Model myszy dotyczący zaburzenia metabolicznego związane ze steatotyczną chorobą wątroby z włóknieniem
18 lipca 2025
Model myszy choroby wątroby związanej z zaburzeniami metabolicznymi (MASLD) z zaburzeniami metabolicznymi, zmianami ekspresji genów wątroby oraz zmianami histologicznymi przypominającymi ludzkie MASLD, w tym zwłóknieniem przechodzącym do zaawansowanego stadium 3. Model ten może być wykorzystywany w badaniach patofizjologii MASLD oraz w przedklinicznych badaniach nowych terapii.
W naszych badaniach koncentrujemy się na steatotycznej chorobie wątroby związanej z zaburzeniami metabolicznymi, czyli MASLD, a w szczególności na mechanizmach akumulacji lipidów i włóknienia. Do najnowszych osiągnięć należą transkryptomika jednokomórkowa i specjalna, standaryzacja modeli zwierzęcych MASLD oraz zatwierdzenie semaglutydu do leczenia MASLD. Istnieje wiele modeli zwierzęcych MASLD, ale odkryliśmy, że wiele z nich nie wywoływało włóknienia wątroby.
Aby odpowiedzieć na ten problem, opracowaliśmy nasz model myszy MASLD. Nasz model myszy indukuje MASLD z włóknieniem poprzez karmienie myszy hiperfagicznych dietą podobną do przeciętnej amerykańskiej diety. Powoduje to MASLD bardzo podobne do choroby u ludzi.
Nasza metoda ułatwi badania nad patofizjologią MASLD oraz testowanie nowych terapii. Na początek pobierz przekrój tkanki wątroby z parafiną na preparatie. Aby odparafinizować, zanurz preparat w ksylenie lub cytryrozpuszcze na pięć do 15 minut.
Następnie nawadnij sekcję szerejnie w 100, 95 i 70% etanolu, a następnie przez pięć minut w wodze destylowanej w każdej. Następnie poplamić ten fragment Sirius Red i odwodnić zamk. Zdejmuj po jednym szkiełku z roztworu klarowego i przetrzyj go ręcznikiem papierowym, aby usunąć nadmiar płynu.
Dodaj do sekcji około 50 do 100 mikrolitrów medium montażowego. Przykryj ten fragment naklejką i delikatnie dociśnij, aby usunąć pęcherzyki powietrza. Pozwól zjeżdżalni wyschnąć na powietrzu.
Teraz obejrzyj przygotowaną sekcję pod mikroskopem świetlnym z oświetleniem jasnego pola, używając obiektywów od 4x do 20x. Przelej około 500 do 1000 mikrolitrów wątroby homogenizowanej do rurek wirówek o pojemności 1,5 mililitra i dodaj kwas trichlorooctowy, aby osiągnąć końcowe stężenie 12%. Krótko zawiruj probówkę, aby wymieszać zawartość. Inkubuj probówkę w kąpieli wodnej lodowej przez 30 minut, a następnie wiruj w 6 000 g w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 10 minut.
Następnie usuń supernatant pipetą. Dodaj jeden mililitr 100% lodowatego etanolu do przeprania granulatu i sonikuj, aby dokładnie się zawiesił. Po ponownym odwirowaniu zawiesiny zasysaj supernatant.
Po trzecim myciu trzymaj rurkę otwartą, aby suszyć pellet na powietrzu przez 10 minut lub dłużej, jeśli to konieczne. Następnie dodaj 800 mikrolitrów 6 zwykłych kwasów solnych do rurki zawierającej granulek białkowy i ponownie zawiesij granulek za pomocą sonikatora, jak pokazano wcześniej. Przenieś zawieszenie do szklanej rurki lub fiolki z zakrętką śrubkową i szczelnie zamknij nakrętkę.
Inkubuj tubkę w piekarniku w temperaturze 110 stopni Celsjusza przez około 22 godziny. W razie potrzeby przelej zawartość z szklanej fiolki do rurki wirówki przed zakręceniem. Wiruj hydrolizowaną próbkę w stężeniu 16 000 g przez 10 minut i wchłanij supernatant zawierający hydroksyprolinę do probówki o pojemności 1,5 mililitra.
Do utleniania hydroksyproliną należy dodać 450 mikrolitrów roztworu chloraminy do probek z 50 mikrolitrami próbki i standardów. Wymieszaj zawartość w probówkach za pomocą wiru i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 25 minut. Następnie do każdej próbki i standardu dodano 500 mikrolitrów odczynnika Ehrlicha.
Po wirowaniu inkubuj próbki w temperaturze 65 stopni Celsjusza przez 20 minut w inkubatorze. Po inkubacji pozwól probówkom ostygnąć do temperatury pokojowej i obserwuj ostateczny kolor próbek. Na koniec zmierz absorpcję próbek i standardów za pomocą spektrofotometru o długości fali 550 nanometrów.
Barwienie tkanki wątroby kolagenem Picro Sirius Red, obserwowane przy jasnym oświetleniu polowym, wykazało kolor kolagenowy czerwony z jasnopomarańczowym lub żółtym tłem. Osadzanie kolagenu odpowiadające włóknieniu zostało zabarwione, podobnie jak kolagen w ścianach naczyń krwionośnych, hilum i torebce wątroby. Mikroskopia światła polaryzacyjnego wykazała wyraźne dwułamne włókna kolagenowe na ciemnym tle, poprawiając wizualizację włóknienia.
Ilościowa identyfikacja obszaru o dodatnim poziomie kolagenu wątrobowego u myszy żółtych agouti karmionych dietą wysokotłuszczową i fruktozową, czyli HFFD, wykazała istotnie wyższe zwłóknienie w porównaniu z kontrolnymi myszami typu dzikiego karmionymi dietą niskotłuszczową i fruktozową. Ilościowe określenie zawartości hydroksyproliny w wątrobie wątrobowej wykazało istotnie wyższy poziom u myszy żółtych z agouti karmionych dietą HFFD w porównaniu do myszy kontrolnych po 16 tygodniach na diecie, co potwierdza zwiększone odkładanie kolagenu w wątrobie włóknistej.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejsze badanie przedstawia mysi model stłuszczeniowej choroby wątroby związanej z dysfunkcją metaboliczną (MASLD), który ściśle naśladuje ludzkie MASLD, w tym progresję do zaawansowanego włóknienia. Model ten jest kluczowy dla badania patofizjologii MASLD oraz testowania nowych podejść terapeutycznych.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Dysfunkcja metaboliczna
- Choroby wątroby
- Modele zwierzęce
Wstęp
- MASLD charakteryzuje się gromadzeniem lipidów i włóknieniem wątroby.
- Istniejące modele zwierzęce często nie wywołują włóknienia wątroby.
- Ostatnie osiągnięcia obejmują transkryptomikę pojedynczych komórek oraz transkryptomikę przestrzenną.
- Semaglutyd został zatwierdzony do leczenia MASLD.
Cel badania
- Opracowanie wiarygodnego modelu mysiego MASLD, który indukuje włóknienie.
- Zbadanie mechanizmów leżących u podstaw akumulacji lipidów i włóknienia.
- Umożliwienie prowadzenia badań przedklinicznych nad potencjalnymi terapiami MASLD.
Stosowane metody
- Karmienie myszy z hiperfagią dietą zbliżoną do przeciętnej diety amerykańskiej.
- Monitorowanie zmian w ekspresji genów w wątrobie.
- Ocena histopatologicznych zmian w wątrobie.
- Ocena progresji stopni włóknienia.
Główne wyniki
- W modelu mysim z sukcesem wywołano MASLD z włóknieniem.
- Zmiany histopatologiczne były podobne do tych obserwowanych w ludzkim MASLD.
- Włóknienie postępowało do zaawansowanego stadium 3.
- Model ten może być wykorzystany do dalszych badań nad terapiami MASLD.
Wnioski
- Opracowany model mysi stanowi cenne narzędzie do badania MASLD.
- Umożliwia on uzyskanie wiedzy na temat patofizjologii tej choroby.
- Model ten może pomóc w ocenie nowych strategii terapeutycznych.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Solidne modele przedkliniczne odtwarzające ludzką stłuszczeniową chorobę wątroby związaną z dysfunkcją metaboliczną (MASLD) z włóknieniem są niezbędne dla translacyjnego odkrywania leków i ograniczania ryzyka mechanistycznego. Niniejszy model mysi umożliwia ilościową ocenę progresji włóknienia oraz dysfunkcji metabolicznych, co zwiększa pewność prognostyczną w ocenie terapeutycznej na wczesnych etapach. Jego zgodność z patologią choroby u ludzi usprawnia selekcję projektów w portfolio oraz decyzje o postępach w rozwoju leków w potokach badawczych nad chorobami metabolicznymi, przy uwzględnieniu analizy ryzyka.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Umożliwia badanie szlaków fibrogennych i dysfunkcji metabolicznych w systemie istotnym dla przebiegu choroby.
- Wspiera funkcjonalną walidację celów poprzez modelowanie postępującego włóknienia i fenotypów metabolicznych.
- Ułatwia analizę mechanistyczną w celu ograniczenia ryzyka dla potencjalnych celów terapeutycznych zaangażowanych w MASLD.
Przesiewanie i opracowanie testu
- Zapewnia zwalidowane punkty końcowe histologiczne i biochemiczne do kwantyfikacji włóknienia.
- Umożliwia powtarzalną ocenę skuteczności związków przy użyciu barwienia picro-sirius red oraz pomiaru poziomu hydroksyproliny.
- Wspiera standaryzację analizy w celu zapewnienia porównywalności między różnymi badaniami i zespołami.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Umożliwia zestawienie przedklinicznych wyników z histopatologią MASLD u ludzi oraz zmianami w ekspresji genów.
- Zapewnia ciągłość procesu od etapu odkrycia po przedkliniczną walidację interwencji antyfibrotycznych i metabolicznych.
- Wspiera rozwój biomarkerów translacyjnych poprzez odwzorowanie progresji choroby u ludzi.
Integracja potoku i przepływu pracy
Model ten łączy wczesną fazę odkrywania, identyfikację związków wiodących oraz walidację przedkliniczną terapii MASLD, dostarczając ilościowych punktów końcowych istotnych dla przebiegu choroby.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez dotyczących mechanizmów włóknienia i dysfunkcji metabolicznych in vivo.
- Przesiew: Zapewnia standaryzowane, ilościowe odczyty włóknienia i parametrów metabolicznych do oceny związków.
- Analityka: Umożliwia statystyczne porównanie nasilenia włóknienia i parametrów metabolicznych pomiędzy grupami eksperymentalnymi.
- Badania translacyjne: Ułatwia dopasowanie wyników przedklinicznych do patologii i ekspresji genów w ludzkim MASLD.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Tworzy platformę wielokrotnego użytku do iteracyjnego testowania różnorodnych metod terapeutycznych celujących w MASLD.
Wpływ operacyjny i organizacyjny
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną i redukuje niejednoznaczność mechanistyczną w walidacji celów terapeutycznych MASLD.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje kwantyfikację włóknienia oraz fenotypowanie metaboliczne w celu uzyskania powtarzalnych wyników.
- Wartość strategiczna: Poprawia proces podejmowania decyzji go/no-go oraz alokację kapitału poprzez dostarczenie solidnych dowodów przedklinicznych.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację kandydatów w leczeniu MASLD z uwzględnieniem ryzyka, w oparciu o istotność translacyjną.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymagana jest wiedza w zakresie obchodzenia się ze zwierzętami, barwienia histologicznego oraz ilościowego oznaczania biochemicznego.
- Niezbędny jest dostęp do mikroskopii, spektrofotometrii oraz infrastruktury analitycznej do pomiarów końcowych.
- W celu zapewnienia powtarzalności wymagana jest standaryzacja diety, opieki nad zwierzętami i protokołów analiz wewnątrz zespołów.
- Adaptacja do innych szczepów myszy lub reżimów dietetycznych może wymagać optymalizacji protokołu.
- Przy projektowaniu badania należy uwzględnić czas trwania modelu oraz harmonogram progresji włóknienia.
