, a następnie przycisk Nowy eksperyment, nazwij eksperyment i kliknij Zapisz, aby upewnić się, że uzyskane dane zostały zapisane w żądanej ścieżce do pliku. Wybierz ikonę wykresu kropkowego na górnym pasku narzędzi, aby utworzyć dwa lub więcej wykresów kropkowych dla każdej próbki. W przypadku jednego z wykresów kropkowych upewnij się, że nazwa osi x wyświetla kanał FSCA, a nazwa osi y wyświetla kanał SSCA. Dla innego wykresu wybierz nazwę osi x, aby wyświetlić kanał, w którym fluoryzuje odczynnik wtórny skierowany do pierwszorzędowego przeciwciała ze znacznikiem antyepitopowym, oraz nazwę osi y, aby wyświetlić kanał, w którym fluoryzuje odczynnik wtórny streptawidyny. Podaj opisową nazwę próbki, klikając prawym przyciskiem myszy rurkę, wybierając opcję Edytuj nazwę i wprowadzając nazwę próbki. Umieść każdą probówkę z próbką w uchwycie cytometru i kliknij przycisk Uruchom, aby rozpocząć ładowanie próbki i pobieranie danych. W razie potrzeby dostosuj zdarzenia, czas i natężenie przepływu. Zdefiniuj bramkę otaczającą zdrowe komórki drożdży na wykresie SSCA i FSCA. Następnie należy zarejestrować fluorescencję wszystkich próbek kontrolnych. Zdefiniuj strategię bramkowania dla utworzonego wykresu przed analizą próbek poddanych obróbce. Rejestruj fluorescencję próbek odfosforylowanych za pomocą cytometru i strategii bramkowania przed analizą danych za pomocą oprogramowania do cytometrii przepływowej. Oceń fosforylację, mierząc i porównując medianę osi y komórek wyrażających białko na swojej powierzchni oraz podstawową fosforylację zapewnianą przez niegrające komórki między próbkami a kontrolą. Na koniec oblicz procentową różnicę mediany fosforylacji, korzystając z podanego wzoru. Wpływ różnych stężeń fosfatazy SHP-2 i czasów inkubacji na medianę różnicy fosforylacji w substratach eksponowanych na powierzchni drożdży zilustrowano na tym rysunku. Procentowa mediana różnicy w fosforylacji zmniejszyła się z czasem we wszystkich stężeniach SHP-2, przy czym najwyższą defosforylację zaobserwowano przy stężeniu 1000 nanomolowych SHP-2 po czterech godzinach. Po dwóch godzinach inkubacji, 1000 nanomolowych SHP-2 spowodowało około 48,8% mediany różnicy fosforylacji, znacznie niższej niż stan 750 nanomolowych w tym samym punkcie czasowym. Nie zaobserwowano istotnej różnicy w medianie różnicy w fosforylacji, gdy inkubacja została przedłużona z dwóch godzin do trzech godzin w stężeniach SHP-2 500 nanomolowych, 750 nanomolowych i 1000 nanomolowych.