Jednoczesna analiza 3D uszkodzenia serca i odpowiedzi immunologicznej w ostrym zawale mięśnia sercowego z reperfuzją przy użyciu mikroskopii fluorescencyjnej arkusza światła

Przyglądamy się wzajemnemu oddziaływaniu komórek odpornościowych i uszkodzonych tkanek po zawale mięśnia sercowego. Naszym celem jest zrozumienie odpowiedzi immunologicznej i poprawa funkcji serca. Zaproponowano, że po zawale mięśnia sercowego wszystkie trzy główne jednostki komórkowe, kardiomiocyty i komórki oraz komórki odpornościowe, muszą być modulowane przez strategie wielocelowe w tym samym czasie.

Oprócz jednoczesnej analizy uszkodzenia serca i odpowiedzi, mogliśmy pokazać lokalizację 3D tych uszkodzonych obszarów, która wcześniej była nieznana. Analiza 3D, zwłaszcza w przypadku multipleksowania różnych celów, zapewnia bardziej niezawodny sposób oceny składu komórkowego po zawale mięśnia sercowego. Na początek umieść uśpioną mysz pod mikroskopem stereoskopowym.

Za pomocą cienkich nożyczek otwórz jamę klatki piersiowej i naciąć odsłoniętą żyłę główną górną w pobliżu wyjścia naczynia z klatki piersiowej do szyi. Za pomocą igły o rozmiarze 27 G przymocowanej do pompy rolkowej, wykonaj perfuzję serca in situ przez prawą i lewą wyrocznię przedsionkową za pomocą PBS zawierającego heparynę. Potwierdzić wystarczające usunięcie krwi z serca, obserwując zanikanie powierzchownego rysunku naczyniowego serca oraz wybielanie płuc i wątroby.

Za pomocą kleszczy i nożyczek należy wyciąć serce wraz z co najmniej pięcioma milimetrami pozostałej aorty i otaczającej ją tkanki płucnej, a następnie przenieść je na sześciocentymetrową szalkę Petriego wypełnioną lodowatym PBS i gazą. Teraz odetnij pozostałe płuca, tłuszcz i tkankę naczyniową, aż pozostanie tylko serce z około pięcioma milimetrami aorty. Przenieś serce do naczynia przygotowanego do kaniulacji aorty i przeciągnij pozostałą aortę przez stalową kaniulę o rozmiarze 20.

Przymocuj go do wcięcia kaniuli za pomocą ładnego szwu 5-0. Legate lewą tętnicę zstępującą przednią na stałe za pomocą szwu 6-0 w miejscu używanym do indukcji reperfuzyjnego ostrego zawału mięśnia sercowego. Wstrzyknąć 400 mikrolitrów PBS zawierających 20 mikrogramów mysiego przeciwciała NT CD31, znakowanego LexaFluor 546 wstecznie przez wprowadzoną kaniulę.

Ostrożnie wyciągnij kaniulę z aorty i przenieś serce do 15-mililitrowej polipropylenowej probówki reakcyjnej zawierającej 10 mililitrów 4% paraformaldehydu. Inkubować probówkę przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza w ciemności bez mieszania. Umyj utrwalone serce w trzech zmianach po pięć mililitrów PBS przez 10 minut każda w temperaturze pokojowej w ciemności, używając obrotu prawie nad głową do mieszania wewnątrz pięciomililitrowych polipropylenowych probówek reakcyjnych.

Odwodnić unieruchomione serce w pięciu mililitrach 50% etanolu w dejonizowanej wodzie przez co najmniej dwie godziny w temperaturze pokojowej w ciemności, mieszając z obrotem prawie nad głową w pięciomililitrowych probówkach reakcyjnych. Aby wybielić odwodnione serce, przenieś je do 15-mililitrowej probówki reakcyjnej zawierającej 10 mililitrów 100% etanolu z 5% dimetylosulfotlenkiem i 5% nadtlenkiem wodoru i inkubuj je w temperaturze czterech stopni Celsjusza w ciemności przez cztery godziny bez mieszania. Umyj wybielone serce w pięciu mililitrach 100% etanolu trzy razy przez 12 godzin każdy w temperaturze pokojowej w ciemności, używając obrotu prawie nad głową do mieszania w pięciomililitrowych probówkach reakcyjnych.

Przenieś serce do pięciomililitrowej probówki reakcyjnej zawierającej cztery mililitry cynamonianu etylu i inkubuj je bez mieszania przez trzy dni w temperaturze pokojowej w ciemności. Przytnij oczyszczony żel i bloki gumy do rozmiaru, który stabilizuje oczyszczone serce w uchwycie na próbkę mikroskopu. Do akwizycji obrazu należy używać obiektywu o aperturze numerycznej 0,1 i odległości roboczej 17,6 milimetra.

Następnie wykryj sygnały fluorescencyjne za pomocą odpowiednich ustawień filtra wzbudzenia i emisji. W przypadku obrazowania za pomocą mikroskopii za pomocą lekkich arkuszy należy wybrać aperturę numeryczną arkusza 0,079, co daje grubość cienkiego arkusza światła wynoszącą pięć mikrometrów. Ustaw odległość między dwiema pojedynczymi płaszczyznami Z na 10 mikrometrów.

Użyj arkusza o szerokości 100%, aby uzyskać jednorodne oświetlenie próbki. Reprezentatywne wycinki serca lokalizujące obszar zagrożony, uszkodzenie śródbłonka i naciekane neutrofile za pomocą wielokanałowego barwienia przeciwciałami i autofluorescencji są zilustrowane na tym rysunku. Obszar ryzyka zidentyfikowano na podstawie braku barwienia CD31 po wstrzyknięciu wstecznym, uszkodzenia śródbłonka przez dożylny ujemny wynik CD31 i naciekania neutrofili przez plamki Ly6G-dodatnie, głównie w pobliżu stref uszkodzenia.

Renderowanie 3D wykazało nakładanie się AAR, uszkodzenia śródbłonka i klastrów neutrofili, co sugeruje lokalizację immunologiczną specyficzną dla regionu. Kwantyfikacja wykazała 90,2% neutrofili w AAR w porównaniu z 9,8% w odległych regionach, co wskazuje na zlokalizowany stan zapalny. W obrębie AAR 79,3% neutrofili znajdowało się poza objętością uszkodzenia śródbłonka, a 20,7% wewnątrz, co sugeruje obwodowe skupienie wokół uszkodzenia.