Rurociąg miksturowy do generowania molekularnych operacyjnych jednostek taksonomicznych (MOTU) wśród chrząszczy nadbrzeżnych i wodnych

Dążąc do przyspieszenia odkrywania gatunków w MEGA różnorodnych tropikach, protokół ten ma na celu wygenerowanie hipotezy grupowania gatunków w chrząszczach wodnych i łęgowych przy użyciu mikstury analizy komputerowej.

Ten rurociąg mikstury, który wykorzystywał sekwencję DNA COI, doprowadził do większej ilości dowodów na rozgraniczenie gatunku chrząszcza raftowego z rodzaju Anisostena, który wcześniej został zbudowany tylko na podstawie danych morfologicznych.

Protokół ten ma na celu rozwiązanie problemu taksonomicznego, jakim jest odkrywanie gatunków za pomocą taksonomii opartej na morfologii, która jest uważana za złoty standard w systematyce owadów, jest często czasochłonne i mylące dla niedostatecznie zbadanych, ale MEGA zróżnicowanych i bardzo niepozornych chrząszczy wodnych.

[Emmanuel] Ten potok generuje molekularne hipotezy pomocnicze zwane MOTU, niezależnie od tego, czy sekwencja odpowiada znanym gatunkom w sekwencjach, do których się odwołuje, czy też gatunki są nieodkryte lub nieopisane.

Dzięki temu, zamiast analizować i porównywać setki struktur narządów płciowych chrząszczy jednocześnie, rurociąg zapewnia wstępne grupowanie, na którym próbki mogą być badane pod kątem współgatunku.

[Narrator] Aby rozpocząć, uruchom MEGA X i załaduj sekwencje DNA w celu wyrównania. Otwórz interfejs linii trasowania, wybierając linię, a następnie klikając edytuj lub zbuduj wyrównanie, a następnie wybierając opcję Utwórz nową linię trasowania. Kliknij OK, aby potwierdzić wybór i wybierz DNA jako typ danych. Najedź kursorem myszy na kartę edycji. Kliknij wstaw sekwencję z pliku. Przejdź do odpowiedniego katalogu i wybierz pliki sekwencji, które chcesz załadować do MEGA. Teraz kliknij wyrównanie, a następnie wybierz wyrównaj według ClustalW, aby wyrównać sekwencje przy użyciu ustawień domyślnych i kliknij OK, aby kontynuować. W celu ręcznej edycji sekwencji usuń wszystkie wstawienia, klikając wstawione podstawy lub pozycje i naciskając delete na klawiaturze. Następnie popraw usunięcia, klikając myślnik reprezentujący brakującą podstawę, usuwając ją i wpisując zamierzoną podstawę. Następnie znajdź najwcześniejszą pozycję, w której wszystkie sekwencje zawierają znak. Kliknij puste pole w nagłówku wiersza bezpośrednio po lewej stronie tej pozycji i przeciągnij, aby zaznaczyć wszystkie nadmiarowe pozycje początkowe. Naciśnij usuń, aby je przyciąć. Następnie znajdź ostatnią wyrównaną pozycję i kliknij pole po prawej stronie tego punktu. Naciśnij ponownie delete, aby przyciąć koniec. Teraz wybierz wszystkie sekwencje i kliknij zakładkę przetłumaczone sekwencje białek. Po wyświetleniu monitu zweryfikuj kod genetyczny jako mitochondrialny bezkręgowców. Jeśli kod genetyczny jest inny, kliknij nie, a pojawi się menu, w którym można zaznaczyć pole dla mitochondrialnego kodu genetycznego bezkręgowców. Jeśli kodony stop oznaczone gwiazdką w wyrównaniu pojawiają się w całej kolumnie, kliknij sekwencje DNA i usuń pierwszą pozycję dla wszystkich sekwencji. Ponownie kliknij sekwencje DNA, a następnie zapisz wyrównanie w formacie .mos lub .mosx. Aby rozpocząć delimitację za pomocą modułu TaxonDNA, otwórz oprogramowanie TaxonDNA. Kliknij import, a następnie wybierz FASTA i prześlij plik wyrównania w formacie FAPSA. Teraz kliknij moduły, a następnie wybierz klaster. Ustaw wartość progową na 3% i zaznacz pole wyboru Generuj indywidualne informacje dla każdego klastra. Kliknij teraz utwórz klastry, aby rozpocząć grupowanie i zapisać wyniki, robiąc zrzut ekranu. W celu rozgraniczenia za pomocą metody Kimura 2-parametrowej otwórz MEGA i kliknij plik, a następnie wybierz otwórz plik lub sesję. Kliknij odległość. Wybierz opcję Oblicz odległości parami i potwierdź plik .meg do rozgraniczenia. Najedź kursorem na pole obok modelu lub metody i kliknij strzałkę, aby rozwinąć menu rozwijane. Wybierz model Kimura 2-parametrowy i kliknij OK, aby uruchomić program. Otwórz okno danych wyjściowych, aby wyświetlić wyniki. Kliknij plik, a następnie wybierz odległości eksportu i drukowania, aby zapisać wynik. Otwórz gatunek zestawu za pomocą automatycznego partycjonowania lub serwera WWW ASAP. Kliknij pomarańczowe pole oznaczone wybierz plik i prześlij plik .fasta. Przewiń w dół i kliknij przejdź. Aby pobrać wynik grupowania, kliknij listę dla wiersza z najniższym wynikiem ASAP i najwyższą rangą wartości P. Następnie, aby rozpocząć szacowanie drzewa, otwórz MEGA i kliknij dane. Następnie wybierz pozycję otwórz plik lub sesję, aby załadować plik .meg. Kliknij modele, a następnie wybierz znajdź najlepsze modele DNA i białek lub ml, aby określić najlepiej dopasowany model podstawiania. Kliknij przycisk OK w menu preferencji analizy. Teraz, aby wygenerować drzewo, kliknij filogenezę, a następnie wybierz skonstruuj i przetestuj drzewo maksymalnego prawdopodobieństwa. Użyj modelu zastępowania najlepszego dopasowania, klikając pole obok modelu lub metody i wybierając odpowiedni model z menu rozwijanego. W sekcji test filogenezy kliknij pole obok testu filogenezy, a następnie wybierz metodę bootstrap z menu rozwijanego. Kliknij pole obok liczby replikacji bootstrap. Wpisz wartość 1 000 i kliknij przycisk OK, aby uruchomić analizę. Po otwarciu okna zawierającego wynikowe drzewo zapisz sesję jako plik .mts lub .mtsx. Zapisz również dane wyjściowe jako plik .newick i wyeksportuj drzewo jako obraz .png. Aby uzyskać informacje o rozgraniczeniu opartym na protokole PTP, odwiedź serwer sieci Web PTP. Kliknij wybierz plik i prześlij drzewo w formacie Newick. Pod moim drzewem jest wybrany ukorzeniony. W polu w obszarze nazwy taksonów grupy zewnętrznej wprowadź grupę zewnętrzną, wpisując nazwę końcówki taksonu. Następnie, w obszarze rozwiązanie maksymalnego prawdopodobieństwa, kliknij pobierz wyniki rozgraniczania, aby zapisać dane wyjściowe PTP ML. Podobnie w obszarze najwyższego rozwiązania obsługiwanego przez bayesian kliknij pozycję Pobierz wyniki rozdzielania, aby zapisać dane wyjściowe analizy biznesowej PTP. Aby zapoznać się z ograniczeniami MPTP opartymi na protokole MPTP, odwiedź serwer sieci Web MPTP. Prześlij plik Newick, przeciągając go na szary kwadrat lub klikając na kwadrat. Po załadowaniu danych kliknij przejdź do wyboru grupy zewnętrznej. Na stronie specyfikacji grupy zewnętrznej wybierz grupę zewnętrzną, klikając pole wyboru obok etykiet taksonów okazów grupy zewnętrznej. Następnie kliknij na wybór modelu, wybierz MPTP i kliknij opcje wizualizacji. Na stronie opcji wizualizacji zaakceptuj ustawienia domyślne. Kliknij Prześlij. Kliknij prawym przyciskiem myszy pliki w obszarze Pliki do pobrania i wybierz Zapisz jako, aby zapisać wyniki. Teraz, aby wygenerować molekularne operacyjne jednostki taksonomiczne lub MOTU, otwórz drzewo za pomocą programu do edycji zdjęć lub programu PowerPoint. Utwórz słupek reprezentujący wyniki podejścia do delimitacji poszczególnych gatunków molekularnych. Jeśli wszystkie podejścia dają identyczne wyniki dla danego klastra molekularnego, należy oznaczyć ten klaster jako MOTU w drodze konsensusu. Rysunek ten przedstawia drzewo genów maksymalnego prawdopodobieństwa i wyniki grupowania molekularnego dla chrząszczy boranus w oparciu o sekwencje COI 3-prime i sześć metod delimitacji. Wszystkie metody spójnie zidentyfikowały cztery MOTUS, Byrrhinus negrosensis, Byrrhinus villarini, Byrrhinus A i Byrrhinus B, z identycznym grupowaniem we wszystkich metodach. Byrrhinus negrosensis i Byrrhinus villarini były wyraźnie oddzielone, mimo że pochodziły z tych samych miejsc. Sekwencje z czterech prowincji zostały zgrupowane w Byrrhinus A, nie wykazując silnej struktury geograficznej. Rysunek ten przedstawia grupowanie chrząszczy Anisostena w cztery MOTU, w tym Anisostena angatbuhay, Anisostena auxilium, Anisostena A i Anisostena B z pełną zgodnością między metodami. Anisostena auxilium pokrywała się geograficznie z Anisostena A i Anisostena B, co wskazuje, że sama geografia nie wyjaśnia rozbieżności molekularnej.