Badanie sekwencyjnych zdarzeń komórkowych fagocytozy wywołanej przez Godanti Bhasma w komórkach ssaków

Fagocytoza, w której fagocyt połyka i rozkłada obce cząstki. Ma to kluczowe znaczenie dla obrony immunologicznej. Potrzebne są ulepszone, przyjazne dla użytkownika metody, aby skutecznie monitorować i oceniać ten złożony proces komórkowy.

Rejestrowanie zdarzeń degradacji w czasie rzeczywistym i unikanie artefaktów spowodowanych wybielaniem zdjęć pozostaje kluczowymi wyzwaniami w dokładnym badaniu fagocytozy i transportu wewnątrzkomórkowego. W przeciwieństwie do cząstek fluorescencyjnych lub syntetycznych, nasz protokół wykorzystuje Godanti Bhasma, cząstkę bez znaczników, która umożliwia bezpośrednią wizualizację etapów fagocytozy bez wybielania zdjęć, optymalizacji lub skomplikowanego przygotowania. Odkrycia te zapewniają powtarzalny model do analizy mechanizmów fagocytarnych, oferując nowe narzędzia do badania dynamiki pęcherzyków, dysfunkcji patogenów i potencjalnej interwencji terapeutycznej w zaburzeniach immunologicznych i lizosomalnych.

Naszym celem jest zbadanie molekularnych regulatorów dojrzewania fagosomu, zbadanie dysfunkcji fagocytarnych w modelach chorób oraz badanie przesiewowe potencjalnych leków, które modulują dynamikę pęcherzyków i transport wewnątrzkomórkowy. Na początek zważ dokładnie 100 miligramów proszku Godanti Bhasma lub GB. Zawiesić proszek w 10 mililitrach DMEM uzupełnionym 10% FBS i 1% penicyliną streptomycyną.

Dokładnie wymieszaj zawiesinę, aby wymieszać zawartość i odstaw mieszaninę na minutę, aby większe cząstki osiadły na dnie. Za pomocą pipety przenieść górne pięć mililitrów zawiesiny do sterylnej probówki wirówkowej. Oznacz pięć mililitrów przeniesionej zawiesiny GB jako roztwór podstawowy do dalszych prac nad hodowlą komórkową.

Ponownie dokładnie wymieszaj zawiesinę, aby zapewnić równomierne rozproszenie cząstek przed dodaniem jej do komórek. Zasiew 3 10 do czwartego ogniwa mocy 3T3-L1 do 35-milimetrowej naczynia zawierającej dwa mililitry DMEM. Inkubuj naczynie w temperaturze 37 stopni Celsjusza w atmosferze 5% dwutlenku węgla, aż komórki osiągną 70% konfluencji.

Następnie dokładnie wymieszaj 300 mikrolitrów zawiesiny wyjściowej GB z dwoma mililitrami podgrzanej świeżej pożywki hodowlanej. Umieścić naczynie hodowlane zawierające komórki i zawiesinę GB na inkubatorze stopniowym mikroskopu obrazowego. Wybierz obiektyw 10x w mikroskopie.

Włącz oświetlenie jasnego pola za pomocą przycisku Jasny. Następnie uruchom oprogramowanie DIGI ImagePlus i wybierz odpowiednią kamerę. Kliknij przycisk Przechwyć i wybierz opcję poklatkową.

Ustaw czas interwału na pięć minut i rozpocznij nagrywanie, klikając przycisk Zakończ. Rejestruj obrazy jasnego pola w odstępach pięciominutowych w sposób ciągły przez 16 do 24 godzin w inkubatorze dwutlenku węgla na poziomie mikroskopu. Użyj oprogramowania ImageJ, aby skompilować wszystkie przechwycone obrazy w film poklatkowy.

Umożliwia to identyfikację etapów fagocytozy od internalizacji cząstek do ich całkowitej degradacji. Po 24 godzinach wzrostu komórek w 96-dołkowych płytkach dokładnie wymieszaj zawiesinę cząstek GB. Dodaj 30 mikrolitrów zawiesiny do każdej studzienki.

Używaj studzienek bez cząstek GB jako kontroli ujemnej. Inkubuj płytki w temperaturze 37 stopni Celsjusza w 5% dwutlenku węgla przez 24 godziny, aby wywołać tworzenie się wakuoli. Aby przygotować neutralny czerwony roztwór, rozpuść neutralną czerwień, aby uzyskać 0,5 miligrama na mililitr roztworu w surowicy wolnej od surowicy.

Przefiltrować roztwór przez filtr 0,2 mikrometra. W celu obrazowania usuń pożywkę z 96-dołkowych płytek. Po dodaniu 60 mikrolitrów barwnika filtracyjnego do każdej studzienki, inkubować płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 15 minut.

Umyj studzienki trzykrotnie PBS, aby usunąć nadmiar barwnika. Następnie przystąp do obrazowania mikroskopowego. Zbadaj wybarwione wakuole pod mikroskopem za pomocą obiektywu 20x, aby ocenić rozmiar, morfologię i liczbę wakuoli.

Aby przygotować roztwór podstawowy bafilomycyny A1, rozpuścić 100 mikrogramów związku w 50 mikrolitrach dimetylosulfotlenku. Następnie rozcieńczyć go 950 mikrolitrami DMEM. Do roztworu roboczego rozcieńczyć jeden mikrolitr bulionu w 1,6 mililitra DMEM, aby uzyskać końcowe stężenie 0,1 nanomolowego.

Dokładnie wymieszaj roztwór roboczy i dodaj 100 mikrolitrów do studzienek zawierających komórki w 96 płytkach dołkowych. Następnie inkubuj komórki w każdej studzience z 30 mikrolitrami zawiesiny cząstek GB, aby zbadać hamowanie tworzenia wakuoli i fagosomów. Aby zahamować zakwaszenie fagosomów, dodaj 100 mikrolitrów roztworu roboczego bafilomycyny A1 do studzienek z wstępnie uformowanymi wakuolami uprzednio potraktowanymi GB. Inkubuj wszystkie studzienki w temperaturze 37 stopni Celsjusza w 5% dwutlenku węgla przez 24 godziny.

Dodaj 60 mikrolitrów neutralnego czerwonego barwnika do każdej studzienki. Inkubować przez 15 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza i umyć studzienki trzykrotnie PBS, aby usunąć nadmiar barwnika, a następnie przeanalizować tworzenie się wakuoli i zakwaszenie pod mikroskopem. Potraktuj wyhodowane komórki 50 mikrolitrami zawiesiny GB i inkubuj je przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza w 5% dwutlenku węgla w standardowych warunkach eksperymentalnych.

Po zabiegu dodać do komórek roztwór pomarańczy akrydynowej w stężeniu jednego miligrama na mililitr i inkubować przez 15 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza, aby zabarwić wakuole i kwaśne organelle pęcherzykowe. Następnie umyj komórki trzykrotnie sterylnym PBS, aby usunąć niezwiązany barwnik i zmniejszyć fluorescencję tła. Na koniec natychmiast przeanalizuj zabarwione szkiełka za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego wyposażonego w obiektyw 20x i niebieski filtr wzbudzenia w zakresie od 450 do 492 nanometrów.

Oceń morfologię komórkową i wychwyt pomarańczy akrydyny, aby zrozumieć dynamikę wakuolarną. Po 30 minutach leczenia GB zaobserwowano cząsteczki przyczepione do powierzchni trzech komórek 3T3-L1. Wokół cząstki pojawiło się przedłużenie błony przypominające miseczkę, wskazujące na inicjację pochłonięcia cząstek.

Po 12 godzinach od leczenia wewnątrz komórek zaobserwowano duże wakuole związane z błoną zawierającą cząstki GB. Obrazowanie poklatkowe wykazało stopniową internalizację i tworzenie wakuoli w pojedynczej żywej komórce w ciągu 4,75 godziny. Cząsteczki GB w wakuolach z czasem ulegały postępującej degradacji, a komórka odzyskała normalną morfologię, na co wskazuje obrót wakuolarny.

Analiza cytometrii przepływowej wykazała, że zinternalizowane cząstki Godanti Bhasma uległy całkowitej degradacji w ciągu 24 godzin, a w pożywce hodowlanej nie pozostały żadne cząstki. Neutralne czerwone barwienie wykazało znacznie wyższe zakwaszenie wakuoli w komórkach wszystkich trzech linii komórkowych traktowanych GB w porównaniu z kontrolami, które wykazywały tylko słabe barwienie lizosomalne. Barwienie pomarańczą akrydynową wykazało pomarańczowo-czerwoną fluorescencję w wakuolach komórek GB 3T3-L1 wskazujących na zakwaszenie, podczas gdy nieleczone komórki wykazywały tylko zieloną fluorescencję.

Jednoczesne leczenie bafilomycyną hamowało tworzenie wakuoli zarówno w komórkach 3T3-L1, jak i HeLa, o czym świadczy brak wakuoli w porównaniu z ich odpowiednimi kontrolami. Po leczeniu bafilomycyną wychwyt neutralnej czerwieni został skutecznie zablokowany, zakłócając zakwaszenie i dojrzewanie wakuoli w komórkach.