Rozległa transdukcja mysich neuronów kory nowej przez wstrzyknięcie subbaraczynoidu AAV2
23 maja 2025
Opisano nową technikę powszechnego dostarczania wirusa związanego z adenowirusem, która wykorzystuje infuzję wirusa podpajęczynówkowego. Metoda ta nie tylko zapewnia szeroką transdukcję mysich neuronów kory nowej w warstwach powierzchownych, ale także powoduje selektywną ekspresję transgenu w neuronach piramidowych warstwy piątej, nawet przy użyciu nieselektywnego promotora.
Nasze badania koncentrują się na opracowaniu metody pozwalającej na transdukcję wirusową dużej objętości tkanki nerwowej w korze nowej myszy. Zazwyczaj zawiesina cząstek wirusa jest wstrzykiwana bezpośrednio do miąższu mózgu. W tym przypadku transfekcja obszaru jest określana przez dyfuzję cząsteczek wirusa w tkance mózgowej, które mają ograniczony zasięg.
Wstrzykujemy wirusy wektorowe AAV2 do przestrzeni podpajęczynówkowej przez powierzchnię mózgu. Odkryliśmy, że podanie wirusa podpajęczynówkowo doprowadziło do prawie czterokrotnego zwiększenia obszaru infekcji w porównaniu z wstrzyknięciem śródmiąższowym. Nowa technika zapewnia szeroką transdukcję neuronów kory nowej u dorosłych myszy i pomaga zachować tkankę mózgową do późniejszych optycznych lub elektrofizjologicznych zapisów aktywności neuronalnej.
Nasza metoda iniekcji pozwala na selektywną ekspresję transgenu w dużej warstwie populacji pięciu neuronów piramidowych, nawet przy użyciu silnego nieselektywnego promotora. Mechanizm takiej selektywności nie jest jednak do końca poznany. Aby rozpocząć, zabezpiecz przednie zęby znieczulonej myszy w listwie zębatej i zamontuj maskę zwierzęcą.
Ostrożnie umieść mysz na nausznikach. Ogol głowę od oczu do tyłu uszu, a następnie przetrzyj ogoloną powierzchnię 70% etanolem, a następnie 5% alkoholowym roztworem jodu. Zastosuj miejscowo sterylny 4% roztwór lidokainy i wstrzyknij podskórnie 0,02 mililitra deksametazonu, aby zmniejszyć ból i stan zapalny.
Za pomocą sterylnego skalpela i nożyczek wykonaj od czterech do pięciu milimetrowych nacięć w linii środkowej, zaczynając między uszami, aby otworzyć skórę głowy. Rozszerz nacięcie za pomocą nożyczek, aby uniknąć uszkodzenia czaszki. Przetrzyj powierzchnię czaszki 3% nadtlenkiem wodoru, aby uwidocznić bregmę i lambdę.
Natychmiast przerwać reakcję za pomocą 0,9% soli fizjologicznej chlorku sodu. Następnie użyj skrobaka do kości, aby usunąć tkankę z powierzchni czaszki. Zamontuj wstępnie przygotowany wtryskiwacz z napędem silnikowym za pomocą strzykawki Hamiltona na ramieniu stereotaktycznym.
Oświetl odsłoniętą czaszkę za pomocą chirurgicznego źródła światła i skieruj mikroskop na bregmę. Patrząc przez mikroskop, manipuluj ramieniem stereotaktycznym, aby wyrównać końcówkę igły bezpośrednio nad bregmą. Wyrównaj bregmę i lambdę poziomo za pomocą końcówki igły.
Wróć do bregmy i zapisz współrzędne. Przesuń wskazówkę do obliczonych współrzędnych. Opuść go do nowej pozycji i zaznacz go.
Wybierz miejsce wstrzyknięcia wirusa w pobliżu celu, biorąc pod uwagę rozprzestrzenianie się wirusa. Teraz użyj sterylnego wiertła dentystycznego o średnicy od 0,5 do 0,8 milimetra, aby wykonać małą kraniotomię podczas oglądania przez mikroskop. Użyj sprężonego powietrza, aby zdmuchnąć pył kostny.
Wykąp otwór sterylną solą fizjologiczną i usuń nadmiar bawełnianym wacikiem. Następnie użyj igły o rozmiarze 27 z haczykowatą końcówką lub drobną pęsetą, aby usunąć pozostałą kość, uważając, aby nie uszkodzić opony twardej. Przykryj czaszkę sterylnym ręcznikiem papierowym zwilżonym solą fizjologiczną.
Następnie umieść sterylną przezroczystą folię na powierzchni czaszki. Przesuń ramię stereotaktyczne do tyłu i wyrównaj igłę mikrostrzykawki nad przezroczystą folią. Następnie dozuj nadmiar oleju, aż pozostaną dwa mikrolitry.
Odpipetować objętość wstrzyknięcia wirusa i kolejne dwa mikrolitry wirusa na przezroczystą folię. Patrząc przez mikroskop, opuść końcówkę igły do środka kropli wirusa. Teraz załaduj wirusa do mikrostrzykawki za pomocą zmotoryzowanego wtryskiwacza.
Usuń zwilżony papier z czaszki i osusz obszar bawełnianym wacikiem. Zmień położenie ramienia stereotaktycznego i igły powyżej miejsca wkłucia. Następnie dozuj kroplę wirusa, aby sprawdzić, czy igła nie jest zatkana.
Wykonaj małe nacięcie w oponie twardej za pomocą igły o rozmiarze 30 z końcówką w kształcie haczyka. Opuścić igłę strzykawki do opony twardej i obliczyć głębokość wprowadzenia na podstawie punktu styku z powierzchnią. Powoli wbij igłę do kory na głębokość 300 mikrometrów, odczekaj dwie do trzech minut, cofnij do 200 mikrometrów i odczekaj kolejne dwie do trzech minut.
Rozpocznij wstrzykiwanie wirusa od 0,06 mikrolitra na minutę, co daje w sumie jeden mikrolitr. Po infuzji należy trzymać igłę w miejscu docelowym przez 10 minut, aby umożliwić dyspersję wirusa. Następnie powoli wycofaj igłę, aby uniknąć przepływu wstecznego.
Dozuj kroplę wirusa, aby upewnić się, że igła nie jest zatkana. Zamknij nacięcie skóry głowy za pomocą szwów wchłanialnych lub niewchłanialnych 5-0. Podanie pajęczynówki AAV2 doprowadziło do znacznie większego obszaru infekcji neuronalnej w porównaniu z tradycyjnym wstrzyknięciem dokorowym, z prawie czterokrotną ekspansją zarówno w kierunku przyśrodkowo-bocznym, jak i przyśrodkowo-ogonowym.
Wstrzyknięcie wirusa pajęczynówkowego spowodowało silne zielone fluorescencyjne znakowanie neuronów w warstwach kory mózgowej drugiej, trzeciej i piątej, podczas gdy warstwy czwarta i szósta nie wykazywały znakowanych ciał komórkowych, ale wykazywały widoczne odpowiednio dendryty i aksony. Cząstki fluorescencyjne, które zostały dodane do wstrzykniętej zawiesiny wirusa podczas wstrzyknięcia podpajęczynówkowego, znaleziono wzdłuż powierzchni mózgu, co wskazuje na rozprzestrzenianie się wirusa przez płyn mózgowo-rdzeniowy, z szerszym pokryciem powierzchni niż znakowanie neuronalne. Duży rozkład powierzchniowy zielonej fluorescencji w odcinkach czołowych potwierdził rozległe zakażenie kory mózgowej po wstrzyknięciu podpajęczynówkowym, w przeciwieństwie do małego miejscowego zakażenia obserwowanego przy standardowym wstrzyknięciu.
W warstwach superziarnistych znaczna część transdukowanych neuronów wykazywała współekspresję parwalbuminy lub kalbindyny, podczas gdy w warstwie piątej nie wykryto żadnych współznakowanych interneuronów, a wszystkie zakażone komórki były reprezentowane wyłącznie przez neurony piramidowe.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejsze badanie przedstawia nową metodę dostarczania wirusa towarzyszącego adenowirusom (AAV) poprzez infuzję do przestrzeni podpajęczynówkowej u myszy. Technika ta zwiększa zakres transdukcji neuronów neocortexu, zapewniając jednocześnie selektywną ekspresję transgenu w neuronach piramidowych warstwy piątej. Metoda ta nie tylko zwiększa obszar infekcji, ale również pozwala na zachowanie tkanki mózgowej do dalszych rejestracji neuronalnych.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Dostarczanie genów
- Transdukcja neuronalna
Wprowadzenie
- Cząsteczki wirusowe są zazwyczaj wstrzykiwane bezpośrednio do mózgu, co ogranicza zakres transdukcji.
- Podanie do przestrzeni podpajęczynówkowej ma na celu przełamanie ograniczeń metod tradycyjnych.
- Badanie analizuje, w jaki sposób metoda ta wpływa na ekspresję transgenu i infekcję neuronalną.
Cel badania
- W celu zwiększenia wydajności transdukcji wirusowej w dużych objętościach tkanki nerwowej.
- W celu zbadania wzorców ekspresji transgenów w konkretnych warstwach kory mózgowej.
- W celu oceny możliwości zastosowania tej metody w przyszłych rejestracjach aktywności neuronalnej.
Zastosowane metody
- Główna platforma obejmowała in vivo iniekcję wirusa do nowokory kostnej myszy.
- Model biologiczny składa się z dorosłych myszy z podaniem wektora AAV2.
- Kluczowe etapy obejmowały przygotowanie chirurgiczne, precyzyjne wprowadzenie igły oraz czasową infuzję wirusa.
- Krytyczne kroki zostały wykonane w celu zapewnienia warunków sterylnych i zminimalizowania uszkodzeń tkanek.
Główne wyniki
- Nowa technika doprowadziła do niemal czterokrotnego zwiększenia obszaru infekcji neuronalnej w porównaniu z metodami tradycyjnymi.
- Zaobserwowano silną ekspresję w warstwach drugiej, trzeciej i piątej, co potwierdza selektywne celowanie w neurony piramidalne warstwy piątej.
- Odnotowano wyraźne rozprzestrzenianie się wirusa poprzez płyn mózgowo-rdzeniowy, co wskazuje na skuteczną dystrybucję.
Wnioski
- Niniejsze badanie przedstawia skuteczną metodę zwiększania wydajności transdukcji wirusowej na rozległych obszarach neocortex.
- Umożliwia ona selektywną ekspresję w konkretnych populacjach neuronów, dostarczając cennych informacji dla przyszłych badań neurologicznych.
- Wyniki te mają znaczenie dla zrozumienia terapii genowej oraz mechanizmów neuronalnych.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Szeroki i selektywny transfer genów do neuronów stanowi kluczowe wyzwanie w odkrywaniu leków neurofarmakologicznych, wpływając na wierność modelowania chorób i walidację celów terapeutycznych. Metoda infuzji AAV2 do przestrzeni podpajęczynowej umożliwia szeroką, warstwowo specyficzną transdukcję w neokorze myszy, co wspiera wysokoprzepustowe badania funkcjonalne przy jednoczesnym zachowaniu tkanki do dalszych analiz. Podejście to zwiększa pewność prognostyczną we wczesnych etapach projektów badawczych z zakresu neuronauk i ułatwia wdrażanie solidnych procesów translacyjnych.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Umożliwia badanie szlaków neuronalnych w rozległych obszarach kory mózgowej w celu mechanistycznej redukcji ryzyka.
- Wspiera funkcjonalną walidację celów genetycznych w populacjach neuronalnych istotnych dla przebiegu choroby.
- Ułatwia selekcję projektów w portfolio poprzez zapewnienie skalowalnego i powtarzalnego dostarczania genów do weryfikacji hipotez.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Przygotowuje zwalidowane systemy neuronalne do wysokoprzepustowego przesiewania optycznego lub elektrofizjologicznego.
- Poprawia powtarzalność testów poprzez zapewnienie spójnej i rozległej ekspresji transgenu.
- Umożliwia ilościową ocenę odpowiedzi neuronalnych w różnych warstwach kory mózgowej.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Jest zgodne z modelami istotnymi dla przebiegu choroby poprzez celowanie w konkretne podtypy neuronów, takie jak neurony piramidalne warstwy piątej.
- Zachowuje integralność tkanki na potrzeby badań podłużnych i odkrywania biomarkerów.
- Wspiera postępy z uwzględnieniem analizy ryzyka, umożliwiając solidną walidację przedkliniczną funkcji genów.
Integracja potoku i przepływu pracy
Ta metoda podawania AAV2 do przestrzeni podpajęczynówkowej integruje się z kontinuum od etapu odkrycia do badań przedklinicznych, łącząc wczesną walidację celu z późniejszymi badaniami funkcjonalnymi i translacyjnymi.
- Biologia odkrywcza: Rozszerza testowanie hipotez na większe, bardziej reprezentatywne populacje neuronów.
- Przesiewanie: Zapewnia zestandaryzowane, powtarzalne dostarczanie genów w celu opracowania testów i oceny związków.
- Analityka: Dostarcza ilościowe, rozdzielcze przestrzennie dane o transdukcji do analiz porównawczych.
- Badania translacyjne: Pozwala na zachowanie tkanki do wielomodalnych odczytów, wspierając dopasowanie biomarkerów i modelowanie chorób.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Tworzy skalowalną platformę do wielokrotnego zastosowania w programach badawczo-rozwojowych w dziedzinie neuronauki.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwowy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność predykcyjną i redukuje niejednoznaczność mechanistyczną w badaniach nad celami neuronalnymi.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje dostarczanie genów, poprawiając powtarzalność i skalowalność w ramach eksperymentów.
- Wartość strategiczna: Umożliwia podejmowanie lepszych decyzji typu go/no-go dzięki wsparciu generowania rzetelnych danych o wysokiej zawartości informacji.
- Wpływ na portfolio: Ułatwia priorytetyzację skorygowaną o ryzyko oraz rozwój zasobów w dziedzinie neuronauki.
Kwestie wdrożeniowe
- Wymaga doświadczenia w chirurgii stereotaktycznej oraz w pracy z wektorami wirusowymi.
- Wymaga precyzyjnej aparatury do kontrolowanej infuzji do przestrzeni podpajęczynówkowej i konserwacji tkanek.
- Konieczna jest standaryzacja protokołów iniekcji oraz analizy danych pomiędzy zespołami.
- Możlizna jest konieczność adaptacji metody dla różnych modeli zwierzęcych lub obszarów mózgu.
- Mechanizmy potencjalnej selektywności nie zostały jeszcze w pełni wyjaśnione, co wpływa na interpretację wyników.
