Name: Wielokrotnego użytku narzędzie do obrazowania wątroby: wielokrotnego użytku narzędzie drukowane w 3D do mikroskopii śródżyciowej wątroby (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2026-03-17T13:25:00.000+00:00
Duration: 11 min 29 s
Description: Poznaj wielokrotnego użytku narzędzie RHIT do mikroskopii śródżyciowej wątroby u myszy. To drukowane w 3D urządzenie poprawia stabilność tkanek i umożliwia długotrwałą obserwację procesów metabolicznych w wysokiej rozdzielczości.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Prace te były wspierane przez Intramural Research Program w US National Institutes of Health, National Cancer Institute oraz bibliotekę NIH. H. Sanchez Cornejo dziękuje peruwiańskiej agencji CONCYTEC za wsparcie finansowe w formie grantu nr PE501087367-2024-PROCIENCIA. Chcemy podziękować członkom laboratorium Porat-Shliom oraz współpracownikom grupy fizyki kwantowej na Uniwersytecie Cambridge za krytyczną lekturę, pracownikom biblioteki NIH oraz Geneti Gaga za pomoc techniczną. Obraz wyrenderowany 3D na Rysunku 2A został stworzony za pomocą Biorender.

Autorzy nie mają żadnych konfliktów interesów do zgłoszenia.

Mikroskopia wewnątrzżyciowa wątroby była szeroko badana, jednak wcześniejsze metody często wymagały wysoce inwazyjnych i niestandaryzowanych zabiegów chirurgicznych w celu stabilizowanego obrazowania końcowego 5,6,7,9,31,32. Ruch jest prawdopodobnie najtrudniejszą barierą uniemożliwiającą powtarzalne obrazowanie w wątrobowym ...

Mikroskopia śródżytna to potężne narzędzie do dynamicznej wizualizacji procesów biologicznych in vivo 1,2,3, w przeciwieństwie do tradycyjnej histologii immunofluorescencji z uwarunkowaniem obrazowania tkanek lub żywych komórek oraz analizą cytometrii przepływowej izolowanych komórek. Do badań wątroby zastosowano IVM do badania wydzieliny żółcii przepływu 4,5, mobilizacji glukozy 6,7, komórek nieprzyprzyprzyzębnych 8,9,10 oraz chorób wątroby11,12. Co więcej, w zakresie badań nad akumulacją lipidów, IVM umożliwia w czasie rzeczywistym informacje o dynamice powstawania, wzrostu i degradacji kropelek lipidowych w żywych tkankach, takich jak wizualizacja i ilościowa ilościowa analiza kropelek lipidowych o wysokiej rozdzielczości przestrzennej, a także bezpośrednia korelacja akumulacji kropelek lipidowych z innymi procesami komórkowymi i fizjologicznymi13. Pomimo tych zalet, IVM wciąż stanowi wyzwanie techniczne: wymaga specjalistycznego sprzętui wiedzy, może powodować uszkodzenia tkanek, zmieniać zachowanie komórkowe i wymagać inwazyjnych zabiegów. Tradycyjne badania in vivo opierające się na obserwacji behawioralnej, monitorowaniu fizjologii i analizie genetycznej dostarczają cennych informacji, ale nie mają przestrzennej i czasowej rozdzielczości oferowanej przez mikroskopię śródżyciową.
Pierwszym poważnym wyzwaniem IVM jest kontrola niestabilności artefaktów spowodowanej biciem serca i oddychaniem badanych zwierząt, co może obniżyć jakość obrazu, skutkując zamazanymi lub zniekształconymi obrazami obserwowanych procesów biologicznych15. Próby korekty tego za pomocą przetwarzania obrazu często skutkują utratą ważnych informacji przestrzennych i czasowych lub wymaganiem zaawansowanego sprzętu chirurgicznego i konserwacji16,17. Po drugie, modele mysie do badań chorób wątroby, takie jak MAFLD i T2D, często są otyłe i dlatego trudniejsze do stabilizacji ze względu na zwiększony rozmiar i zawartość lipidów tkanek16,18. W otyłych modelach myszy NAFLD i T2D wzrost masy ciała stanowi mechaniczne wyzwania dla obrazowania wewnątrzżyciowego poprzez przekraczanie nośności standardowych etapów mikroskopu i utrudnianie stabilizacji zwierząt19. Ta dodatkowa masa zwiększa ryzyko artefaktów ruchu i kompresji tkanek, które oba upośledzają precyzję obrazowania20.
Jednocześnie podwyższona zawartość lipidów wątroby zwiększa nieprzezroczystość tkanek i rozpraszanie światła, co pogarsza rozdzielczość obrazu i kontrast. Efekty te często potęgują współistniejące choroby metaboliczne, takie jak zmienione przeciekanie i stan zapalny, co dodatkowo zmniejsza rozmieszczenie barwnika i klarowność sygnału21. Wreszcie, utrzymanie stałej temperatury ciała podczas obrazowania, aby utrzymać fizjologię tkanek i aktywność biologiczną, może być trudne i utrudniać powtarzalność. Ponadto stabilne ustawienie wątroby na etapie mikroskopu podczas IVM jest kluczowe, aby zapobiec naprężeniom mechanicznym lub uszkodzeniom tkanek7. Odsłonięcie tkanki wątroby to delikatny zabieg, który wymaga precyzji technicznej, aby zapobiec silnemu krwawieniu i uszkodzeniu miąższu wątroby7. Aby ograniczyć artefakty ruchu, klatka piersiowa myszy była wcześniej podnoszona ze sceny mikroskopu za pomocą kartonu, co pozwoliło grawitacji odciągnąć wątrobę od reszty ciała22. Chociaż to podejście okazało się skuteczne w generowaniu danych mierzalnych, materiał kartonowy jest nie do utrzymania, ponieważ traci kształt i jest trudny do czyszczenia. Dodatkowo trudno jest zmienić wymiary kartonowej wkładki, aby dostosować je do modeli myszy z otyłością.
W ostatnich latach pojawiło się kilka zaawansowanych technik mikroskopii wewnątrzżyciowej wątroby, w tym skaningowa mikroskopia pola świetlnego oraz komputerowo ulepszone systemy optyczne, które wykazały poprawę rozdzielczości przestrzenno-czasowej23, obniżonej fototoksyczności24, większej głębi obrazowania25,26 oraz tłumienia artefaktów ruchu27. Te zmiany, co potwierdzają najnowsze badania28, 29, 30, stanowią istotny postęp technologiczny w tej dziedzinie. Niniejszy artykuł przedstawia narzędzie do obrazowania wątroby wielokrotnego użytku (RHIT), innowacyjne narzędzie do IVM wątroby myszy. RHIT przyczynia się do ewoluującego krajobrazu, oferując skalowalne i wielokrotnego użytku narzędzie, które zwiększa stabilność mechaniczną oraz dostępność tkanek w różnych modelach zwierzęcych, w tym tych z chorobami metabolicznymi. Jego projekt odpowiada na uporczywe wyzwania związane z ruchem, zmiennością i złożonością ustawienia, integrując dopasowanie anatomiczne, powtarzalność aranżacji oraz łatwość obsługi. Kompatybilność RHIT-a zarówno z konwencjonalnymi, jak i zaawansowanymi metodami obrazowania, zwiększa użyteczność tych nowych technik, wspierając niezawodne i fizjologicznie stabilne obrazowanie wewnątrzżyciowe wątroby.
Chociaż zaproponowano różne metody stabilizacji tkanki podczas IVM, takie jak oknochirurgiczne 9,31,32,33,34,35,36 oraz specjalnie złożony etap akrylowy 6,37, te metody wprowadzają również liczne ograniczenia i złożoności dotyczące skalowalności, powtarzalności i umiejętności chirurgicznych. W porównaniu z tym RHIT jest funkcjonalnie odrębny pod względem przeznaczenia i konstrukcji. Nie opiera się na bezpośredniej kompresji ani osadzaniu na bazie żelu38. Zamiast tego RHIT pełni rolę skalowalnego, wielokrotnego użytku, anatomicznie konturowanego narzędzia, które wspiera izolację wątroby poprzez pozycjonowanie grawitacyjne, utrzymując orientację fizjologiczną bez ograniczania lub zniekształcania tkanki. Co istotne, RHIT poprawia powtarzalność danych, wierność obrazowaniu oraz spójność proceduralną w szerokim zakresie rozmiarów myszy. Eliminuje to potrzebę stosowania żeli, klejów czy skomplikowanych interfejsów chirurgicznych, jednocześnie upraszczając ustawienie tkanek i kontrolę temperatury. Ponadto RHIT to specjalistyczne narzędzie łączące zwierzęta z mikroskopem, zaprojektowane tak, aby wspierać zarówno wsparcie fizjologiczne, jak i precyzję obrazowania.
RHIT bezpośrednio odpowiada na mechaniczne i optyczne wyzwania modeli o metabolicznych uszkodzeniach dzięki skalowalnej geometrii, która pozwala na większe rozmiary zwierząt i równomiernie rozkłada masę, minimalizując niestabilność platformy. Osłona wątroby stabilizuje tkankę za pomocą grawitacji bez nacisku, umożliwiając stały dostęp i zmniejszając ruch podczas obrazowania. Jego wielokrotnego użytku, chemicznie obojętny projekt zapewnia kompatybilność z tkankami biologicznymi, jednocześnie wspierając higieniczne ponowne użycie. Dzięki konsekwentnemu pozycjonowaniu, minimalizacji artefaktów ruchu i utrzymaniu integralności tkanek, RHIT zapewnia fundamentalny postęp w procesach pracy mikroskopii śródkluczowej. Jego elastyczność i dostępność w otwartym kodzie dodatkowo promują szeroką użyteczność w laboratoriach i modelach zwierzęcych, ustanawiając nowy standard dla narzędzi obrazowania wspierających zarówno próbkę, jak i system obrazowania.
Ponadto komercyjnie dostępne podgrzewane sceny mikroskopu mogą wymagać zaawansowanych ustawień mikroskopu i obsługi39. Nie są skalowalne do samego okazu i zazwyczaj są droższe, przez co dla wielu badaczy są mniej dostępne. Dlatego ważna jest wielokrotnego użytku, skalowalna wkładka, aby ustandaryzować IVM dla różnych modeli zwierzęcych. Technologia druku 3D, nazywana także produkcją addytywną, zyskuje coraz większą popularność w laboratoriach naukowych, przekształcając protokoły laboratoryjne biochemiczne, fizyczne i biologiczne. W przypadku IVM technologia 3D została wykorzystana do produkcji lekkich obrazujących optycznych okien41,42, poprawy dostępności tkanek43 oraz ułatwienia naprawy i rekonstrukcji tkanek44. Dlatego spersonalizowane narzędzie stabilizacji tkanek, które, o ile nam wiadomo, nie zostało jeszcze opisane, stanowi doskonałą okazję do wykorzystania druku 3D w celu pokonania niektórych wyzwań związanych z wątrobową IVM.
RHIT powstaje przy użyciu jednoetapowej metody druku 3D i znacząco poprawia stabilizację tkanek przez dłuższy czas. RHIT jest bardzo dostępny i nadaje się do ostrych eksperymentów IVM, które wymagają minimalnej wiedzy chirurgicznej. Ponadto RHIT jest łatwo skalowalny do rozmiaru zwierzęcia i ma niskie koszty produkcji. Na koniec wykazujemy, że RHIT umożliwia stabilne obrazowanie fluorescencyjne poklatkowe i poprawia stabilność tkanek w porównaniu z wcześniej używaną wkładką kartonową. RHIT upraszcza IVM homeostazy lipidów wątrobowych bez bezpośredniego kontaktu lub mierzalnego wpływu na warunki fizjologiczne. W konsekwencji RHIT stanowi przewagę konkurencyjną jako przyspieszony, wielokrotnego użytku i elastyczny wkład w IVM 34,36,45.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68337/68337fig1.jpg" /> 
Rysunek 1: Projekt RHIT. (A) Projekt i wymiary 3,0 mm RHIT w skali dla myszy otyłej. Widok enface (po lewej) pokazuje wymiary, pozycję i rozmiar otworu tkankowego, a także orientację myszy podczas obrazowania. Widok z boku (po prawej) zawiera wymiary i wskazuje położenie podkładki grzewczej oraz wkładki do pomiaru temperatury. Parametry skalowania dla różnych rozmiarów myszy przedstawiono w Tabeli 1. (B) 3D widok RHIT wygenerowany z otwartoźródłowego pliku STL, pokazujący, gdzie przewód sondy odbytniczej jest włożony przez niestandardowy port (wymiary wkładki sondy odbytniczej pokazane w prawym górnym rogu). (C) Montaż techniczny RHIT pokazujący integrację urządzenia grzewczego i niestandardowych wkładek konstrukcyjnych dla różnych rozmiarów RHIT, przewód jest montowany w wkładce do sondy odbytniczej dla dostępu do sondy temperatury. Skrót: RHIT = Wielokrotnego użytku narzędzie do obrazowania wątroby. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68337/68337fig1large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.</a>
RHIT został pierwotnie zaprojektowany jako jednoczęściowy zespół z wykorzystością ABS (akrylonitryl butadienowy styren), szeroko stosowanego polimeru termoplastycznego w modelowaniu osadzonym (3D) drukowanym45. ABS oferuje kilka zalet w tym zastosowaniu: jest lekki, odporny na wysoką temperaturę (temperatura topnienia ~200 °C) oraz dobrą odporność na uderzenia 46,47,48. Konstrukcja RHIT-a wykorzystuje regulowalną gęstość ABS, pozwalając mu pochłaniać ruchy fizjologiczne, takie jak tętno i oddychanie. Zwiększona gęstość wypełnienia poprawia tłumienie ruchu, co skutkuje większą stabilnością obrazu i poprawą jakości obrazu.
RHIT został zaprojektowany tak, aby pochłaniać ruch poprzez regulacje gęstości chemicznie obojętnego materiału, takiego jak ABS. W tym kontekście gęstość odnosi się konkretnie do wewnętrznego procentu wypełnienia używanego podczas druku 3D, co wpływa na sztywność i zdolność platformy do tłumienia drgań 49,50,51. Zaobserwowano, że zwiększenie gęstości ABS zmniejsza transmisję ruchu spowodowaną biciem serca i oddychaniem, co daje stabilną platformę do obrazowania i poprawia jakość obrazu. Testowaliśmy konstrukty RHIT o zmiennej gęstości wypełnienia wewnętrznego (20-100%) i zaobserwowaliśmy jakościowo, że konfiguracje o wyższej gęstości prowadziły do widocznego zmniejszenia artefaktów ruchu podczas obrazowania wewnątrzżyciowego wątroby u myszy. Formalna ilościfikacja nie została przeprowadzona, ponieważ konfiguracja o wysokiej gęstości okazała się wystarczająco solidna i skuteczna we wszystkich testowanych rozmiarach RHIT oraz konsekwentnie zapewniała niezawodne działanie w warunkach rutynowych obrazowania. Dla większości użytkowników ta domyślna gęstość będzie odpowiednia bez dalszych regulacji. Jednak w przypadku eksperymentów wymagających określonych cech mechanicznych można modyfikować gęstość wypełnienia i parametry projektowe, a pełne instrukcje druku 3D wspierają takie dostosowywanie.
Do druku można stosować alternatywne materiały; jednak ABS jest preferowanym materiałem do produkcji RHIT, ponieważ oferuje kilka kluczowych zalet. Jest chemicznie obojętny, minimalizując ryzyko interakcji z tkankami lub płynami ustrojowymi, oraz nierozpuszczalny w wodzie, co umożliwia efektywne czyszczenie, przechowywanie i ponowne użycie. Te właściwości czynią ABS niezawodnym i trwałym wyborem do zastosowań eksperymentalnych. Gdy dostęp do drukarki modelującej z osadzeniem jest ograniczony, można stosować inne techniki i materiały druku 3D. Stereolitografia, selektywne spiekanie laserowe oraz wielostrumieniowe fuzje to odpowiednie opcje z materiałami takimi jak nylon, żywice fotopolimerowe czy proszki kompozytowe. Nylon zapewnia trwałość i elastyczność, podczas gdy żywice stereolitograficzne oferują wysoką rozdzielczość do zastosowań wymagających drobnych szczegółów konstrukcyjnych. Projekt RHIT można łatwo dostosować do tolerancji i ograniczeń różnych materiałów, co sprawia, że jest kompatybilny z różnymi platformami drukarskimi. Użytkownicy powinni wybierać materiały na podstawie stabilności mechanicznej, biokompatybilności, kompatybilności z procesami obrazowania oraz dostępnych zasobów drukarskich.

<table><tbody><tr><td>Taśma maskująca &frac12;calowa</td><td>Taśma maskująca 3M uniwersalna:</td><td>b40069428</td><td></td></tr><tr><td>Pokrywki 40 mm</td><td>Bioptech</td><td>40-1313-03191</td><td></td></tr><tr><td>70% (v/v) etanolu</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BP2818-4</td><td>70% etanolu objętościowo i 30% wody objętościowej</td></tr><tr><td>Aparat do znieczulenia: AMD 3 Plus</td><td>Somni</td><td>AMD-17106</td><td></td></tr><tr><td>Żel transmisji ultradźwiękowej Aquasonic 100</td><td>Laboratoria Parkera</td><td>&nbsp; 01 08</td><td></td></tr><tr><td>BODIPY 665/67</td><td>Thermo Fisher Scientific (Invitrogen)</td><td>B3932</td><td>Zobacz Tabelę 2</td></tr><tr><td>Oprogramowanie CAD (Autodesk Inventor lub odpowiednik) &nbsp;</td><td>Autodesk (reprezentatywne oprogramowanie CAD)</td><td>Nie ma</td><td>Oprogramowanie</td></tr><tr><td>System kauterii</td><td>Gemini</td><td>GEM 5917</td><td></td></tr><tr><td>Środek dezynfekuujący Clidox</td><td>Pharmacal Research Laboratories Inc.</td><td>VWR, MSPP-96118F</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop konfokalny (Leica SP8 lub odpowiednik)</td><td>Leica</td><td>SP8</td><td></td></tr><tr><td>Aplikatory z bawełnianymi końcówkami</td><td>Puritańskie Produkty Medyczne</td><td>25-806 1WC</td><td></td></tr><tr><td>Niestandardowa aluminiowa wkładka sceniczna (3 mm grubości, 35 mm wgłębienia)</td><td>Nie ma</td><td>Nie ma</td><td></td></tr><tr><td>FORANE (izofluran, USP) płyn do inhalacji, 250 mL</td><td>Baxter</td><td>10019-360-60</td><td></td></tr><tr><td>Maszynka do strzyżenia włosów (opcjonalnie)</td><td>Onyx Fine Instruments</td><td>ASWRHC</td><td></td></tr><tr><td>Poduszka grzewcza z sondą odbytniczą</td><td>Instrumenty naukowe ALA</td><td>PODKŁADKA GRZEWCZA-1/2</td><td></td></tr><tr><td>Heparyna sodowa, 1000 USP U/mL</td><td>Hikma</td><td>0641-0391-12</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Thermo Fisher Scientific (Invitrogen)</td><td>62249</td><td>Zobacz Tabelę 2</td></tr><tr><td>Podkładka grzewcza do myszy</td><td>Instrumenty naukowe ALA</td><td>PODKŁADKA GRZEWCZA-1/2</td><td></td></tr><tr><td>Mus musculus</td><td>Laboratorium Jacksona</td><td>C57BL/6</td><td>Mysz laboratoryjna</td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna (0,9% chlorku sodu)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>7210-16</td><td></td></tr><tr><td>RHIT (Reuseable Hepatic Imaging Tool) – odpowiedni rozmiar</td><td>Dostarczone</td><td>Nie ma</td><td>Zobacz Tabelę 1</td></tr><tr><td>Szczypce chirurgiczne, zakrzywiony koniec</td><td>Narzędzia Nauki Ścisłej</td><td>11251-23</td><td></td></tr><tr><td>Gaza chirurgiczna</td><td>McKesson</td><td>6939</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki chirurgiczne</td><td>Narzędzia Nauki Ścisłej</td><td>14001-14</td><td></td></tr><tr><td>Tetrametylorodamina Dextran</td><td>Thermo Fisher Scientific (Invitrogen)</td><td>D7139</td><td>Zobacz Tabelę 2</td></tr><tr><td>Ultra Fine Strzykawki U-100 Insuliny, 31 g</td><td>Betty Mills</td><td>BD326730</td><td></td></tr></tbody></table>

wielokrotnego użytku narzędzie do obrazowania wątroby: wielokrotnego użytku narzędzie drukowane w 3d do mikroskopii śródżyciowej wątroby

Reusable Hepatic Imaging Tool: A Reusable 3D-Printed Tool for Hepatic Intravital Microscopy

Funkcję i dysfunkcję wątroby można ocenić, bezpośrednio wizualizując dynamiczne procesy wątroby za pomocą mikroskopii śródżyciowej opartej na konfokalnej (IVM). W szczególności można osiągnąć doskonałą precyzję przestrzenną i czasową przy wydobyciu zarówno informacji jakościowych, jak i ilościowych. Na etapie mikroskopu utrzymanie warunków tkanek fizjologicznych przy jednoczesnym osiągnięciu stabilności i powtarzalności pozostaje wyzwaniem. Wzrost masy ciała i zawartość lipidów wątrobowych mają negatywny wpływ na ten proces w zwierzęcych modelach cukrzycy typu II (T2D) oraz niealkoholowej stłuszczeniowej choroby wątroby (MAFLD). Aby przezwyciężyć te ograniczenia, stworzyliśmy RHIT, rewolucyjny projekt instrumentu obrazowania, który poprawia dostęp i stabilność tkanek. RHIT to wielokrotnego użytku, skalowalne urządzenie do obrazowania wątroby produkowane przy użyciu druku 3D w efektywnej, jednostopniowej metodzie. Jego wymiary mogą być zmieniane, aby pasować do myszy o różnych rozmiarach. W skrócie, RHIT to urządzenie drukowane w 3D do pozycjonowania i stabilizacji zwierząt laboratoryjnych podczas mikroskopii wewnątrzżyciowej wątroby, stosowane po krótkim przygotowaniu chirurgicznym w celu minimalizacji manipulacji, stresu i zmienności. Jego wielorazowy, standaryzowany projekt jest łatwy do produkcji i personalizacji, wspierając różne rozmiary i potencjalne projekty eksperymentalne. Wstępne wyniki wykazują znaczącą poprawę stabilności i niezawodności obrazowania wewnątrzżyciowego wątroby, umożliwiając szczegółową wizualizację struktur podkomórkowych, takich jak krople lipidowe. Ta zwiększona precyzja ułatwia badania metaboliczne i fizjologiczne z lepszą przejrzystością, powtarzalnością i potencjałem do projektowania podłużnego. Protokół oferuje ustandaryzowane, dostępne podejście, które odpowiada na długoletnie wyzwania techniczne związane z terapią IVM wątroby.

RHIT został zaprojektowany przy użyciu aplikacji CAD (Rysunek 1). Wymiary RHIT są skalowane, aby uwzględnić małe, średnie i duże myszy (Tabela 1). Projekt RHIT składa się z płaskiego materiału ABS o długości 107,50 mm z otworem dostosowanym do obrazowania wątroby. IVM wykonywano w warunkach optymalnych (RHIT) i suboptymalnych (bez wkładek lub kartonu) (patrz Rysunek 3A-C). To ilustruje zakres możliwych wyników oraz stopień stabi...

Protokół ten wprowadza nowoczesne, wielokrotnego użytku narzędzie do obrazowania wątroby (RHIT) do mikroskopii śródżyciowej (IVM) żywych myszy, które zwiększa stabilność tkanek podczas szybkich i ostrych eksperymentów. Konstrukcja RHIT, drukowana w 3D, oferuje opłacalną produkcję, skalowalność i wszechstronność, umożliwiając długotrwałą obserwację procesów metabolicznych u myszy o różnych rozmiarach.

Wielokrotnego użytku narzędzie do obrazowania wątroby: wielokrotnego użytku narzędzie drukowane w 3D do mikroskopii śródżyciowej wątroby

Hepatic function and dysfunction can be assessed by directly visualizing the dynamic processes of the liver using confocal-based intravital microscopy ...

Głównym celem tej procedury jest pokazanie Narzędzia Obrazowania Wątroby wielokrotnego użytku, czyli RHIT, jako przełomowego narzędzia do pozyskiwania wysokiej jakości, dynamicznych danych biologicznych, zwłaszcza w badaniach nad wątrobą. Tradycyjne metody naukowe badania myszy w eksperymentach kontrolowanych od dawna opierają się na obserwacji behawioralnej, monitoringu fizjologii oraz analizie genetycznej. Złożoność tych badań często skutkuje niespójnymi lub ograniczonymi wynikami danych.Wiele eksperymentów opiera się na danych, które są albo niekompletne, albo trudne do interpretacji, takie jak krótkie błyski obrazów o niskiej rozdzielczości, które szybko zanikają, co utrudnia uchwycenie długoterminowych trendów lub subtelnych zmian. Wprowadzamy RHIT, umożliwiające dynamiczne, wysokorozdzielcze przechwytywanie badań nad wątrobą i poza nimi. Technika, którą demonstrujemy, umożliwia wytwarzanie niestandardowych narzędzi obrazowania z wykorzystaniem dostępnych materiałów i szeroko dostępnych technologii druku 3D.Zaprojektowane do użytku w środowiskach akademickich i o ograniczonych zasobach, to podejście umożliwia szybkie rozwijanie i wdrażanie urządzeń obsługujących obrazowanie in vivo o wysokiej rozdzielczości. Nasze wielokrotnego użytku narzędzie obrazowania wątroby, czyli RHIT, zostało opracowane w celu poprawy stabilności tkanek podczas mikroskopii śródwitalnej wątroby. Modułowa konstrukcja RHIT-a umożliwia myszy o różnych rozmiarach i umożliwia rozszerzone obrazowanie dynamicznych procesów metabolicznych przy minimalnych zakłóceniach fizjologicznych.RHIT jest wytwarzany w jednym etapie z użyciem akrylonitrylu, butadienu, styrenu, ABS, termoplastu wybranego ze względu na lekkość, termostabilność i trwałość mechaniczną. Poprzez regulację gęstości materiału RHIT skutecznie pochłania ruch wywołany przez oddychanie i bicie serca, co zmniejsza artefakty obrazu i zwiększa klarowność. Chemiczna bezwładność ABS i nierozpuszczalność w wodzie zapewniają dostępność z tkankami biologicznymi oraz umożliwiają efektywne czyszczenie i ponowne użycie.Aby odtworzyć RHIT, użyj oprogramowania do projektowania produktów 3D. Do tego projektu użyto Autodesk Inventor. Otwórz Autodesk Inventor i stwórz nową standardową część.Zapisz plik z odpowiednim opisem. Stwórz szkic RHIT na płaszczyźnie frontowej za pomocą funkcji tworzenia szkicu 2D. Kliknij ikonę prostokąta i umieść jej lewy dolny róg w początku płaszczyzny szkicu.Narysuj drugi prostokąt wewnątrz pierwszego, aby reprezentować okno obrazowania RHIT. Dodaj wymiary do obu prostokątów za pomocą cechy wymiarowej, zapewniając, że wszystkie długości i szerokości są odniesiene do początku i względem siebie. Dostosuj wymiary RHIT do rozmiaru myszy.Dodaj grubość do RHIT, wybierając tylko zewnętrzny prostokąt i wyciągaj szkic narzędziem do wyciągania, aby zostawić otwór w centrum. Wybierz dolną ścianę wyciągniętego RHIT i rozpocznij nowy szkic 2D, korzystając z funkcji start 2D sketch. Narysuj prostokąt, aby określić kieszeń na termofor.Określ wymiary prostokąta na podstawie rozmiaru i grubości podkładki grzewczej, która zostanie włożona do tego szczelina. Pomiary te powinny odpowiadać fizycznej podgrzewce, która ma być używana, aby zapewnić dokładne modelowanie temperatury ssaka. Zastosuj wymagane wymiary za pomocą funkcji wymiarowej.Opuszczaj szkic 2D i wykonaj usuwanie materiału za pomocą narzędzia do wycinania ekstrudacji, aby stworzyć głęboką wnękę dla podkładki grzewczej. Można powiększać obraz według potrzeb, aby precyzyjnie ustawić szkic. Zacznij nowy szkic sondy temperaturowej na tej samej powierzchni co komora.Kliknij na rozpocznij szkic 2D i wybierz ikonę koła. Umieść okrąg na powierzchni gładkiej i odpowiednio go wymierz. Wyjście z trybu szkicu.Kliknij na wyciąganie i wybierz szkic koła. W trybie wytłaczania kliknij na tnij, wytnij i usuń materiał. Umieść okrąg po prawej stronie twarzy wraz z wkładką kieszonkową.Nie musi być jeszcze wycentrowany. Dodaj wymiary, aby wyrównać je ze środkiem grubości RHIT. Kliknij wyciągnięć.Pojawi się wyskakujące okienko ze strzałką pokazującą kierunek cięcia oraz opcją przejścia przez wszystko. Zaznacz wszystko, aby przeciąć cały materiał, a potem kliknij OK. Wyjście z trybu wytłaczania.Dodaj zaokrąglenia na krawędziach okna, klikając ikonę filletu i zaznacz wszystkie osiem ostrych krawędzi. Dodaj rozmiar zaokrągłowania i wyjdź z trybu zaokrągania. Przygotuj model do druku 3D, przechodząc do zakładki środowiska i wybierając zakładkę druku 3D.Aby wydrukować niezmodyfikowany RHIT, zaimportuj plik STL, zarówno z rysunku 1A, jak i materiałów uzupełniających, do oprogramowania do przygotowania druku 3D. Kliknij import, zaznacz plik i kliknij "przygotuj", aby pokroić model na warstwy do druku. Wybierz kompatybilną komercyjną drukarkę 3D i kliknij drukuj.Monitoruj proces drukowania. Gdy będzie gotowe, ostrożnie usuń i wyczyść wydrukowany RHIT w razie potrzeby. Poczekaj 10 do 15 minut po wyrzuceniu, zanim rozpocznij operację i badania obrazowe.Przygotowanie mikroskopu i wykorzystanie RHIT. Przygotuj konwencjonalny odwrócony mikroskop konfokalny do IBN wątroby, jak pokazano na rysunku 2A. Włóż adapter sceny, aby zmieścić próbkę.Do tego protokołu zastosowano specjalnie wykonaną metalową wkładkę z okrągłym otworem 35 mm oraz szkłem pokrywy 40 mm. Dokładnie wyczyść obie strony szkła pokrywowego przed i po zdjęciu, używając 70% etanolu w razie potrzeby. Zabezpiecz odpowiedni RHIT na podstawie rozmiaru myszy taśmą, ustawiając przysłonę RHIT z obiektywem, równolegle do pokrycia obrazowania, jak pokazano na rysunku 2G, na metalowej wkładce taśmą na szybie pokrywy.Wybierz obiektyw do obrazowania na podstawie rozmiaru obszaru, rozdzielczości przestrzennej i czasu obrazowania, na przykład obiektyw 25X na 95 stopni wody. Wypoziomuj obiektyw blisko szyby pokrywy. Przymocuj taśmą taśmę gazy na wilgotnym oknie.To pomoże ustawić tkankę i oddzielić ją od innych narządów jamy brzusznej. Wstępnie rozgrzewany RHIT za pomocą podgrzewki umieszczonej w szczelinie i zabezpiecz sondę cieplną obok RHIT, widoczną na rysunkach 2G do H. To utrzyma temperaturę ciała myszy podczas obrazowania. Ogol sierść brzucha za pomocą maszynki do włosów i/lub kremu do usuwania włosów.Usuń pozostałości włosów i zdezynfekuj odsłoniętą skórę 70% etanolem. W zależności od wymagań instytucjonalnych IACUC, może być stosowane naprzemienne stosowanie Betadine i etanolu, aby zapewnić odpowiednie przygotowanie miejsca operacji. Ponowne ocenenie głębokości znieczulenia przed operacją zwierzęcia.Odsłonić wątrobę, wykonując poziome, półksiężycowe nacięcie w kształcie dwóch do trzech centymetrów pod klatką piersiową nożyczkami chirurgicznymi od ksifoidu, kończące się po lewej bocznej stronie górnej części brzucha. Po początkowym nacięciu ostrożnie wykonaj mniejsze nacięcie wtórne w warstwie mięśniowej, aby odsłonić lewy płat wątroby. Kauteryzuj w razie potrzeby, aby uniknąć krwawienia.Zapobiegaj uszkodzeniom wątroby spowodowaną przez ciepło podczas stosowania kauteryzatora, umieszczając gazę nasączoną solą fizjologiczną między wątrobą a warstwą mięśniową, aby pochłaniała ciepło wydzielane z mięśnia. Unikaj nadmiernego krwawienia, urazów chirurgicznych lub mechanicznych, albo zewnętrznego ucisku. Po odsłonięciu wątroby przenieś mysz na etap mikroskopowy.Ustawienie myszy na scenie mikroskopu. Ustaw odbrzuch znieczulonej myszy skierowany do dołu na platformie RHIT mikroskopu. Reguluj stożek nosa tak, aby mysz pozostawała pod znieczuleniem.Użyj aplikatora nasączonego solą fizjologiczną z bawełnianym końcówką, aby delikatnie prowadzić lewy boczny płat wątroby do okładki, jednocześnie delikatnie wywierając zewnętrzny nacisk na klatkę piersiową. Wykorzystaj grawitację, by ostrożnie wyprowadzić wątrobę na szybę pokrywową. Użyj paska gazy, aby delikatnie oddzielić wątrobę od ciała myszy.Sprawdź ponownie stożek nosa, aby upewnić się, że mysz pozostaje pod znieczuleniem podczas badania obrazowego. Zapobiegaj odwodnieniu tkanek, nakładając żel na bazie wody wokół krawędzi odsłoniętej jamy i unikając bezpośredniego kontaktu z termoforem. Mikroskop z zamkniętą komorą wilgotności również pomaga utrzymać temperaturę i wilgotność.Stosuj maść okulistyczną na oczy, aby zapobiec wysuszeniu rogówki. Na koniec przygotuj timelapse IVM, aby rozpocząć obrazowanie. Otwórz migawki laserowe, oceniaj znakowanie fluorescencyjne i zidentyfikuj stabilny obszar zainteresowania z wyraźnym przepływem krwi.Wybierz odpowiednie akwizycje obrazu, w tym format, szybkość, interwały obrazowania oraz długość czasu, średnią klatki itd. Zdefiniuj górną i dolną granicę dla stosów Z, jeśli jest to konieczne, i rozpocznij nagrywanie timelapse. Aby zweryfikować nasz protokół, zmierzyliśmy stabilność obrazu za pomocą indeksu podobieństwa strukturalnego, czyli SIM, pokazanego na rysunku 3D.SIM porównuje dwa obrazy na podstawie luminancji, kontrastu i wzorców strukturalnych. Wartość jeden oznacza doskonałe podobieństwo, natomiast zero odzwierciedla zniekształcenie. Rysunek 3C pokazuje, że RHIT konsekwentnie generuje najwyższe wartości SIM, nawet do 50 razy więcej niż brak insert, co świadczy o lepszej jakości obrazu.Na obrazach oznaczonych A do C porównaliśmy IVM wątroby bez stabilizatora, z kartonowym wkładem oraz z RHIT. RHIT utrzymuje wyraźną rozdzielczość kropelek lipidowych w magentie, jąder zielonych oraz naczynia w cyjanie. Czarno-białe wstawki podkreślają stabilność obrazu.RHIT umożliwił także długoterminowe działanie IBM u otyłych myszy przez ponad osiem godzin, co pokazano w pierwszym filmie. Wyniki te potwierdziły, że RHIT znacząco poprawia jakość obrazowania i powtarzalność w różnych warunkach. Razem RHIT upraszcza złożoną konfigurację tradycyjnie wymaganą dla IBM z wątrobą, poprawiając zarówno powtarzalność, jak i dostępność.To podejście przewiduje szerszy trend w kierunku wykorzystania druku 3D do standaryzacji zaawansowanych protokołów obrazowania. Poza obrazowaniem wątroby, zasady projektowania RHIT mogą być rozszerzone na inne zastosowania, w tym tomografię narządów, naukę o materiałach oraz inżynierię, gdzie stabilność ruchu jest kluczowa dla wierności obrazu.

reusable-hepatic-imaging-tool-reusable-3d-printed-tool-for-hepatic

Research

JoVE Journal

Engineering

Inżynieria

Opisano metodę wizualizacji i kwantyfikacji trójwymiarowej struktury żyły wrotnej wątroby myszy lub wewnątrzwątrobowych przewodów żółciowych. Tę technikę odlewu żywicznego można zastosować również do innych układów przewodowych lub naczyniowych, co umożliwia wizualizację lub kwantyfikację nienaruszonej architektury komunikacyjnej układu in situ.

Trójwymiarowe odlewanie w żywicy i obrazowanie żyły wrotnej myszy lub wewnątrzpasączniczego systemu przewodów żółciowych

Ten film opisuje procedurę obrazowania do obserwacji i badania wewnątrznaczyniowej dynamiki tkanki wątroby myszy za pomocą mikroskopii wielofotonowej po ustabilizowaniu narządu. Mikroskopia wielofotonowa umożliwia obrazowanie tkanek biologicznych w wysokiej rozdzielczości przestrzennej in vivo.

Wspomagana oprawą obrazowania ocena wątroby myszy do wizualizacji naczyniowej opartej na mikroskopii wielofotonowej: technika obrazowania wspomagana urządzeniem stabilizacyjnym w celu uzyskania wielowymiarowych obrazów naczyń krwionośnych w wątrobie myszy

Stabilne przyżyciowe obrazowanie komórek odpornościowych w wątrobie w wysokiej rozdzielczości jest wyzwaniem. W tym miejscu zapewniamy wysoce czułą i wiarygodną metodę badania migracji i interakcji komórka-komórka komórek odpornościowych w wątrobie myszy przez długi czas (około 6 godzin) za pomocą wielofotonowej laserowej mikroskopii skaningowej w połączeniu z monitorowaniem intensywnej terapii.

Długoterminowe przyżyciowe obrazowanie mikroskopii wielofotonowej komórek odpornościowych w zdrowej i chorej wątrobie przy użyciu myszy reporterowych CXCR6.Gfp

Mikrotomografia komputerowa z podwójnym odlewem z żywicy, czyli DUCT, umożliwia wizualizację, digitalizację i segmentację dwóch systemów rurowych jednocześnie, co ułatwia analizę 3D architektury organów. DUCT łączy wstrzyknięcie ex vivo dwóch żywic nieprzepuszczających promieni rentgenowskich, a następnie skanowanie mikrotomografii komputerowej i segmentację danych tomograficznych.

DUCT: Podwójny odlew z żywicy, a następnie tomografia mikrokomputerowa do analizy wątroby 3D

Obecny protokół optymalizuje metody perfuzji/decelularyzacji wątroby in situ i mikroskopii dwufotonowej w celu stworzenia niezawodnej platformy do wizualizacji dynamiki przebudowy macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM) podczas niealkoholowego stłuszczeniowego zapalenia wątroby (NASH).

Obrazowanie 3D macierzy zewnątrzkomórkowej wątroby w mysim modelu niealkoholowego stłuszczeniowego zapalenia wątroby

Korzystając z mysiego modelu niealkoholowej stłuszczeniowej choroby wątroby (NAFLD) wywołanego dietą, opisujemy użycie nowatorskich technik obrazowania mikrotomografii komputerowej in vivo jako nieinwazyjnej metody oceny etapów progresji NAFLD, koncentrując się głównie na sieci naczyniowej wątroby ze względu na jej znaczący udział w dysregulacji wątroby związanej z NAFLD.

Nowatorskie techniki obrazowania mikrotomografii komputerowej in vivo do oceny postępu niealkoholowej stłuszczeniowej choroby wątroby

Celem tego badania było opracowanie nowatorskiego trójwymiarowego cyfrowego modelu do wczesnej diagnozy zwłóknienia wątroby, który obejmuje sztywność każdego woksela w wątrobie pacjenta i dlatego może być wykorzystany do obliczenia proporcji dystrybucji wątroby pacjenta w różnych stadiach zwłóknienia.

Trójwymiarowy cyfrowy model do wczesnej diagnostyki zwłóknienia wątroby w oparciu o elastografię rezonansu magnetycznego

Protokół przedstawia nowe narzędzie do uproszczenia obrazowania przyżyciowego za pomocą odwróconej mikroskopii konfokalnej.

Uproszczone podejście do obrazowania przyżyciowego do długoterminowego monitorowania dynamiki tkanki nabłonkowej pod odwróconym mikroskopem konfokalnym

Tutaj opisujemy platformę, która umożliwia nieinwazyjne obrazowanie in vivo sferoidów wątroby wszczepionych do przedniej komory oka myszy. Przebieg pracy obejmuje zarówno generowanie sferoid z pierwotnych komórek wątroby, jak i przeszczep do oka myszy oraz obrazowanie in vivo w rozdzielczości komórkowej za pomocą mikroskopii konfokalnej.

Obrazowanie in vivo sferoid wątroby wszczepionych do przedniej komory oka myszy

Protokół ten oferuje kompleksowy pipeline obrazowania umożliwiający wizualizację i modelowanie morfologii komórek wątrobowych gwiaździstych w nienaruszonej tkance wątroby. Podejście to łączy znakowanie fluorescencyjne fibroblastów z wykorzystaniem genetyki myszy, przygotowanie tkanek in situ oparte na perfuzji wątroby oraz zmodyfikowaną metodę oczyszczania tkanek iDISCO, aby uzyskać optyczną przezroczystość.

Mapowanie morfologii komórek gwiaździstych wątroby wątroby w myszych modelach włóknienia wątroby

Poznaj wielokrotnego użytku narzędzie RHIT do mikroskopii śródżyciowej wątroby u myszy. To drukowane w 3D urządzenie poprawia stabilność tkanek i umożliwia długotrwałą obserwację procesów metabolicznych w wysokiej rozdzielczości.

Wielokrotnego użytku narzędzie do obrazowania wątroby: wielokrotnego użytku narzędzie drukowane w 3D do mikroskopii śródżyciowej wątroby (Wideo) | JoVE Journal

Wielokrotnego użytku narzędzie do obrazowania wątroby: wielokrotnego użytku narzędzie drukowane w 3D do mikroskopii śródżyciowej wątroby

Przeglądaj więcej filmów