Przygotowanie nienaruszonej tkanki do analizy mikroskopowej warstwy komórek bielma w rozwijających się i dojrzałych nasionach Arabidopsis

Jednym z naszych zakresów badawczych jest nasiennictwo. Naszym celem jest odpowiedź na pytanie, w jaki sposób bielmo przyczynia się do kiełkowania nasion. Test in vitro zwany testem zahamowania wzrostu nasion ujawnił fizjologiczne znaczenie bielma w kiełkowaniu nasion. Nasiona rzodkiewnika są dość małe, a warstwa komórkowa bielma znajduje się poniżej testa, które są komórkami. Przygotowanie próbek bielma bez chemicznego wiązania jest trudne. Wcześniejsze analizy bielma wykorzystywały próbki utrwalone chemicznie, więc nie były w stanie zaobserwować ruchu białek organizmu. Nasz protokół umożliwia obrazowanie dynamiki komórek bielma w pięciu komórkach. Nasz protokół może być wykonany przy użyciu standardowego sprzętu laboratoryjnego i umożliwia głębszy wgląd w zdarzenia międzykomórkowe i mechanizmy molekularne oraz prawidłową funkcję bielma.

[Narrator] Aby rozpocząć uprawę roślin Arabidopsis na glebie lub wełnie mineralnej, aż do fazy kwitnienia. Zaznacz w pełni otwarte kwiaty kolorowymi nitkami, aby wskazać zero dni po kwitnieniu. Wybierz silikony od 12 do 16 dni po kwitnieniu do następnego zabiegu. Za pomocą cienkich nożyczek odetnij zaznaczone rozwijające się silikony na szypułce i zbierz je w 1,5-mililitrowych tubkach. Przygotuj mokrą bibułę filtracyjną do sekcji, aby zapobiec wysuszeniu i umieść próbkę pod mikroskopem stereoskopowym. Za pomocą dwóch kleszczy, jednego z grubymi końcówkami do trzymania, a drugiego z ostrymi końcówkami do rozdzierania. Oddziel zawór od reflum. Następnie za pomocą kleszczy z zamkniętymi końcówkami delikatnie podnieś rozwijające się nasiona z krzemionek, aby ich nie uszkodzić. Używając igły do wstrzykiwań o rozmiarze 27, stwórz bliznę o wielkości około 0,1 do 0,2 milimetra na jądrze i bielmie otaczającym zarodek. Przytrzymaj nasiona kleszczami, nie miażdżąc ich i zrób bliznę na styku liścieni i radykałów. Teraz wypchnij zarodek, ściskając nasiona kleszczami, uważając, aby nie zmiażdżyć otoczki nasiennej i zachowując jej okrągły kształt. Włożyć igłę do wstrzykiwań do pustej otoczki nasiennej w miejscu blizny i przekłuć ją od wewnątrz na zewnątrz. Następnie trzymaj igłę na miejscu i użyj kleszczyków z zamkniętą końcówką, aby zarysować powierzchnię Testa. Następnie odetnij jedną stronę koperty nasiennej, aby umożliwić jej otwarcie. Teraz za pomocą kleszczyków z ostrymi końcówkami otwórz kopertę z nasionami w arkuszu. Wyizolowana próbka powinna być teraz dwuwarstwowym arkuszem złożonym z bielma i Testa. Umieść suche nasiona Arabidopsis w 1,5 mililitrowej probówce i dodaj do niej jeden mililitr podwójnie destylowanej wody. Trzymaj nasiona wchłonięte przez co najmniej 40 minut w temperaturze pokojowej. Przygotuj mokrą bibułę filtracyjną na stoliku mikroskopu stereoskopowego do rozwarstwienia i za pomocą mikropipety o pojemności 1000 mikrolitrów przenieś wchłonięte nasiona na mokrą bibułę filtracyjną. Teraz umieść próbkę pod mikroskopem stereoskopowym. Za pomocą igły do wstrzykiwań wykonaj bliznę o wielkości około 0,2 milimetra na jądrze i bielmie otaczającym zarodek. Przytrzymaj nasiona kleszczami, nie miażdżąc ich i celuj w połączenie między liścieniem a rodnikiem dla blizny. Teraz wypchnij zarodek po uszczypnięciu nasion kleszczami. Unikaj zgniatania pustej otoczki nasiennej i zachowaj jej okrągły kształt. Za pomocą igły do wstrzykiwań odciąć zarówno górną, jak i dolną stronę pustej otoczki nasiennej, aby uformować ją w cylindryczną formę. Następnie przetnij cylindryczną otoczkę nasion wzdłuż jej środkowej osi, aby podzielić ją na dwie części. Wyniki powinny być dwuwarstwowymi arkuszami wykonanymi z bielma i testy. Umieścić wyizolowane próbki bielma w postaci arkuszy na szkiełku podstawowym i umieścić je w wodzie. Na koniec delikatnie umieść szkiełko nakrywkowe na próbce, upewniając się, że warstwa bielma jest skierowana do góry w kierunku szkiełka nakrywkowego. Użyj lakieru do paznokci lub smaru, aby uszczelnić krawędzie szkiełka nakrywkowego i zapobiec wysuszeniu przed obserwacją próbki pod mikroskopem. Liczne komórki bielma i ich struktury wewnątrzkomórkowe zostały z powodzeniem zobrazowane z nasion zebranych 14 dni po kwitnieniu przy użyciu ustalonego protokołu przygotowania. Fotociała wykryto wewnątrz jądra komórek bielma, wyrażając PHYB-GFP w świetle białym, potwierdzając ich obecność i lokalizację jądrową. Komórki bielma wykazywały odwracalne tworzenie się fotociała po naprzemiennej ekspozycji na światło dalekiej czerwieni i czerwieni, potwierdzając odwracalność zdjęcia PHYB i aktywność biologiczną do 4,5 godziny po sekcji. Wykonano fluorescencyjne obrazowanie poklatkowe mitochondriów w nienaruszonych komórkach bielma po trzech godzinach od zahamowania nasion i wykryto ruch mitochondriów. Bardziej dynamiczną ruchliwość mitochondriów zaobserwowano w komórkach bielma po jednym dniu hamowania nasion, co wskazuje na rosnącą aktywność w czasie.