Izolacja, hodowla i charakterystyka fibroblastów związanych z rakiem prostaty

Naszym celem jest zrozumienie mechanizmu, za pomocą którego fibroblasty związane z rakiem przyczyniają się do progresji guza w raku prostaty, mając na celu zneutralizowanie tego przesłuchu jako strategii terapeutycznej. Odrębne populacje CAF o różnych właściwościach można ocenić w organoidach 3D uzyskanych przy użyciu komórek nowotworowych i zrębowych po różnych manipulacjach. Nasz protokół pozwala na niezawodne generowanie CAFów do tych celów.

Głównymi wyzwaniami są: niezawodna izolacja komórek nowotworowych i prawidłowych komórek z mikrośrodowisk tych samych pacjentów, niejednorodność, brak specyficznych markerów CAF, plastyczność CAF oraz ograniczone modele in vitro podsumowujące złożoność TME. Za pomocą podobnych metod scharakteryzowaliśmy fundamentalną pronowotworową rolę czynnika transkrypcyjnego STAT3 i jego genów docelowych w mysich CAF raka piersi, wykazując ich skuteczność jako celów terapeutycznych. Optymalna izolacja fibroblastów z guza i przyległych normalnych regionów radykalnej prostatektomii próbki uzyskane od pacjentów z rakiem prostaty przy użyciu niewielkiej ilości tkanki.

Na początek zważ próbki tkanek na wadze w pierwszym dniu w celu izolacji fibroblastów. Za pomocą sterylnych kleszczy przenieś tkankę do sześciocentymetrowych naczyń. Umyj tkankę dwa razy w czterech mililitrach lodowatego PBS i dwa razy w czterech mililitrach lodowatego kompletnego DMEM.

Teraz przenieś tkankę na sześciocentymetrową płytkę na lodzie. Dodaj jeden mililitr DMEM uzupełnionego antybiotykiem na talerz. Następnie za pomocą nożyczek lub ostrzy rozdrobnij tkankę na fragmenty mniejsze niż jeden milimetr kwadratowy.

Przenieś zmieloną tkankę do 15-mililitrowej stożkowej probówki zawierającej pięć mililitrów lodowatego kompletnego DMEM. Następnie odwirować zawiesinę o sile 754 g przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Za pomocą pipety o pojemności 10 mililitrów usuń supernatant.

Ponownie zawiesić osad w pięciu mililitrach lodowatego zimnego kompletnego DMEM i ponownie odwirować. Po usunięciu supernatantu ponownie zawiesić osad w roztworze kolagenazy II. Przenieś zawiesinę do mikroprobówek o pojemności 1,5 mililitra.

Uszczelnij mikroprobówki folią parafinową. Następnie umieść je w temperaturze 37 stopni Celsjusza do trawienia przez noc z ciągłym kołysaniem przez osiem do 12 godzin. Następnego dnia przenieś strawione próbki do 15-mililitrowych stożkowych probówek.

Odpipetuj pięć mililitrów lodowatego zimnego, kompletnego DMEM, aby dezaktywować kolagenazę. Następnie odwirować zawiesinę o sile 754 g przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Zawiesić osad w jednym mililitrze 0,05% trypsyny-EDTA po odpipetowaniu supernatantu.

Inkubować przez pięć minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza, od czasu do czasu wstrząsając. Następnie odpipetować jeden mililitr świeżo przygotowanego roztworu DNazy I do próbek i dobrze wymieszać. Po odwirowaniu i usunięciu supernatantu, ponownie zawiesić osad w pięciu mililitrach zimnego kompletnego DMEM i ponownie odwirować.

Ponownie zawiesić powstałe komórki w kompletnym DMEM uzupełnionym 20% płodową surowicą bydlęcą. Umieść komórki na płytkach i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla i 95% wilgotnością przez co najmniej trzy dni. Po trzech dniach zbadaj komórki pod kątem morfologii i żywotności.

Gdy komórki osiągną zbieg, przenieś je do 10-centymetrowego naczynia zawierającego kompletny DMEM z 20% płodową surowicą bydlęcą. Płytki fibroblastów związanych z rakiem lub normalnych fibroblastów przy 70% konfluencji w 12-dołkowych płytkach. Następnego dnia dodaj 0,45 grama agaru o niskiej temperaturze topnienia do 12,5 mililitra PBS w stożkowej probówce o pojemności 50 mililitrów w sterylnych warunkach.

Rozpuść mieszaninę za pomocą kuchenki mikrofalowej. Schłodzić roztwór agaru do 37 stopni Celsjusza. Następnie rozcieńczyć w stosunku jeden do czterech wstępnie podgrzanym kompletnym DMEM, aby przygotować roztwór roboczy.

Odessać pożywkę z płytki 12-dołkowej. Odpipetować 500 mikrolitrów roboczego roztworu agaru do każdej studzienki. Inkubować przez 20 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza, aby umożliwić zestalenie się agaru.

W międzyczasie utrzymuj pozostały roztwór agaru w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Trypsynizuj komórki nowotworowe i przygotuj zawiesinę komórkową 20 000 komórek na mililitr. Wymieszaj równe objętości zawiesiny komórek nowotworowych i roztworu agaru, aby uzyskać końcową objętość siedmiu mililitrów, co odpowiada trzem powtórzeniom technicznym na każdy warunek.

Pipetuj w górę i w dół wiele razy, aby zapewnić równomierne mieszanie. Następnie dozować 500 mikrolitrów tej mieszaniny zawierającej około 5 000 komórek na wierzchu zestalonej warstwy podstawowej w każdym dołku. Po pozostawieniu agaru do zestalenia się przez 20 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza, dodaj jeden mililitr kompletnego DMEM do każdej studzienki.

Zmieniaj podłoże co drugi dzień, delikatnie zasysając od krawędzi studzienki i dodając świeże podłoże do środka. Wysiaduj tak długo, aż kolonie staną się dobrze widoczne. Gdy kolonie są widoczne, wyrzuć pożywkę hodowlaną.

Następnie wybarwić kolonie 200 mikrolitrami roztworu chlorku tetrazolu Nitro blue. Inkubować przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza w wilgotnym inkubatorze. Następnego dnia wyrzuć roztwór barwiący.

Uzyskuj obrazy barwionych kolonii za pomocą mikroskopu stereoskopowego. Udało się wyizolować czyste fibroblasty. W wielu przypadkach, szczególnie we wczesnych pasażach, fibroblasty związane z rakiem wykazywały morfologię bardziej wrzecionowatą w porównaniu z normalnymi fibroblastami.

Analiza ilościowa potwierdziła, że proliferacja komórek DU145 leczonych pożywką kondycjonowaną fibroblastami związanymi z rakiem była znacznie wyższa w ciągu 120 godzin niż w przypadku osób leczonych normalnymi pożywkami kondycjonowanymi fibroblastami lub pozostawionych nieleczonych. Komórki DU145 hodowane bezpośrednio z fibroblastami związanymi z rakiem i normalnymi fibroblastami również wykazywały zwiększoną proliferację w ciągu 96 godzin w porównaniu z kontrolami. Odpowiednie krzywe wzrostu wykazały, że jednoczesna hodowla z prawidłowymi fibroblastami związanymi z rakiem spowodowała podobny wzrost proliferacji DU145 w czasie.

Wpływ kondycjonowanych pożywek na proliferację DU145 różnił się w zależności od par fibroblastów związanych z rakiem i normalnych fibroblastów, przy czym pary wczesnego pasażu wykazywały znacznie silniejsze efekty niż późniejsze. W testach tworzenia miękkich kolonii agarowych zarówno związane z rakiem, jak i normalne fibroblasty zwiększały liczbę i wielkość kolonii DU145 w porównaniu z kontrolami, co wskazuje na zwiększony wzrost niezależny od zakotwiczenia. Oderwane warstwy fibroblastów powstałe w wyniku problemów technicznych uniemożliwiły tworzenie się kolonii w niektórych powtórzeniach.

Same kondycjonowane pożywki nie sprzyjały tworzeniu się kolonii niezależnych od zakotwiczenia w komórkach DU145.