Synteza złożonych gigantycznych pęcherzyków jednowarstwowych: biomimetyczny model komórek jądrzastych

W artykule przedstawiono metodę otrzymywania złożonych gigantycznych pęcherzyków jednowarstwowych (cGUV) o strukturze pęcherzyka w pęcherzyku, z dostosowaną przewodnością elektryczną w obszarach wewnętrznych, pierścieniowych i zewnętrznych. Elektroformacja syntetyzuje proste GUV, które są przekształcane w stomatocyty i cGUV poprzez szok osmotyczny, zapewniając cenny model do badania biofizyki komórek jądrzastych.

Przeprowadziliśmy szczegółowe badania nad syntezą i elektrohydrodynamiką złożonych gigantycznych pęcherzyków jednowarstwowych, aby ustalić, że są one biomagnetycznymi odpowiednikami komórek eukariotycznych. Próba ma na celu zrozumienie technologii obejmujących zastosowanie pola elektrycznego w komórkach biologicznych, takich jak elektroporacja ogniw i elektrodeformacja ogniw.

Połączenie mikroskopii fluorescencyjnej i świetlnej, nanosekundowych impulsów elektrycznych, oscyloskopu i źródeł zasilania oraz innowacyjnych metod syntezy służy do rozwoju badań w tej dziedzinie. Wyzwaniem w syntezie dobrze uformowanych związków GUV jest wrażliwość metody na temperaturę, rodzaje lipidów i zastosowany skład. W tej pracy pokazujemy to dla DMPC i systemu cholesterolowego, ale uogólnienie tego pozostaje wyzwaniem. W literaturze zsyntetyzowano proste GUV, które naśladują komórki nukleinowe. Syntetyzujemy złożony gigantyczny pęcherzyk, aby naśladować jądrzaste komórki ze strukturą obronną zastawki, otaczając wewnętrzny pęcherzyk o wielkości mniej więcej połowy wielkości pęcherzyka zewnętrznego.

Skupimy się na badaniu wpływu impulsów mikro i nanosekundowych na pęcherzyk wewnętrzny, który jest naśladowcą jądra komórki biologicznej w kontekście elektroporacji.

[Narrator] Na początek dokładnie wyczyść szkiełka z tlenku indu i cyny lub pokryte ITO roztworem płynu do naczyń i spłucz wodą dejonizowaną o przewodności 0,055 mikrosiemensa na centymetr. Następnie za pomocą 100% roztworu etanolu ponownie wyczyść szkiełka i spłucz wodą dejonizowaną. Szkiełka suszymy w piekarniku nastawionym na 85 stopni Celsjusza. Zidentyfikuj przewodzącą stronę każdego szkiełka z powłoką ITO za pomocą miernika cęgowego. Przymocuj czysty szkiełko do stopnia kodera wirowego za pomocą podciśnienia, upewniając się, że strona przewodząca jest skierowana do góry. Nałóż 25 mikrolitrów roztworu lipidowego, jedna to cztery kropelki na przewodzącą stronę jednego szkiełka ITO. Weź kolejny szkiełko i nałóż 25 mikrolitrów roztworu lipidowego dwa w ten sam sposób. Wysuszyć próżniowo oba szkiełka pokryte lipidami w eksykatorze przechowywanym w ciemności przez co najmniej dwie godziny. Następnie ułóż szkiełko ITO pokryte lipidem z szkiełkiem lipidowym równolegle z czystym szkiełkiem, upewniając się, że przewodzące strony są skierowane do siebie, i umieść między nimi przekładkę z gumy silikonowej o grubości trzech milimetrów. Uszczelnij zestaw zaciskiem, aby utworzyć komorę galwaniczną. Teraz napełnij komorę 100-milimolowym roztworem sacharozy za pomocą dwumililitrowej strzykawki. Podłączyć wyjściowy generatora funkcyjnego do prowadnic z powłoką ITO z generatorem funkcyjnym. Umieść obie komory elektroformacyjne w inkubatorze utrzymywanym w temperaturze od 38 do 40 stopni Celsjusza. Zastosuj pole elektryczne prądu przemiennego o napięciu woltów od szczytu do szczytu przy częstotliwości 10 Hz za pomocą dwukanałowego generatora funkcyjnego przez cztery godziny. Po inkubacji odłączyć komory elektroformacji od generatora funkcyjnego. Wyjmij je z inkubatora i pozwól im ostygnąć do temperatury pokojowej. Za pomocą strzykawki zbierz zsyntetyzowane gigantyczne pęcherzyki jednowarstwowe z każdej komory i przenieś je do oddzielnych dwumililitrowych probówek do mikrowirówek. Inkubować probówki w temperaturze pokojowej między 25 a 27 stopni Celsjusza przez godzinę przed przystąpieniem do wstrząsu osmotycznego. Przenieś 200 mikrolitrów prostych, gigantycznych pęcherzyków jednowarstwowych lub sGUV, zawieszonych w pożywce hydratyzującej zawierającej 100-milimolowy roztwór sacharozy do komory obserwacyjnej i wprowadź 125 mikrolitrów 300-milimolowego roztworu glukozy w celu wywołania wstrząsu osmotycznego i zainicjowania zmian kształtu. Pozwól sGUV, które obecnie przechodzą wstrząsowi osmotycznemu, odpocząć przez godzinę w komorze obserwacyjnej umieszczonej na stoliku mikroskopowym. Wykonaj różnicową mikroskopię interferencyjną, kontrastową i epifluorescencyjną przy użyciu mikroskopu odwróconego wyposażonego w kamerę monochromatyczną. Użyj soczewek obiektywowych Plan Fluor o bardzo dużej odległości roboczej 20X na 0,45 i 40X na 0,60, aby obserwować zmiany kształtów w sGUV. Do epifluorescencji użyj zestawu zielonych filtrów ze wzbudzeniem na 510 do 560 nanometrów, lustra dichroicznego na 575 nanometrach i filtra barierowego na 590 nanometrach dla dwuwarstw zabarwionych na czerwono Nialla. Monitoruj zmiany kształtów w komorze obserwacyjnej za pomocą kontrastu różnicowego i mikroskopii epifluorescencyjnej z soczewkami obiektywowymi Plan Fluor. Obserwuj tworzenie się pęcherzyków stomatocytarnych w miarę postępu zmiany kształtu. Monitoruj, jak najpierw osiadają większe pęcherzyki, a następnie z czasem zwiększa się liczba mniejszych pęcherzyków. Następnie dodaj roztwór soli, aby dostosować przewodność w różnych obszarach cGUV przed wywołaniem wstrząsu osmotycznego. Na przykład, aby uzyskać wyższą przewodność w obszarach zewnętrznych i wewnętrznych niż w obszarze pierścieniowym, przenieś 200 mikrolitrów roztworu sacharozy do komory elektrooporowej. Dodaj 20 mikrolitrów 7,5-milimolowego roztworu soli do komory i wywołaj szok osmotyczny za pomocą 125 mikrolitrów 300-milimolowego roztworu glukozy. Pozwól sGUV wstrząsu osmotycznego spoczywać w komorze przez trzy do czterech godzin. Upewnij się, że powstałe cGUV mają wyższą przewodność w obszarach zewnętrznych i wewnętrznych w porównaniu z obszarem pierścieniowym. Aby przeprowadzić elektrodeformację cGUV, należy rozmieścić druty elektrodowe w odległości 500 mikrometrów od siebie i przyłożyć potencjał elektryczny prądu przemiennego 7,5 V od szczytu do szczytu przy 100 kilohercach za pomocą generatora funkcyjnego. Po przyłożeniu pola elektrycznego nagraj wideo z prędkością 10 klatek na sekundę i obserwuj spłaszczoną deformację pęcherzyków zewnętrznych i deformację pęcherzyków wewnętrznych. Następnie załaduj mieszaninę cGUV do szkiełka wnękowego i uszczelnij szkiełkiem nakrywkowym, aby zapobiec przemieszczaniu się. Użyj laserowego skaningowego mikroskopu konfokalnego, aby przeanalizować morfologię cGUV poprzez skanowanie w osi Z z krokiem o wielkości jednego mikrometra. Do obrazowania zastosuj soczewkę obiektywową Plan Apochromat 40X na 1,3 oleju DIC. Użyj czerwonego trybu jednokanałowego ze wzbudzeniem 561 nanometrów i emisją od 561 do 695 nanometrów, aby zobrazować cGUV wybarwiony czerwienią Nialla lub rodaminą PE. Zmodyfikuj i wyodrębnij plik . Plik obrazu CZI za pomocą oprogramowania połączonego z mikroskopem. Wstawianie elementów graficznych, takich jak podziałki liniowe, oraz włączanie widoków 2D i 3D. Następnie przejdź do metody przetwarzania i parametrów, aby dostosować żądane ustawienia. Następnie kliknij Zastosuj, aby wyeksportować obraz w formacie JPG. Na koniec otwórz plik w oprogramowaniu ImageJ. Aby wstawić pasek skali, przejdź do analizy, a następnie ustaw skalę do kalibracji, a następnie wybierz analizę, a następnie narzędzia i pasek skali, aby go zastosować. Konfokalne obrazowanie stosu Z potwierdziło, że pęcherzyki wewnętrzne były całkowicie oddzielone od pęcherzyków zewnętrznych i uniesione w płaszczyźnie Z ze względu na mniejszą gęstość roztworu wewnętrznego. Pośredni stan stomatocytów wykazywał wąską szyjkę łączącą pęcherzyki wewnętrzne i zewnętrzne przed całkowitym rozdzieleniem. Zróżnicowaną populację form pęcherzykowych, w tym wiele pęcherzyków wewnętrznych, ciała w kształcie gwiazdy i struktury rurkowe, zaobserwowano sześć godzin po wstrząsie osmotycznym. Duża obfitość cGUV została utworzona przy użyciu mieszaniny lipidów 1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-fosfocholiny i cholesterolu w stosunku 63 do 37 molowych. Pod wpływem pola elektrycznego prądu przemiennego cGUV wykazywały deformację, przy czym pęcherzyk zewnętrzny tworzył spłaszczony kształt, a pęcherzyk wewnętrzny tworzył kształt prolatki.