Wielokrotnego użytku narzędzie do obrazowania wątroby: wielokrotnego użytku narzędzie drukowane w 3D do mikroskopii śródżyciowej wątroby

Głównym celem tej procedury jest pokazanie Narzędzia Obrazowania Wątroby wielokrotnego użytku, czyli RHIT, jako przełomowego narzędzia do pozyskiwania wysokiej jakości, dynamicznych danych biologicznych, zwłaszcza w badaniach nad wątrobą. Tradycyjne metody naukowe badania myszy w eksperymentach kontrolowanych od dawna opierają się na obserwacji behawioralnej, monitoringu fizjologii oraz analizie genetycznej. Złożoność tych badań często skutkuje niespójnymi lub ograniczonymi wynikami danych.

Wiele eksperymentów opiera się na danych, które są albo niekompletne, albo trudne do interpretacji, takie jak krótkie błyski obrazów o niskiej rozdzielczości, które szybko zanikają, co utrudnia uchwycenie długoterminowych trendów lub subtelnych zmian. Wprowadzamy RHIT, umożliwiające dynamiczne, wysokorozdzielcze przechwytywanie badań nad wątrobą i poza nimi. Technika, którą demonstrujemy, umożliwia wytwarzanie niestandardowych narzędzi obrazowania z wykorzystaniem dostępnych materiałów i szeroko dostępnych technologii druku 3D.

Zaprojektowane do użytku w środowiskach akademickich i o ograniczonych zasobach, to podejście umożliwia szybkie rozwijanie i wdrażanie urządzeń obsługujących obrazowanie in vivo o wysokiej rozdzielczości. Nasze wielokrotnego użytku narzędzie obrazowania wątroby, czyli RHIT, zostało opracowane w celu poprawy stabilności tkanek podczas mikroskopii śródwitalnej wątroby. Modułowa konstrukcja RHIT-a umożliwia myszy o różnych rozmiarach i umożliwia rozszerzone obrazowanie dynamicznych procesów metabolicznych przy minimalnych zakłóceniach fizjologicznych.

RHIT jest wytwarzany w jednym etapie z użyciem akrylonitrylu, butadienu, styrenu, ABS, termoplastu wybranego ze względu na lekkość, termostabilność i trwałość mechaniczną. Poprzez regulację gęstości materiału RHIT skutecznie pochłania ruch wywołany przez oddychanie i bicie serca, co zmniejsza artefakty obrazu i zwiększa klarowność. Chemiczna bezwładność ABS i nierozpuszczalność w wodzie zapewniają dostępność z tkankami biologicznymi oraz umożliwiają efektywne czyszczenie i ponowne użycie.

Aby odtworzyć RHIT, użyj oprogramowania do projektowania produktów 3D. Do tego projektu użyto Autodesk Inventor. Otwórz Autodesk Inventor i stwórz nową standardową część.

Zapisz plik z odpowiednim opisem. Stwórz szkic RHIT na płaszczyźnie frontowej za pomocą funkcji tworzenia szkicu 2D. Kliknij ikonę prostokąta i umieść jej lewy dolny róg w początku płaszczyzny szkicu.

Narysuj drugi prostokąt wewnątrz pierwszego, aby reprezentować okno obrazowania RHIT. Dodaj wymiary do obu prostokątów za pomocą cechy wymiarowej, zapewniając, że wszystkie długości i szerokości są odniesiene do początku i względem siebie. Dostosuj wymiary RHIT do rozmiaru myszy.

Dodaj grubość do RHIT, wybierając tylko zewnętrzny prostokąt i wyciągaj szkic narzędziem do wyciągania, aby zostawić otwór w centrum. Wybierz dolną ścianę wyciągniętego RHIT i rozpocznij nowy szkic 2D, korzystając z funkcji start 2D sketch. Narysuj prostokąt, aby określić kieszeń na termofor.

Określ wymiary prostokąta na podstawie rozmiaru i grubości podkładki grzewczej, która zostanie włożona do tego szczelina. Pomiary te powinny odpowiadać fizycznej podgrzewce, która ma być używana, aby zapewnić dokładne modelowanie temperatury ssaka. Zastosuj wymagane wymiary za pomocą funkcji wymiarowej.

Opuszczaj szkic 2D i wykonaj usuwanie materiału za pomocą narzędzia do wycinania ekstrudacji, aby stworzyć głęboką wnękę dla podkładki grzewczej. Można powiększać obraz według potrzeb, aby precyzyjnie ustawić szkic. Zacznij nowy szkic sondy temperaturowej na tej samej powierzchni co komora.

Kliknij na rozpocznij szkic 2D i wybierz ikonę koła. Umieść okrąg na powierzchni gładkiej i odpowiednio go wymierz. Wyjście z trybu szkicu.

Kliknij na wyciąganie i wybierz szkic koła. W trybie wytłaczania kliknij na tnij, wytnij i usuń materiał. Umieść okrąg po prawej stronie twarzy wraz z wkładką kieszonkową.

Nie musi być jeszcze wycentrowany. Dodaj wymiary, aby wyrównać je ze środkiem grubości RHIT. Kliknij wyciągnięć.

Pojawi się wyskakujące okienko ze strzałką pokazującą kierunek cięcia oraz opcją przejścia przez wszystko. Zaznacz wszystko, aby przeciąć cały materiał, a potem kliknij OK. Wyjście z trybu wytłaczania.

Dodaj zaokrąglenia na krawędziach okna, klikając ikonę filletu i zaznacz wszystkie osiem ostrych krawędzi. Dodaj rozmiar zaokrągłowania i wyjdź z trybu zaokrągania. Przygotuj model do druku 3D, przechodząc do zakładki środowiska i wybierając zakładkę druku 3D.

Aby wydrukować niezmodyfikowany RHIT, zaimportuj plik STL, zarówno z rysunku 1A, jak i materiałów uzupełniających, do oprogramowania do przygotowania druku 3D. Kliknij import, zaznacz plik i kliknij "przygotuj", aby pokroić model na warstwy do druku. Wybierz kompatybilną komercyjną drukarkę 3D i kliknij drukuj.

Monitoruj proces drukowania. Gdy będzie gotowe, ostrożnie usuń i wyczyść wydrukowany RHIT w razie potrzeby. Poczekaj 10 do 15 minut po wyrzuceniu, zanim rozpocznij operację i badania obrazowe.

Przygotowanie mikroskopu i wykorzystanie RHIT. Przygotuj konwencjonalny odwrócony mikroskop konfokalny do IBN wątroby, jak pokazano na rysunku 2A. Włóż adapter sceny, aby zmieścić próbkę.

Do tego protokołu zastosowano specjalnie wykonaną metalową wkładkę z okrągłym otworem 35 mm oraz szkłem pokrywy 40 mm. Dokładnie wyczyść obie strony szkła pokrywowego przed i po zdjęciu, używając 70% etanolu w razie potrzeby. Zabezpiecz odpowiedni RHIT na podstawie rozmiaru myszy taśmą, ustawiając przysłonę RHIT z obiektywem, równolegle do pokrycia obrazowania, jak pokazano na rysunku 2G, na metalowej wkładce taśmą na szybie pokrywy.

Wybierz obiektyw do obrazowania na podstawie rozmiaru obszaru, rozdzielczości przestrzennej i czasu obrazowania, na przykład obiektyw 25X na 95 stopni wody. Wypoziomuj obiektyw blisko szyby pokrywy. Przymocuj taśmą taśmę gazy na wilgotnym oknie.

To pomoże ustawić tkankę i oddzielić ją od innych narządów jamy brzusznej. Wstępnie rozgrzewany RHIT za pomocą podgrzewki umieszczonej w szczelinie i zabezpiecz sondę cieplną obok RHIT, widoczną na rysunkach 2G do H. To utrzyma temperaturę ciała myszy podczas obrazowania. Ogol sierść brzucha za pomocą maszynki do włosów i/lub kremu do usuwania włosów.

Usuń pozostałości włosów i zdezynfekuj odsłoniętą skórę 70% etanolem. W zależności od wymagań instytucjonalnych IACUC, może być stosowane naprzemienne stosowanie Betadine i etanolu, aby zapewnić odpowiednie przygotowanie miejsca operacji. Ponowne ocenenie głębokości znieczulenia przed operacją zwierzęcia.

Odsłonić wątrobę, wykonując poziome, półksiężycowe nacięcie w kształcie dwóch do trzech centymetrów pod klatką piersiową nożyczkami chirurgicznymi od ksifoidu, kończące się po lewej bocznej stronie górnej części brzucha. Po początkowym nacięciu ostrożnie wykonaj mniejsze nacięcie wtórne w warstwie mięśniowej, aby odsłonić lewy płat wątroby. Kauteryzuj w razie potrzeby, aby uniknąć krwawienia.

Zapobiegaj uszkodzeniom wątroby spowodowaną przez ciepło podczas stosowania kauteryzatora, umieszczając gazę nasączoną solą fizjologiczną między wątrobą a warstwą mięśniową, aby pochłaniała ciepło wydzielane z mięśnia. Unikaj nadmiernego krwawienia, urazów chirurgicznych lub mechanicznych, albo zewnętrznego ucisku. Po odsłonięciu wątroby przenieś mysz na etap mikroskopowy.

Ustawienie myszy na scenie mikroskopu. Ustaw odbrzuch znieczulonej myszy skierowany do dołu na platformie RHIT mikroskopu. Reguluj stożek nosa tak, aby mysz pozostawała pod znieczuleniem.

Użyj aplikatora nasączonego solą fizjologiczną z bawełnianym końcówką, aby delikatnie prowadzić lewy boczny płat wątroby do okładki, jednocześnie delikatnie wywierając zewnętrzny nacisk na klatkę piersiową. Wykorzystaj grawitację, by ostrożnie wyprowadzić wątrobę na szybę pokrywową. Użyj paska gazy, aby delikatnie oddzielić wątrobę od ciała myszy.

Sprawdź ponownie stożek nosa, aby upewnić się, że mysz pozostaje pod znieczuleniem podczas badania obrazowego. Zapobiegaj odwodnieniu tkanek, nakładając żel na bazie wody wokół krawędzi odsłoniętej jamy i unikając bezpośredniego kontaktu z termoforem. Mikroskop z zamkniętą komorą wilgotności również pomaga utrzymać temperaturę i wilgotność.

Stosuj maść okulistyczną na oczy, aby zapobiec wysuszeniu rogówki. Na koniec przygotuj timelapse IVM, aby rozpocząć obrazowanie. Otwórz migawki laserowe, oceniaj znakowanie fluorescencyjne i zidentyfikuj stabilny obszar zainteresowania z wyraźnym przepływem krwi.

Wybierz odpowiednie akwizycje obrazu, w tym format, szybkość, interwały obrazowania oraz długość czasu, średnią klatki itd. Zdefiniuj górną i dolną granicę dla stosów Z, jeśli jest to konieczne, i rozpocznij nagrywanie timelapse. Aby zweryfikować nasz protokół, zmierzyliśmy stabilność obrazu za pomocą indeksu podobieństwa strukturalnego, czyli SIM, pokazanego na rysunku 3D.

SIM porównuje dwa obrazy na podstawie luminancji, kontrastu i wzorców strukturalnych. Wartość jeden oznacza doskonałe podobieństwo, natomiast zero odzwierciedla zniekształcenie. Rysunek 3C pokazuje, że RHIT konsekwentnie generuje najwyższe wartości SIM, nawet do 50 razy więcej niż brak insert, co świadczy o lepszej jakości obrazu.

Na obrazach oznaczonych A do C porównaliśmy IVM wątroby bez stabilizatora, z kartonowym wkładem oraz z RHIT. RHIT utrzymuje wyraźną rozdzielczość kropelek lipidowych w magentie, jąder zielonych oraz naczynia w cyjanie. Czarno-białe wstawki podkreślają stabilność obrazu.

RHIT umożliwił także długoterminowe działanie IBM u otyłych myszy przez ponad osiem godzin, co pokazano w pierwszym filmie. Wyniki te potwierdziły, że RHIT znacząco poprawia jakość obrazowania i powtarzalność w różnych warunkach. Razem RHIT upraszcza złożoną konfigurację tradycyjnie wymaganą dla IBM z wątrobą, poprawiając zarówno powtarzalność, jak i dostępność.

To podejście przewiduje szerszy trend w kierunku wykorzystania druku 3D do standaryzacji zaawansowanych protokołów obrazowania. Poza obrazowaniem wątroby, zasady projektowania RHIT mogą być rozszerzone na inne zastosowania, w tym tomografię narządów, naukę o materiałach oraz inżynierię, gdzie stabilność ruchu jest kluczowa dla wierności obrazu.