Wykorzystanie metody przenoszenia kropelek w celu niezawodnego przygotowania gigantycznych pęcherzyków jednowarstwowych

Naszym celem są mikroroboty przypominające komórki, które poruszają się po tkankach ciała w celu miejscowego podawania terapii. Są one oparte na gigantycznych pęcherzykach jednowarstwowych i błonie fosfolipidowej i zawierają aktywne cząsteczki. Protokół ten stanowi przewodnik dla początkujących, którzy chcą przyjąć i dostosować metodę przenoszenia kropelek w biologii syntetycznej i w innych dziedzinach, na przykład w mikrorobotyce.

W porównaniu z innymi technikami przygotowania GUV, protokół ten oferuje wysoką skuteczność enkapsulacji i proste wykonanie, dzięki czemu jest dostępny dla każdej grupy badawczej posiadającej podstawowy sprzęt laboratoryjny. Ocenimy nawigację mikrorobotów opartych na GUV w warunkach przypominających tkanki i wdrożymy strategie detekcji, aby umożliwić autonomiczne przemieszczanie się w kierunku chorych komórek. Aby rozpocząć, przesuń komorę rękawicową do środka lub obok kaptura chemicznego.

Otwórz komorę rękawicy i umieść krystalizator wypełniony cząstkami krzemionki na dnie komory. Przykryj krystalizator białą powierzchnią nośną, a następnie ułóż go ręcznikami papierowymi. Włożyć wszystkie wymagane materiały do komory rękawicy i umieścić szklaną fiolkę zawierającą roztwór chloroformu na uchwycie pierścienia korkowego lub 150-mililitrowej zlewce umieszczonej jak najbliżej boku operatora.

Teraz zamknij komorę rękawicy, upewniając się, że dwie połówki są dobrze wyrównane i nie mogą się ślizgać. Użyj dostarczonych plastikowych, aby całkowicie uszczelnić komorę. Zamknij zawór wylotowy i zanurz rurę numer pięć w 500-mililitrowej zlewce, która jest do połowy wypełniona wodą.

Następnie podłącz regulowany zaworem koniec rury numer dwa do przewodu podciśnieniowego. Następnie podłącz drugi koniec do przewodu azotowego za pomocą rury numer trzy. Otwórz zawór i włącz przewód podciśnieniowy, aż rękawice napompują się i staną się zbyt sztywne, aby się zgiąć.

Następnie zamknij zarówno przewód podciśnieniowy, jak i zawór. Następnie należy otworzyć przewód azotu, aż rękawice opróżnią się i wysuną się z komory rękawicy. Po założeniu rękawiczek należy użyć strzykawki Hamiltona, aby przenieść określoną objętość DOPC w roztworze chloroformu do fiolki z ciemnego szkła.

Zamknąć fiolkę z kapturkiem zawierającym igły. Teraz połącz rurę numer sześć z rurą numer osiem i rurę numer siedem z rurą numer dziewięć za pomocą złączy dwukierunkowych. Wyjmij rękawice z komory rękawic i otwórz zawór wylotowy.

Następnie powoli otwieraj przewód azotu i monitoruj przepływ gazu pod kątem pęcherzyków w zlewce. Stopniowo zwiększaj przepływ azotu, aż do osiągnięcia stałej, ale zauważalnej szybkości bulgotania. Po trzech minutach przepływu zamknij przewód azotu.

Gdy ostatnia bańka opuści zlewkę, zamknij zawór wylotowy. Załóż rękawice z powrotem i odłącz rury ósmą i dziewiątą od dwukierunkowych złączy. Następnie otwórz fiolkę i przesuń nakrętkę z powrotem do 50-mililitrowej tubki.

Następnie otwórz butelkę z olejem i przenieś wymaganą ilość oleju do ciemnej fiolki. Ponownie zamknąć fiolkę z kapslem, zdjąć rękawice i otworzyć komorę rękawicy. Energicznie obracać szczelnie zapieczętowaną fiolkę z zawiesiną lipidową przez co najmniej 30 sekund.

Następnie inkubuj go w temperaturze 80 stopni Celsjusza w łaźni wodnej przez 30 minut. Po ponownym zawirowaniu fiolki, należy ją inkubować przez noc w temperaturze pokojowej. Za pomocą nożyczek odetnij nakrętkę z pięciomililitrowej tubki.

Wywierć około ośmiomilimetrowy otwór w środku nasadki, aby dopasować ją do końcówki pipety P1000. Jeśli otwór jest zbyt szeroki, aby zmieścić się w końcówce, wyrzuć nasadkę i uruchom ponownie z nową. Za pomocą paska papieru ściernego o wymiarach dwa na pięć centymetrów wygładź krawędzie wywierconego otworu.

Umieść nakrętkę z powrotem na pięciomililitrowej probówce i odwiruj przy 3 000 g przez pięć minut, aby wyeliminować wszelkie resztki plastiku. Następnie zdejmij nakrętkę i wyrzuć tubkę. Teraz odetnij nakrętkę z nowej pięciomililitrowej tubki i zastąp ją przygotowaną nasadką z otworem.

Włóż końcówkę P1000 przez otwór z pierścieniem uszczelniającym o przekroju okrągłym zablokowanym między końcówką a nasadką, aby zapobiec dalszemu ruchowi w dół. Napełnij probówkę 5,5 mililitra roztworu zewnętrznego przez końcówkę. Przygotować wcześniej przygotowaną fiolkę z zawiesiną lipidów przez co najmniej 30 sekund.

Następnie inkubuj go w łaźni wodnej o temperaturze 50 stopni Celsjusza przez 30 minut. Pozwól, aby przygotowane wcześniej roztwory wodne zrównoważyły się w temperaturze pokojowej przez co najmniej 10 minut. Teraz odpipetuj 300 mikrolitrów roztworu zewnętrznego do probówki o pojemności 1,5 mililitra lub wcześniej zmodyfikowanej probówki o pojemności 5 mililitrów.

Powoli nałóż 100 mikrolitrów zawiesiny lipidowej na wierzch roztworu oleju, zapewniając utworzenie dwóch odrębnych i ciągłych faz. Pozostaw interfejs w spokoju przez 10 minut, aby uzyskać równowagę. W dwumililitrowej probówce odpipetuj 250 mikrolitrów zawiesiny lipidowej, a następnie 6,25 mikrolitrów roztworu wewnętrznego, aby przygotować 2,5% emulsję typu woda w oleju.

Mieszaj obie fazy, aż emulsja stanie się jednorodna i stabilna. Przenieść 200 mikrolitrów przygotowanej emulsji na utworzoną wcześniej granicę faz zawiesiny lipidowej roztworu oleju. Jeśli używasz rurki o pojemności 1,5 mililitra, po prostu zamknij rurkę.

Jeśli używasz zmodyfikowanej pięciomililitrowej probówki, umieść gumową nasadkę na końcówce pipety i delikatnie przenieś całą probówkę do stożkowej probówki o pojemności 50 mililitrów. Odwirować probówki w temperaturze pokojowej z odpowiednią prędkością. Po odwirowaniu sprawdź, czy na dnie znajduje się nieprzezroczysty osad i czy faza olejowa jest czysta na górze.

Aby usunąć olej z pięciomililitrowej rurki zawierającej GUV, wyjmij końcówkę pipety z tuby, upewniając się, że gumowa nasadka pozostaje na swoim miejscu. Wyrzuć końcówkę i zachowaj gumową nasadkę, O-ring i nasadkę przytrzymującą do wykorzystania w przyszłości. Zamiast tego, jeśli używasz rurki o pojemności 1,5 mililitra, użyj mikropipety P1000, aby usunąć roztwór oleju, pozostawiając około 50 mikrolitrów i uważając, aby nie naruszyć granulki.

Zmienić końcówkę pipety, a następnie ponownie zawiesić osad w pozostałych 50 mikrolitrach roztworu. Na koniec przenieś zawieszony materiał do czystej dwumililitrowej rurki. Roztwory lipidów przygotowane w warunkach wysokiej wilgotności wytworzyły gigantyczne pęcherzyki jednowarstwowe o znacznie niższych plonach i większym występowaniu nieuporządkowanych agregatów w porównaniu z tymi przygotowanymi w komorze o kontrolowanej wilgotności, chociaż niektóre agregaty były nadal obecne w tych ostatnich.

Przy 3,300 g przez 20 minut wydajność i jakość pęcherzyków obciążonych sacharozą były optymalne, podczas gdy zarówno niższa, jak i wyższa prędkość wirowania pozwalała na niekorzystne wyniki, takie jak zmniejszenie plonu lub tworzenie agregatów. Olej mineralny skutkował powstawaniem pęcherzyków o większym średnim rozkładzie średnicy, podczas gdy olej silikonowy AR 20 generował znacznie wyższą ogólną liczbę pęcherzyków.