Name: Izolacja i cytometryczna ocena interakcji neuroimmunologicznych w mysim modelu mini-udaru (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-06-20T14:40:00.000+00:00
Duration: 8 min 22 s
Description: Poznaj protokół oceny funkcji komórek odpornościowych po udarze niedokrwiennym przy użyciu cytometrii przepływowej w mysim modelu mini-udaru. Ta metoda umożliwia szczegółową analizę interakcji neuroimmunologicznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Prace te były wspierane przez Chińską Narodową Fundację Nauk Przyrodniczych (nr 82201622) oraz Fundację Nauk Przyrodniczych Mongolii Wewnętrznej (nr 2020MS03017).

Wszystkie eksperymenty na zwierzętach zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Wykorzystania Zwierząt (IACUC) Pekińskiego Szpitala Przyjaźni Stołecznego Uniwersytetu Medycznego. Zalecamy, aby wszystkie roztwory były poddawane sterylnej filtracji i aby wszystkie używane probówki były sterylne.
1. Przygotowanie odczynników i buforu
<ol>
	<li>Mieszanina enzymów wytrawiających: Rozpuścić kolagenazę IV, aby uzyskać stężenie 0,25% i rozcieńczyć DNazę I, aby osiągnąć końcowe stężenie 2 U/ml.</li>
	<li>Bufor do magnetycznego sortowania komórek aktywowanych (MACS): Rozpuść albuminę surowicy bydlęcej (BSA) i kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA) do osiągnięcia stężeń 0,5% i 2 mM odpowiednio w 1x PBS.</li>
</ol>
2. Ogniskowy model udaru niedokrwiennego
UWAGA: Myszy C57BL / 6 J (8-10 tygodniowe) zostały wykorzystane do ustalenia ogniskowego modelu udaru niedokrwiennego, jak opisano wcześniej14. Można zastosować wszelkie alternatywne farmaceutyczne środki znieczulające do wstrzykiwań, które są dobrze udokumentowane dla gryzoni.
<ol>
	<li>Wywołać znieczulenie u myszy za pomocą 3% izofluranu podawanego z szybkością przepływu 0,8-1,0 l/min tlenu, a następnie utrzymać znieczulenie za pomocą 1,5% izofluranu. Utrzymuj temperaturę ciała na poziomie 37 °C przez cały czas trwania zabiegu za pomocą poduszki grzewczej. UWAGA: To badanie podkreśla znaczenie sprawdzenia, czy znieczulone zwierzęta osiągnęły chirurgiczną płaszczyznę znieczulenia przed nacięciem. Osiąga się to poprzez ocenę odruchu wycofania łapy poprzez mocne uszczypnięcie palców kończyn tylnych, aby potwierdzić brak odpowiedzi. Jeśli nie zostaną zaobserwowane, zwierzę jest odpowiednio znieczulane.</li>
	<li>Przytnij futro w okolicy między prawym okiem a prawym uchem za pomocą elektrycznej maszynki do golenia. Upewnij się, że skóra jest sterylna, nakładając naprzemiennie chlorheksydynę i alkohol okrężnymi ruchami przez co najmniej trzy aplikacje. Następnie przed wykonaniem nacięcia należy podać podskórnie 5 mg/kg meloksykamu i 3,25 mg/kg buprenorfiny o przedłużonym uwalnianiu. Przed nacięciem należy wykonać śródskórne wstrzyknięcie do 4 mg/kg lidokainy, rozcieńczonej w soli fizjologicznej, wzdłuż linii nacięcia. Następnie nałóż lubrykant okulistyczny na powierzchnię oczu, aby zapobiec wysuszeniu rogówki i wykonaj pionowe nacięcie o długości 0,5 cm w wyznaczonym obszarze przylegającym do oczu pod mikroskopem preparacyjnym.</li>
	<li>Delikatnie oddziel wszystkie tkanki, aby odsłonić czaszkę i zidentyfikować dystalną gałąź prawej środkowej tętnicy mózgowej (MCA), charakteryzującą się pionową strukturą naczyniową w kształcie litery "Y". Użyj wiertarki elektrycznej, aby przebić czaszkę, uważając, aby ostrożnie ją usunąć.</li>
	<li>Delikatnie wytnij opony mózgowe za pomocą mikrokleszczyków.</li>
	<li>Odsłonić dystalną gałąź prawej środkowej tętnicy mózgowej (MCA), a następnie wykonać trwałe podwiązanie dystalnej gałęzi prawej tętnicy mózgowej za pomocą niewchłanialnego szwu polipropylenowego 10-0, zabezpieczając go podwójnym węzłem, po którym następuje węzeł odwrotny. Następnie usuń nadmiar końców szwu.</li>
	<li>Ustaw tkankę do pierwotnego stanu i zamknij nacięcie skóry twarzy nylonowym szwem 4-0.</li>
	<li>Ustaw mysz w pozycji leżącej na plecach i przytnij futro w okolicy szyi za pomocą elektrycznej maszynki do golenia. Upewnij się, że skóra jest sterylna, nakładając naprzemiennie chlorheksydynę i alkohol okrężnymi ruchami przez co najmniej trzy aplikacje.</li>
	<li>Wykonaj poziome nacięcie w okolicy szyi i delikatnie rozsuń gruczoły podżuchwowe. Krótko mówiąc, umiejętnie wykonuje się poprzeczne nacięcie przez skórę za pomocą skalpela, ułatwiając wizualizację gruczołów podżuchwowych po obu stronach linii środkowej. Gruczoł podżuchwowy jest następnie ostrożnie poddawany sekcji za pomocą kleszczy i tępo zakończonych nożyczek, odsłaniając leżącą poniżej tętnicę szyjną.</li>
	<li>Ostrożnie wypreparuj pochewkę tętnicy szyjnej za pomocą mikrokleszczyków, identyfikując wspólną tętnicę szyjną i oddzielając ją od nerwu błędnego.</li>
	<li>Przewlecz nylonowy szew 4-0 przez wspólną tętnicę szyjną i zabezpiecz go węzłem ślizgowym.</li>
	<li>Powtórz krok 10 na przeciwległej tętnicy szyjnej wspólnej. Tymczasowo zamknij obustronne tętnice szyjne wspólne (CCA) na 7 minut.</li>
	<li>Wymień tkankę gruczołu podżuchwowego do jej pierwotnej pozycji i zamknij nacięcie szyi klejem tkankowym. UWAGA: Pozorowana grupa operacyjna została poddana procedurom, które były identyczne z tymi w grupie udarowej, z jednym wyjątkiem, że dystalne MCA i CCA pozostały niepodwiązane.</li>
	<li>Monitoruj mysz przez cały zabieg chirurgiczny i po nim, w tym jej oddech i temperaturę ciała. Umieść mysz w klatce pozbawionej ściółki, umieszczonej do połowy na poduszce grzewczej i utrzymuj tę konfigurację, aż będzie w pełni wybudzona. Aby złagodzić dyskomfort, należy podać 0,05 mg/kg buprenorfiny w ciągu pierwszych 48 godzin po zabiegu.</li>
</ol>
3. Perfuzja i rozwarstwienie mózgu
<ol>
	<li>Przygotować strzykawkę o pojemności 50 ml i przymocować do jej końca igłę o pojemności 26 g. Napełnić strzykawkę roztworem soli fizjologicznej.</li>
	<li>Głęboko znieczulij mysz za pomocą 3% izofluranu, a następnie poddaj się eutanazji przez uduszenie dwutlenkiem węgla. UWAGA: Badanie to podkreśla krytyczną konieczność upewnienia się, że znieczulone zwierzęta osiągnęły chirurgiczną płaszczyznę znieczulenia przed wykonaniem jakichkolwiek nacięć. Weryfikację tę uzyskuje się poprzez ocenę odruchu wycofania łapy poprzez mocne uszczypnięcie palców na tylnej kończynie, potwierdzając w ten sposób brak jakiejkolwiek odpowiedzi. Jeśli nie zaobserwuje się żadnej reakcji, można stwierdzić, że zwierzę jest wystarczająco znieczulone.</li>
	<li>Ustaw mysz w pozycji leżącej na piankowej desce, rozciągając kończyny przednie i tylne, zabezpieczając je igłami 26 G.</li>
	<li>Gdy mysz zostanie dokładnie znieczulona, chwyć skórę brzucha ząbkowanymi kleszczami kciuka i wykonaj boczne nacięcie, aby odsłonić wątrobę. Przystąp do cięcia wzdłuż obu stron żeber, aby odsłonić serce.</li>
	<li>Wprowadzić igłę 26 G do lewej komory i odciąć prawą małżowinę uszną, a następnie wcisnąć strzykawkę, aby umożliwić wypływ krwi.</li>
	<li>Kontynuuj proces perfuzji, aż krew spływająca z małżowiny usznej stanie się czysta.</li>
	<li>Odetnij głowę myszy, przecinając kręgosłup szyjny za pomocą prostych nożyczek chirurgicznych.</li>
	<li>Wykonaj tylno-przednie nacięcie w skórze głowy, aby odsłonić czaszkę. Wykonaj dwa boczne nacięcia na styku ścian bocznych i podstawy czaszki.</li>
	<li>Przeciąć czaszkę wzdłuż szwu strzałkowego i wykonać nacięcie między oczodołami.</li>
	<li>Użyj kleszczy, aby usunąć czaszkę pokrywającą każdą półkulę, odsłaniając w ten sposób mózg i przenieś go do stalowej matrycy mózgu myszy. Następnie podziel mózg na kolejne plasterki koronalne o grubości 2 mm.</li>
</ol>
4. Trawienie tkanki korowej do zawiesiny jednokomórkowej i barwienie przeciwciał do cytometrii przepływowej
<ol>
	<li>Wprowadzić 500 μl mieszanki enzymów trawiących do każdego dołka 12-dołkowej płytki.</li>
	<li>Delikatnie oddziel tkankę zawału i przenieś ją do mieszanki enzymów trawiennych za pomocą mikrokleszczy (ryc. 1).</li>
	<li>Tkankę należy rozdrobnić na jak najmniejsze kawałki za pomocą nożyczek okulistycznych i inkubować w temperaturze 37 °C przez 20 minut.</li>
	<li>Za pomocą pipety P1000 delikatnie odessać i dozować roztwór 10 razy, aby zdysocjować tkankę na poszczególne komórki, a następnie przepuścić roztwór przez sitko do komórek o wielkości 70 μm. Stale płukać zarówno płytkę 12-dołkową, jak i sitko komórkowe lodowatym HBSS zawierającym wapń i magnez.</li>
	<li>Odwirować w temperaturze 500 × g w temperaturze 4 °C przez 5 minut, a następnie ostrożnie wyrzucić supernatant. UWAGA: Biorąc pod uwagę, że wytworzone granulki są dość luźne i łatwo się przemieszczają, należy powstrzymać się od ich naruszania, aby zapobiec utracie komórek.</li>
	<li>Zawiesić osad w 1 ml 1x PBS i powtórzyć krok 5. Następnie ponownie zawiesić osad w 150 μl 1x PBS i przenieść zawiesinę na 96-dołkową płytkę z okrągłym dnem. Następnie ponownie odwirować w temperaturze 500 × g w temperaturze 4 °C przez 5 minut.</li>
	<li>Mocno chwycić 96-dołkową płytkę i szybko ją odwrócić, aby odrzucić supernatant.</li>
	<li>Rozcieńczyć barwnik fluorescencyjny o żywotności komórek w stosunku 1:100 w 1x PBS, a następnie ponownie zawiesić osad w podwielokrotności 150 μl. Inkubować przez 10 minut w temperaturze pokojowej (RT), osłonięty przed światłem.</li>
	<li>Odwirować w temperaturze 500 × g w temperaturze 4 °C przez 5 minut i odrzucić supernatant. Rozcieńczyć koktajl przeciwciał na powierzchni komórki w buforze MACS. Nie myjąc komórek, dodać koktajl przeciwciał na powierzchni komórki i inkubować przez dodatkowe 15-20 minut w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Odwirować przy 500 × g w temperaturze 4 °C przez 5 minut i odrzucić supernatant. Zawiesić osad w 150 μl buforu MACS.</li>
	<li>Powtórzyć krok 4.10 i przenieść zawiesinę do probówek wirówkowych o pojemności 1,5 ml lub probówek z polistyrenu o okrągłym dnie o pojemności 5 ml.</li>
</ol>
5. Analiza i sortowanie cytometrii przepływowej
<ol>
	<li>Zaprojektuj wielokolorowy panel cytometrii przepływowej zgodnie z konfiguracją urządzenia, wykorzystując techniki ręczne lub narzędzie do projektowania online, aby zoptymalizować wybór fluoroforów sprzężonych z przeciwciałami i zminimalizować nakładanie się widma. UWAGA: Podczas projektowania wielokolorowego panelu cytometrii przepływowej należy wziąć pod uwagę kilka kluczowych kwestii. Po pierwsze, przed rozpoczęciem należy zapoznać się z konfiguracją używanego instrumentu, w tym z laserami i filtrami. Po drugie, należy stosować jasne znaczniki fluoroforowe na przeciwciałach dla antygenów o niskiej liczebności, decydując się jednocześnie na słabe etykiety fluoroforowe na przeciwciałach ukierunkowanych na antygeny o wysokiej ekspresji. Wreszcie, konieczne jest uwzględnienie w panelu barwnika żywotności komórek, aby skutecznie wykluczyć z danych niezdolne do życia komórki i zanieczyszczenia. W szczególności, aby zapewnić odpowiednie bramkowanie antygenów o niskiej liczebności lub słabo scharakteryzowanych, należy stosować kontrole fluorescencji minus jeden (FMO)15. Kontrole FMO obejmują wszystkie markery linii z wyjątkiem interesującego nas, ułatwiając precyzyjne rozgraniczenie między komórkami zabarwionymi dodatnio i ujemnie16.</li>
	<li>Dostosuj ustawienia detektorów rozproszenia do przodu (FSC) i rozproszenia bocznego (SSC), aby zapewnić, że interesujące komórki są odpowiednio wyświetlane na skali i mogą być bramkowane zgodnie z wymaganiami.</li>
	<li>Skrupulatnie dostosuj FSC i SSC, aby wyeliminować zanieczyszczenia i zewnętrzny hałas. Odróżniaj dublety od pojedynczych komórek na wykresie punktowym, który ilustruje zarówno obszar, jak i wysokość FSC. Wyizoluj żywotne komórki na podstawie żywotności komórek fluorescencji barwnika-ujemnego sygnału. UWAGA: Ustawienia dla różnych instrumentów mogą wykazywać niewielkie różnice. Na przykład niektóre sortowniki komórek wykorzystują szerokość i wysokość FSC do odróżnienia dubletów od pojedynczych komórek, podczas gdy inne wykorzystują obszar i wysokość FSC do tego samego celu.</li>
	<li>Dostosuj kompensację dla każdego kanału. UWAGA: Zarówno próbki komórkowe, jak i dostępne na rynku kulki kompensacyjne mogą być stosowane w celu kompensacji rozlewania się fluorescencji.<ol>
		<li>Porównaj kontrolę autofluorescencji (niebarwione komórki) z kontrolami pozytywnymi barwionych komórek, aby upewnić się, że barwione komórki są odpowiednio skalowane dla każdego parametru. Ponadto można dostroić kompensację, analizując wielokolorowe próbki komórek, monitorując 2-kolorowe wykresy punktowe i dostosowując ustawienia kompensacji w górę lub w dół, aby upewnić się, że populacje komórek są wyrównane względem siebie w pionie lub poziomie.</li>
		<li>Wykorzystaj sygnały CD45 i CD11b do rozróżnienia limfocytów (wysoki CD11b-CD45), mikrogleju (CD11b + CD45int), komórek szpikowych (wysoki CD11b + CD45) i astrocytów (CD11b-CD45- GLAST+)17,18.</li>
		<li>Wykorzystaj pozorowaną tkankę mózgową jako kontrolę autofluorescencji i odniesienie do rozróżniania limfocytów. Jeśli badany jest określony cel, należy zastosować kontrolę FMO z tkanką mózgową po udarze.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Rozpocznij zbieranie danych kontrolnych i przykładowych i upewnij się, że zostały one zapisane. UWAGA: Biorąc pod uwagę, że opisany tutaj model mini-udaru powoduje mały zawał, zazwyczaj pobiera się mniej komórek niż w modelu niedrożności tętnicy środkowej mózgu (MCAO). Ogólnie rzecz biorąc, zebranie 5 × 105 komórek daje odpowiednio około 5 × 103 mikrogleju i 1 × 105 astrocytów.</li>
	<li>Wybierz i posortuj żądane populacje komórek do okrągłodennych probówek polistyrenowych o pojemności 5 ml lub stożkowych probówek wirówkowych o pojemności 15 ml. UWAGA: Dodaj 500 μl PBS i skrupulatnie przepłucz probówkę, aby zapewnić żywotność komórek i pomóc w tworzeniu osadu komórkowego.</li>
</ol>
6. Analiza ekspresji genów w wybranych populacjach komórek
UWAGA: Ekstrakcję całkowitego RNA można alternatywnie przeprowadzić przy użyciu komercyjnych zestawów zgodnie z wytycznymi producenta.
<ol>
	<li>Odwirować komórki z etapu 5.6 w temperaturze 500 × g w temperaturze 4 °C przez 3 minuty, a następnie odrzucić supernatant. Ponownie zawiesić komórki w 1 ml odczynnika TRIzol. UWAGA: Liczba posortowanych komórek jest znacznie mniejsza w porównaniu z hodowanymi komórkami lub tkankami. W związku z tym wyższa prędkość wirowania może pomóc w tworzeniu bardziej zwartych osadów komórkowych. Komórki uzyskane na tym etapie mogą być wykorzystane do kolejnych zastosowań, takich jak hodowle komórkowe lub sekwencjonowanie jednokomórkowego RNA.</li>
	<li>Pozostawić próbkę w temperaturze pokojowej przez 5 minut, aby ułatwić dysocjację kompleksów nukleoproteinowych.</li>
	<li>Dodać 0,2 ml chloroformu do próbki i zabezpieczyć probówkę. Potrząsaj energicznie probówkami przez 15 s, a następnie inkubuj przez 2 minuty w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Odwirować próbki o masie 10 000 g przez 15 minut w temperaturze 4 °C. RNA pozostanie wyłącznie w górnej fazie wodnej.</li>
	<li>Ostrożnie przenieś górną fazę wodną do czystej probówki, uważając, aby nie naruszyć interfejsu. UWAGA: Objętość fazy wodnej powinna wynosić około 500 μL.</li>
	<li>Wytrącić RNA z fazy wodnej, wprowadzając 0,5 ml izopropanolu i delikatnie mieszając, kilkakrotnie odwracając probówkę. Próbki należy inkubować w temperaturze pokojowej przez 10 minut.</li>
	<li>Odwirować próbki o masie 10 000 g przez 10 minut w temperaturze 4 °C w celu zebrania RNA.</li>
	<li>Zdekantować supernatant i dokładnie usunąć wszelkie pozostałości cieczy przez aspirację.</li>
	<li>Umyj granulkę RNA raz 75% etanolem, dodając co najmniej 1 ml 75% etanolu. Dokładnie wymieszać próbkę, a następnie odwirować w temperaturze 7500 × g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Wyeliminuj wszelkie ślady etanolu. Suszyć granulkę RNA na powietrzu przez 5 minut.</li>
	<li>Rozpuść RNA w 10 μl wody wolnej od RNaz, pipetując w górę i w dół.</li>
	<li>Kontynuuj przeprowadzanie PCR w czasie rzeczywistym zgodnie z instrukcjami producenta.</li>
</ol>

<ol><li>Kleindorfer, D. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((2021+Guideline+for+the+prevention+of+stroke+in+patients+with+stroke+and+transient+ischemic+attack%3A+A+guideline+from+the+American+heart+association%2FAmerican+Stroke+Association%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%22%5BJournal%5D)">2021 Guideline for the prevention of stroke in patients with stroke and transient ischemic attack: A guideline from the American heart association/American Stroke Association.</a> Stroke. 52 (7), e364-e467 (2021).</li>
<li>Pu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Projected+global+trends+in+ischemic+stroke+incidence%2C+deaths+and+disability-adjusted+life+years+from+2020+to+2030%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%22%5BJournal%5D)">Projected global trends in ischemic stroke incidence, deaths and disability-adjusted life years from 2020 to 2030.</a> Stroke. 54 (5), 1330-1339 (2023).</li>
<li>Cheng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Projections+of+the+stroke+burden+at+the+global%2C+regional%2C+and+national+levels+up+to+2050+based+on+the+global+burden+of+disease+study+2021%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Heart+Assoc%22%5BJournal%5D)">Projections of the stroke burden at the global, regional, and national levels up to 2050 based on the global burden of disease study 2021.</a> J Am Heart Assoc. 13 (23), e036142(2024).</li>
<li>Ma, Y., Yang, S., He, Q., Zhang, D., Chang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+immune+cells+in+post-stroke+angiogenesis+and+neuronal+remodeling%3A+The+known+and+the+unknown%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">The role of immune cells in post-stroke angiogenesis and neuronal remodeling: The known and the unknown.</a> Front Immunol. 12, 784098(2021).</li>
<li>Duan, M., Xu, Y., Li, Y., Feng, H., Chen, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+brain-peripheral+immune+responses+for+secondary+brain+injury+after+ischemic+and+hemorrhagic+stroke%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuroinflammation%22%5BJournal%5D)">Targeting brain-peripheral immune responses for secondary brain injury after ischemic and hemorrhagic stroke.</a> J Neuroinflammation. 21 (1), 102(2024).</li>
<li>Chen, B. R., Wu, T., Chen, T. H., Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroimmune+interactions+and+their+roles+in+neurodegenerative+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Fundam+Res%22%5BJournal%5D)">Neuroimmune interactions and their roles in neurodegenerative diseases.</a> Fundam Res. 4 (2), 251-261 (2024).</li>
<li>Zhang, Z., Lv, M., Zhou, X., Cui, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Roles+of+peripheral+immune+cells+in+the+recovery+of+neurological+function+after+ischemic+stroke%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Roles of peripheral immune cells in the recovery of neurological function after ischemic stroke.</a> Front Cell Neurosci. 16, 1013905(2022).</li>
<li>Garcia-Bonilla, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+brain+and+blood+single-cell+transcriptomics+in+acute+and+subacute+phases+after+experimental+stroke%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">Analysis of brain and blood single-cell transcriptomics in acute and subacute phases after experimental stroke.</a> Nat Immunol. 25 (2), 357-370 (2024).</li>
<li>Stevens, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+flow+cytometry+to+evaluate+temporal+changes+in+inflammatory+cells+following+focal+cerebral+ischemia+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">The use of flow cytometry to evaluate temporal changes in inflammatory cells following focal cerebral ischemia in mice.</a> Brain Res. 932 (1-2), 110-119 (2002).</li>
<li>Carson, M. J., Reilly, C. R., Sutcliffe, J. G., Lo, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mature+microglia+resemble+immature+antigen-presenting+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Mature microglia resemble immature antigen-presenting cells.</a> Glia. 22 (1), 72-85 (1998).</li>
<li>Cardona, A. E., Huang, D., Sasse, M. E., Ransohoff, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+murine+microglial+cells+for+RNA+analysis+or+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Isolation of murine microglial cells for RNA analysis or flow cytometry.</a> Nat Protoc. 1 (4), 1947-1951 (2006).</li>
<li>De Haas, A. H., Boddeke, H. W., Biber, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Region-specific+expression+of+immunoregulatory+proteins+on+microglia+in+the+healthy+CNS%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Region-specific expression of immunoregulatory proteins on microglia in the healthy CNS.</a> Glia. 56 (8), 888-894 (2008).</li>
<li>Mcdonough, A., Weinstein, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroimmune+response+in+ischemic+preconditioning%5BTitle%5D)+AND+%22Neurotherapeutics%22%5BJournal%5D)">Neuroimmune response in ischemic preconditioning.</a> Neurotherapeutics. 13 (4), 748-761 (2016).</li>
<li>Wang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptome+analysis+reveals+dynamic+microglial-induced+a1+astrocyte+reactivity+via+c3%2Fc3ar%2FNF-kappab+signaling+after+ischemic+stroke%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Transcriptome analysis reveals dynamic microglial-induced a1 astrocyte reactivity via c3/c3ar/NF-kappab signaling after ischemic stroke.</a> Mol Neurobiol. 61 (12), 10246-10270 (2024).</li>
<li>Maecker, H. T., Trotter, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometry+controls%2C+instrument+setup%2C+and+the+determination+of+positivity%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry%22%5BJournal%5D)">Flow cytometry controls, instrument setup, and the determination of positivity.</a> Cytometry. 69A, 1037-1042 (2006).</li>
<li>Siddiqui, S., Livak, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Principles+of+advanced+flow+cytometry%3A+A+practical+guide%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Principles of advanced flow cytometry: A practical guide.</a> Methods Mol Biol. 2580, 89-114 (2023).</li>
<li>Sousa, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+transcriptomics+reveals+distinct+inflammation-induced+microglia+signatures%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Rep%22%5BJournal%5D)">Single-cell transcriptomics reveals distinct inflammation-induced microglia signatures.</a> EMBO Rep. 19 (11), e46171(2018).</li>
<li>Martin, E., El-Behi, M., Fontaine, B., Delarasse, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+microglia+and+monocyte-derived+macrophages+from+the+central+nervous+system+by+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Analysis of microglia and monocyte-derived macrophages from the central nervous system by flow cytometry.</a> J Vis Exp. 124, e55781(2017).</li>
<li>Zhang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia-associated+neuroinflammation+is+a+potential+therapeutic+target+for+ischemic+stroke%5BTitle%5D)+AND+%22Neural+Regen+Res%22%5BJournal%5D)">Microglia-associated neuroinflammation is a potential therapeutic target for ischemic stroke.</a> Neural Regen Res. 16 (1), 6-11 (2021).</li>
<li>Mao, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+polarization+in+ischemic+stroke%3A+Complex+mechanisms+and+therapeutic+interventions%5BTitle%5D)+AND+%22Chin+Med+J+%28Engl%29%22%5BJournal%5D)">Microglia polarization in ischemic stroke: Complex mechanisms and therapeutic interventions.</a> Chin Med J (Engl). 134 (20), 2415-2417 (2021).</li>
<li>Shui, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+in+ischemic+stroke%3A+Pathogenesis+insights+and+therapeutic+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22J+Inflamm+Res%22%5BJournal%5D)">Microglia in ischemic stroke: Pathogenesis insights and therapeutic challenges.</a> J Inflamm Res. 17, 3335-3352 (2024).</li>
<li>Feng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Infiltration+and+persistence+of+lymphocytes+during+late-stage+cerebral+ischemia+in+middle+cerebral+artery+occlusion+and+photothrombotic+stroke+models%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuroinflammation%22%5BJournal%5D)">Infiltration and persistence of lymphocytes during late-stage cerebral ischemia in middle cerebral artery occlusion and photothrombotic stroke models.</a> J Neuroinflammation. 14 (1), 248(2017).</li>
<li>Schulze, J., Gellrich, J., Kirsch, M., Dressel, A., Vogelgesang, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Central+nervous+system-infiltrating+t+lymphocytes+in+stroke+are+activated+via+their+TCR+%28T-cell+receptor%29+but+lack+CD25+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%22%5BJournal%5D)">Central nervous system-infiltrating t lymphocytes in stroke are activated via their TCR (T-cell receptor) but lack CD25 expression.</a> Stroke. 52 (9), 2939-2947 (2021).</li>
<li>Fluri, F., Schuhmann, M. K., Kleinschnitz, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+of+ischemic+stroke+and+their+application+in+clinical+research%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Des+Devel+Ther%22%5BJournal%5D)">Animal models of ischemic stroke and their application in clinical research.</a> Drug Des Devel Ther. 9, 3445-3454 (2015).</li>
<li>Leelatian, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+analysis+of+human+tissues+and+solid+tumors+with+mass+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+B+Clin+Cytom%22%5BJournal%5D)">Single-cell analysis of human tissues and solid tumors with mass cytometry.</a> Cytometry B Clin Cytom. 92 (1), 68-78 (2017).</li>
<li>Delmonte, O. M., Fleisher, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometry%3A+Surface+markers+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22J+Allergy+Clin+Immunol%22%5BJournal%5D)">Flow cytometry: Surface markers and beyond.</a> J Allergy Clin Immunol. 143 (2), 528-537 (2019).</li>
<li>Schmit, T., Klomp, M., Khan, M. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+application+of+flow+cytometry+for+simultaneous+and+multi-parametric+analysis+of+heterogenous+cell+populations+in+basic+and+clinical+research%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">The application of flow cytometry for simultaneous and multi-parametric analysis of heterogenous cell populations in basic and clinical research.</a> Methods Mol Biol. 2223, 183-200 (2021).</li>
<li>Dukhinova, M., Kopeikina, E., Ponomarev, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Usage+of+multiparameter+flow+cytometry+to+study+microglia+and+macrophage+heterogeneity+in+the+central+nervous+system+during+neuroinflammation+and+neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Usage of multiparameter flow cytometry to study microglia and macrophage heterogeneity in the central nervous system during neuroinflammation and neurodegeneration.</a> Methods Mol Biol. 1745, 167-177 (2018).</li>
<li>Rui, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myeloid+gasdermin+d+drives+early-stage+T-cell+immunity+and+peripheral+inflammation+in+a+mouse+model+of+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuroinflammation%22%5BJournal%5D)">Myeloid gasdermin d drives early-stage T-cell immunity and peripheral inflammation in a mouse model of Alzheimer's disease.</a> J Neuroinflammation. 21 (1), 266(2024).</li>
<li>Rauber, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometry+identifies+changes+in+peripheral+and+intrathecal+lymphocyte+patterns+in+CNS+autoimmune+disorders+and+primary+CNS+malignancies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuroinflammation%22%5BJournal%5D)">Flow cytometry identifies changes in peripheral and intrathecal lymphocyte patterns in CNS autoimmune disorders and primary CNS malignancies.</a> J Neuroinflammation. 21 (1), 286(2024).</li>
<li>Rayaprolu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow-cytometric+microglial+sorting+coupled+with+quantitative+proteomics+identifies+moesin+as+a+highly-abundant+microglial+protein+with+relevance+to+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Neurodegener%22%5BJournal%5D)">Flow-cytometric microglial sorting coupled with quantitative proteomics identifies moesin as a highly-abundant microglial protein with relevance to Alzheimer's disease.</a> Mol Neurodegener. 15 (1), 28(2020).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów.

W niniejszej pracy przedstawiono szczegółowy protokół oceny funkcji komórek odpornościowych po udarze niedokrwiennym, wykorzystujący analizę cytometrii przepływowej w modelu mini-udaru. Krytyczne etapy tego protokołu obejmują ustanowienie ogniskowego udaru niedokrwiennego poprzez trwałe podwiązanie dystalnej gałęzi prawej środkowej tętnicy mózgowej (MCA) wraz z siedmiominutową niedrożnością obustronnych tętnic szyjnych wspólnych (CCA). To podejście chirurgiczne prowadzi do łagodnego udaru, który charakteryzuje się stałą ...

Udar mózgu jest główną przyczyną śmiertelności i długotrwałej niepełnosprawności na całym świecie, przy czym udar niedokrwienny stanowi zdecydowaną większość przypadków 1,2,3. Ogólnym celem tej metody jest pogłębienie naszej wiedzy na temat interakcji neuroimmunologicznych, które zachodzą po udarze niedokrwiennym, poprzez zapewnienie wyrafinowanego podejścia do oceny aktywacji zarówno rezydentnych, jak i naciekających komórek odpornościowych w mysim modelu mini-udaru 4,5. Skomplikowana interakcja między tymi komórkami odpornościowymi a mikrośrodowiskiem neuronalnym ma kluczowe znaczenie dla zrozumienia patofizjologii udaru niedokrwiennego. Jednak dokładne mechanizmy leżące u podstaw tych interakcji neuroimmunologicznych pozostają słabo wyjaśnione, głównie ze względu na dynamiczny i wieloaspektowy charakter odpowiedzi immunologicznych wywołanych przez zapalenienerwów 6. Technika ta ma na celu wyjaśnienie złożonej dynamiki odpowiedzi immunologicznych w kontekście zapalenia układu nerwowego i ich późniejszego wpływu na uszkodzenie neuronów i wyniki regeneracji.
Uzasadnienie rozwoju tej techniki wynika z kluczowej roli, jaką komórki odpornościowe odgrywają w nasilaniu uszkodzeń neuronów i wpływaniu na powrót do zdrowia po zdarzeniu niedokrwiennym. Tradycyjnym metodom badania tych interakcji często brakuje rozdzielczości niezbędnej do uchwycenia czasowych i przestrzennych niuansów aktywacji komórek odpornościowych. Dzięki zastosowaniu analizy cytometrii przepływowej zawiesin jednokomórkowych pochodzących z mikrowypreparowanej tkanki mózgowej po zawale, protokół ten oferuje bardziej szczegółową i dynamiczną ocenę profili komórek odpornościowych w czasie 7,8. Podejście to umożliwia identyfikację określonych populacji komórek odpornościowych i ich stanów funkcjonalnych, które mają kluczowe znaczenie dla zrozumienia patofizjologii udaru niedokrwiennego.
W porównaniu z alternatywnymi technikami, takimi jak barwienie histologiczne lub sekwencjonowanie masowego RNA, które mogą dostarczyć ograniczonego wglądu w indywidualny wkład typów komórek odpornościowych, ta metoda cytometrii przepływowej ma kilka zalet. Na przykład wcześniejsze badania wykazały, że cytometria przepływowa pozwala na wysokoprzepustową analizę wielu markerów jednocześnie, ułatwiając bardziej kompleksową charakterystykę fenotypów i funkcji komórek odpornościowych 9,10,11,12,13. Ponadto zdolność tej metody do przystosowania się do różnych schorzeń neurodegeneracyjnych - takich jak stwardnienie rozsiane, choroba Parkinsona i choroba Alzheimera - pokazuje jej wszechstronność i znaczenie w szerszej literaturze dotyczącej interakcji neuroimmunologicznych.
Dla badaczy rozważających zastosowanie tej metody niezbędna jest ocena konkretnych celów ich badania. Technika ta jest szczególnie przydatna w badaniach wymagających szczegółowej analizy czasowej odpowiedzi immunologicznych w kontekście udaru niedokrwiennego lub powiązanych chorób neurodegeneracyjnych. Zaleca się, aby użytkownicy posiadali podstawową wiedzę na temat cytometrii przepływowej i doświadczenie z modelami mysimi, aby skutecznie wdrożyć ten protokół i zinterpretować uzyskane dane. Zapewniając solidne ramy do badania interakcji neuroimmunologicznych, metoda ta w znacznym stopniu przyczynia się do trwających wysiłków na rzecz określenia złożoności udziału układu immunologicznego w patologii udaru.

<table><tbody><tr><td>1,5 ml probówka do mikrowirówek</td><td>GNIAZDO&nbsp;</td><td>615601</td><td>Materiał laboratoryjny</td></tr><tr><td>1 i razy; PBS</td><td>Corning</td><td>21-040-CM</td><td>Odczynnik</td></tr><tr><td>96-dołkowa, przezroczysta, okrągłodenna mikropłytka poddana działaniu TC</td><td>Corning</td><td>3799</td><td>Materiał laboratoryjny</td></tr><tr><td>Układ anty-myszowy APC CD19</td><td>Legenda biologiczna</td><td>152410</td><td>Przeciwciało</td></tr><tr><td>APC/Cyjanina7 anty-mysz CD45</td><td>Legenda biologiczna</td><td>103116</td><td>Przeciwciało</td></tr><tr><td>Avertin (1,25 proc.)</td><td>Biotechnologia Nanjing Aibei&nbsp;</td><td>Zobacz materiał M2920</td><td>Odczynnik</td></tr><tr><td>BD FACSAria II</td><td>BD</td><td>642510</td><td>Sprzęt</td></tr><tr><td>Brilliant Violet 421 anty-mysz CD4</td><td>Legenda biologiczna</td><td>100437</td><td>Przeciwciało</td></tr><tr><td>Brilliant Violet 605 anty-mysz / człowiek CD11b</td><td>Legenda biologiczna</td><td>101237</td><td>Przeciwciało</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A1933-1G</td><td>Chemiczny</td></tr><tr><td>Kolagenaza IV</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C4-28-100MG</td><td>Enzym</td></tr><tr><td>DNaza I</td><td>Laboratoria biologiczne w Nowej Anglii</td><td>Zobacz materiał M0303L</td><td>Enzym</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>EDS-100G</td><td>Chemiczny</td></tr><tr><td>Falcon 5 ml probówki z polistyrenu z okrągłym dnem</td><td>Corning</td><td>352052</td><td>Materiał laboratoryjny</td></tr><tr><td>Sokół&nbsp; Stożkowe probówki wirówkowe 15 ml</td><td>Corning</td><td>352095</td><td>Materiał laboratoryjny</td></tr><tr><td>FlowJo V10</td><td>BD</td><td></td><td>Oprogramowanie</td></tr><tr><td>Przeciwciało GLAST (ACSA-1), PE</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-118-344</td><td>Przeciwciało</td></tr><tr><td>Izofluran</td><td>RWD Nauki przyrodnicze</td><td>Przekaźnik Przemysłowy R510-22-10</td><td>Odczynnik</td></tr><tr><td>PE/Cyjanina7 anty-mysz CD3</td><td>Legenda biologiczna</td><td>100220</td><td>Przeciwciało</td></tr><tr><td>PE/Dazzle 594 przeciw myszom NK-1.1</td><td>Legenda biologiczna</td><td>156518</td><td>Przeciwciało</td></tr><tr><td>TRIzol ODCZYNNIK</td><td>Thermo Fisher Scientific Inc.</td><td>15596026</td><td>Odczynnik</td></tr><tr><td>Ultraczysta woda destylowana wolna od DNaz/RNaz</td><td>Thermo Fisher Scientific Inc.</td><td>10977015</td><td>Odczynnik</td></tr><tr><td>Kleje do tkanek Vetbond</td><td>3 mln</td><td>1469SB powiedział:</td><td>Materiał laboratoryjny</td></tr><tr><td>Zestaw do naprawy Zombie Aqua</td><td>Legenda biologiczna</td><td>423102</td><td>Aminowo-reaktywny barwnik fluorescencyjny</td></tr></tbody></table>

izolacja i cytometryczna ocena interakcji neuroimmunologicznych w mysim modelu mini-udaru

Isolation and Flow Cytometric Assessment of Neuroimmune Interactions in a Mini-Stroke Murine Model

Udar mózgu jest główną przyczyną zgonów i długotrwałej niepełnosprawności na całym świecie, przy czym większość przypadków dotyczy udaru niedokrwiennego. Po udarze niedokrwiennym dochodzi do aktywacji rezydentnych i naciekających komórek odpornościowych, co przyczynia się do dalszego uszkodzenia neuronów. Jednak rola układu odpornościowego w patologii udaru niedokrwiennego nie jest w pełni poznana, głównie ze względu na złożoną i dynamiczną regulację odpowiedzi immunologicznych w reakcji na zmiany w mikrośrodowisku podczas zapalenia nerwów. Dlatego ważne jest, aby monitorować i analizować aktywację rezydentnych i infiltrujących komórek odpornościowych w czasie po udarze niedokrwiennym. W tym badaniu przedstawiono protokół oceny funkcji tych komórek odpornościowych po udarze niedokrwiennym za pomocą analizy cytometrii przepływowej w modelu mini-udaru. Mikrodyfundujemy tkankę mózgową po zawale w określonych punktach czasowych, a następnie dysocjujemy ją na zawiesinę jednokomórkową zarówno metodami mechanicznymi, jak i enzymatycznymi. Komórki są przepuszczane przez sitko komórkowe o średnicy 70 μm i znakowane fluorescencyjnie znakowanymi koktajlami przeciwciał przed ilościowym określeniem za pomocą analizy cytometrii przepływowej. Chociaż test ten został opracowany specjalnie do badania interakcji neuroimmunologicznych po udarze niedokrwiennym, można go również łatwo dostosować do badania mechanizmów neuroimmunologicznych w innych chorobach neurodegeneracyjnych, takich jak stwardnienie rozsiane, choroba Parkinsona i choroba Alzheimera.

W niniejszym badaniu przedstawiamy udoskonalony protokół oceny funkcjonalności komórek odpornościowych po udarze niedokrwiennym, wykorzystujący analizę cytometryczną w modelu mini-udaru. Mini-udar indukowano poprzez trwałe podwiązanie dystalnej gałęzi prawej tętnicy środkowej mózgu (MCA), po czym przeprowadzono 7-minutową okluzję obustronnych tętnic szyjnych wspólnych (CCAs). Metodologia ta pozwala na wywołanie łagodnego udaru charakteryzującego się niewielką, powtarzalną objętością zmian oraz wyjątkowo niskim wskaźnikie...

W tym miejscu przedstawiamy protokół oceny funkcji komórek odpornościowych po udarze niedokrwiennym za pomocą analizy cytometrii przepływowej w modelu mini-udaru. Metoda ta umożliwia szczegółowe badanie interakcji neuroimmunologicznych i może być zaadaptowana do badania innych chorób neurodegeneracyjnych, pogłębiając naszą wiedzę na temat odpowiedzi immunologicznych w patologii udaru.

Izolacja i cytometryczna ocena interakcji neuroimmunologicznych w mysim modelu mini-udaru

Stroke is a leading cause of death and long-term disability worldwide, with ischemic stroke representing the majority of cases. Following an ischemic ...

Zakres naszych badań koncentruje się na funkcji komórek odpornościowych po udarze niedokrwiennym. Naszym celem jest zrozumienie praw rezydujących i naciekających komórek odpornościowych w patologii udaru. Obecnie cytometria przepływowa jest szeroko stosowana do oceny funkcji komórek odpornościowych i interakcji w zapaleniach nerwów.Ponadto techniki immunologiczne oraz pojedyncze komórki i sekwencjonowanie naprzód badania nad interakcjami neuroimmunologicznymi. Nasze laboratorium skupi się na zilustrowaniu drogi astrocytów w interakcjach neuroimmunologicznych, wkładach angio w procesy neurozapalne. Aby rozpocząć, weź strzykawkę o pojemności 50 mililitrów i przymocuj igłę o rozmiarze 26 do jej końca.Całkowicie napełnić strzykawkę roztworem soli fizjologicznej. Ustaw znieczuloną mysz w pozycji leżącej na płycie piankowej. Wyprostuj kończyny przednie i tylne i zabezpiecz je za pomocą igieł o rozmiarze 26.Za pomocą ząbkowanych kleszczy kciukowych chwyć skórę brzucha i wykonaj boczne nacięcie, aby odsłonić wątrobę. Przeciąć wzdłuż obu stron żeber, aby odsłonić serce. Teraz włóż igłę o rozmiarze 26 do lewej komory i odetnij prawą wyrocznię.Wcisnąć tłok strzykawki, aby umożliwić odpływ krwi. Kontynuuj perfuzję, aż krew spływająca z wyroczni stanie się czysta. Po odcięciu głowy myszy i wyekstrahowaniu mózgu, przenieś go do stalowej matrycy mózgu myszy i pokrój na kolejne plastry rogówki o grubości dwóch milimetrów.Wprowadź 500 mikrolitrów mieszanki enzymów trawiennych do każdego dołka 12-dołkowej płytki. Za pomocą mikrokleszczyków delikatnie oddziel tkankę zawału i przenieś ją do mieszanki enzymów trawiennych. Na koniec rozdrobnij tkankę nożyczkami okulistycznymi na najmniejsze możliwe kawałki i inkubuj płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 20 minut.Za pomocą pipety AP 1000 delikatnie odessać i dozować roztwór 10 razy, aby zdysocjować tkankę na poszczególne komórki. Następnie przepuść roztwór przez sitko o średnicy 70 mikrometrów. Kilkakrotnie przepłukać zarówno płytkę 12-dołkową, jak i sitko komórkowe lodowatym HBSS zawierającym wapń i magnez.Teraz odwirować zebraną zawiesinę komórek w temperaturze 500 G przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Ostrożnie wyrzucić supernatant, nie naruszając osadu. Zawiesić granulat w jednym mililitrze PBS.Po powtórzeniu procesu wirowania, ponownie zawiesić osad w 150 mikrolitrach PBS i przenieść zawiesinę do 96-dołkowej okrągłej płyty dennej. Ponownie odwirować w temperaturze 500 G przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Po odwirowaniu mocno chwycić 96-dołkową płytkę i szybko ją odwrócić, aby odrzucić supernatant.Następnie rozcieńczyć matrycę fluorescencyjną żywotności komórki w stosunku jeden do stu w PBS i ponownie zawiesić osad w 150 mikrolitrach rozcieńczonego roztworu barwnika. Inkubować przez 10 minut w temperaturze pokojowej, chroniąc płytkę przed światłem. Po odwirowaniu przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza odrzucić supernatant.Rozcieńczyć koktajl przeciwciał na powierzchni komórki w magnetycznym sortowaniu komórek aktywowanych magnetycznie lub maksymalnym buforze i bez mycia komórek dodać koktajl przeciwciał do studzienek. Inkubować przez 15 do 20 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza, a następnie odwirować przez dodatkowe pięć minut. Po odwirowaniu płytki i odrzuceniu supernatantu, ponownie zawiesić osad w 150 mikrolitrach maksymalnego buforu.Przenieś zawiesinę do 1,5-mililitrowych probówek wirówkowych lub pięciomililitrowych probówek z polistyrenu o okrągłym dnie. Zaprojektuj wielokolorowy panel cytometrii przepływowej zgodnie z konfiguracją przyrządu przy użyciu metod ręcznych lub narzędzia do projektowania paneli online. Uwzględnij w panelu barwnik żywotności komórek, aby wykluczyć z danych niezdolne do życia komórki i zanieczyszczenia.Dostosuj ustawienia detektora rozproszenia do przodu i bocznego, aby upewnić się, że interesujące komórki są poprawnie wyświetlane i mogą być prawidłowo bramkowane. Dostosuj parametry FSC i SSC, aby wyeliminować zanieczyszczenia i hałas z zewnątrz. Na wykresie kropkowym przedstawiającym powierzchnię FSC w funkcji wysokości odróżnij dublety od pojedynczych komórek.Użyj negatywnego sygnału barwnika żywotności, aby wyizolować żywe komórki. Porównaj kontrolę autofluorescencji z niebarwionych komórek z barwionymi kontrolami pozytywnymi komórek, aby potwierdzić, że barwione komórki są odpowiednio skalowane dla każdego parametru. Dostosuj kompensację, analizując wielokolorowe próbki komórek i badając dwa kolorowe wykresy punktowe.Dostosuj ustawienia kompensacji w górę lub w dół, aż populacje komórek wyrównają się względem siebie w pionie lub poziomie. Wykorzystaj sygnały CD45 i CD11B do rozróżnienia limfocytów, mikrogleju, komórek szpikowych i astrocytów na podstawie ich specyficznych wzorców ekspresji. Wykorzystaj pozorowaną tkankę mózgową jako kontrolę autofluorescencji, aby służyć jako odniesienie do identyfikacji limfocytów.Jeśli analizujesz konkretny cel, użyj kontroli FMO z tkanką mózgową po udarze. Zbierz dane kontrolne i zapisz je. Podobnie zbierz przykładowe dane i zapisz je.Wybierz i posortuj docelowe populacje komórek do pięciomililitrowych probówek z polistyrenu z okrągłym dnem lub stożkowych probówek wirówkowych o pojemności 15 mililitrów. Dodaj 500 mikrolitrów PBS i przepłucz probówkę zbiorczą, aby zachować żywotność komórek i ułatwić tworzenie osadów. Mikroglej CCR7 dodatni i CD11c oznaczono ilościowo w drugim i siódmym dniu po udarze niedokrwiennym.Ekspresja CCR7 w mikrogleju gwałtownie wzrosła w drugim dniu i pozostała podwyższona w siódmym dniu w porównaniu z kontrolami pozorowanymi. Mikroglej CD11c dodatni podążał za podobnym trendem, osiągając szczyt w drugim dniu i utrzymując się na poziomie wyższym niż pozorowany w siódmym dniu. Wykresy punktowe wykazały gęste sygnały CCR7 i CD11c w drugim i siódmym dniu.Kontrastuje z rzadkimi sygnałami w pozorowanych kontrolach. Strategia bramkowania rozdzieliła komórki szpikowe i limfocyty mikrogleju za pomocą ekspresji CD11B i CD45. Dodatkowe markery pozwoliły określić żywotne komórki, astrocyty i podzbiory limfocytów.

isolation-flow-cytometric-assessment-neuroimmune-interactions-mini

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Włóknista okluzja tętnicy środkowej mózgu jest powszechnie stosowanym modelem badania udaru niedokrwiennego u myszy.

Modelowanie udaru u myszy – zator tętnicy środkowej mózgu z wykorzystaniem modelu filamentowego

Różne mysie modele zamknięcia tętnicy środkowej mózgu (MCAO) są szeroko stosowane w eksperymentalnych badaniach mózgu. W tym miejscu demonstrujemy model przezczaszkowego stałego dystalnego MCAO, który powoduje konsekwentny zawał kory mózgowej o wielkości odpowiadającej uszkodzeniom spowodowanym przez większość udarów niedokrwiennych u ludzi.

Modelowanie udaru u myszy: trwała koagulacja dalszej tętnicy środkowej mózgu

Charakterystyka komórek szpikowych mózgu po udarze może być przeprowadzona za pomocą metody frakcjonowania optycznego lub za pomocą analizy cytometrycznej zawiesin leukocytów mózgu. Obie są użytecznymi technikami do przeprowadzenia dokładnego fenotypowego rozróżnienia głównych podzbiorów komórek szpikowych znajdujących się w niedokrwionym mózgu.

Charakterystyka stereologiczna i cytometrii przepływowej subpopulacji leukocytów w modelach przejściowego lub trwałego niedokrwienia mózgu

Ten protokół opisuje powtarzające się wstępne kondycjonowanie hipoksyjne, czyli krótkie ekspozycje na niedotlenienie ogólnoustrojowe, które zmniejszają objętość zawału i zaburzenie bariery krew-mózg po przejściowym zamknięciu tętnicy środkowej mózgu u myszy. Szczegółowo opisano również podwójną kwantyfikację objętości zawału i przerwania bariery krew-mózg po udarze, aby ocenić skuteczność ochrony nerwowo-naczyniowej.

Kwantyfikacja ochrony nerwowo-naczyniowej po powtarzającym się kondycjonowaniu wstępnym hipoksyjnym i przejściowym zamknięciu tętnicy środkowej mózgu u myszy

Tutaj prezentujemy metodologię wytwarzania ogniskowego udaru w mysiej istocie białej poprzez miejscowe wstrzyknięcie nieodwracalnego inhibitora śródbłonkowej syntazy tlenku azotu (eNOS) (L-Nio). Przedstawiono dwie odmiany stereotaktyczne, wsteczne śledzenie neuronów oraz znakowanie i rozwarstwianie świeżych tkanek, które rozszerzają potencjalne zastosowania tej techniki.

Wszechstronny mysi model podkorowego udaru istoty białej do badania zwyrodnienia aksonów i neurobiologii istoty białej

Stan zapalny odgrywa kluczową rolę w patogenezie udaru niedokrwiennego. Coraz więcej dowodów sugeruje, że działa jak miecz obosieczny, który zaostrza wczesne uszkodzenie mózgu, ale także przyczynia się do późniejszej naprawy. Protokół ten opisuje izolację komórek odpornościowych z niedokrwionego mózgu i ich późniejsze fenotypowanie metodą cytometrii przepływowej.

Izolacja i analiza cytometrii przepływowej komórek odpornościowych z niedokrwionego mózgu myszy

Aby zrozumieć patofizjologię udaru, ważne jest korzystanie z wiarygodnych modeli. W artykule opisano jeden z najczęściej stosowanych modeli udaru u myszy, określany jako model niedrożności tętnicy środkowej mózgu (MCAo) (określany również jako model włókna śródświetlnego lub szewu) z reperfuzją.

Podejście chirurgiczne do niedrożności tętnicy środkowej mózgu i udaru wywołanego reperfuzją u myszy

Ten protokół opisuje użycie cytometrii przepływowej do identyfikacji zmian w składzie komórek odpornościowych, profilu cytokin i profilu chemokiny w środowisku płucnym po przejściowym zamknięciu tętnicy środkowej mózgu, mysim modelu udaru niedokrwiennego.

Charakterystyka komórek odpornościowych i mediatorów prozapalnych w środowisku płucnym

Różne modele niedrożności tętnicy środkowej mózgu (MCAo) są używane w eksperymentalnych badaniach nad udarem. W tym miejscu opisano eksperymentalny model udaru przejściowego MCAo przez tętnicę szyjną zewnętrzną (ECA), który ma na celu naśladowanie udaru u człowieka, w którym skrzeplina naczyniowo-mózgowa jest usuwana w wyniku spontanicznej lizy skrzepu lub terapii.

Modelowanie udaru u myszy: przejściowe zamknięcie tętnicy środkowej mózgu przez tętnicę szyjną zewnętrzną

Aby zbadać odpowiedź immunologiczną na zaburzenia mózgu, jednym z powszechnych podejść jest analiza zmian w komórkach odpornościowych. Oto dwa proste i skuteczne protokoły do izolacji komórek odpornościowych z tkanki mózgu mysiego i rdzenia kostnego z czaszki.

Izolowanie komórek odpornościowych z mózgu i czaszki myszy

Poznaj protokół oceny funkcji komórek odpornościowych po udarze niedokrwiennym przy użyciu cytometrii przepływowej w mysim modelu mini-udaru. Ta metoda umożliwia szczegółową analizę interakcji neuroimmunologicznych.

Izolacja i cytometryczna ocena interakcji neuroimmunologicznych w mysim modelu mini-udaru

Przeglądaj więcej filmów