Technika biopsji spojówki i bezpośredniej immunofluorescencji w diagnostyce pemfigoidu błony śluzowej
17 czerwca 2025
W tym miejscu przedstawiamy protokół pobierania i przetwarzania biopsji spojówki w celu identyfikacji pemfigoidu błony śluzowej.
Staramy się zwiększyć zastosowanie biopsji spojówki w diagnostyce pemfigoidu błony śluzowej, który jest przewlekłym zapaleniem spojówek, a nieleczony może powodować ślepotę. Bezpośrednie barwienie immunofluorescencyjne biopsji spojówki w celu osadzania kompleksu immunologicznego w błonie pacjenta jest diagnostyką MMP, ale nie jest wykonywane w wielu ośrodkach na całym świecie. Obecny artykuł dotyczący metod opisuje techniki pobierania biopsji spojówki i stosowania pożywki o optymalnej temperaturze cięcia wypełnionej wkładami do przenoszenia próbki i przygotowania krwi, co zmniejsza operację próbki.
Na początek zaplanuj biopsję z obu oczu pacjenta z podejrzeniem pemfigoidu w znieczuleniu miejscowym lub miejscowym przy użyciu mikroskopu operacyjnego. Uzyskaj świadomą zgodę od pacjenta i jasno wyjaśnij możliwe skutki uboczne, w tym krwawienie, blizny i potencjalną potrzebę rozpoczęcia miejscowego przyjmowania sterydów po operacji. Przed wykonaniem biopsji należy przygotować wkłady, czyszcząc je zwykłą solą fizjologiczną i wypełniając optymalną temperaturą cięcia lub pożywką OCT oddzielnie dla każdego oka.
Teraz umieść wziernik w wybranym oku, w prawo lub w lewo. Po zastosowaniu miejscowej proparakainy, jeśli pacjent nadal odczuwa ból, wstrzyknąć 0,2 mililitra 2% lidokainy podspojówkowo za pomocą strzykawki o pojemności 1 mililitra do tuberkuliny. Po zdjęciu spojówki z twardówki za pomocą kleszczy kończyn, wykonaj liniowe wycięcie o długości około 4-5 milimetrów i szerokości 2-3 milimetrów za pomocą nożyczek Westcotta.
Natychmiast przenieś całą biopsję do podłoża o optymalnej temperaturze cięcia. Błyskawiczne zamrażanie osadzonych próbek za pomocą ciekłego azotu lub suchego lodu. Następnie przechowuj je przez noc w temperaturze -80 stopni Celsjusza.
Zamrożoną tkankę podzielić na plastry o grubości 4-6 mikrometrów za pomocą kriostatu utrzymywanego w temperaturze od -20 do -25 stopni Celsjusza. Zamontuj sekcje na dodatnio naładowanych szkiełkach mikroskopowych pokrytych polilizyną, aby zapewnić przyczepność. Następnie zawiń szkiełka w folię aluminiową przed przechowywaniem w temperaturze -80 stopni Celsjusza do momentu zabarwienia.
Rozmrażaj szkiełka w temperaturze pokojowej przez 10 minut. Następnie utrwal tkankę w 100% zimnym acetonie na kolejne 10 minut, aby zachować antygeny i zminimalizować uszkodzenia tkanek. Teraz przepłucz szkiełka OBS trzy razy, każdy przez pięć minut, aby wyeliminować resztki pożywki OCT i acetonu.
Na szkiełka nanieść rozcieńczone sprzężone przeciwciała, anty-IgG, anty-IgA, anty-IgM i anty-IgC3. Nie należy stosować przeciwciał do szkiełka kontroli ujemnej. Teraz inkubuj szkiełka w wilgotnej komorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 45-60 minut.
Następnie przemyj szkiełka PBS trzy razy przez pięć minut każde, aby usunąć niezwiązane przeciwciała. Przeciwbarwienie z medium montażowym zawierającym DAPI do wizualizacji jądrowej. Na koniec umieść szkiełko nakrywkowe na każdym szkiełku i pozwól im utwardzić się przez 20 minut.
Zbadaj szkiełka za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego wyposażonego w odpowiednie filtry, w tym zielony filtr wzbudzenia o długości 488 nanometrów do wykrywania fluoroforów. Błona podstawna została potwierdzona w biopsjach spojówek przy użyciu barwienia PAS, pojawiając się jako ciągły jasnoróżowy pasek u podstawy nabłonka. Bezpośrednią dodatniość immunofluorescencji zwizualizowano jako jasnozieloną fluorescencję wzdłuż błony podstawnej.
Bezpośrednie biopsje immunofluorescencyjne dodatnie wykazały fluorescencję immunoglobulin IgM, IgA i IgG, podczas gdy biopsje ujemne nie miały fluorescencji. Kontrola pozytywna wykazała silną zieloną fluorescencję na błonie podstawnej.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy artykuł przedstawia protokół pobierania i przetwarzania biopsji spojówki w celu diagnozy pęcherczycy błon śluzowych (MMP), poważnego schorzenia, które w przypadku braku leczenia może prowadzić do ślepoty.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Okulistyka
- Patologia
- Immunologia
Wstęp
- Przebieg pęcherzycy błon śluzowych to przewlekłe bliznowaciejące zapalenie spojówek.
- Bezpośrednie barwienie immunofluorescencyjne jest kluczowe dla postawienia diagnozy.
- Wiele ośrodków nie wykonuje biopsji spojówki w przypadku pęcherzycy błon śluzowych.
- Nieleczona pęcherzyca błon śluzowych może prowadzić do poważnych powikłań, w tym do ślepoty.
Cel badania
- Zwiększenie częstotliwości wykonywania biopsji spojówki w diagnostyce MMP.
- Przedstawienie szczegółowego protokołu procedury biopsji.
- Podkreślenie znaczenia dokładnej diagnozy w zapobieganiu ślepoty.
Zastosowane Metody
- Zaplanuj biopsję obu oczu w znieczuleniu miejscowym lub powierzchniowym.
- Uzyskaj świadomą zgodę pacjenta po poinformowaniu o ryzyku.
- Przygotuj kasetki z medium OCT (optimal cutting temperature).
- Podczas biopsji używaj mikroskopu operacyjnego w celu zapewnienia precyzji.
Główne wyniki
- Protokół ułatwia efektywne obchodzenie się z próbkami i ich przetwarzanie.
- Bezpośrednie barwienie immunofluorescencyjne może potwierdzić diagnozę MMP.
- Świadoma zgoda zapewnia pacjenta o potencjalnych skutkach ubocznych.
- Udoskonalone techniki mogą prowadzić do szerszego stosowania biopsji.
Wnioski
- Biopsja spojówki jest niezbędna do zdiagnozowania pęcherzycy błon śluzowych.
- Znormalizowane protokoły mogą zwiększyć dokładność diagnostyczną.
- Szerzej stosowanie tej techniki może zapobiec ślepoty u pacjentów.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie przemysłowe
Bezpośrednia immunofluorescencja (DIF) z biopsji spojówki stanowi rozstrzygające narzędzie diagnostyczne w przypadku pęcherzycy błon śluzowych (MMP) – choroby o dużym stopniu niezaspokojonych potrzeb medycznych ze względu na ryzyko nieodwracalnej ślepoty. Standaryzowane protokoły biopsji i DIF umożliwiają wiarygodną detekcję kompleksów immunologicznych, co wspiera wczesną interwencję i zmniejsza niejednoznaczność diagnostyczną w procesach okulistycznych i immunopatologicznych. Wdrożenie tych metod zwiększa pewność prognostyczną w krytycznym momencie diagnostyki, co pozwala na lepsze planowanie dalszych strategii terapeutycznych i priorytetyzację działań w ramach opieki nad pacjentem.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Umożliwia precyzyjną identyfikację patologii immunologicznej poprzez bezpośrednie wykrywanie złogów immunoglobulin i dopełniacza.
- Wspiera ograniczanie ryzyka mechanistycznego poprzez odróżnienie MMP od etiologii indukowanych lekami lub pseudopempfigoidy.
- Ułatwia funkcjonalną walidację celów w procesach chorobowych napędzanych przez kompleksy immunologiczne.
Przesiew i opracowanie testu
- Ustanawia zwalidowane testy immunofluorescencyjne na tkankach w celu powtarzalnego wykrywania biomarkerów chorób.
- Standaryzuje sposób postępowania z próbkami i ich przetwarzanie, co zwiększa niezawodność testów oraz porównywalność wyników między ośrodkami.
- Zapewnia ilościowe i jakościowe odczyty lokalizacji kompleksów immunologicznych w błonie podstawnej.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Umożliwia dopasowanie wyników diagnostycznych do translacyjnych strategii biomarkerowych w chorobach autoimmunologicznych oka.
- Zapewnia ciągłość procesu od diagnozy klinicznej po walidację przedklinicznych modeli mechanizmów immunologicznych.
- Wspiera optymalizację ryzyka w procesie wdrażania immunomodulujących kandydatów terapeutycznych.
Integracja potoku i przepływu pracy
Niniejszy protokół biopsji i DIF integruje interfejs diagnostyczno-badawczy, dostarczając danych dla potoków badań klinicznych i przedklinicznych.
- Biologia odkrywcza: dostarcza bezpośrednich dowodów na udział kompleksów immunologicznych, wyjaśniając mechanizmy choroby i wspierając weryfikację hipotez.
- Przesiewy: zapewnia standaryzowane, powtarzalne testy immunofluorescencyjne do wykrywania biomarkerów w próbkach tkanek.
- Analityka: generuje ilościowe odczyty fluorescencji do analizy porównawczej próbek pacjentów i kontroli.
- Badania translacyjne: łączy wyniki diagnostyki klinicznej z opracowywaniem modeli przedklinicznych i walidacją biomarkerów.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: oferuje protokół wielokrotnego użytku do wykrywania kompleksów immunologicznych w różnych kontekstach tkanek autoimmunologicznych i zapalnych.
Wpływ operacyjny i organizacyjny
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną w diagnostyce chorób immunologicznych oraz walidacji celów terapeutycznych.
- Wartość operacyjna: Poprawia standaryzację, powtarzalność i skalowalność procesów immunofluorescencji w tkankach.
- Wartość strategiczna: Usprawnia podejmowanie decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) i zmniejsza niepewność diagnostyczną na późnych etapach.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację programów terapeutycznych przeciwzapalnych i immunomodulujących z uwzględnieniem analizy ryzyka.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymagana jest wiedza z zakresu preparatyki tkanek okulistycznych oraz mikroskopii immunofluorescencyjnej.
- Wymagany jest dostęp do kriosztatu, mikroskopii fluorescencyjnej oraz zwalidowanych odczynników przeciwciał.
- Konieczna jest standaryzacja wyboru miejsca biopsji oraz protokołów przetwarzania próbek między zespołami.
- Możliwa może być konieczność adaptacji metody dla innych tkanek błon śluzowych lub kontekstów autoimmunologicznych.
- Negatywne wyniki biopsji nie wykluczają choroby, co wymaga ostrożnej interpretacji i potencjalnego powtórzenia badań.
