Name: Badanie sekwencyjnych zdarzeń komórkowych fagocytozy wywołanej przez Godanti Bhasma w komórkach ssaków (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-07-11T15:50:00.000+00:00
Duration: 10 min 10 s
Description: Poznaj mechanizmy fagocytozy z wykorzystaniem Godanti Bhasma w komórkach ssaków. Metoda time-lapse umożliwia bezpośrednią obserwację wnikania cząstek, dynamiki wakuoli i ich kwasowania bez fotobleachingu.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Badania te były wspierane przez Science & Engineering Research Board (SERB) Core Research Grant (CRG/2022/009045), Departament Nauki i Technologii, Rząd Indii.

1. Hodowla komórkowa i wysiew
<ol>
	<li>Przygotuj kompletną pożywkę DMEM uzupełnioną 10% inaktywowanym termicznie FBS i antybiotykami (100 μg/ml penicyliny, 100 μg/ml streptomycyny). Przed użyciem wysterylizuj wszystkie odczynniki i sprzęt.</li>
	<li>Hodować komórki 3T3-L1, HeLa i RAW 264.7w kolbach o średnicy 25 cm2 i szalkach hodowlanych o średnicy 35 mm przy użyciu DMEM. Utrzymywać kultury w temperaturze 37 °C w wilgotnym inkubatorze z 5% CO2 i wymieniać pożywkę co 48 godzin.</li>
	<li>W celu subkulturacji umyj komórki 2x PBS, a następnie odłącz przylegające komórki za pomocą 500 μl trypsyny-EDTA i inkubuj przez 5 minut. Dodaj 1 ml DMEM, aby zneutralizować roztwór trypsyny-EDTA, pipetę, aby utworzyć zawiesinę jednokomórkową i dostosuj objętość do 10 ml ze świeżym DMEM. Wirować przy 300 x g przez 5 minut, ponownie zawiesić osad w 1 ml świeżej pożywki.</li>
	<li>Zmieszać 10 μl zawiesiny komórek z 0,4% błękitem trypanowym (1:1), policzyć żywe komórki za pomocą hemocytometru, obliczyć gęstość jako komórki/ml = średnia liczba x 104 x 2.</li>
	<li>W przypadku płytek 96-dołkowych: Dozować 100 μl zawiesiny komórek (zawierającej 10 000 komórek) do każdej studzienki. W przypadku szkiełek wnękowych należy wysiać 50 μl zawiesiny komórkowej (zawierającej 5000 komórek) do dwóch wnęk, pozostawiając środkową jamę pustą. Dodaj 50 μl DMEM do każdej z wysianych jam.</li>
	<li>Inkubować płytki i szkiełka podstawowe w temperaturze 37 °C w 5% stężeniu CO2 przez 24 godziny, aby umożliwić przyleganie komórek i stabilizację. Zbadaj komórki pod odwróconym mikroskopem przy 20-krotnym powiększeniu, aby ocenić morfologię, zbieg i zanieczyszczenie przed przystąpieniem do eksperymentów.</li>
</ol>
2. Przygotowanie roztworu/koktajlu podstawowego GB do hodowli komórkowej
<ol>
	<li>Zaopatrzyć się w GB i dokładnie zważyć 100 mg proszku. Zawiesić proszek w 10 ml DMEM uzupełnionym 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS) i 1% penicyliną-streptomycyną.</li>
	<li>Zmieszaj zawiesinę i odstaw na 1 minutę, aby większe cząstki mogły się uspokoić. Następnie przenieść górne 5 ml zawiesiny do sterylnej probówki wirówkowej.</li>
	<li>Oznaczyć tę 5 ml przygotowaną zawiesinę GB jako roztwór podstawowy do kolejnych eksperymentów z hodowlami komórkowymi. Dokładnie wymieszaj zawiesinę, aby zapewnić równomierne rozproszenie cząstek przed dodaniem jej do komórek.</li>
</ol>
3. Analiza cytometrii przepływowej
<ol>
	<li>Zebrać komórki RAW 264.7, HeLa lub 3T3-L1 przez trypsynizację, zneutralizować kompletnym DMEM, odwirować przy 300 x g przez 5 minut, ponownie zawiesić w 1 ml świeżej pożywki, wymieszać 10 μl z 0,4% błękitem trypanowym (1:1), policzyć żywe komórki za pomocą hemocytometru, obliczyć gęstość i dostosować do 2 x 105 komórek/ml.</li>
	<li>Wysiewaj 2 x 105 komórek na basenie na 12-dołkowej płytce i hoduj przez 24 godziny. Inkubować w temperaturze 37 °C z 5% CO2 .</li>
	<li>Traktuj komórki zawiesiną GB (300 μl na studzienkę) przez różne czasy: 30 minut, 1 godzinę i 12 godzin. Po zabiegu umyj komórki 5x PBS, aby usunąć nadmiar cząstek.</li>
	<li>Trypsynizuj komórki jak w kroku 1.3 i dokładnie umyj je PBS. Załadować przygotowaną zawiesinę do portu próbki cytometru przepływowego. Uruchom oprogramowanie i wybierz odpowiednie ustawienia akwizycji. Wybierz tryb jasnego pola do obrazowania.</li>
	<li>Rozpocznij pobieranie danych, klikając przycisk Uruchom w oprogramowaniu. Zbieraj dane dla co najmniej 10 000 zdarzeń, ponieważ system przechwytuje obrazy poszczególnych komórek przechodzących przez komórkę przepływu.</li>
	<li>Użyj wykresów punktowych obszaru w funkcji współczynnika proporcji, aby bramkować pojedyncze nienaruszone komórki. Pomaga to wykluczyć dublety i zbity. Wyświetl odpowiednie obrazy w bibliotece obrazów. Zbierz obrazy pojedynczych komórek z biblioteki obrazów oprogramowania, aby zbadać zmiany morfologiczne wywołane leczeniem.</li>
	<li>Do analizy cząstek wysiewaj 2 x 105 komórek na basenie na płytkach 12-dołkowych i hoduj przez 24 godziny. Traktuj komórki zawiesiną GB (300 μl na studzienkę) przez różne czasy: 1 godzina, 7 godzin, 14 godzin i 24 godziny.</li>
	<li>Po zabiegu delikatnie wstrząsnąć płytką hodowlaną przez 1 minutę i zebrać pożywkę hodowlaną do probówek o pojemności 1,5 ml. Umyj komórki 5x PBS, aby usunąć wszelkie cząstki zewnątrzkomórkowe.</li>
	<li>Dodać 500 μl buforu RIPA (20 mM Tris-HCl, pH 7,5; 150 mM NaCl; 0,1% Triton X-100; 1% deoksycholanu sodu), aby całkowicie zlizować komórki.</li>
	<li>Przepuścić oddzielnie pożywkę hodowlaną i próbki komórek zlizowanych zawierające cząstki przez cytometr przepływowy. Załaduj próbki do portu próbki systemu. Uruchom oprogramowanie i wybierz odpowiednie ustawienia akwizycji. Wybierz tryb jasnego pola do analizy cząstek.</li>
	<li>Rozpocznij pobieranie danych, klikając przycisk Uruchom w oprogramowaniu. Zbieraj dane dla co najmniej 20 000 zdarzeń, gdy system rejestruje obrazy pojedynczych cząstek przechodzących przez komórkę przepływową.</li>
	<li>Użyj wykresów punktowych obszaru i proporcji, aby wykluczyć wszystkie cząstki. Użyj narzędzi wykresu punktowego, aby przeanalizować liczbę cząstek.</li>
</ol>
4. Mikroskopia poklatkowa
<ol>
	<li>Hodować komórki 3T3-L1 (3,0 x 104) w naczyniu o średnicy 35 mm z 2 ml DMEM w temperaturze 37 °C w 5% CO2 aż do osiągnięcia 70% konfluencji.</li>
	<li>Dokładnie wymieszać 300 μl zawiesiny GB z podgrzaną świeżą pożywką hodowlaną o pojemności 2 ml, a następnie umieścić naczynie hodowlane z komórkami i GB na stoliku mikroskopu obrazowego.</li>
	<li>Wybierz cel 10x. Włącz oświetlenie jasnego pola za pomocą przycisku Jasne. Kliknij przycisk Film , aby przejść do trybu poklatkowego. Ustaw czas interwału na 5 minut. Rozpocznij nagrywanie, klikając przycisk Rec .</li>
	<li>Rejestruj obrazy co 5 minut przez 16 godzin do 24 godzin, zapewniając ciągłe obrazowanie w standardowych warunkach w inkubatorzeCO2 .</li>
	<li>Użyj oprogramowania ImageJ, aby skompilować przechwycone obrazy w film poklatkowy. Technika ta pozwala na różnicowanie różnych etapów fagocytozy, od internalizacji do całkowitej degradacji cząstek.</li>
</ol>
5. Neutralne czerwone zabarwienie
<ol>
	<li>Po 24 godzinach wzrostu komórek na 96-dołkowych płytkach i szkiełkach wnękowych, dokładnie wymieszaj zawiesinę cząstek GB i dodaj 30 μl zawiesiny do każdej studzienki lub jamy.</li>
	<li>Inkubować w temperaturze 37 °C z 5% CO2 przez 24 godziny w celu wywołania tworzenia się wakuoli. Stosować nieoczyszczone studzienki lub jamy jako kontrole ujemne.</li>
	<li>W przypadku barwienia czerwienią neutralną (NR) przygotuj roztwór NR o stężeniu 0,5 mg/ml w DMEM bez surowicy i przefiltruj go przez filtr 0,2 μm.</li>
	<li>Do obrazowania wakuoli na 96-dołkowych płytkach i szkiełku jastrowym: usunąć pożywkę, dodać 60 μl barwnika NR i inkubować w temperaturze 37 °C przez 15 minut. Umyj 3x PBS, aby usunąć nadmiar barwnika, a następnie przystąp do obrazowania mikroskopowego.</li>
	<li>Zbadaj wakuole pod mikroskopem za pomocą obiektywu 20x, aby ocenić rozmiar, morfologię i liczbę wakuoli.</li>
</ol>
6. Leczenie bafilomycyną A1 w celu tworzenia wakuoli i hamowania zakwaszenia
<ol>
	<li>Przygotować roztwór podstawowy bafilomycyny A1 (BFA1) o stężeniu 100 μg/ml (160,5 nM), rozpuszczając 100 μg BFA w 50 μl DMSO, a następnie rozcieńczając w 950 μl DMEM. Rozcieńczyć 1 μl tego podstawowego materiału w 1,6 ml DMEM, aby otrzymać roztwór roboczy o długości 0,1 nM.</li>
	<li>Dokładnie wymieszać i dodać 100 μl roboczego roztworu BFA do studzienek zawierających komórki w 96-dołkowych płytkach. Dodaj również 30 μl zawiesiny cząstek GB, aby ocenić hamowanie tworzenia wakuoli i fagosomów.</li>
	<li>Aby zahamować zakwaszenie fagosomów, dodaj 100 μl roboczego roztworu BFA do studzienek z wstępnie uformowanymi wakuolami (wcześniej potraktowanymi cząstkami GB). Inkubować wszystkie studzienki w temperaturze 37 °C z 5% CO2 przez 24 godziny.</li>
	<li>Dodać 60 μl barwnika neutralnej czerwieni (NR) do każdego dołka, inkubować przez dodatkowe 15 minut i przeanalizować tworzenie wakuoli i zakwaszenie.</li>
</ol>
7. Barwienie pomarańczą akrydynową (AO)
<ol>
	<li>Komórki hodowane na szkiełkach jamy należy traktować 50 μl GB i inkubować przez noc w standardowych warunkach doświadczalnych.</li>
	<li>Po poddaniu działaniu substancji należy inkubować komórki w roztworze oranżu akrydynowego (1 mg/ml) przez 15 minut w temperaturze 37 °C, aby umożliwić selektywne barwienie wakuoli i kwaśnych organelli pęcherzykowych.</li>
	<li>Umyj komórki 3x sterylnym roztworem soli fizjologicznej buforowanym fosforanami (PBS), aby usunąć niezwiązany barwnik i zminimalizować fluorescencję tła.</li>
	<li>Szybko przeanalizuj szkiełka za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego wyposażonego w obiektyw 20x i niebieski filtr wzbudzenia w zakresie 450-492 nm, aby ocenić morfologię komórkową i wychwyt pomarańczy akrydynowej, co zapewni wgląd w dynamikę wakuolarną.</li>
</ol>

<ol><li>Stuart, L. M., Ezekowitz, R. A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phagocytosis+and+comparative+innate+immunity%3A+learning+on+the+fly%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Phagocytosis and comparative innate immunity: learning on the fly.</a> Nat Rev Immunol. 8 (2), 131-141 (2008).</li>
<li>Underhill, D. M., Goodridge, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Information+processing+during+phagocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Information processing during phagocytosis.</a> Nat Rev Immunol. 12 (7), 492-502 (2012).</li>
<li>Gordon, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phagocytosis%3A+An+immunobiologic+process%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Phagocytosis: An immunobiologic process.</a> Immunity. 44 (3), 463-475 (2016).</li>
<li>Flannagan, R. S., Jaumouillé, V., Grinstein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cell+biology+of+phagocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Pathol+Mech+Dis%22%5BJournal%5D)">The cell biology of phagocytosis.</a> Annu Rev Pathol Mech Dis. 7, 61-98 (2012).</li>
<li>Kinchen, J. M., Ravichandran, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phagosome+maturation%3A+Going+through+the+acid+test%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Phagosome maturation: Going through the acid test.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 9 (10), 781-795 (2008).</li>
<li>Segal, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+neutrophils+kill+microbes%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">How neutrophils kill microbes.</a> Annu Rev Immunol. 23, 197-223 (2005).</li>
<li>Huynh, K. K., Grinstein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+vacuolar+pH+and+its+modulation+by+some+microbial+species%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol+Mol+Biol+Rev%22%5BJournal%5D)">Regulation of vacuolar pH and its modulation by some microbial species.</a> Microbiol Mol Biol Rev. 71 (3), 452-462 (2007).</li>
<li>Méresse, S., Gorvel, J. P., Chavrier, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+rab7+GTPase+resides+on+a+vesicular+compartment+connected+to+lysosomes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">The rab7 GTPase resides on a vesicular compartment connected to lysosomes.</a> J Cell Sci. 112 (21), 3195-3204 (1999).</li>
<li>Caponegro, M. D., Thompson, K. K., Tayyab, M., Tsirka, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Rigorous+Quantitative+Approach+to+Analyzing+Phagocytosis+Assays%5BTitle%5D)+AND+%22Bio+Protoc%22%5BJournal%5D)">A Rigorous Quantitative Approach to Analyzing Phagocytosis Assays.</a> Bio Protoc. 10 (15), e3698(2020).</li>
<li>de Neergaard, T., Sundwall, M., Wrighton, S., Nordenfelt, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-Sensitivity+Assessment+of+Phagocytosis+by+Persistent+Association-Based+Normalization%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">High-Sensitivity Assessment of Phagocytosis by Persistent Association-Based Normalization.</a> J Immunol. 206 (1), 214-224 (2021).</li>
<li>Chu, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+quantification+of+discrete+phagocytic+events+by+live+cell+time-lapse+high-content+microscopy+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">High-resolution quantification of discrete phagocytic events by live cell time-lapse high-content microscopy imaging.</a> J Cell Sci. 133 (5), jcs237883(2020).</li>
<li>Park, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+Flow+Cytometry+Protocols+for+Examining+Phagocytosis+of+Microplastics+and+Bioparticles+by+Immune+Cells+of+Aquatic+Animals%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Imaging Flow Cytometry Protocols for Examining Phagocytosis of Microplastics and Bioparticles by Immune Cells of Aquatic Animals.</a> Front Immunol. 11, 203(2020).</li>
<li>Kapellos, T. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+real+time+imaging+platform+to+quantify+macrophage+phagocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">A novel real time imaging platform to quantify macrophage phagocytosis.</a> Biochem Pharmacol. 116, 107-119 (2016).</li>
<li>Li, Q., Jagannath, C., Rao, P. K., Singh, C. R., Lostumbo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+phagosomal+proteomes%3A+from+latex-bead+to+bacterial+phagosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Analysis of phagosomal proteomes: from latex-bead to bacterial phagosomes.</a> Proteomics. 10 (22), 4098-4116 (2010).</li>
<li>Blum, J. S., Wearsch, P. A., Cresswell, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathways+of+antigen+processing%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Pathways of antigen processing.</a> Annu Rev Immunol. 31, 443-473 (2013).</li>
<li>Das, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Godanti+bhasma+%28anhydrous+CaSO4%29+induces+massive+cytoplasmic+vacuolation+in+mammalian+cells%3A+A+model+for+phagocytosis+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Godanti bhasma (anhydrous CaSO4) induces massive cytoplasmic vacuolation in mammalian cells: A model for phagocytosis assay.</a> Methods. 230, 158-168 (2024).</li>
<li>Huss, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proton+translocation+by+V-ATPase%3A+molecular+mechanism+and+target+for+inhibition+by+Bafilomycin+A1%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bioenerg+Biomembr%22%5BJournal%5D)">Proton translocation by V-ATPase: molecular mechanism and target for inhibition by Bafilomycin A1.</a> J Bioenerg Biomembr. 34, 243-250 (2002).</li>
<li>Méndez-Alejandre, A., Raymond, B. B. A., Trost, M., Marín-Rubio, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bi-functional+particles+for+real-time+phagosome+acidification+and+proteolysis+multiplex+assay+in+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Bi-functional particles for real-time phagosome acidification and proteolysis multiplex assay in macrophages.</a> Front Immunol. 14, 1204223(2023).</li>
<li>Lancaster, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phagosome+resolution+regenerates+lysosomes+and+maintains+the+degradative+capacity+in+phagocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Phagosome resolution regenerates lysosomes and maintains the degradative capacity in phagocytes.</a> J Cell Biol. 220 (9), e202005072(2021).</li>
<li>Krendel, M., Gauthier, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Building+the+phagocytic+cup+on+an+actin+scaffold%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Building the phagocytic cup on an actin scaffold.</a> Curr Opin Cell Biol. 77, 102112(2022).</li>
<li>Barger, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane-cytoskeletal+crosstalk+mediated+by+myosin-I+regulates+adhesion+turnover+during+phagocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Membrane-cytoskeletal crosstalk mediated by myosin-I regulates adhesion turnover during phagocytosis.</a> Nat Commun. 10 (1), 1249(2019).</li>
<li>Ghosh, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+determination+of+phagocytosis+using+pH-sensitive+fluorescent+bioparticles%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Quantitative determination of phagocytosis using pH-sensitive fluorescent bioparticles.</a> J Vis Exp. (125), e56093(2017).</li>
<li>Rashidfarrokhi, A., Richina, V., Tafesse, F. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+the+Early+Stages+of+Phagocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Visualizing the Early Stages of Phagocytosis.</a> J Vis Exp. (120), e54646(2017).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Fagocytoza służy jako kluczowy mechanizm obrony immunologicznej, umożliwiając pochłonięcie, a następnie eliminację cząstek, patogenów i komórek apoptotycznych. Aby zrozumieć procesy powstawania i dojrzewania fagosomów, inteligentne biokompatybilne cząstki w połączeniu z zaawansowanymi technikami obrazowania są niezbędne do badania dynamicznych zdarzeń, takich jak progresja wakuolarna, zakwaszenie i degradacja pochłoniętych materiałów18,19. Zastosowaliśmy GB, biok...

Fagocytoza jest niezbędnym procesem komórkowym przeprowadzanym przez profesjonalne fagocyty rezydujące w tkankach, takie jak makrofagi i komórki dendrytyczne, a także fagocyty nieprofesjonalne, takie jak komórki nabłonkowe i fibroblasty, które pochłaniają i rozkładają obce cząstki. Komórki te internalizują i eliminują obce cząstki, patogeny lub szczątki komórkowe, znacząco przyczyniając się do obrony immunologicznej i homeostazy tkanek1. Proces ten rozpoczyna się od rozpoznania patogenów, szczątków lub cząstek za pomocą receptorów rozpoznawania wzorców (PRR), takich jak receptory Toll-podobne (TLR), które wiążą się z wzorcami molekularnymi związanymi z patogenami (PAMP)2. To rozpoznanie wyzwala tworzenie się kubka fagocytarnego, w którym wypukłości błony plazmatycznej rozciągają się wokół cząstki docelowej3. Włókna aktynowe odgrywają kluczową rolę na tym etapie, napędzając przebudowę błony niezbędną do pochłonięcia cząstek4. Gdy cząstka zostanie zamknięta w fagosomie, tworzy się pęcherzyk związany z błoną. Fagosom ulega dojrzewaniu, charakteryzującemu się fuzją z wczesnymi, a następnie późnymi endosomami, a następnie włączeniem lizosomów zawierających enzymy hydrolityczne5. Enzymy te, takie jak katepsyny, lizozymy i nukleazy, są aktywowane przez zakwaszenie w fagosomie, osiągane przez wakuolarną ATPazę (V-ATPazę), obniżając pH do 4,5-5,5. Proces degradacji kończy się egzocytozą resztek z komórki. Dysfunkcje w tym dynamicznym i złożonym procesie mogą prowadzić do poważnych wyzwań immunologicznych 6,7,8.
Aby dokładnie ocenić złożony proces komórkowy fagocytozy, potrzebne są ulepszone i łatwe metody monitorowania głównych zdarzeń komórkowych fagocytozy. Tradycyjnie, metoda monitorowania w celu kwantyfikacji fagocytozy obejmuje takie techniki, jak utrwalanie fagocytów w określonych odstępach czasu w celu wizualizacji mikroskopowej, pomiar internalizacji celów znakowanych barwnikiem poprzez obrazowanie lub cytometrię przepływową lub liczenie liczby komórek docelowych pozostałych po określonym czasie trwania fagocytozy, jednak metody te nie wychwytują wahań z minuty na minutę, które występują podczas procesu fagocytozy9. Co więcej, metody opierające się na wskaźnikach pośrednich, takich jak wychwyt barwnika, mogą nie odzwierciedlać dokładnie rzeczywistych zdarzeń fagocytarnych ze względu na potencjalny pasywny transfer barwnika10.
Ostatnie postępy w obrazowaniu żywych komórek, cytometrii przepływowej i technikach barwienia zrewolucjonizowały naszą zdolność do monitorowania fagocytozy z wysoką precyzją czasoprzestrzenną. Na przykład obrazowanie żywych komórek umożliwia ciągłą obserwację dynamicznych procesów z sekwencyjnym śledzeniem zdarzeń11. Cytometria przepływowa jest szeroko stosowana do analizy komórek ssaków i wykrywania biomarkerów w badaniach klinicznych12. Jednak tradycyjne metody FC nie są przystosowane do oceny cech morfologicznych i przestrzennych poszczególnych komórek12. Obrazowa cytometria przepływowa (IFC) służy jako solidna alternatywa, która umożliwia zbieranie szczegółowych informacji z pojedynczych komórek. IFC łączy możliwości analityczne cytometrii przepływowej z obrazowaniem o wysokiej rozdzielczości, umożliwiając analizę pojedynczych komórek ze szczegółami morfologicznymi i przestrzennymi. Różne cząsteczki, w tym fluorescencyjne kulki lateksowe, zymosan-APC i syntetyczne nanocząstki, są powszechnie stosowane do badania fagocytozy, dostarczając wglądu w zaangażowanie receptorów, tworzenie fagosomów i odpowiedzi immunologiczne12.
W przeciwieństwie do konwencjonalnych technik biochemicznych, które zazwyczaj opierają się na analizie punktów końcowych, obrazowanie żywych komórek zapewnia ciągłe, dynamiczne monitorowanie procesów komórkowych. Metoda ta oferuje wysoką rozdzielczość czasoprzestrzenną i możliwość obserwacji sekwencyjnych zdarzeń w fagocytozie. W rezultacie jest to potężne narzędzie do badania złożonego procesu fagocytozy, pozwalające na dokładniejszy i bardziej szczegółowy wgląd w zachowania i mechanizmy komórkowe13.
Oprócz postępów w systemach obrazowania istnieje zapotrzebowanie na inteligentne cząsteczki fagocytarne, które mogą wyraźnie podkreślać zdarzenia fagocytarne, w szczególności etapy degradacji zachodzące w fagosomie. Badania nad fagocytozą często wykorzystują cząsteczki, takie jak kulki lateksu, zymozan, bakterie, komórki apoptotyczne i syntetyczne nanocząstki do badania mechanizmów, takich jak zaangażowanie receptorów, tworzenie fagosomów i odpowiedzi immunologiczne. Chociaż cząstki te dostarczają cennych informacji, mają ograniczenia w śledzeniu całego procesu degradacji lub bezpośredniej ocenie dojrzewania fagosomów. Na przykład kulki lateksowe nie ulegają biodegradacji i nie mogą wykazywać degradacji, podczas gdy zymosan i bakterie często wymagają skomplikowanego etykietowania i mogą nie dawać spójnych profili degradacji14,15.
Nasze poprzednie badanie wykazało użyteczność GB, tradycyjnego ajurwedyjskiego preparatu składającego się głównie z siarczanu wapnia, jako idealnej cząstki do badania dojrzewania i degradacji fagosomów16. GB rozpuszcza się z czasem w kwaśnym środowisku fagosomu, umożliwiając wyraźną wizualizację degradacji cząstek. Co więcej, zdolność GB do indukowania silnego tworzenia wakuoli ułatwia badanie różnych etapów dojrzewania fagosomów, od wczesnego tworzenia do zakwaszenia i ostatecznego ustąpienia. W przeciwieństwie do innych cząstek, GB eliminuje potrzebę zewnętrznego znakowania, zapewniając samowystarczalny system do badania pełnego cyklu życia fagosomów, co czyni go idealnym modelem do zrozumienia dynamiki fagocytozy i związanych z nią zaburzeń16.
W badaniu przedstawiono ustandaryzowany i powtarzalny protokół przeznaczony do oceny fagocytozy indukowanej cząstkami i tworzenia wakuoli przy użyciu Godanti Bhasma (GB) zarówno w profesjonalnych (RAW 264.7), jak i nieprofesjonalnych (HeLa i 3T3-L1) fagocytarnych liniach komórkowych. Ogólnym celem tej metody jest zapewnienie solidnej platformy do badania mechanizmów wychwytu komórkowego, biogenezy wakuolarnej i przetwarzania cząstek wewnątrzkomórkowych w różnych typach komórek. GB zawieszono w DMEM w stężeniu 10 mg/ml, a aby zapewnić jednorodność, większe cząstki pozostawiono do osiadania, podczas gdy górna frakcja została zebrana do użytku eksperymentalnego. W testach cytometrii przepływowej komórki wysiewano w gęstości 2 x 105 komórek na studzienkę na płytkach 12-dołkowych, a do każdej studzienki dodano 300 μl zawiesiny roboczej GB. W przypadku analiz obrazowych 5 000-10 000 komórek wysiewano na dołek w 96-dołkowych płytkach lub na szkiełkach komorowych. Metoda ta ustanawia GB jako wiarygodny model do badania powstawania wakuoli i internalizacji cząstek w różnych typach komórek.

<table><tbody><tr><td>Kolby hodowlane 25 cm2</td><td>NEST, Indie</td><td>707001</td><td></td></tr><tr><td>Płytki 96- i 6-dołkowe</td><td>Tarsons India Pvt. Ltd., Kalkuta, Indie; Thermo Scientific, Indie</td><td>980040; 140675</td><td></td></tr><tr><td>Pomarańcz akrydynowy</td><td>SRL, Indie</td><td>82407</td><td></td></tr><tr><td>Antybiotyki i roztwór trypsyny-EDTA</td><td>High Media, Indie</td><td>628242; 655111</td><td></td></tr><tr><td>Linie komórkowe - HeLa, 3T3-L1 i RAW-264.7</td><td>Narodowe Centrum Nauk o Komórkach (NCCS), Pune, Maharastra</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Naczynia do hodowli kultur (35mm)&nbsp;</td><td>SPL Lifesciences, Indie</td><td>101350</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s zmodyfikowany Eagle medium (DMEM)</td><td>MP Biomedicles, Indie</td><td>1033126</td><td></td></tr><tr><td>Surowica płodowa bydlęca (FBS)</td><td>High Media, Indie</td><td>651257</td><td></td></tr><tr><td>Cytometr przepływowy</td><td>Millipore, Stany Zjednoczone Ameryki</td><td>Amnis powiedział:</td><td>Cytometry przepływowe do obrazowania Amnis,</td></tr><tr><td>Mikroskop fluorescencyjny</td><td>DiGi Lab, Indie</td><td>Modelu: DiGi 110 Nieskończoność</td><td></td></tr><tr><td>Godanti Bhasma</td><td>Patańdżali Ajurwed</td><td>240002</td><td></td></tr><tr><td>Neutralny czerwony barwnik</td><td>CDH, Indie</td><td>593630</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop poklatkowy</td><td>NanoEnTek Inc.&nbsp; Seul, Korea.</td><td>Juli</td><td>Inteligentny analizator komórek fluorescencyjnych JuLi,</td></tr><tr><td>Mikroskop poklatkowy</td><td>LEEDZ MICRO IMA. Wielka Brytania</td><td>S.No. LIM225552358A58</td><td>EA PRIME Mikroskop odwrócony</td></tr></tbody></table>

badanie sekwencyjnych zdarzeń komórkowych fagocytozy wywołanej przez godanti bhasma w komórkach ssaków

Exploring the Sequential Cellular Events of Phagocytosis Triggered by Godanti Bhasma in Mammalian Cells

Fagocytoza jest istotnym mechanizmem komórkowym, dzięki któremu komórki pochłaniają i rozkładają obce cząstki, patogeny lub zanieczyszczenia, odgrywając kluczową rolę w obronie immunologicznej i utrzymaniu homeostazy tkanek. Zakłócenia w tym procesie są związane z różnymi chorobami. Aby zbadać złożone zdarzenia związane ze szlakiem fagocytozy, niezbędne są zaawansowane inteligentne cząstki i skuteczne techniki monitorowania. Godanti Bhasma (GB), tradycyjna medycyna indyjska składająca się z bioaktywnych cząsteczek siarczanu wapnia, jest szybko internalizowana przez fagocytozę w komórkach ssaków, wywołując znaczną wakuolizację cytoplazmatyczną. Kluczowe etapy fagocytozy indukowanej przez GB oceniano tutaj za pomocą cytometrii przepływowej (FC), obrazowania żywych komórek i specyficznych technik barwienia. Analiza cytometrii przepływowej wykazała tworzenie się fagocytarnych struktur przypominających miseczki związanych z internalizacją cząstek. Obrazowanie żywych komórek umożliwiło obserwację w czasie rzeczywistym procesów fagocytarnych, w tym wychwytu cząstek, tworzenia wakuoli, degradacji pochłoniętych materiałów i obrotu wakuolarnego. Barwienie neutralną czerwienią i pomarańczą akrydynową zastosowano do oceny zakwaszenia wakuolarnego. Co ciekawe, leczenie lizosomalnym inhibitorem BFA1 w komórkach traktowanych GB nie prowadziło do wakuolizacji, o czym świadczy brak wychwytu obojętnej czerwieni, co podkreśla wymóg kwaśnego środowiska do wystąpienia wakuolizacji. Odkrycia te podkreślają potencjał fagocytozy indukowanej przez GB jako modelu do wyjaśnienia sekwencyjnych zdarzeń komórkowych zaangażowanych w ten proces, co ma kluczowe znaczenie dla zrozumienia interakcji gospodarz-patogen, transportu wewnątrzkomórkowego i opracowania innowacyjnych strategii terapeutycznych dla zaburzeń związanych z fagocytozą.

Badanie podkreśla kluczowe odpowiedzi komórkowe na cząstki GB w komórkach ssaków. Użyliśmy obrazowego cytometru przepływowego do zbadania internalizacji cząstek GB w komórkach 3T3-L1 (ryc. 1). Komórki były wystawione na działanie cząstek przez czas od 30 minut do 12 godzin. Po 30 minutach zaobserwowaliśmy cząsteczki na powierzchni komórki (ryc. 1B), a błona komórkowa zaczęła fałdować się do wewnątrz w miejscach przyczepu, co wskazuje na inicjację internalizacji ...

Badanie to wyjaśnia przetwarzanie fagocytarne cząstek Godanti Bhasma (GB) w komórkach ssaków, charakteryzując ich wychwyt komórkowy, dynamikę wakuoli, zakwaszenie i degradację. Odkrycia te nie tylko pogłębiają naszą wiedzę na temat podstawowych mechanizmów fagocytozy, ale także sprawiają, że GB jest obiecującym systemem modelowym do opracowywania nowych strategii terapeutycznych.

Badanie sekwencyjnych zdarzeń komórkowych fagocytozy wywołanej przez Godanti Bhasma w komórkach ssaków

Phagocytosis is a vital cellular mechanism through which cells engulf and degrade foreign particles, pathogens, or debris, playing a key role in immune ...

Fagocytoza, w której fagocyt połyka i rozkłada obce cząstki. Ma to kluczowe znaczenie dla obrony immunologicznej. Potrzebne są ulepszone, przyjazne dla użytkownika metody, aby skutecznie monitorować i oceniać ten złożony proces komórkowy.Rejestrowanie zdarzeń degradacji w czasie rzeczywistym i unikanie artefaktów spowodowanych wybielaniem zdjęć pozostaje kluczowymi wyzwaniami w dokładnym badaniu fagocytozy i transportu wewnątrzkomórkowego. W przeciwieństwie do cząstek fluorescencyjnych lub syntetycznych, nasz protokół wykorzystuje Godanti Bhasma, cząstkę bez znaczników, która umożliwia bezpośrednią wizualizację etapów fagocytozy bez wybielania zdjęć, optymalizacji lub skomplikowanego przygotowania. Odkrycia te zapewniają powtarzalny model do analizy mechanizmów fagocytarnych, oferując nowe narzędzia do badania dynamiki pęcherzyków, dysfunkcji patogenów i potencjalnej interwencji terapeutycznej w zaburzeniach immunologicznych i lizosomalnych.Naszym celem jest zbadanie molekularnych regulatorów dojrzewania fagosomu, zbadanie dysfunkcji fagocytarnych w modelach chorób oraz badanie przesiewowe potencjalnych leków, które modulują dynamikę pęcherzyków i transport wewnątrzkomórkowy. Na po

exploring-sequential-cellular-events-phagocytosis-triggered-godanti

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

W niniejszym artykule opisujemy metodę wykorzystującą multispektralną przepływową cytometrię obrazową do ilościowego oznaczenia internalizacji nanocząstek polianhydrydowych lub bakterii przez komórki RAW 264.7.

Analiza internalizacji komórkowej nanocząsteczek i bakterii przy użyciu wielospektralnej obrazującej cytometrii przepływowej

Opisujemy metody wideomikroskopii żywych komórek fagocytozy Candida albicans za pomocą makrofagów.  Metody te umożliwiają specyficzną dla danego etapu analizę migracji, rozpoznawania, pochłaniania i dojrzewania fagosomów oraz ujawniają nowe aspekty fagocytozy.

Mikroskopia wideo żywych komórek fagocytozy patogenów grzybowych

Phagocytic cells play a major role in the innate immune system by removing and eliminating invading microorganisms in their phagosomes. Phagosome ...

Badanie biogenezy fagolizosomów w żywych makrofagach

Opisujemy eksperymentalny układ do wizualizacji z bezprecedensową wysoką rozdzielczością tworzenia i zamykania fagosomów w trzech wymiarach u żywych makrofagów, przy użyciu mikroskopii fluorescencyjnej z całkowitym wewnętrznym odbiciem. Umożliwia monitorowanie podstawy miseczki fagocytarnej, rozciągających się pseudopodów, a także dokładnego miejsca rozszczepienia fagosomu.

"Test zamykania fagosomu" do wizualizacji powstawania fagosomów w trzech wymiarach przy użyciu mikroskopii fluorescencyjnej z całkowitym wewnętrznym odbiciem (TIRFM)

Tutaj opisujemy technikę opartą na mikroskopie, aby wizualizować i kwantyfikować wczesne kaskady zdarzeń podczas fagocytozy patogenów, takich jak grzyby Candida albicans i cząstki większe niż 0,5 μm, w tym kulki pokryte zymozanem i IgG.

Wizualizacja wczesnych stadiów fagocytozy

Opisujemy tutaj prostą i szybką metodę izolacji fagosomów zawierających Salmonella typhimurium od makrofagów poprzez pokrycie bakterii biotyną i streptawidyną.

Izolacja fagosomów zawierających Salmonella typhimurium od makrofagów

Tutaj opisujemy metody wykorzystujące mikroskopię konfokalną z wirującym dyskiem do obrazowania pojedynczych zdarzeń fagocytarnych przez makrofagi otrzewnowe rezydujące u myszy. Protokoły można rozszerzyć na inne komórki fagocytarne.

Poklatkowe obrazowanie 3D fagocytozy przez makrofagi myszy

Mechanizm związany z fagocytozą w zakażeniu Leishmania pozostaje słabo poznany. W tym miejscu opisujemy metody oceny wczesnych zdarzeń zachodzących podczas interakcji Leishmania z komórkami gospodarza.

Badanie fagocytozy Leishmania za pomocą mikroskopii konfokalnej

W niniejszej pracy opisujemy test wykorzystujący mikroiniekcję w połączeniu z fluorescencyjną hybrydyzacją in situ w celu dokładnego pomiaru kinetyki eksportu mRNA z jądra w somatycznych komórkach ssaków.

Analiza kinetyki eksportu jądrowego mRNA w komórkach ssaków za pomocą mikroiniekcji

Zastosowanie testu kolonogennego do oceny żywotności reprodukcyjnej jest uznane od ponad 50 lat. W niniejszym materiale przedstawiamy ogólną procedurę przeprowadzania testu kolonogennego z wykorzystaniem komórek adherentnych.

Test klonogenny: komórki adherentne

Poznaj mechanizmy fagocytozy z wykorzystaniem Godanti Bhasma w komórkach ssaków. Metoda time-lapse umożliwia bezpośrednią obserwację wnikania cząstek, dynamiki wakuoli i ich kwasowania bez fotobleachingu.

Badanie sekwencyjnych zdarzeń komórkowych fagocytozy wywołanej przez Godanti Bhasma w komórkach ssaków

Przeglądaj więcej filmów