Name: Technika biopsji spojówki i bezpośredniej immunofluorescencji w diagnostyce pemfigoidu błony śluzowej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-06-17T15:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 5 s
Description: Poznaj technikę biopsji spojówki i bezpośredniej immunofluorescencji w diagnostyce pemfigoidu błony śluzowej. Ta metoda umożliwia wczesne rozpoznanie choroby i zapobieganie ślepoty.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Fundacji Badań nad Okiem w Hyderabad w Indiach za wsparcie tego badania.

Protokół jest zgodny z wytycznymi komisji etycznej ds. badań na ludziach komisji etycznej ds. badań na ludziach LV Prasad Eye Institute.
1. Technika biopsji spojówki
<ol>
	<li>Zaplanuj biopsję z obu oczu pacjenta z podejrzeniem pemfigoidu w znieczuleniu miejscowym lub miejscowym i pod mikroskopem operacyjnym.</li>
	<li>Uzyskaj świadomą zgodę od pacjenta i wymień możliwe skutki uboczne krwawienia, bliznowacenia i konieczności rozpoczęcia miejscowego przyjmowania sterydów po operacji.</li>
	<li>Umieść 1-2 krople 0,5% proparakainy w obu oczach i odczekaj 5 minut przed rozpoczęciem zabiegu.</li>
	<li>Upewnij się, że pacjent nie odczuwa bólu podczas dotykania spojówki drobnymi kleszczami. Jeśli pacjent nadal odczuwa ból po zastosowaniu miejscowej proparakainy, wstrzyknąć 0,2 ml 2% lidokainy podspojówkowej za pomocą strzykawki tuberkulinowej o pojemności 1 ml.</li>
	<li>Umieść wziernik w prawym lub lewym oku, w zależności od tego, co zostanie wybrane jako pierwsze.</li>
	<li>Zbadaj powierzchnię oka pod kątem obszarów bliznowacenia i rogowacenia. Wybierz obszar biopsji, który nie jest zajęty i nie jest pokryty bliznami ani zrogowaciałością. UWAGA: W tym badaniu jako miejsce biopsji preferowana jest spojówka opuszkowa górna z dala od rąbka, a następnie spojówka opuszkowa dolna.</li>
	<li>Za pomocą kleszczy podnieś twardówkę ze spojówki i liniowo wytnij nożyczkami Westcotta o długości 4-5 mm i szerokości 2-3 mm.</li>
	<li>Natychmiast przenieść całą biopsję do optymalnego podłoża tnącego (OCT). UWAGA: Biopsje można przenosić w zwykłej soli fizjologicznej lub pożywce transportowej Michela.</li>
	<li>Weź wkład i plastikową foremkę do chusteczek higienicznych z dołkiem pośrodku, wyczyść je solą fizjologiczną i wysusz na powietrzu.</li>
	<li>Napełnij wkład pożywką OCT oddzielnie dla prawego i lewego oka. Zanurz wyciętą tkankę spojówki w pożywce OCT i wyślij ją do patologii.</li>
	<li>Powtórz podobne kroki również dla strony przeciwnej.</li>
</ol>
2. Przenoszenie tkanki
<ol>
	<li>Próbki z biopsji spojówki należy umieścić w pożywce OCT, aby zachować architekturę tkanek i antygenowość, jeśli są one podawane w pożywce transportowej Michela lub roztworze soli fizjologicznej.</li>
	<li>Osadzone próbki należy zamrozić błyskawicznie przy użyciu ciekłego azotu lub suchego lodu i przechowywać w temperaturze -80 °C przez noc.</li>
</ol>
3. Przygotowanie i sekcja tkanek
<ol>
	<li>Zamrożoną tkankę podzielić na 4–6 μm plastrów (w liczbie 7) za pomocą kriostatu w temperaturze od -20 °C do -25 °C.</li>
	<li>Zamontuj skrawki na dodatnio naładowanych szkiełkach mikroskopowych pokrytych polilizyną, aby zapewnić przyczepność i przechowuj w temperaturze -80 °C do momentu zabarwienia w folii aluminiowej.</li>
</ol>
4. Barwienie immunofluorescencyjne
<ol>
	<li>Rozmrażaj szkiełka w temperaturze pokojowej (RT) przez 10 minut i utrwalaj w zimnym acetonie (100%) przez 10 minut, aby zachować antygeny i zapobiec uszkodzeniu tkanek.</li>
	<li>Spłucz trzykrotnie 1x PBS, za każdym razem przez 5 minut, aby usunąć nadmiar pożywki OCT i acetonu.</li>
	<li>Na szkiełka nanieść sprzężone przeciwciała anty-IgG, anty-IgA, anty-IgM i anty-C3 rozcieńczone (fibrynogen-1:10 [kontrola pozytywna], IgG-1:10, IgA-1:10, IgM-1:10, C3-1:5, C4-1:10). UWAGA: Przeciwciała rozcieńcza się w 1x PBS.</li>
	<li>W przypadku kontroli ujemnych pomiń stosowanie sprzężonych przeciwciał i postępuj zgodnie z pozostałymi krokami wymienionymi poniżej.</li>
	<li>Postępuj zgodnie z wytycznymi producenta dotyczącymi rozcieńczania przeciwciał i standaryzuj ze znanymi kontrolami dodatnimi i ujemnymi.</li>
	<li>Inkubować szkiełka w wilgotnej komorze w temperaturze 37 °C przez 45-60 minut.</li>
	<li>Przemyć szkiełka PBS (3× przez 5 minut każda) w celu usunięcia niezwiązanych przeciwciał.</li>
	<li>Barwienie przeciwstawne za pomocą pożywki montażowej DAPI (4',6 -diamidino-2-fenylodole) do wizualizacji jądrowej.</li>
	<li>Umieść szkiełko nakrywkowe na szkiełkach i pozwól im utwardzić się przez 20 minut.</li>
	<li>Zbadać preparaty za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego wyposażonego w filtry odpowiednie dla zastosowanych fluoroforów (zielony filtr wzbudzenia dla 488 nm).</li>
	<li>Udokumentuj wyniki za pomocą mikrofotografii cyfrowych.</li>
</ol>
5. Szybki kwas okresowy - barwienie Schiffa
<ol>
	<li>Przygotowanie kwasu okresowego Schiffa (PAS)<ol>
		<li>Rozpuścić 1 g zasadowej fuschiny w 100 ml gorącej wody destylowanej.</li>
		<li>Dodaj 10 ml kwasu solnego i 2 g dwusiarczynu potasu, aby odbarwić barwnik.</li>
		<li>Po schłodzeniu dodać 0,5 g węgla aktywnego, wymieszać i przefiltrować roztwór, aby uzyskać klarowny odczynnik Schiffa w kwasie okresowym. Przechowywać w ciemnej butelce. UWAGA: Aby przetestować odczynnik Schiffa, wlej 10 ml 37% formaliny do szkiełka zegarka i dodaj kilka kropli odczynnika Schiffa, który ma być testowany. Dobry odczynnik Schiffa szybko zmieni kolor na czerwono-fioletowy. Pogarszający się odczynnik Schiffa spowoduje opóźnioną reakcję, a produkt będzie miał głęboki niebiesko-fioletowy kolor.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Technika barwienia PAS<ol>
		<li>Nawodnij szkiełka w wodzie.</li>
		<li>Utleniać w 0,5% roztworze kwasu okresowego przez 5 min.</li>
		<li>Spłucz w wodzie destylowanej.</li>
		<li>Umieść w odczynniku Schiffa na 15 minut (na tym etapie skrawki są jasnoróżowe)</li>
		<li>Myć w letniej wodzie z kranu przez 5 minut (sekcje zmieniają kolor na ciemnoróżowy).</li>
		<li>Barwienie przeciwstawne w hematoksylinie Mayera przez 1 min.</li>
		<li>Myć w wodzie z kranu przez 5 min.</li>
		<li>Odwodnić szkiełka w następujących roztworach: Jeden raz w 80% alkoholu etylowym przez 1 minutę, dwa razy w 90% alkoholu etylowym przez 1 minutę, dwa razy w 100% alkoholu etylowym przez 1 minutę.</li>
		<li>Odwodnić szkiełka trzy razy w ksylenie przez 1 minutę każda.</li>
		<li>Umieść szkiełko nakrywkowe na szkiełkach za pomocą syntetycznego medium montażowego (np. uchwytu DPX)</li>
		<li>Obserwuj wyniki PAS pod mikroskopem jasnego pola.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Jain, N., Jakati, S., Shanbhag, S. S., Basu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+immunofluorescence+findings+and+factors+affecting+conjunctival+biopsy+positivity+in+ocular+mucous+membrane+pemphigoid%5BTitle%5D)+AND+%22Cornea%22%5BJournal%5D)">Direct immunofluorescence findings and factors affecting conjunctival biopsy positivity in ocular mucous membrane pemphigoid.</a> Cornea. 43 (2), 159-165 (2024).</li>
<li>Vazirani, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+cicatrizing+conjunctivitis%3A+a+review+of+the+differential+diagnosis+and+an+algorithmic+approach+to+management%5BTitle%5D)+AND+%22Indian+J+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Chronic cicatrizing conjunctivitis: a review of the differential diagnosis and an algorithmic approach to management.</a> Indian J Ophthalmol. 68 (11), 2349-2355 (2020).</li>
<li>Singh, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drug-induced+cicatrizing+conjunctivitis%3A+a+case+series+with+review+of+etiopathogenesis%2C+diagnosis+and+management%5BTitle%5D)+AND+%22Ocul+Surf%22%5BJournal%5D)">Drug-induced cicatrizing conjunctivitis: a case series with review of etiopathogenesis, diagnosis and management.</a> Ocul Surf. 24, 83-92 (2022).</li>
<li>Bocanegra-Oyola, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+characteristics+of+ocular+mucous+membrane+pemphigoid%3A+a+systematic+review+and+meta-analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Ocul+Immunol+Inflamm%22%5BJournal%5D)">Clinical characteristics of ocular mucous membrane pemphigoid: a systematic review and meta-analysis.</a> Ocul Immunol Inflamm. 32 (10), 2388-2404 (2024).</li>
<li>Coco, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conjunctival+biopsy+site+in+mucous+membrane+pemphigoid%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Conjunctival biopsy site in mucous membrane pemphigoid.</a> Am J Ophthalmol. 216, 1-6 (2020).</li>
<li>Ong, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mucous+membrane+pemphigoid+with+ocular+involvement%3A+the+clinical+phenotype+and+its+relationship+to+direct+immunofluorescence+findings%5BTitle%5D)+AND+%22Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Mucous membrane pemphigoid with ocular involvement: the clinical phenotype and its relationship to direct immunofluorescence findings.</a> Ophthalmology. 125 (4), 496-504 (2018).</li>
<li>Anesi, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reliability+of+conjunctival+biopsy+for+diagnosis+of+ocular+mucous+membrane+pemphigoid%3A+redetermination+of+the+standard+for+diagnosis+and+outcomes+of+previously+biopsy-negative+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Ocul+Immunol+Inflamm%22%5BJournal%5D)">Reliability of conjunctival biopsy for diagnosis of ocular mucous membrane pemphigoid: redetermination of the standard for diagnosis and outcomes of previously biopsy-negative patients.</a> Ocul Immunol Inflamm. 29 (6), 1106-1113 (2021).</li>
<li>Dart, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autoantibody+detection+for+diagnosis+in+direct+immunofluorescence-negative+mucous+membrane+pemphigoid%3A+ocular+and+other+sites+compared%5BTitle%5D)+AND+%22Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Autoantibody detection for diagnosis in direct immunofluorescence-negative mucous membrane pemphigoid: ocular and other sites compared.</a> Ophthalmology. 128 (3), 372-382 (2021).</li>
<li>Leonard, J. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunofluorescent+studies+in+ocular+cicatricial+pemphigoid%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Immunofluorescent studies in ocular cicatricial pemphigoid.</a> Br J Dermatol. 118 (2), 209-217 (1988).</li>
<li>Mehra, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diagnostic+relevance+of+direct+immunofluorescence+in+ocular+mucous+membrane+pemphigoid%5BTitle%5D)+AND+%22JDDG%22%5BJournal%5D)">Diagnostic relevance of direct immunofluorescence in ocular mucous membrane pemphigoid.</a> JDDG. 13 (12), 1268-1274 (2015).</li>
<li>Shimanovich, I., Nitz, J. M., Zillikens, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+and+repeated+sampling+increases+the+sensitivity+of+direct+immunofluorescence+testing+for+the+diagnosis+of+mucous+membrane+pemphigoid%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Acad+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Multiple and repeated sampling increases the sensitivity of direct immunofluorescence testing for the diagnosis of mucous membrane pemphigoid.</a> J Am Acad Dermatol. 77 (4), 700-705 (2017).</li>
<li>Goldich, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characteristics+of+patients+with+ocular+cicatricial+pemphigoid+referred+to+major+tertiary+hospital%5BTitle%5D)+AND+%22Can+J+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Characteristics of patients with ocular cicatricial pemphigoid referred to major tertiary hospital.</a> Can J Ophthalmol. 50 (2), 137-142 (2015).</li>
<li>Mudhar, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biopsies+of+cicatricial+conjunctivitis+cases+reveal+highly+variable+sampling+practice+among+ophthalmologists%3A+time+for+national+and+international+standardisation%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Biopsies of cicatricial conjunctivitis cases reveal highly variable sampling practice among ophthalmologists: time for national and international standardisation.</a> Br J Ophthalmol. 100 (6), 736-744 (2016).</li>
<li>Vodegel, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+diagnostic+immunofluorescence+using+biopsies+transported+in+saline%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Enhanced diagnostic immunofluorescence using biopsies transported in saline.</a> BMC Dermatol. 4, 1-7 (2004).</li>
<li>Jonkman, M. F., De Groot, A. C., Slegers, T. P., De Jong, M. C., Pas, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+diagnosis+of+pure+ocular+mucous+membrane+pemphigoid%3A+indirect+immunofluorescence+versus+immunoblot%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Immune diagnosis of pure ocular mucous membrane pemphigoid: indirect immunofluorescence versus immunoblot.</a> Eur J Dermatol. 19 (5), 456-460 (2009).</li>
<li>Shimanovich, I., Nitz, J. M., Witte, M., Zillikens, D., Rose, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunohistochemical+diagnosis+of+mucous+membrane+pemphigoid%5BTitle%5D)+AND+%22J+Oral+Pathol+Med%22%5BJournal%5D)">Immunohistochemical diagnosis of mucous membrane pemphigoid.</a> J Oral Pathol Med. 47 (6), 613-619 (2018).</li>
<li>Philip, A. M., Stephenson, A., Al-Dabbagh, A., Ramezani, K., Fernandez-Santos, C. C., Foster, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ocular+cicatricial+pemphigoid+with+IgM-positive+biopsy%5BTitle%5D)+AND+%22Cornea%22%5BJournal%5D)">Ocular cicatricial pemphigoid with IgM-positive biopsy.</a> Cornea. 42 (12), 1503-1505 (2023).</li>
<li>Williams, G. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conjunctival+neutrophils+predict+progressive+scarring+in+ocular+mucous+membrane+pemphigoid%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Conjunctival neutrophils predict progressive scarring in ocular mucous membrane pemphigoid.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 57 (13), 5457-5469 (2016).</li>
<li>Levian, B., Hussaini, S. S., Woodley, D. T., Kasperkiewicz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pseudopemphigoid%3A+a+systematic+review%5BTitle%5D)+AND+%22JAAD+Int%22%5BJournal%5D)">Pseudopemphigoid: a systematic review.</a> JAAD Int. 17, 170-171 (2024).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Opisana tutaj technika biopsji spojówki wykorzystuje pożywkę OCT jako pożywkę transferową, eliminując potrzebę dodatkowego podłoża transferowego i unikając obsługi biopsji w celu przeniesienia go na pożywkę OCT w celu kriosekcji. Plastikowa forma kartridża wypełniona pożywką i biopsją jest bezpośrednio zamrażana w celu wytworzenia bloków tkanki, a następnie cięta. Zaletą OCT jest to, że szybko zamarza z minimalnymi uszkodzeniami spowodowanymi tworzeniem się kryształów i otacza próbki tkanek. Najważniejszym krokiem w immu...

Pemfigoid błony śluzowej (MMP) jest przewlekłą bliznowatą chorobą spojówek o etiologii autoimmunologicznej i atakuje błony śluzowe w organizmie 1,2. Przewlekłe bliznowacenie spojówek ma różną etiologię i konieczne jest różnicowanie MMP od SJS, sarkoidozy, neoplazji płaskonabłonkowej oka i pseudopemfigoidu, ponieważ to pierwsze wymaga ogólnoustrojowej immunosupresji 3,4. Co więcej, MMP jest chorobą potencjalnie powodującą ślepotę, w której pacjenci często zgłaszają się późno i są początkowo błędnie diagnozowani 1,2,5. Tylko zajęcie oka bez zajęcia ogólnoustrojowego można zaobserwować u 27,4% pacjentów z MMP oka6. Rozpoznanie MMP wymaga biopsji spojówki w celu wykazania obecności autoprzeciwciał w błonie podstawnej 2,5. Immunofluorescencja bezpośrednia (DIF) jest kluczowym narzędziem diagnostycznym do identyfikacji chorób autoimmunologicznych wpływających na spojówki, takich jak MMP. DIF pomaga wykrywać odkładanie się immunoglobulin i składników dopełniacza in situ w strefie błony podstawnej (BMZ), co jest charakterystyczne dla MMP. Wskaźniki dodatniości DIF wahają się od 30% do 80%1,5. Jednak niektórzy pacjenci mogą mieć ujemną biopsję, zwłaszcza ci z MMP tylko ocznej, ale dokumentacja kliniczna progresji choroby jest traktowana podobnie jak w przypadku MMP z dodatnim wynikiem biopsjioka 7,8. W związku z tym Dart i wsp. podkreślili potrzebę oddzielnych kryteriów diagnostycznych dla MMP8 tylko w gałce ocznej.
Proponowane przyczyny niskiego wskaźnika dodatnich wyników we wszystkich badaniach to zaawansowana choroba z rozległymi bliznowaceniami na powierzchni oka, nieodpowiednie techniki przetwarzania lub barwienia tkanek oraz wariant choroby z ujemnym wynikiem biopsji 8,9,10,11. Retrospektywna analiza biopsji od 27 pacjentów z podejrzeniem MMP oka wykazała tylko 30% wskaźnik dodatniości, a 63,7% miało zajęcie tylko oka12. DIF wymaga określonego protokołu; Nie każde laboratorium diagnostyczne jest do tego przystosowane. Istnieją różnice dotyczące miejsca biopsji, tego, czy należy wykonać biopsję z jednego lub obu oczu oraz roztworów do przenoszenia próbek 13,14,15. W retrospektywnej analizie biopsji spojówek w naszym ośrodku, wskaźnik dodatniej DIF wynosił 54,1%, z większą liczbą pozytywnych wyników w przypadku biopsji obustronnej (59% w porównaniu z 45%)8. Chociaż biopsja ma kluczowe znaczenie, objawy kliniczne i postępujące bliznowacenie powierzchni oka pomagają w rozpoznaniu MMP. Łatwiej jest zdiagnozować, gdy zajęte jest miejsce pozagałkowe, takie jak jama ustna lub skóra, zgłoszone odpowiednio u 40% i 18% pacjentów5.
W istniejącej literaturze istnieją różnice, a przedstawiony tutaj protokół może służyć jako przewodnik referencyjny z modyfikacjami wprowadzonymi w celu zmniejszenia potrzeby stosowania unikalnego medium transferowego14. Biopsje są przenoszone w pożywce o optymalnej temperaturze cięcia (OCT) i zamrażane zatrzaskowo w tym samym kartridżu transferowym w laboratorium patomorfologicznym, co eliminuje potrzebę stosowania dodatkowego podłoża transferowego. W niniejszym artykule przedstawiono metodologię barwienia DIF tkanki spojówki, pobierania tkanek i protokołu transferu próbki.

<table><tbody><tr><td>1 N kwas solny&nbsp;</td><td>Finanse&nbsp; chemiczna Limited&nbsp;</td><td>7647-01-0</td><td></td></tr><tr><td>Aceton&nbsp;</td><td>Qualigens (Qualigens)</td><td>Q33517 powiedział:</td><td></td></tr><tr><td>Albumina</td><td>DAKO</td><td>F0117 powiedział:</td><td></td></tr><tr><td>Podstawowa fuksyna</td><td>Qualigens (Qualigens)</td><td>Numer katalogowy Q39402 powiedział:</td><td></td></tr><tr><td>Klasa C3c</td><td>Biosystemy diagnostyczne&nbsp;</td><td>F003 powiedział:</td><td></td></tr><tr><td>Klasa C4c</td><td>Biosystemy diagnostyczne&nbsp;</td><td>F005 powiedział:</td><td></td></tr><tr><td>Nabój</td><td>Nauki polilogiczne</td><td>25376-500</td><td></td></tr><tr><td>Aktywowany węglem drzewnym&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>Silnik C-5260</td><td></td></tr><tr><td>Kriostat&nbsp;</td><td>Leica&nbsp;</td><td>CM1860UV&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Ostrza do kriotomów&nbsp;</td><td>Leica&nbsp;</td><td>818</td><td></td></tr><tr><td>DAPI (interfejs DAPI)</td><td>Biblioteka&nbsp;</td><td>Zobacz materiał AB104139 powiedział:</td><td></td></tr><tr><td>Fibrynogen&nbsp;</td><td>Biosystemy diagnostyczne&nbsp;</td><td>F006 powiedział:</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop fluorescencyjny</td><td>Olympus</td><td>CX43</td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze&nbsp;</td><td>Joja chirurgiczna</td><td>JS1528A</td><td></td></tr><tr><td>Komora wilgotności&nbsp;</td><td>Biosystemy diagnostyczne&nbsp;</td><td>Zobacz materiał SM365</td><td></td></tr><tr><td>IgA</td><td>Biosystemy diagnostyczne&nbsp;</td><td>F007 powiedział:</td><td></td></tr><tr><td>IgG (IgG)</td><td>Biosystemy diagnostyczne&nbsp;</td><td>F008 powiedział:</td><td></td></tr><tr><td>Igm</td><td>Biosystemy diagnostyczne&nbsp;</td><td>F009 powiedział:</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka samoprzylepne IHC&nbsp;</td><td>Tomo&nbsp;</td><td>33140455</td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze</td><td>Żużel&nbsp;</td><td>S-7223</td><td></td></tr><tr><td>Michel's tansport medium</td><td>Fisher Scinitics&nbsp;</td><td>NC0253304</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskopijne szkło osłonowe</td><td>Niebieska gwiazda</td><td>https://www.bluestarslides.com</td><td></td></tr><tr><td>OCT Średnie&nbsp;</td><td>Kriomatriks&nbsp;</td><td>6769006</td><td></td></tr><tr><td>PBS&nbsp;</td><td>DAKO</td><td>DM831 powiedział:</td><td></td></tr><tr><td>Kwas okresowy&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>Numer telefonu 375810-25G</td><td></td></tr><tr><td>Dwusiarczyn potasu</td><td>Sigma</td><td>Zobacz materiał P2522-500G</td><td></td></tr><tr><td>Proparakaina 0,5%</td><td>Sunway Prywatny&nbsp;</td><td>G/1118A</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki Westcotta</td><td>Pillig Gurgical Instruments&nbsp;</td><td>423480</td><td></td></tr></tbody></table>

technika biopsji spojówki i bezpośredniej immunofluorescencji w diagnostyce pemfigoidu błony śluzowej

Technique of Conjunctival Biopsy and Direct Immunofluorescence for Diagnosing Mucous Membrane Pemphigoid

Pemfigoid błony śluzowej oka (MMP) objawia się przewlekłym bliznowaceniem spojówek, które, jeśli nie jest leczone, może powodować ślepotę. Szybka diagnoza i terapia immunosupresyjna zapobiegają postępowi choroby. Bezpośrednie barwienie immunofluorescencyjne (DIF) biopsji spojówki w celu osadzania się kompleksu immunologicznego w błonie podstawnej jest diagnostyką MMP. Wskaźnik dodatnich wyników biopsji zależy od charakterystyki biopsji, lateralizacji, podeszłego wieku i aktywności choroby. Aktualny artykuł metodowy opisuje technikę pobierania biopsji spojówki i stosowania wkładów wypełnionych pożywką o optymalnej temperaturze cięcia do przenoszenia próbek i przygotowania bloków. Biopsję wykonuje się z niebliznowatego, niezaangażowanego lub stosunkowo mniej zaangażowanego obszaru spojówki w obu oczach. Zwykły rozmiar biopsji to 4-5 mm długości, 2-3 mm szerokości i powinien mieć maleńką tkankę podspojówkową, aby nie pominąć błony podstawnej. Zalecamy wykonanie okresowego barwienia kwasem Schiffa w celu potwierdzenia obecności błony podstawnej. Stosując określony protokół, kriosekcje z biopsji są barwione przeciwciałami sprzężonymi z fluorescencją IgG, IgM, IgA oraz czynnikami dopełniacza C3c i C4c. Dodatnia biopsja wykazuje zieloną dodatnią fluorescencję w błonie podstawnej, a nawet jeśli jedno z przeciwciał jest dodatnie, jest MMP dodatnie. Ujemna biopsja nie wyklucza pemfigoidu; jednak pozytywny potwierdza MMP i odróżnia go od wywołanego lekami bliznowacenia spojówek lub pseudopemphigoidu.

Interpretacja DIF wymaga potwierdzenia obecności błony podstawnej w skrawkach tkanek (ryc. 1). W szkiełkach zabarwionych PAS błona podstawna pojawi się jako jasnoróżowa błona znajdująca się w obszarze podstawy nabłonka spojówki (ryc. 1C). Należy również skomentować ciągłość i architekturę membrany podstawnej. Dodatni wynik DIF będzie widoczny jako jasnozielony BM (figura 1B), wskazujący na osadzanie się IgM (fig...

W tym miejscu przedstawiamy protokół pobierania i przetwarzania biopsji spojówki w celu identyfikacji pemfigoidu błony śluzowej.

Technika biopsji spojówki i bezpośredniej immunofluorescencji w diagnostyce pemfigoidu błony śluzowej

Ocular mucous membrane pemphigoid (MMP) presents as chronic cicatrizing conjunctivitis that, if left untreated, can cause blindness. Timely diagnosis and ...

Staramy się zwiększyć zastosowanie biopsji spojówki w diagnostyce pemfigoidu błony śluzowej, który jest przewlekłym zapaleniem spojówek, a nieleczony może powodować ślepotę. Bezpośrednie barwienie immunofluorescencyjne biopsji spojówki w celu osadzania kompleksu immunologicznego w błonie pacjenta jest diagnostyką MMP, ale nie jest wykonywane w wielu ośrodkach na całym świecie. Obecny artykuł dotyczący metod opisuje techniki pobierania biopsji spojówki i stosowania pożywki o optymalnej temperaturze cięcia wypełnionej wkładami do przenoszenia próbki i przygotowania krwi, co zmniejsza operację próbki.Na początek zaplanuj biopsję z obu oczu pacjenta z podejrzeniem pemfigoidu w znieczuleniu miejscowym lub miejscowym przy użyciu mikroskopu operacyjnego. Uzyskaj świadomą zgodę od pacjenta i jasno wyjaśnij możliwe skutki uboczne, w tym krwawienie, blizny i potencjalną potrzebę rozpoczęcia miejscowego przyjmowania sterydów po operacji. Przed wykonaniem biopsji należy przygotować wkłady, czyszcząc je zwykłą solą fizjologiczną i wypełniając optymalną temperaturą cięcia lub pożywką OCT oddzielnie dla każdego oka.Teraz umieść wziernik w wybranym oku, w prawo lub w lewo. Po zastosowaniu miejscowej proparakainy, jeśli pacjent nadal odczuwa ból, wstrzyknąć 0,2 mililitra 2% lidokainy podspojówkowo za pomocą strzykawki o pojemności 1 mililitra do tuberkuliny. Po zdjęciu spojówki z twardówki za pomocą kleszczy kończyn, wykonaj liniowe wycięcie o długości około 4-5 milimetrów i szerokości 2-3 milimetrów za pomocą nożyczek Westcotta.Natychmiast przenieś całą biopsję do podłoża o optymalnej temperaturze cięcia. Błyskawiczne zamrażanie osadzonych próbek za pomocą ciekłego azotu lub suchego lodu. Następnie przechowuj je przez noc w temperaturze -80 stopni Celsjusza.Zamrożoną tkankę podzielić na plastry o grubości 4-6 mikrometrów za pomocą kriostatu utrzymywanego w temperaturze od -20 do -25 stopni Celsjusza. Zamontuj sekcje na dodatnio naładowanych szkiełkach mikroskopowych pokrytych polilizyną, aby zapewnić przyczepność. Następnie zawiń szkiełka w folię aluminiową przed przechowywaniem w temperaturze -80 stopni Celsjusza do momentu zabarwienia.Rozmrażaj szkiełka w temperaturze pokojowej przez 10 minut. Następnie utrwal tkankę w 100% zimnym acetonie na kolejne 10 minut, aby zachować antygeny i zminimalizować uszkodzenia tkanek. Teraz przepłucz szkiełka OBS trzy razy, każdy przez pięć minut, aby wyeliminować resztki pożywki OCT i acetonu.Na szkiełka nanieść rozcieńczone sprzężone przeciwciała, anty-IgG, anty-IgA, anty-IgM i anty-IgC3. Nie należy stosować przeciwciał do szkiełka kontroli ujemnej. Teraz inkubuj szkiełka w wilgotnej komorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 45-60 minut.Następnie przemyj szkiełka PBS trzy razy przez pięć minut każde, aby usunąć niezwiązane przeciwciała. Przeciwbarwienie z medium montażowym zawierającym DAPI do wizualizacji jądrowej. Na koniec umieść szkiełko nakrywkowe na każdym szkiełku i pozwól im utwardzić się przez 20 minut.Zbadaj szkiełka za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego wyposażonego w odpowiednie filtry, w tym zielony filtr wzbudzenia o długości 488 nanometrów do wykrywania fluoroforów. Błona podstawna została potwierdzona w biopsjach spojówek przy użyciu barwienia PAS, pojawiając się jako ciągły jasnoróżowy pasek u podstawy nabłonka. Bezpośrednią dodatniość immunofluorescencji zwizualizowano jako jasnozieloną fluorescencję wzdłuż błony podstawnej.Bezpośrednie biopsje immunofluorescencyjne dodatnie wykazały fluorescencję immunoglobulin IgM, IgA i IgG, podczas gdy biopsje ujemne nie miały fluorescencji. Kontrola pozytywna wykazała silną zieloną fluorescencję na błonie podstawnej.

technique-conjunctival-biopsy-direct-immunofluorescence-for

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Opryszczkowe zapalenie skóry (DH) jest przewlekłym stanem zapalnym charakteryzującym się reakcją autoimmunologiczną między IgA a transglutaminazą epidermalną (eTG). DH rozwija się u niewielkiej części pacjentów z nadwrażliwością na gluten i/lub celiakią. Wyniki niniejszego badania wskazują, że DH może rozwijać się również u małpy z gatunku makaka rezusa z objawami idiopatycznego zapalenia skóry.

Rozpoznanie transglutaminazy epidermalnej przez przeciwciała IgA i przeciwciała przeciwko tkankowej transglutaminazie 2 w rzadkim przypadku zapalenia skóry u Rhesus

Rośnie zainteresowanie zrozumieniem funkcji immunologicznych określonych subpopulacji komórek w łatach Peyera (PP), głównych miejscach indukcyjnych tkanek limfatycznych związanych z jelitami.  W tym miejscu przedstawiamy równoległe protokoły przygotowania preparatów pojedynczych komórek PP do analizy cytometrii przepływowej i kriosekcji PP do barwienia immunologicznego.

Izolowanie i barwienie immunologiczne limfocytów i komórek dendrytycznych z mysich plastrów Peyera

Zebraliśmy, wybarwiliśmy i zobrazowaliśmy komórki z spojówki wewnętrznej krawędzi powieki u ludzi. Charakteryzując morfologię komórek i aktywność metaboliczną, metoda ta może pogłębić naszą wiedzę na temat suchego oka i roli, jaką tarcie między powierzchniami oka może odgrywać w odczuwaniu dyskomfortu ocznego.

Cytologia wyciskowa obszaru wycieraczki pokrywy

Odsłonięta normalna powierzchnia oka składa się z rogówki i spojówki. Komórki nabłonkowe, komórki kubkowe i komórki odpornościowe są obecne w spojówce. W tym miejscu opisano nieinwazyjną technikę cytologii wyciskowej z wykorzystaniem urządzenia do cytologii wyciskowej i cytometrii przepływowej do analizy komórek odpornościowych w spojówce.

Nieinwazyjny sposób izolowania i fenotypowania komórek ze spojówki

Badanie mikrośrodowiska guza może zidentyfikować prognostyczne lub predykcyjne biomarkery klinicznej odpowiedzi na immunoterapię. Przedstawiona tutaj jest innowacyjna metoda oparta na obrazowaniu wielospektralnym fluorescencji in situ w celu automatycznej analizy i zliczania różnych subpopulacji limfocytów T CD8 +. Ta powtarzalna i niezawodna technika nadaje się do dużych analiz kohortowych.

Multipleksowa analiza immunofluorescencyjna i kwantyfikacja wewnątrznowotworowych limfocytów T PD-1 + Tim-3 + CD8 +

Szczegółowy protokół dla sześciomarkerowego multipleksowego panelu immunofluorescencyjnego jest zoptymalizowany i wykonany, przy użyciu automatycznego barwnika dla bardziej spójnych wyników i krótszego czasu zabiegu. Podejście to może być bezpośrednio zaadaptowane przez dowolne laboratorium do badań immunoonkologicznych.

Zautomatyzowany multipleksowy panel immunofluorescencyjny do badań immunoonkologicznych na próbkach tkanek raka utrwalonego formaliną

Tutaj prezentujemy protokół swobodnego pośredniego testu immunofluorescencyjnego na odcinkach biopsji skóry, który pozwala na identyfikację specyficznych dla choroby wariantów konformacji alfa synukleiny związanej z chorobą Parkinsona i wielu białek obwodowego układu nerwowego.

Celowanie w agregaty alfa synukleiny w obwodowych włóknach nerwowych skóry za pomocą swobodnego testu immunofluorescencji

Zapalenie powierzchni oka uszkadza tkanki powierzchni oka i zagraża funkcjom życiowym oka. Niniejszy protokół opisuje metodę wywoływania zapalenia oka i zbierania uszkodzonych tkanek w mysim modelu dysfunkcji gruczołów Meiboma (MGD).

Indukcja stanu zapalnego powierzchni oka i gromadzenie zajętych tkanek

Zmiany skórne są powszechnymi i ważnymi cechami w wielu chorobach reumatycznych, a biopsja z analizą patologiczną odgrywa kluczową rolę w diagnostyce. Niniejszy artykuł zawiera szczegółowy przegląd standaryzowanej procedury biopsji skóry i, na przykładzie tocznia rumieniowatego krążkowego, podkreśla istotną rolę dermatopatologii w diagnozowaniu chorób reumatycznych.

Biopsja skóry w celu rozpoznania tocznia rumieniowatego krążkowego

Niniejszy artykuł demonstruje działanie i wpływ mikroskopii konfokalnej in vivo w diagnozie i leczeniu suchego oka oraz bada zastosowanie i wyniki mikroskopii konfokalnej in vivo , aby stanowić podstawę przyszłych badań.

In Vivo Mikroskopia konfokalna w diagnostyce i leczeniu suchego oka: Skupienie się na protokołach obrazowania i interpretacji

Poznaj technikę biopsji spojówki i bezpośredniej immunofluorescencji w diagnostyce pemfigoidu błony śluzowej. Ta metoda umożliwia wczesne rozpoznanie choroby i zapobieganie ślepoty.

Technika biopsji spojówki i bezpośredniej immunofluorescencji w diagnostyce pemfigoidu błony śluzowej

Przeglądaj więcej filmów