Name: Synteza złożonych gigantycznych pęcherzyków jednowarstwowych: biomimetyczny model komórek jądrzastych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-07-03T13:10:00.000+00:00
Duration: 10 min 10 s
Description: Poznaj metodę syntezy złożonych gigantycznych pęcherzyków jednowarstwowych jako biomimetycznych modeli komórek jądrzastych. Technika elektroformowania i szoku osmotycznego umożliwia badanie elektrohydrodynamiki lipidowych układów.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Rupesh Kumar dziękuje Ministerstwu Rozwoju Zasobów Ludzkich (MHRD), Rządowi Indii, za stypendium PMRF i dotację na nieprzewidziane wydatki. Z wdzięcznością wyrażamy uznanie dla mikroskopii konfokalnej z skanowaniem laserowym znajdującej się w Centralnym Ośrodku, IRCC, IIT Bombay.

1. Preparation of lipid mixture solutions
<ol>
	<li>Przygotuj 1 mL roztworu DMPC i cholesterolu w proporcji molowej 63:37 o stężeniu końcowym 5 mg/mL. W tym celu dodaj 149 µL DMPC (25 mg/mL stoku otrzymanego w chloroformie), 252 µL cholesterolu (5 mg/mL cholesterolu rozpuszczonego w chloroformie) i 599 µL chloroformu.</li>
	<li>Przygotuj kolejny 1 mL roztworu DMPC: Cholesterol w proporcji molowej 57:43 o stężeniu 5 mg/mL, wymieszaj 139,8 µL DMPC (25 mg/mL stoku otrzymanego w chloroformie), 301 µL cholesterolu (5 mg/mL, przygotowanego z proszku rozpuszczonego w chloroformie) i 559,2 µL chloroformu.</li>
	<li>Aby zabarwić dwuwarstwową warstwę lipidową, dodaj 100 µL Czerwieni Nilu (z 5 mM stoku roztworu) do 1 mL mieszaniny lipidów zawierającej DMPC i cholesterol w proporcji molowej 63:37 (opisane w punktach 1.1 i 1.2). Alternatywnie, dodaj 30 µL Liss Rhod-PE (1mg/mL stoku Liss Rhod-PE) do 1 mL przygotowanej mieszaniny lipidów (opisane w punktach 1.1 i 1.2). 
	UWAGA: Ponieważ rozpuszczalnik (chloroform) jest bardzo lotny, po wielokrotnym otwarciu fiolki w celu użycia stoku (25 mg/mL DMPC) może on się skoncentrować, co może zmienić skład.</li>
</ol>
2. Protokół elektroformacji do syntezy prostych gigantycznych pojedynczych otoczek wielowarstwowy (sGUVs)
<ol>
	<li>Dokładnie wyczyść szklane ślizgi pokryte tlenkiem cyny i indu (ITO) za pomocą roztworu mydła do naczyń i spłucz dejonizowaną wodą (0,055 µS/cm). Wyczyść ślizgi za pomocą 100% roztworu etanolu, spłucz dejonizowaną wodą i osusz w piekarniku w temperaturze 85 °C.</li>
	<li>Zidentyfikuj przewodzącą stronę ślizgów pokrytych ITO za pomocą klawiatury. Zabezpiecz wyczyszczony ślizg pokryty ITO na stojaku wirówki za pomocą próżni z przewodzącą stroną skierowaną w górę.</li>
	<li>Nałóż 25 µL roztworów lipidowych (przygotowane w punkcie 1.1) przez nałożenie czterech kropli roztworu na przewodzącą stronę ślizgu ITO. Następnie weź inny ślizg ITO i nałóż 25 µL roztworów lipidowych (przygotowane w punkcie 1.2) przez nałożenie czterech kropli roztworu na przewodzącą stronę ślizgu ITO.</li>
	<li>Susz oba szklane ślizgi pokryte lipidami w wysuszarce, która jest trzymана w ciemności przez co najmniej 2 godziny. 
	UWAGA: Ochrona przed światłem chroni lipidy przed możliwymi zmianami chemicznymi.</li>
	<li>Ułóż ślizg pokryty ITO (pokryty lipidem przygotowanym w punkcie 1.1) równolegle z innymi czystymi ślizgami ITO, przewodzące strony skierowane jedna ku drugiej, z 3 mm grubą gumową przestrzenią pomiędzy nimi. Uszczelnij układ za pomocą zaciskacza, aby stworzyć bezpieczną komorę elektroformacyjną.</li>
	<li>Wykonaj ten sam proces opisany w punkcie 2.5 dla ślizgu pokrytego ITO z roztworem lipidowym przygotowanym w punkcie 1.2, aby utworzyć komorę elektroformacyjną.</li>
	<li>Umieść obie komory w inkubatorze utrzymywanym w temperaturze 38-40 °C i napełnij komorę 100 mM roztworem sacharozy za pomocą strzykawki 2 mL. Zastosuj przemienne pole elektryczne 5 Vpp o częstotliwości 10 Hz za pomocą dwukanałowego generatora funkcji przez 4 godziny. 
	UWAGA: Upewnij się, że przewodząca strona ślizgu ITO jest poprawnie zaciśnięta do kleszczy krokodyla, które łączą się z generatorem funkcji.</li>
	<li>Odłącz komorę elektroformacyjną od generatora funkcji. Wyjmij komorę z inkubatora i pozwól jej ostygnąć do temperatury pokojowej. Zebraj syntetyzowane sGUVs z obu komór za pomocą strzykawki i przenieś je do 2 mL mikroprobówek i inkubatora w temperaturze pokojowej (25-27 °C) przez 1 godzinę przed poddaniem je szokowi osmotycznemu.</li>
</ol>
3. Przejście kształtu w szoku osmotycznym (sGUV-do-Stomatocyt-do-cGUV)
<ol>
	<li>Przenieś 200 µL sGUVs zawieszonych w mediach nawadniających zawierających 100 mM roztworu sacharozy do komory obserwacyjnej.</li>
	<li>Wprowadź 125 µL roztworu glukozy (300 mM) do tej zawiesiny sGUV zawierającej 200 µL 100 mM sacharozy w komorze obserwacyjnej, aby wywołać szok osmotyczny, który inicjuje przemianę kształtu sGUVs. 
	UWAGA: Stosuj ten sam proces (podany w punkcie 3) do syntezy sGUV z kompozycji lipidowej podanymi w punktach 1.1 i 1.2 dla przemiany kształtu napędzanej szokiem osmotycznym.</li>
	<li>Pozwól sGUVs indukowanym szokim osmotycznym odpoczywać przez 1 godzinę w komorze obserwacyjnej umieszczonej na scenie mikroskopu.</li>
	<li>Aby przeprowadzić i obserwować przemianę kształtu sGUVS, umieść komorę obserwacyjną (komora elektrofuzyjna, łożysko Petriego, szkło wklęsłe lub do

<ol><li>Dimova, R. Chapter one - Giant vesicles: A biomimetic tool for membrane characterization. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDimova%2C+R+%22Advances+in+planar+lipid+bilayers+and+liposomes%22">Advances in planar lipid bilayers and liposomes</a>. Iglic, A. 16, 1-50 (2012).</li>
<li>Maoyafikuddin, M., Thaokar, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+the+waveform+of+the+pulsed+electric+field+on+the+cylindrical+deformation+of+uncharged+giant+unilamellar+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Effect of the waveform of the pulsed electric field on the cylindrical deformation of uncharged giant unilamellar vesicles.</a> Langmuir. 39 (28), 9660-9670 (2023).</li>
<li>Nair, K. S., Bajaj, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+giant+unilamellar+vesicle+preparation+techniques+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Colloid+Interface+Sci%22%5BJournal%5D)">Advances in giant unilamellar vesicle preparation techniques and applications.</a> Adv Colloid Interface Sci. 318, 102935(2023).</li>
<li>Göpfrich, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One-pot+assembly+of+complex+giant+unilamellar+vesicle-based+synthetic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synth+Biol%22%5BJournal%5D)">One-pot assembly of complex giant unilamellar vesicle-based synthetic cells.</a> ACS Synth Biol. 8 (5), 937-947 (2019).</li>
<li>Chen, S., Sun, Z. G., Murrell, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+reconstitution+of+the+actin+cytoskeleton+inside+giant+unilamellar+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">In vitro reconstitution of the actin cytoskeleton inside giant unilamellar vesicles.</a> J Vis Exp. (186), e64026(2022).</li>
<li>Merkle, D., Kahya, N., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstitution+and+anchoring+of+cytoskeleton+inside+giant+unilamellar+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22ChemBioChem%22%5BJournal%5D)">Reconstitution and anchoring of cytoskeleton inside giant unilamellar vesicles.</a> ChemBioChem. 9 (16), 2673-2681 (2008).</li>
<li>Fink, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+cues+govern+shape+and+cytoskeletal+organization+in+giant+unilamellar+lipid+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synth+Biol%22%5BJournal%5D)">Extracellular cues govern shape and cytoskeletal organization in giant unilamellar lipid vesicles.</a> ACS Synth Biol. 12 (2), 369-374 (2023).</li>
<li>Angelova, M. I., Dimitrov, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liposome+electroformation%5BTitle%5D)+AND+%22Faraday+Discuss+Chem+Soc%22%5BJournal%5D)">Liposome electroformation.</a> Faraday Discuss Chem Soc. 81, 303-311 (1986).</li>
<li>Angelova, M. I., Soléau, S., Meleard, P., Faucon, F., Bothorel, P. Preparation of giant vesicles by external AC electric fields. Kinetics and applications. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAngelova%2C+MI+%22Trends+in+Colloid+and+Interface+Science+VI.+Progress+in+Colloid+%26+Polymer+Science%22">Trends in Colloid and Interface Science VI. Progress in Colloid & Polymer Science</a>. Helm, C., Loesche, M., Moehwald, H. 89, 127-131 (1992).</li>
<li>Weinberger, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gel-assisted+formation+of+giant+unilamellar+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Gel-assisted formation of giant unilamellar vesicles.</a> Biophys J. 105 (1), 154-164 (2013).</li>
<li>Maoyafikuddin, M., Pundir, M., Thaokar, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Starch+aided+synthesis+of+giant+unilamellar+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Phys+Lipids%22%5BJournal%5D)">Starch aided synthesis of giant unilamellar vesicles.</a> Chem Phys Lipids. 226, 104834(2020).</li>
<li>Shi, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphological+transformations+of+vesicles+with+confined+flexible+filaments%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Morphological transformations of vesicles with confined flexible filaments.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 120 (18), e2300380120(2023).</li>
<li>Litschel, T., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+reconstitution+inside+giant+unilamellar+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biophys%22%5BJournal%5D)">Protein reconstitution inside giant unilamellar vesicles.</a> Annu Rev Biophys. 50, 525-548 (2021).</li>
<li>Kurihara, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-reproduction+of+supramolecular+giant+vesicles+combined+with+the+amplification+of+encapsulated+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Chem%22%5BJournal%5D)">Self-reproduction of supramolecular giant vesicles combined with the amplification of encapsulated DNA.</a> Nat Chem. 3 (10), 775-781 (2011).</li>
<li>Zong, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+fissionable+artificial+eukaryote-like+cell+model%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Chem+Soc%22%5BJournal%5D)">A fissionable artificial eukaryote-like cell model.</a> J Am Chem Soc. 139 (29), 9955-9960 (2017).</li>
<li>Zong, W., Li, Q., Zhang, X., Han, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deformation+of+giant+unilamellar+vesicles+under+osmotic+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Colloids+Surf+B%3A+Biointerfaces%22%5BJournal%5D)">Deformation of giant unilamellar vesicles under osmotic stress.</a> Colloids Surf B: Biointerfaces. 172, 459-463 (2018).</li>
<li>Shin, J., Jang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multicompartment+synthetic+vesicles+for+artificial+cell+applications%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Appl+Eng+Mater%22%5BJournal%5D)">Multicompartment synthetic vesicles for artificial cell applications.</a> ACS Appl Eng Mater. 2 (12), 2758-2770 (2024).</li>
<li>Riske, K. A., Dimova, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electro-deformation+and+poration+of+giant+vesicles+viewed+with+high+temporal+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Electro-deformation and poration of giant vesicles viewed with high temporal resolution.</a> Biophys J. 88 (2), 1143-1155 (2005).</li>
<li>Maoyafikuddin, M., Kulkarni, S. V., Thaokar, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+method+and+high+salt+concentration+can+affect+electrodeformation+of+GUVs+under+strong+pulsed+DC+fields%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Omega%22%5BJournal%5D)">Synthesis method and high salt concentration can affect electrodeformation of GUVs under strong pulsed DC fields.</a> ACS Omega. 10 (7), 6427-6436 (2025).</li>
<li>Behera, N., Thaokar, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Numerical+modeling+of+giant+pore+formation+in+vesicles+under+msPEF-induced+electroporation%3A+Role+of+charging+time+and+waveform%5BTitle%5D)+AND+%22Bioelectrochemistry%22%5BJournal%5D)">Numerical modeling of giant pore formation in vesicles under msPEF-induced electroporation: Role of charging time and waveform.</a> Bioelectrochemistry. 164, 108926(2025).</li>
<li>Kumar, R., Chakrabarti, R., Thaokar, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Compound+giant+unilamellar+vesicles+as+a+bio-mimetic+model+for+electrohydrodynamics+of+a+nucleate+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Soft+Matter%22%5BJournal%5D)">Compound giant unilamellar vesicles as a bio-mimetic model for electrohydrodynamics of a nucleate cell.</a> Soft Matter. 20 (35), 6995-7011 (2024).</li>
<li>Sinha, K. P., Thaokar, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrohydrodynamics+of+a+compound+vesicle+under+an+AC+electric+field%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Physics%22%5BJournal%5D)">Electrohydrodynamics of a compound vesicle under an AC electric field.</a> Journal of Physics. 29 (27), 275101(2017).</li>
<li>Méléard, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bending+elasticities+of+model+membranes%3A+Influences+of+temperature+and+sterol+content%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Bending elasticities of model membranes: Influences of temperature and sterol content.</a> Biophys J. 72 (6), 2616-2629 (1997).</li>
<li>Dimova, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+developments+in+the+field+of+bending+rigidity+measurements+on+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Colloid+Interface+Sci%22%5BJournal%5D)">Recent developments in the field of bending rigidity measurements on membranes.</a> Adv Colloid Interface Sci. 208, 225-234 (2014).</li>
<li>Needham, D., McIntosh, T. J., Evans, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thermomechanical+and+transition+properties+of+dimyristoylphosphatidylcholine%2Fcholesterol+bilayers%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Thermomechanical and transition properties of dimyristoylphosphatidylcholine/cholesterol bilayers.</a> Biochemistry. 27 (13), 4668-4673 (1988).</li>
<li>Almeida, P. F. F., Vaz, W. L. C., Thompson, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lateral+diffusion+in+the+liquid+phases+of+dimyristoylphosphatidylcholine%2Fcholesterol+lipid+bilayers%3A+a+free+volume+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Lateral diffusion in the liquid phases of dimyristoylphosphatidylcholine/cholesterol lipid bilayers: a free volume analysis.</a> Biochemistry. 31 (29), 6739-6747 (1992).</li>
<li>de Meyer, F., Smit, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+cholesterol+on+the+structure+of+a+phospholipid+bilayer%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Effect of cholesterol on the structure of a phospholipid bilayer.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 106 (10), 3654-3658 (2009).</li>
<li>Kraske, W. V., Mountcastle, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+cholesterol+and+temperature+on+the+permeability+of+dimyristoylphosphatidylcholine+bilayers+near+the+chain+melting+phase+transition%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Effects of cholesterol and temperature on the permeability of dimyristoylphosphatidylcholine bilayers near the chain melting phase transition.</a> Biochim Biophys Acta. 1514 (2), 159-164 (2001).</li>
<li>Corvera, E., Mouritsen, O. G., Singer, M. A., Zuckermann, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+permeability+and+the+effect+of+acyl-chain+length+for+phospholipid+bilayers+containing+cholesterol%3A+theory+and+experiment%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">The permeability and the effect of acyl-chain length for phospholipid bilayers containing cholesterol: theory and experiment.</a> Biochim Biophys Acta. 1107 (2), 261-270 (1992).</li>
<li>Kamiya, K., Osaki, T., Takeuchi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+of+vesicles-in-a-vesicle+with+asymmetric+lipid+components+using+a+pulsed-jet+flow+method%5BTitle%5D)+AND+%22RSC+Advances%22%5BJournal%5D)">Formation of vesicles-in-a-vesicle with asymmetric lipid components using a pulsed-jet flow method.</a> RSC Advances. 9 (52), 30071-30075 (2019).</li>
<li>Doğan Güzel, F., Kaur, J., Zendeh, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cheap+portable+electroformed+giant+unilamellar+vesicles+preparation+kit%5BTitle%5D)+AND+%22J+Liposome+Res%22%5BJournal%5D)">Cheap portable electroformed giant unilamellar vesicles preparation kit.</a> J Liposome Res. 33 (2), 183-188 (2023).</li>
<li>Kaur, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On-chip+label-free+impedance-based+detection+of+antibiotic+permeation%5BTitle%5D)+AND+%22IET+Nanobiotechnol%22%5BJournal%5D)">On-chip label-free impedance-based detection of antibiotic permeation.</a> IET Nanobiotechnol. 15 (1), 100-106 (2021).</li>
</ol>

Autorzy nie mają żadnych sporów o interesy do zadeklarowania.

Kompozycja i rodzaje lipidów w dużej mierze wyznaczają właściwości mechaniczne błony dwuwarstwowej, która tworzy GUV. Błona dwuwarstwową złożoną z DMPC/Chol wykazuje unikalne przemiany kształtu, gdy jest poddawana uderzeniu osmotycznemu. Pod silnym hipertonicznym uderzeniem osmotycznym, płyn wodny wewnątrz sGUV jest wydalany, co prowadzi do odkształcenia błony dwuwarstwowej GUV. Obserwowane przemiany kształtu są w dużej mierze wpływowane przez napływ wody w kierunku zewnętrznym i sztywność zginania błony dwuwarstwowej. T...

Modele biomimetyczne były szeroko stosowane do badania złożonych zjawisk biofizycznych membran komórkowych. Najprostsze modele biomimetyczne dostarczają cennych informacji poprzez minimalizowanie ingerencji wielu zmiennych obecnych w komórkach biologicznych. Olbrzymie Jednowarstwowe Wezykuły (GUVs) są podstawowym systemem biomimetycznym stosowanym do badania biofizyki membran1,2. GUVs są dobrze ugruntowanym modelem reprezentującym błonę komórkową. Składają się z pojedynczej sferycznej dwuwarstwy lipidowej o średnicy 10-30 µm i są zamknięte oraz zawieszone w roztworze wodnym. W tym artykule nazywamy je sGUVs. Systemy te są konstruowane z użyciem podejścia od dołu, gdzie podstawowe komponenty komórkowe -- lipidy, białka i katalizatory -- są zbudowane w celu naśladowania struktury i funkcji biologicznych membran3,4.
Mimo że proste sGUVs, z jedynie wodnym rdzeniem wewnątrz, są powszechnie stosowane, opracowano bardziej zaawansowane modele, aby reprezentować specyficzne cechy komórek biologicznych. Na przykład GUVs z strukturami wspieranymi przez aktynę naśladują cytoszkielet5,6,7, podczas gdy środowiska o wysokiej zawartości soli są używane do naśladowania warunków fizjologicznych. Środowiska z wyższą zawartością soli naśladują warunki fizjologiczne, jednak jest trudno je uzyskać w GUVs ponieważ tradycyjne metody, takie jak elektroformacja8,9, są często nieodpowiednie do syntezy GUVs o wielkości mikrometrowej w takich warunkach. Nowsze metody, takie jak metoda wspomaganej żelem, która używa żeli polimerowych lub skrobowych do wspomagania napęczniania dwuwarstwy podczas hydratacji, radzą sobie z tymi ograniczeniami10,11. Podobnie badano zmiany morfologiczne sGUVs12. Dodatek zamkniętych i otwartych filamentów, takich jak zamknięta aktyny, mikrotubule i inne komponenty cytoszkieletu o różnej sztywności, oraz stan stresu osmotycznego wewnątrz nich, wpływa na przemiany morfologiczne tych osmotycznie spłaszczonych, ale początkowo prawie sferycznych wezykuł. Analiza teoretyczna ujawnia różnorodne przemiany morfologiczne, w tym struktury rurkowe, kuliste, podobne do rakietki, wiśniowe i kropelkowe, które dobrze pasują do obserwacji eksperymentalnych12. Te odkrycia mają znaczące implikacje dla zrozumienia organizacji filamentów, mikrotubuli i nanopierścieni wewnątrz komórek i wezykuł. Inne badania przeglądają metody enkapsulacji białek i badają jak zamknięta aktyny, mikrotubule i komponenty cytoszkieletu regulują kształt osmotycznie spłaszczonych wezykuł12,13.
Co więcej, inspirowane architekturą komórki eukariotów, opracowano złożone modele oparte na GUVs w kierunku tworzenia sztucznych modeli przypominających podział komórki i komórki dzielące się, reprodukcję i cechy wieloskładnikowe komórek eukariotów, komórek samoreplikują się14,15,16,17 oraz komórek wieloskładnikowych. Poza zastosowaniami strukturalnymi, GUVs są również wybranymi modelami do zrozumienia elektroporacji komórkowej -- procesu, w którym zastosowane pole elektryczne indukuje tworzenie porów w błonie lipidowej z powodu stresu Maxwella. GUVs, o wymiarach porównywalnych z komórkami biologicznymi, wykazują elektrodeformację i elektroporację pod polami elektrycznymi. Takie badania nad GUVs dostarczają informacji na temat właściwości elektromechanikalnych, takich jak pojemność błony i sztywność zginania18 oraz mechanizmów elektroporacji2,19,20. Jednakże, praktycznie, te badania najlepiej reprezentują komórki bez jądra, takie jak czerwone krwinki (RBCs).
Aby wypełnić tę lukę, proponujemy złożone Olbrzymie Jednowarstwowe Wezykuły (cGUVs) jako nowy model biomimetyczny dla komórek eukariotycznych z jądrem21,22. Te wezykuły posiadają strukturę wezykułę w wezykule, gdzie wewnętrzna dwuwarstwa naśladuje błonę jądra, a zewnętrzna dwuwarstwa reprezentuje błonę plazmatyczną. Ponadto udowadniamy, jak przewodnictwo elektryczne wewnętrznej, pierścieniowej i zewnętrznej części może być modulowane bez potrzeby zaawansowanego sprzętu, takiego jak mikromanipulatorzy czy mikrostrzykawki. To uproszczone podejście do syntezy cGUVs oferuje obiecującą platformę dla postępów w badaniach biofizycznych nad komórkami z jądrem.

<table><tbody><tr><td>Cholesterol (Sigma grade, 99%)</td><td>Avanti Polar Lipids, Inc.</td><td>C8667</td><td>Do syntezy sGUV</td></tr><tr><td>Choloroform</td><td>Merck Life Science Pvt. Ltd.</td><td>DA2P711602</td><td>używany jako rozpuszczalnik do przygotowania roztworu lipidowego</td></tr><tr><td>DMPC</td><td>Avanti Polar Lipids, Inc.</td><td>850345C</td><td>Do syntezy sGUV</td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Hayman</td><td>F204325</td><td>Do czyszczenia szkła ITO</td></tr><tr><td>FITC-DEXTRAN (4 Kda-MW)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>466994</td><td>Do enkapsulacji wewnątrz wewnętrznych pęcherzyków cGUV</td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G-7021</td><td>Do przygotowania roztworu glukozy, używany do wstrząsu osmotycznego sGUV zawieszonych w roztworze sacharozy</td></tr><tr><td>Liss Rhod PE</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>810150C-1MG</td><td>Do barwienia cząsteczek lipidowych</td></tr><tr><td>Nile red</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>72485</td><td>Do barwienia membrany cGUV i sGUV</td></tr><tr><td>Sodium chloride (NaCl)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1936060521</td><td>Do przygotowania roztworu solnego, do zmiany przewodności  przedziałów cGUV</td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9378</td><td>Do roztworu sacharozy jako mediów nawadniających komory elektroformacyjnej</td></tr><tr><td>Urządzenia</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Płytki Cavitly</td><td>Blue star</td><td></td><td>Zawiesina cGUV umieszczona do obserwacji mikroskopowej</td></tr><tr><td>cMOS pco.edge 4.2 camera</td><td>Excelitas</td><td>61009524</td><td>Do obrazów fluorescencyjnych monochromatycznych  i obrazowania DIC</td></tr><tr><td>Pokrywa szklana (22 x 60 mm)</td><td>Blue star</td><td></td><td>Do pokrywania płytek z wnęką</td></tr><tr><td>Komora elektrofuzyjna Eppendorf</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td>Zawiesina sGUV umieszczona w komorze do obserwacji osmotycznej i mikroskopowej, można również użyć dowolnej innej prostej komory</td></tr><tr><td>Generator funkcji (Dwukanałowy)</td><td>Tektronix</td><td>AFG3022C</td><td>Generator funkcji używany do dostarczania napięcia przemiennego do komory elektroformacyjnej</td></tr><tr><td>Inkubator</td><td>Lokalnie spersonalizowany</td><td></td><td>Komora elektroformacyjna umieszczona w temperaturze 40°</td></tr><tr><td>Szkła ITO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>576352-10PAK</td><td>Szkła ITO używane w metodzie elektroformacyjnej</td></tr><tr><td>Mikroskop inwertowany Nikon Eclipse</td><td>Nikon</td><td>TE2000-U</td><td>Do wizualizowania sGUV i cGUV</td></tr><tr><td>Arkusz silikonowy (grubość 3 mm )</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>GF49463141</td><td>Do rozstawiania w komorze elektroformacyjnej</td></tr><tr><td>Strzykawka (2 mL)</td><td>Becton Dickinson India Pvt Ltd.</td><td>300844</td><td>Używany do wstrzykiwania mediów nawadniających i zbioru sGUV z komory elektroformacyjnej</td></tr><tr><td>Konfokalne setup mikroskopowe Zeiss</td><td>Centralna obiektywność IIT Bombay</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

synteza złożonych gigantycznych jednowarstwowych pęcherzyków: biomimetyczny model komórek z jądrem

Synthesis of Compound Giant Unilamellar Vesicles: A Biomimetic Model of Nucleate Cells

Prosta Giant unilamellar vesicle (sGUV) to sferyczna, mikronometrowa struktura, która składa się z dwuwarstwy lipidowej otaczającej wodny roztwór i zawieszonej w innym wodnym medium. Jako biomimetyczne modele biologicznych komórek, sGUV są uznawane za ugruntowane systemy do badań biofizycznych. Jednak sGUV przede wszystkim naśladują komórki bez jądra, co ogranicza ich zastosowanie jako modele komórek bez jądra. Proponujemy złożone Giant Unilamellar vesicles (cGUV) jako bardziej odpowiedni biomimetyczny model dla komórek z jądrem. cGUV to struktury pęcherzyk-w-pęcherzyku, gdzie zewnętrzne i wewnętrzne dwuwarstwy pęcherzyków mogą być uważane za odpowiednio błonę komórkową i błonę jądra komórkowego.

W niniejszym badaniu opisujemy prostą metodę syntezy cGUV. Krótko mówiąc, sGUV zostały wytworzone przy użyciu składu lipidowego DMPC i cholesterolu w zakresie 37-43 mol% w środowisku sacharozy metodą elektroformacji. Następnie te sGUV zostały poddane szokowi osmotycznemu poprzez wprowadzenie hipertonicznego roztworu glukozy, co spowodowało natychmiastową zmianę kształtu na somatocyticzny. Proces ten doprowadził do powstania stanu pośredniego, w którym zewnętrzne i wewnętrzne pęcherzyki pozostały połączone przez szyjkę, co ostatecznie zaowocowało rozwojem struktury pęcherzyk-w-pęcherzyku, nazywanej cGUV.
Ponadto wiadomo, że GUV przygotowane z wyższymi poziomiami cholesterolu w dwuwarstwie wykazują zmniejszoną przepuszczalność jonów. Ta cecha pozwala na dostosowanie przewodności w pierścieniowym roztworze cGUV poprzez regulację przewodności medium nawilżającego, roztworu wewnętrznego poprzez hipertoniczny glukozę, a roztworu zewnętrznego poprzez regulację rozcieńczenia lub dodanie przewodzącego medium, co sprawia, że wynikowe cGUV mają kontrolowaną przewodność w zewnętrznej, pierścieniowej i wewnętrznej strefie, co jest istotne dla badań pola elektrycznego. Proponujemy tę efektywną i prostą metodę syntezy złożonych pęcherzyków, która może być wykorzystana jako biomimetyczny model eukariotycznych, jądrowych komórek, poszerzając ich zastosowanie w badaniach biofizycznych.

sGUVs zostały syntetyzowane metodą elektroformacji (jak pokazano na Rysunku 1) i zebrane z komory za pomocą strzykawki. Zebrane sGUVs zostały początkowo wizualizowane pod mikroskopem odwróconym i poddane szokowi osmotycznemu, aby wywołać ich przemianę w kształt stomatocytu. Po dalszej remodelacji błony, ten stomatocyt jest przekształcany w strukturę pęcherzyka w pęcherzyku, zwaną złożonym Giant Unilamellar Vesicle (cGUV) (Rysunek 1). cGUVs zostały następnie prze...

Ten artykuł przedstawia metodę przygotowywania złożonych wielowarstwowo-jednowarstwowych pęcherzyków (cGUVs) o strukturze pęcherzyka w pęcherzyku, z dostosowaną przewodnością elektryczną w regionach wewnętrznym, pierścieniowym i zewnętrznym. Elektroformacja syntetyzuje proste GUV, które są przekształcane w stomatocyty i cGUV za pomocą wstrząsu osmotycznego, zapewniając wartościowy model do badania biofizyki komórek z jądrami.

Synteza złożonych gigantycznych jednowarstwowych pęcherzyków: Biomimetyczny model komórek z jądrem

A simple Giant unilamellar vesicle (sGUV) is a micron-sized spherical vesicle, which is composed of a lipid bilayer that encloses an aqueous solution ...

Przeprowadziliśmy rozbudowane badania nad syntezą i elektrohydrodynamiką złożonych gigantycznych unilamellarnych wezykuł w celu ustanowienia ich jako biomagnetycznych odpowiedników komórek eukariotycznych. Celem jest zrozumienie technologii polegających na stosowaniu pola elektrycznego do komórek biologicznych, takich jak elektroporacja komórek i elektrodesformowanie komórek.Aby prowadzić badania w tej dziedzinie, stosuje się kombinację mikroskopii fluorescencyjnej i świetlnej, nanosekundowych impulsów elektrycznych, oscyloskopu i źródeł zasilania oraz innowacyjnych metod syntezy. Wyzwaniem w syntezie dobrze uformowanych złożonych GUV w wrażliwości metody na temperaturę, rodzaje lipidów i użytą kompozycję. W tej pracy udowadniamy to dla układu DMPC i cholesterolu, ale uogólnienie pozostaje wyzwaniem. Proste GUV, które naśladują komórki nuklearne, zostały zsyntetyzowane w literaturze. Syntezujemy złożone gigantyczne wezykuły, aby naśladować komórki z jądrem i strukturą obronną zaworu, otocząć wezykuł wewnętrzny o wielkości około połowy wielkości wezykułu zewnętrznego.Skupimy się na badaniu wpływu mikrosekundowych i nanosekundowych impulsów na wezykuł wewnętrzny, który jest naśladownictwem jądra komórki biologicznej w kontekście elektroporacji.[Narrator] Aby zacząć, dokładnie wyczyść szkła powleczone tlenkiem indu i ITO za pomocą roztworu do mycia naczyń, a następnie spłucz wodą dejonizowaną o przewodności 0,055 mikrosiemensów na centymetr. Następnie za pomocą 100% roztworu etanolu ponownie wyczyść szkła i spłucz wodą dejonizowaną. Wysusz szkła w piekarniku ustawionym na 85 stopni Celsjusza. Za pomocą kleszczy zmierz strony przewodzące każdego szkła powlekanego ITO. Zabezpiecz czyste szkło na podstawce wirowania za pomocą podciśnienia, upewniając się, że przewodząca strona jest skierowana w górę. Nałóż 25 mikrolitrów roztworu lipidowego, czyli cztery krople na przewodzącą stronę jednego szkła ITO. Weź inne szkło i nałóż 25 mikrolitrów roztworu lipidowego, dwie w taki sam sposób. Wysusz próżniowo oba szkła powleczone lipidami w wysuszarce przechowywanej w ciemności przez co najmniej dwie godziny. Następnie ułóż szkło powlekane lipidami ITO z lipidem jednym równolegle do czystego szkła, upewniając się, że strony przewodzące są skierowane na siebie, i umieść między nimi trzymilimetrowy silikonowy przestrzennik. Uszczelnij zestaw za pomocą kleszczy, aby stworzyć komorę elektroformacyjną. Następnie wypełnij komorę 100-milimolarowym roztworem sacharozy za pomocą strzykawki o pojemności dwóch mililitrów. Podłącz kabel wyjściowy generatora funkcji do szkła powlekanego ITO za pomocą generatora funkcji. Umieść obie komory elektroformacyjne w inkubatorze utrzymywanym w temperaturze od 38 do 40 stopni Celsjusza. Zastosuj przemienne pole elektryczne o pięciu woltach szczytowo-szczytowych o częstotliwości 10 herców za pomocą generatora dwukanałowego przez cztery godziny. Po inkubacji odłącz komory elektroformacyjne od generatora. Wyjmij je z inkubatora i pozwól im ostygnąć do temperatury pokojowej. Za pomocą strzykawki zebraj zsyntetyzowane gigantyczne unilamellarne wezykuły z każdej komory i przenieś je do osobnych dwumilitrowych mikrocentryfugowych probówek. Inkubatoruj probówki w temperaturze pokojowej od 25 do 27 stopni Celsjusza przez godzinę przed przejściem do wstrząsu osmotycznego. Przenieś 200 mikrolitrów prostych gigantycznych unilamellarnych wezykułów lub sGUV, zawieszonych w hydratującym medium zawierającym 100-milimolarowy roztwór sacharozy, do komory obserwacyjnej i wprowadź 125 mikrolitrów 300-milimolarowego roztworu glukozy, aby wywołać wstrząs osmotyczny i rozpocząć przemiany kształtu. Pozostaw sGUV, które przechodzą teraz wstrząs osmotyczny, na jedną godzinę wewnątrz komory obserwacyjnej umieszczonej na etapie mikroskopu. Wykonaj kontrast interferencyjny różnicowy i mikroskopiowe fluorescencyjne za pomocą odwróconego mikroskopu wyposażonego w monochromatyczną kamerę. Użyj obiektywów Plan Fluor extra-long working distance 20X przez 0,45 i 40X przez 0,60, aby obserwować przemiany kształtu w sGUV. W przypadku mikroskopi fluorescencyjnego użyj zielonego zestawu filtrów z ekscytacją na 510 do 560 nanometrów, lustra dichoicznego na 575 nanometrów i filtru barierowego na 590 nanometrów dla dwuwarstwy Niall Red. Monitoruj przemiany kształtu w komorze obserwacyjnej za pomocą kontrastu interferencyjnego różnicowego i mikroskopi fluorescencyjnego z obiektywami Plan Fluor. Obserwuj powstawanie wezykułów stomatocytów w miarę postępowania przemian kształtu. Monitoruj, jak większe wezykuły osadzą się jako pierwsze, a następnie nastąpi wzrost liczby mniejszych wezykułów w czasie. Następnie dodaj roztwór soli, aby dostosować przewodność w różnych regionach cGUV przed wywołaniem wstrząsu osmotycznego. Na przykład, aby stworzyć wyższą przewodność w regionach zewnętrznych i wewnętrznych niż w regionie pierścieniowym, przenieś 200 mikrolitrów roztworu sacharozy do komory elektrofuzyjnej. Dodaj 20 mikrolitrów 7,5-milimolarowego roztworu soli do komory i wywołaj wstrząs osmotyczny za pomocą 125 mikrolitrów 300-milimolarowego roztworu glukozy. Pozostaw sGUV w

synthesis-compound-giant-unilamellar-vesicles-biomimetic-model

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Mikroprzepływowe natryskiwanie dwuwarstwy lipidowej na granicy kropelek zapewnia niezawodny sposób generowania pęcherzyków z kontrolą nad asymetrią błony, włączeniem białek transbłonowych i enkapsulacją materiału. Technika ta może być stosowana do badania różnych systemów biologicznych, w których pożądane są biomolekuły podzielone na przedziały.

Wytwarzanie dwuwarstwowych pęcherzyków lipidowych za pomocą natryskiwania mikroprzepływowego

Rekonstytucja białka transbłonowego, KvAP, w gigantyczne pęcherzyki jednowarstwowe (GUVs) jest demonstrowana dla dwóch metod odwodnienia i ponownego nawodnienia — elektroformacji i pęcznienia wspomaganego żelem. W obu metodach małe jednowarstwowe pęcherzyki zawierające białko są łączone ze sobą, tworząc GUV, które można następnie badać za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej i elektrofizjologii patch-clamp.

Rekonstytucja białka transbłonowego, kanału jonowego bramkowanego napięciem, KvAP, w gigantycznych pęcherzykach jednowarstwowych do badań mikroskopowych i patch clamp

Gigantyczne pęcherzyki zawierające wysoko upakowane składniki o rozmiarach mikrometrów są użytecznymi modelami komórek. Metoda wirowania emulsji typu woda w oleju jest prostym, ale potężnym narzędziem do przygotowywania gigantycznych pęcherzyków z zamkniętymi materiałami.

Otrzymywanie gigantycznych pęcherzyków otaczających mikrosfery przez odwirowanie emulsji typu woda w oleju

Prezentujemy technikę bezdotykowej mikromanipulacji pęcherzykami, wykorzystując zlokalizowane gradienty jonów wapnia. Mikroiniekcja roztworu jonów wapnia w pobliżu gigantycznego pęcherzyka lipidowego jest wykorzystywana do przebudowy błony lipidowej, w wyniku czego powstają wypukłości rurki błonowe.

Przebudowa błony gigantycznych pęcherzyków w odpowiedzi na zlokalizowane gradienty jonów wapnia

Pokazujemy jednokomórkową hodowlę bakterii wewnątrz gigantycznych pęcherzyków (GV). GV zawierające komórki bakteryjne przygotowano metodą transferu kropelkowego i unieruchomiono na podpartej membranie na szklanym podłożu w celu bezpośredniej obserwacji wzrostu bakterii. To podejście można również dostosować do innych komórek.

Hodowla komórek bakteryjnych na poziomie pojedynczej komórki wewnątrz gigantycznych pęcherzyków

Celem protokołu jest wiarygodny pomiar właściwości mechanicznych membrany gigantycznych pęcherzyków za pomocą aspiracji mikropipet.

Wykrywanie gigantycznych jednopłytkowych pęcherzyków hybrydowych przez elektroformację i pomiar ich właściwości mechanicznych za pomocą aspiracji mikropipetami

Ten artykuł przedstawia prostą metodę szybkiego wytwarzania gigantycznych pęcherzyków jednowarstwowych z zamkniętymi białkami cytoszkieletu. Metoda ta okazuje się przydatna do oddolnego odtwarzania struktur cytoszkieletu w zamknięciu i interakcjach cytoszkielet-błona.

Szybka enkapsulacja odtworzonego cytoszkieletu w gigantycznych pęcherzykach jednowarstwowych

W tym manuskrypcie demonstrujemy eksperymentalne techniki hermetyzacji cytoszkieletu F-aktyny w gigantyczne jednowarstwowe pęcherzyki lipidowe (zwane również liposomami) oraz metodę tworzenia warstwy F-aktyny naśladującej korę mózgową na wewnętrznej wlotce błony liposomowej.

In vitro Rekonstrukcja cytoszkieletu aktynowego w gigantycznych pęcherzykach jednowarstwowych

Ten przewodnik dla początkujących przedstawia ogólny protokół przygotowania gigantycznych pęcherzyków jednowarstwowych (GUV) metodą przenoszenia kropel, omawiając krytyczne etapy i dostarczając informacji, które pomogą w możliwych korektach wymaganych dla różnych zastosowań, w tym biologii syntetycznej i mikrorobotyki.

Wykorzystanie metody przenoszenia kropelek w celu niezawodnego przygotowania gigantycznych pęcherzyków jednowarstwowych

Ten artykuł przedstawia prostą jednoetapową rekonstrukcję sieci cytoszkieletu wewnątrz oddzielonych fazowo gigantycznych pęcherzyków. Metodę tę można uogólnić i zastosować do enkapsulacji lub uwięzienia szerokiego zakresu biomolekuł.

Metody in vitro Rekonstrukcja sieci cytoszkieletu w oddzielonych fazowo gigantycznych pęcherzykach jednowarstwowych (GUV)

Poznaj metodę syntezy złożonych gigantycznych pęcherzyków jednowarstwowych jako biomimetycznych modeli komórek jądrzastych. Technika elektroformowania i szoku osmotycznego umożliwia badanie elektrohydrodynamiki lipidowych układów.

Synteza złożonych gigantycznych jednowarstwowych pęcherzyków: Biomimetyczny model komórek z jądrem

Przeglądaj więcej filmów