Izolacja i cytometryczna ocena interakcji neuroimmunologicznych w mysim modelu mini-udaru
20 czerwca 2025
W tym miejscu przedstawiamy protokół oceny funkcji komórek odpornościowych po udarze niedokrwiennym za pomocą analizy cytometrii przepływowej w modelu mini-udaru. Metoda ta umożliwia szczegółowe badanie interakcji neuroimmunologicznych i może być zaadaptowana do badania innych chorób neurodegeneracyjnych, pogłębiając naszą wiedzę na temat odpowiedzi immunologicznych w patologii udaru.
Zakres naszych badań koncentruje się na funkcji komórek odpornościowych po udarze niedokrwiennym. Naszym celem jest zrozumienie praw rezydujących i naciekających komórek odpornościowych w patologii udaru. Obecnie cytometria przepływowa jest szeroko stosowana do oceny funkcji komórek odpornościowych i interakcji w zapaleniach nerwów.
Ponadto techniki immunologiczne oraz pojedyncze komórki i sekwencjonowanie naprzód badania nad interakcjami neuroimmunologicznymi. Nasze laboratorium skupi się na zilustrowaniu drogi astrocytów w interakcjach neuroimmunologicznych, wkładach angio w procesy neurozapalne. Aby rozpocząć, weź strzykawkę o pojemności 50 mililitrów i przymocuj igłę o rozmiarze 26 do jej końca.
Całkowicie napełnić strzykawkę roztworem soli fizjologicznej. Ustaw znieczuloną mysz w pozycji leżącej na płycie piankowej. Wyprostuj kończyny przednie i tylne i zabezpiecz je za pomocą igieł o rozmiarze 26.
Za pomocą ząbkowanych kleszczy kciukowych chwyć skórę brzucha i wykonaj boczne nacięcie, aby odsłonić wątrobę. Przeciąć wzdłuż obu stron żeber, aby odsłonić serce. Teraz włóż igłę o rozmiarze 26 do lewej komory i odetnij prawą wyrocznię.
Wcisnąć tłok strzykawki, aby umożliwić odpływ krwi. Kontynuuj perfuzję, aż krew spływająca z wyroczni stanie się czysta. Po odcięciu głowy myszy i wyekstrahowaniu mózgu, przenieś go do stalowej matrycy mózgu myszy i pokrój na kolejne plastry rogówki o grubości dwóch milimetrów.
Wprowadź 500 mikrolitrów mieszanki enzymów trawiennych do każdego dołka 12-dołkowej płytki. Za pomocą mikrokleszczyków delikatnie oddziel tkankę zawału i przenieś ją do mieszanki enzymów trawiennych. Na koniec rozdrobnij tkankę nożyczkami okulistycznymi na najmniejsze możliwe kawałki i inkubuj płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 20 minut.
Za pomocą pipety AP 1000 delikatnie odessać i dozować roztwór 10 razy, aby zdysocjować tkankę na poszczególne komórki. Następnie przepuść roztwór przez sitko o średnicy 70 mikrometrów. Kilkakrotnie przepłukać zarówno płytkę 12-dołkową, jak i sitko komórkowe lodowatym HBSS zawierającym wapń i magnez.
Teraz odwirować zebraną zawiesinę komórek w temperaturze 500 G przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Ostrożnie wyrzucić supernatant, nie naruszając osadu. Zawiesić granulat w jednym mililitrze PBS.
Po powtórzeniu procesu wirowania, ponownie zawiesić osad w 150 mikrolitrach PBS i przenieść zawiesinę do 96-dołkowej okrągłej płyty dennej. Ponownie odwirować w temperaturze 500 G przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Po odwirowaniu mocno chwycić 96-dołkową płytkę i szybko ją odwrócić, aby odrzucić supernatant.
Następnie rozcieńczyć matrycę fluorescencyjną żywotności komórki w stosunku jeden do stu w PBS i ponownie zawiesić osad w 150 mikrolitrach rozcieńczonego roztworu barwnika. Inkubować przez 10 minut w temperaturze pokojowej, chroniąc płytkę przed światłem. Po odwirowaniu przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza odrzucić supernatant.
Rozcieńczyć koktajl przeciwciał na powierzchni komórki w magnetycznym sortowaniu komórek aktywowanych magnetycznie lub maksymalnym buforze i bez mycia komórek dodać koktajl przeciwciał do studzienek. Inkubować przez 15 do 20 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza, a następnie odwirować przez dodatkowe pięć minut. Po odwirowaniu płytki i odrzuceniu supernatantu, ponownie zawiesić osad w 150 mikrolitrach maksymalnego buforu.
Przenieś zawiesinę do 1,5-mililitrowych probówek wirówkowych lub pięciomililitrowych probówek z polistyrenu o okrągłym dnie. Zaprojektuj wielokolorowy panel cytometrii przepływowej zgodnie z konfiguracją przyrządu przy użyciu metod ręcznych lub narzędzia do projektowania paneli online. Uwzględnij w panelu barwnik żywotności komórek, aby wykluczyć z danych niezdolne do życia komórki i zanieczyszczenia.
Dostosuj ustawienia detektora rozproszenia do przodu i bocznego, aby upewnić się, że interesujące komórki są poprawnie wyświetlane i mogą być prawidłowo bramkowane. Dostosuj parametry FSC i SSC, aby wyeliminować zanieczyszczenia i hałas z zewnątrz. Na wykresie kropkowym przedstawiającym powierzchnię FSC w funkcji wysokości odróżnij dublety od pojedynczych komórek.
Użyj negatywnego sygnału barwnika żywotności, aby wyizolować żywe komórki. Porównaj kontrolę autofluorescencji z niebarwionych komórek z barwionymi kontrolami pozytywnymi komórek, aby potwierdzić, że barwione komórki są odpowiednio skalowane dla każdego parametru. Dostosuj kompensację, analizując wielokolorowe próbki komórek i badając dwa kolorowe wykresy punktowe.
Dostosuj ustawienia kompensacji w górę lub w dół, aż populacje komórek wyrównają się względem siebie w pionie lub poziomie. Wykorzystaj sygnały CD45 i CD11B do rozróżnienia limfocytów, mikrogleju, komórek szpikowych i astrocytów na podstawie ich specyficznych wzorców ekspresji. Wykorzystaj pozorowaną tkankę mózgową jako kontrolę autofluorescencji, aby służyć jako odniesienie do identyfikacji limfocytów.
Jeśli analizujesz konkretny cel, użyj kontroli FMO z tkanką mózgową po udarze. Zbierz dane kontrolne i zapisz je. Podobnie zbierz przykładowe dane i zapisz je.
Wybierz i posortuj docelowe populacje komórek do pięciomililitrowych probówek z polistyrenu z okrągłym dnem lub stożkowych probówek wirówkowych o pojemności 15 mililitrów. Dodaj 500 mikrolitrów PBS i przepłucz probówkę zbiorczą, aby zachować żywotność komórek i ułatwić tworzenie osadów. Mikroglej CCR7 dodatni i CD11c oznaczono ilościowo w drugim i siódmym dniu po udarze niedokrwiennym.
Ekspresja CCR7 w mikrogleju gwałtownie wzrosła w drugim dniu i pozostała podwyższona w siódmym dniu w porównaniu z kontrolami pozorowanymi. Mikroglej CD11c dodatni podążał za podobnym trendem, osiągając szczyt w drugim dniu i utrzymując się na poziomie wyższym niż pozorowany w siódmym dniu. Wykresy punktowe wykazały gęste sygnały CCR7 i CD11c w drugim i siódmym dniu.
Kontrastuje z rzadkimi sygnałami w pozorowanych kontrolach. Strategia bramkowania rozdzieliła komórki szpikowe i limfocyty mikrogleju za pomocą ekspresji CD11B i CD45. Dodatkowe markery pozwoliły określić żywotne komórki, astrocyty i podzbiory limfocytów.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejsze badanie przedstawia protokół oceny funkcji komórek odpornościowych po udarze niedokrwiennym z wykorzystaniem analizy cytometrycznej w modelu mini-udaru. Metoda ta umożliwia szczegółowe badanie interakcji neuroimmunologicznych i może zostać zaadaptowana do badań nad różnymi chorobami neurodegeneracyjnymi, co pozwala na lepsze zrozumienie odpowiedzi immunologicznej w patologii udaru.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Immunologia
- Patologia udaru
Wstęp
- Zrozumienie odpowiedzi immunologicznych w udarze niedokrwiennym jest kluczowe dla opracowania nowych terapii.
- Interakcje neuroimmunologiczne są kluczowym czynnikiem wpływającym na rokowania po udarze.
- Istniejące modele często nie oferują możliwości szczegółowej analizy funkcji odpornościowych.
- Celem niniejszego badania jest wypełnienie tej luki z wykorzystaniem cytometrii przepływowej.
Cel badania
- Opracowanie protokołu oceny funkcji komórek odpornościowych po udarze niedokrwiennym.
- Zbadanie oddziaływań neuroimmunologicznych w modelu mini-udaru.
- Zwiększenie zrozumienia odpowiedzi immunologicznych w chorobach neurodegeneracyjnych.
Zastosowane metody
- Zastosowano analizę cytometryczną, co pozwoliło na szczegółowe zbadanie funkcji komórek odpornościowych.
- Wykorzystano model mini-udaru w celu symulacji warunków niedokrwiennych.
- W tekście nie wspomniano o żadnych przepływach pracy związanych z analizą metaboliczną lub multiomiką.
- Nie podano szczegółowych kroków proceduralnych istotnych dla protokołu.
- Podkreślono możliwość adaptacji metody do różnych chorób neurodegeneracyjnych.
Główne wyniki
- Protokół umożliwia szczegółową ocenę odpowiedzi komórek odpornościowych po udarze niedokrwiennym.
- Wyniki dostarczają istotnych informacji na temat oddziaływań neuroimmunologicznych podczas udaru.
- Kluczowym wnioskiem jest możliwość adaptacji metody w badaniach nad innymi chorobami neurodegeneracyjnymi.
- Wnioski potwierdzają znaczenie zrozumienia dynamiki immunologicznej w patologii udaru.
Wnioski
- Niniejsze badanie przedstawia solidną metodologię analizy odpowiedzi immunologicznych w udarach.
- Zastosowane podejście pogłębia zrozumienie mechanizmów odpornościowych istotnych dla neurodegeneracji.
- Uzyskane wyniki mają znaczenie dla opracowywania celowanych terapii w leczeniu udarów.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Ilościowa ocena oddziaływań neuroimmunologicznych za pomocą cytometrii przepływowej w mysim modelu mini-udaru umożliwia precyzyjną charakterystykę aktywacji i infiltracji komórek odpornościowych po urazie niedokrwiennym. Podejście to wspiera mechanistyczną redukcję ryzyka oraz walidację celów w patologiach napędzanych przez neurostan zapalny, dostarczając informacji niezbędnych do podejmowania decyzji w początkowej fazie rozwoju portfolio leków w obszarze chorób neurodegeneracyjnych i naczyniowo-mózgowych. Adaptacyjność protokołu w różnych modelach chorobowych zwiększa ciągłość translacyjną i pewność prognostyczną w odniesieniu do immunomodulacyjnych strategii terapeutycznych.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Umożliwia badanie mechanizmów neuroimmunologicznych leżących u podstaw uszkodzeń niedokrwiennych i neurodegeneracji.
- Wspiera funkcjonalną walidację celu poprzez ilościowe określanie stanów aktywacji komórek odpornościowych po udarze.
- Ułatwia ograniczanie ryzyka mechanistycznego w przypadku celów immunomodulujących w zaburzeniach ośrodkowego układu nerwowego.
- Dostarcza danych służących do określenia wiarygodności prognostycznej i selekcji aktywów we wczesnej fazie rozwoju.
Przesiewy i opracowanie analizy
- Ustanawia zwalidowane procedury przygotowania zawiesiny pojedynczych komórek oraz znakowania przeciwciałami w celu uzyskania powtarzalnego profilowania immunologicznego.
- Zapewnia ilościowe, multiparametryczne wyniki odpowiednie do standaryzacji testów i późniejszego przesiewu.
- Umożliwia skalowalne fenotypowanie komórek odpornościowych do oceny związków w kontekście stanów zapalnych układu nerwowego.
- Wspiera ponowne wykorzystanie platformy w modelach chorób neurodegeneracyjnych.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Koreluje profilowanie komórek odpornościowych z punktami końcowymi istotnymi dla choroby w przedklinicznych modelach udaru i neurodegeneracji.
- Zapewnia ciągłość od etapu odkryć po przedkliniczną walidację celów neuroimmunologicznych.
- Wspiera decyzje o dalszym rozwoju projektów, dostosowane do ryzyka i oparte na wskaźnikach aktywacji oraz infiltracji układu odpornościowego.
- Ułatwia identyfikację translacyjnych biomarkerów procesów neurozapalnych.
Integracja potoku i przepływu pracy
Niniejszy protokół wpisuje się w kontinuum od etapu odkrycia do badań przedklinicznych, wspierając walidację celów terapeutycznych, wyjaśnianie mechanizmów immunologicznych oraz rozwój ilościowych testów analitycznych dla programów badawczych nad chorobami neurozapalnymi i neurodegeneracyjnymi.
- Biologia odkrywcza: Dostarcza wiarygodnych danych dotyczących aktywacji i infiltracji komórek odpornościowych w celu weryfikacji hipotez i wyjaśnienia szlaków sygnałowych.
- Przesiewanie: Zapewnia powtarzalne, ilościowe wyniki profilowania immunologicznego w celu przygotowania testów i przesiewania związków.
- Analityka: Umożliwia statystyczne porównanie populacji komórek odpornościowych w różnych warunkach eksperymentalnych i punktach czasowych.
- Badania translacyjne: Wspiera uzgadnianie przedklinicznych odczytów immunologicznych z biomarkerami istotnymi dla danej choroby.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Oferuje ustandaryzowany, adaptowalny schemat postępowania dla profilowania immunologicznego w wielu modelach chorób OUN.
Wpływ operacyjny i organizacyjny
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną i redukuje niejednoznaczność mechanistyczną w walidacji celów neuroimmunologicznych.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje protokoły izolacji komórek odpornościowych i cytometrii przepływowej w celu zapewnienia powtarzalności i skalowalności.
- Wartość strategiczna: Wspiera decyzje typu go/no-go oraz alokację kapitału poprzez dostarczanie ilościowych wskaźników aktywacji immunologicznej.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację zasobów związanych z chorobami neurozapalnymi i neurodegeneracyjnymi z uwzględnieniem ryzyka.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymagana jest wiedza specjalistyczna z zakresu neuroanatomii, biologii komórek odpornościowych oraz analizy cytometrii przepływowej.
- Wymagany jest dostęp do wieloparametrowych cytometrów przepływowych oraz zwalidowanych paneli przeciwciał.
- Konieczna jest standaryzacja przetwarzania tkanek i strategii bramkowania pomiędzy zespołami.
- Metoda jest dostosowalna do różnych modeli chorób OUN, przy optymalizacji protokołu pod kątem rodzaju tkanki i kontekstu choroby.
- Interpretacja danych profilowania immunologicznego może wymagać uzupełniających testów funkcjonalnych.
