Name: Izolacja, hodowla i charakterystyka fibroblastów związanych z rakiem prostaty (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-08-01T14:25:00.000+00:00
Duration: 9 min 43 s
Description: Poznaj metodę izolacji i hodowli fibroblastów związanych z rakiem prostaty z tkanek po prostatektomii radykalnej. Protokół umożliwia badanie interakcji między fibroblastami a komórkami nowotworowymi w mikrośrodowisku guza.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Prace te były wspierane przez Włoskie Stowarzyszenie Badań nad Rakiem (AIRC), IG16930 i IG24851 do V.P; włoskie Ministerstwo Szkolnictwa Wyższego i Badań Naukowych (MIUR PRIN 2017 i 2022 do V.P.); Fundacja Truus i Gerrita van Riemsdijk, Liechtenstein, darowizna na rzecz V.P.; Region Piemontu (Deflect). A.S. był wspierany przez Włoską Fundację Badań nad Rakiem (FIRC) w ramach stypendium podoktorskiego, a Los Angeles było wspierane przez Fondazione Umberto Veronesi. Rysunek 2 został utworzony za pomocą BioRender.com.

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów.

Wyprowadzanie i analiza komórek z tkanki PCa dostarcza odpowiedniego modelu eksperymentalnego, szczególnie biorąc pod uwagę, że dostępne modele zwierzęce nie odtwarzają w pełni anatomii ludzkiej prostaty i progresji choroby37. Gruczoły krokowe szympansów są anatomicznie podobne do ludzkich, ale wykazują powolny, stochastyczny postęp choroby, a także sugerują ograniczenia etyczne. Psy różnią się znacznie pod względem budowy i patobiologii prostaty i rozwijają sporadyczne choroby prostaty związane z...

Rak prostaty (PCa) jest najczęściej diagnozowanym nowotworem u mężczyzn w prawie dwóch trzecich krajów na całym świecie. W 2022 roku zgłoszono około 1,5 miliona nowych przypadków, co spowodowało 3 97 000 zgonów na całym świecie. Liczby te sprawiają, że PCa jest drugim najczęstszym nowotworem i piątą najczęstszą przyczyną śmiertelności związanej z nowotworami wśród mężczyzn1.
PCa jest chorobą wieloogniskową i biologicznie złożoną, charakteryzującą się znaczną niejednorodnością międzynowotworową 2,3,4, różnorodnymi podtypami molekularnymi i zmiennymi wynikami klinicznymi 5,6, z których wszystkie znacząco wpływają na rokowanie i odpowiedź terapeutyczną7.
Podczas gdy krytyczna rola mikrośrodowiska guza (TME) w inicjacji i progresji guza prostaty jest dobrze znana 8,9, interakcje molekularne między komórkami nowotworowymi a otaczającym je przedziałem zrębu pozostają nie w pełni poznane. Chociaż powszechnie wiadomo, że mikrośrodowisko guza gruczołu krokowego (TME) odgrywa kluczową rolę w inicjacji i progresji guza, interakcje molekularne między komórkami nowotworowymi a otaczającym zrębem pozostają niewystarczająco zdefiniowane. TME składa się z różnych komórek zrębu, w tym komórek pochodzenia mezenchymalnego i immunologicznego, które uaktywniają się w odpowiedzi na sygnały pochodzące z guza, a następnie nabywają funkcje sprzyjające nowotworowi10,11. Wśród nich fibroblasty związane z rakiem (CAF) często stanowią najliczniejszą populację zrębu. CAF przyczyniają się do przebudowy macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM), promują wzrost guza oraz ułatwiają inwazję i migrację komórek rakowych 4,11,12,13. Poprzez wydzielane czynniki i bezpośrednie interakcje komórka-komórka, CAF wpływają również na proliferację, inwazję i oporność na terapię. Warto zauważyć, że CAF są populacją niejednorodną. Chociaż ogólnie związane z funkcjami pronowotworowymi, niektóre podtypy mogą odgrywać role supresyjnenowotworu 14,15. Co ważne, brak unikalnych markerów dla CAF stanowi wyzwanie dla ich precyzyjnej identyfikacji i funkcjonalnego rozbioru ich różnorodnych ról12,16.
Solidne podejście do badania funkcjonalnych przesłuchów między CAF a komórkami nowotworowymi polega na wyizolowaniu pierwotnych CAF i dopasowanych normalnych fibroblastów (NF), a następnie ocenie ich wpływu na zachowania komórek nowotworowych, takie jak proliferacja, migracja, tworzenie kolonii i wzrost niezależny od zakotwiczenia 17,18,19 . W tym artykule opisano udoskonalony, wysoce powtarzalny protokół izolacji CAF i NF z próbek radykalnej prostatektomii pacjentów wysokiego ryzyka PCa. Kluczowym elementem tego protokołu jest dokładna identyfikacja i preparacja guza i regionów wolnych od guza przez biegłego uropatologa, co pozwala na wyprowadzenie CAF i NF od tego samego pacjenta. To podejście oparte na sparowanych próbkach pomaga kontrolować heterogeniczność międzyguzową i indywidualne zmienne specyficzne dla pacjenta, które mogą wpływać na fenotypy fibroblastów 20,21,22. Aby zapewnić dostępność wystarczającej ilości tkanki nowotworowej, skupiamy się na próbkach od pacjentów z wynikiem Gleasona ≥7.
Wiarygodna charakterystyka fenotypowa izolowanych fibroblastów wymaga użycia wielu markerów w celu odróżnienia ich od innych typów komórek, w szczególności komórek nabłonkowych, które mogą mieć wspólną nakładającą się ekspresję markera16. Ponieważ pierwotne fibroblasty PCa zwykle ulegają starzeniu po 10-15 pasażach, co komplikuje długoterminowe analizy, przedstawiamy również protokół nieśmiertelności komórek poprzez stabilną ekspresję ludzkiej odwrotnej transkryptazy telomerazy (hTERT)23.
Aby zbadać funkcjonalny wpływ CAF i NF na komórki nowotworowe, przetestowaliśmy i zoptymalizowaliśmy kilka strategii eksperymentalnych. Biorąc pod uwagę, że CAF wywierają wpływ zarówno poprzez czynniki wydzielane, jak i bezpośredni kontakt komórka-komórka24, opracowywane są dwa uzupełniające się systemy testów: (1) leczenie komórek rakowych pożywką kondycjonowaną fibroblastami (CM) oraz (2) bezpośrednia kohodowla fibroblastów i komórek nowotworowych. Testy te oceniają kluczowe właściwości komórek rakowych, w tym proliferację, wzrost niezależny od zakotwiczenia i migrację. Aby ustandaryzować wpływ wydzielanych czynników, kondycjonowane pożywki z CAF i NF zostały zagęszczone i określone ilościowo (conCM) na podstawie całkowitej zawartości białka.
Wykazanie znaczących efektów funkcjonalnych za pomocą tych testów może pomóc w identyfikacji krytycznych mediatorów nowotworzenia wywołanego przez CAF, oferując potencjalne cele interwencji terapeutycznej.

<table><tbody><tr><td>Płytka 12-dołkowa</td><td>Sarstedt powiedział:</td><td>833921</td><td></td></tr><tr><td>Płytka 24-dołkowa</td><td>Sarstedt powiedział:</td><td>833922</td><td></td></tr><tr><td>Płytka 6-dołkowa</td><td>Sarstedt powiedział:</td><td>833920</td><td></td></tr><tr><td>Płytka 96-dołkowa</td><td>Sarstedt powiedział:</td><td>833924</td><td></td></tr><tr><td>Mysi mAb anty-GAPDH (6C5)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Zobacz materiał CB1001</td><td>Źródło: Mysz; Rozcieńczenie dla WB: 1:1000</td></tr><tr><td>aSMA (Agencja Przedsiębiorczości)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A5228&nbsp;</td><td>Źródło: Mysz; Rozcieńczenie dla WB: 1:3000</td></tr><tr><td>Kaweolina</td><td>Technologia sygnalizacji komórkowej</td><td>CST3267</td><td>Źródło: Królik; Rozcieńczenie dla WB: 1:1000</td></tr><tr><td>CD31-VioBlue</td><td>Milteny Biotec</td><td>130-119-980</td><td>Cytometria przepływowa Ab, marker komórek śródbłonka</td></tr><tr><td>CD326-PE (EpCAM)</td><td>Milteny Biotec</td><td>130113-826</td><td>Cytometria przepływowa Ab, marker komórek nabłonkowych</td></tr><tr><td>CD45-FITC</td><td>Milteny Biotec</td><td>130-110769</td><td>Cytometria przepływowa Ab, marker leukocytów Pan</td></tr><tr><td>CD90-APC</td><td>Milteny Biotec</td><td>130-114-903</td><td>Cytometria przepływowa Ab, marker fibroblastów</td></tr><tr><td>Kolagen VI (COL6A1)</td><td>Księga Abcam</td><td>ab182744 powiedział:</td><td>Źródło: Królik; Rozcieńczenie dla WB: 1:1000</td></tr><tr><td>Rurka stożkowa 15 ml</td><td>Sarstedt powiedział:</td><td>62554502</td><td></td></tr><tr><td>Probówka stożkowa 50 ml</td><td>Sarstedt powiedział:</td><td>62547254</td><td></td></tr><tr><td>Mikroprobówki Cryopure 2 ml</td><td>Sarstedt powiedział:</td><td>72380992</td><td></td></tr><tr><td>Płytka hodowlana o średnicy 100 mm&nbsp;</td><td>Corning</td><td>353003</td><td></td></tr><tr><td>Płytka hodowlana o średnicy 100 mm&nbsp;</td><td>Corning</td><td>353025</td><td></td></tr><tr><td>Płytka hodowlana o średnicy 60 mm&nbsp;</td><td>Corning</td><td>353002</td><td></td></tr><tr><td>Dimetylosulfotlenek (DMSO)</td><td>Sigma Aldirch</td><td>Zobacz materiał D8418</td><td>Zastosowanie w okapie biologicznym</td></tr><tr><td>Dulbecco' s Zmodyfikowany Orzeł" s Średni (DMEM)</td><td>Gibco (firma Gibco)</td><td>11965092</td><td>Przechowywać w temperaturze 4 & deg; C, użyj w okapie biologicznym</td></tr><tr><td>FAP (Język do ryb)</td><td>Księga Abcam</td><td>ab53066 powiedział:</td><td>Źródło: Królik; Rozcieńczenie dla WB: 1:500</td></tr><tr><td>Odczynnik blokujący FcR, ludzki</td><td>Milteny Biotec</td><td>130-059-901</td><td>Blokada FC</td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca (FBS)</td><td>Gibco (firma Gibco)</td><td>16000044</td><td>Przechowywać w temperaturze 4 & deg; C, użyj w okapie biologicznym</td></tr><tr><td>Końcówki z filtrem 10 i mikro; L</td><td>Sarstedt powiedział:</td><td>703010255</td><td></td></tr><tr><td>Końcówki z filtrem 100 &micro; L</td><td>Sarstedt powiedział:</td><td>703030255</td><td></td></tr><tr><td>Końcówki z filtrem 1000 &micro; L</td><td>Sarstedt powiedział:</td><td>703060255</td><td></td></tr><tr><td>Końcówki z filtrem 20 i mikro; L</td><td>Sarstedt powiedział:</td><td>703030265</td><td></td></tr><tr><td>Końcówki z filtrem 200 &micro; L</td><td>Sarstedt powiedział:</td><td>703031255</td><td></td></tr><tr><td>Filtropur S Plus 0,20 &mikro; m&nbsp;</td><td>Sarstedt powiedział:</td><td>831826102</td><td></td></tr><tr><td>Kleszcz</td><td>2Biol</td><td>1102412</td><td></td></tr><tr><td>FSP1/S100A4</td><td>Technologia sygnalizacji komórkowej</td><td>D9F9D (13018)</td><td>Źródło: Królik; Rozcieńczenie dla WB: 1:2000</td></tr><tr><td>IL6 powiedział:</td><td>Technologia abklonalna</td><td>Zobacz materiał A0286</td><td>Źródło: Królik; Rozcieńczenie dla WB: 1:1000</td></tr><tr><td>ObrazJ</td><td>Krajowy Instytut Zdrowia</td><td>Wersja 1.53c</td><td>Oprogramowanie do analizy obrazu</td></tr><tr><td>Incucyte Imagelock 96-dołkowa płytka</td><td>Sartorious (Szeryf)</td><td>BA-04857 powiedział:</td><td></td></tr><tr><td>Incucyte&reg; Zestaw SX5</td><td>Sartorious (Szeryf)</td><td>Zestaw SX5</td><td>Przyrząd do analizy żywych komórek&nbsp;</td></tr><tr><td>Odczynnik do transfekcji Lipofectamine 2000</td><td>ThermoFisher Naukowy</td><td>11668019</td><td>odczynnik do transfekcji za pośrednictwem kationów lipidów</td></tr><tr><td>MACS&reg; Rozwiązanie do przechowywania tkanek</td><td>Milteny Biotec</td><td>130-100-008</td><td></td></tr><tr><td>Czytnik mikropłytek (absorbancja 600 nm)</td><td>Preparat Promega</td><td>Zobacz materiał GM3500</td><td></td></tr><tr><td>Mikroprobówki 1,5 mL&nbsp;</td><td>Sarstedt powiedział:</td><td>7269001</td><td></td></tr><tr><td>NCAD (Jednostka Sieciowa)</td><td>Księga Abcam</td><td>ab18203 powiedział:</td><td>Źródło: Królik; Rozcieńczenie dla WB: 1:1000</td></tr><tr><td>Nitro Niebieski Tetrazolium&nbsp;</td><td>Sigma Aldirch</td><td>n5514 powiedział:</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm&nbsp;</td><td>Sigma Aldirch</td><td>HS234526B</td><td></td></tr><tr><td>pBABE-puro-hTERT</td><td>Addgene powiedział:</td><td>1771</td><td>Przechowywać w temperaturze -20 stopni; C, użyj w okapie biologicznym</td></tr><tr><td>pCL-Ampułka</td><td>Novus Biological&nbsp;</td><td>NBP2-29541</td><td>Przechowywać w temperaturze -20 stopni; C, użyj w okapie biologicznym</td></tr><tr><td>PDGFRB powiedział:</td><td>Santa Cruz</td><td>SC-432 powiedział:</td><td>Źródło: Królik; Rozcieńczenie dla WB: 1:1000</td></tr><tr><td>Penicylina-Streptomycyna (PS, 10 000 &mu; g/ml)&nbsp;</td><td>Gibco (firma Gibco)</td><td>15140122</td><td>Przechowywać w temperaturze 4 & deg; C, użyj w okapie biologicznym</td></tr><tr><td>Mikroskop z kontrastem fazowym&nbsp;</td><td>Olimpia&nbsp;</td><td>Zobacz materiał BX42</td><td></td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami&nbsp; (PBS)</td><td>Domowej roboty</td><td></td><td>NaCl, 137 mM; KCl, 2,7 mM; Na2HPO4, 10 mM;KH2PO4, 1,8 mM. Autoklaw i przechowywanie w RT</td></tr><tr><td>Roztwór poli-L-lizyny</td><td>Sigma Aldirch</td><td>Zobacz materiał P8920 powiedział:</td><td>Przechowywać w temperaturze 4 & deg; C, użyj w okapie biologicznym</td></tr><tr><td>Dichlorowodorek puromycyny</td><td>Sigma Aldirch</td><td>Zobacz materiał P8833 powiedział:</td><td></td></tr><tr><td>Secura Semi Micro Balance</td><td>Sartorius Sartorius (Wyspa Sar</td><td>SECURA125-1S</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta serologiczna 10 mL&nbsp;</td><td>Sarstedt powiedział:</td><td>861254001</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta serologiczna 2 mL&nbsp;</td><td>Sarstedt powiedział:</td><td>861252001</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta serologiczna 25 mL&nbsp;</td><td>Sarstedt powiedział:</td><td>861256001</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta serologiczna 5 mL&nbsp;</td><td>Sarstedt powiedział:</td><td>861253001</td><td></td></tr><tr><td>STATYSTYKA 3</td><td>CST</td><td>9139</td><td>Źródło: Mysz; Rozcieńczenie dla WB: 1:1000</td></tr><tr><td>STAT3 Y705</td><td>CST</td><td>9131</td><td>Źródło: Królik; Rozcieńczenie dla WB: 1:1000</td></tr><tr><td>mikroskop stereoskopowy</td><td>Księga Leica</td><td>MZ125</td><td></td></tr><tr><td>Strzykawka 10 ml</td><td>Pentaferte</td><td>00202260D12</td><td></td></tr><tr><td>Mieszalnik TermoMixer</td><td>Eppendorph powiedział:</td><td>22331</td><td></td></tr><tr><td>Trypsyna-EDTA (0,5%), bez czerwieni fenolowej</td><td>Gibco (firma Gibco)</td><td>15400054</td><td></td></tr><tr><td>Vim</td><td>Santa Cruz</td><td>SC-6260 powiedział:</td><td>Źródło: Mysz; Rozcieńczenie dla WB: 1:2000</td></tr><tr><td>Koncentrator odśrodkowy Vivaspin 20&nbsp;</td><td>Sigma Aldirch</td><td>Z614602</td><td>MWCO 10,000 Da&nbsp;</td></tr><tr><td>Nożyczki Wagnera</td><td>2Biol</td><td>14070-12</td><td></td></tr></tbody></table>

izolacja, hodowla i charakterystyka fibroblastów związanych z rakiem prostaty

Isolation, Culture, and Characterization of Prostate Cancer-Associated Fibroblasts

Zrąb guza może być aktywnie kształtowany przez komórki nowotworowe w celu przyjęcia właściwości pronowotworowych, co czyni go centralnym punktem badań nad rakiem. Wśród składników zrębu, fibroblasty związane z rakiem (CAF) - często najliczniejszy typ komórek w mikrośrodowisku guza (TME) - odgrywają kluczową rolę w promowaniu progresji raka poprzez ich interakcje z komórkami nowotworowymi i innymi składnikami zrębu. Wyjaśnienie mechanizmów stojących za tymi interakcjami wymaga solidnych metod izolowania i charakteryzowania CAF, które mogą również stanowić podstawę do opracowania nowych terapii przeciwnowotworowych ukierunkowanych na CAF. W pracy przedstawiono metodę izolowania fibroblastów zarówno z guza, jak i przyległych normalnych regionów próbek po radykalnej prostatektomii pobranych od pacjentów z rakiem prostaty (PCa). Takie podejście umożliwia jednoczesną izolację CAF i ich normalnych odpowiedników (NF) od tego samego osobnika, zapewniając sparowany system eksperymentalny. Podano szczegółowe protokoły dotyczące utrzymywania pierwotnych CAF i NF do dalszych analiz in vitro, a także ich unieśmiertelnienia w celu ułatwienia długoterminowych badań. Opisujemy również testy funkcjonalne zaprojektowane w celu porównania wpływu CAF i NF na zachowanie komórek rakowych, w tym proliferację, migrację i wzrost niezależny od zakotwiczenia. Szczegółowo opisano dwa uzupełniające się podejścia: leczenie komórek nowotworowych za pomocą pożywki kondycjonowanej pochodzącej z fibroblastów (CM) oraz bezpośrednia kohodowla fibroblastów z komórkami nowotworowymi. Łącznie metodologie te stanowią kompleksowy zestaw narzędzi do badania dynamicznych interakcji między CAF a komórkami nowotworowymi, nie tylko w PCa, ale potencjalnie w wielu nowotworach u ludzi. Co więcej, charakterystyka molekularna tych interakcji może ujawnić kluczowe mediatory onkogenezy napędzanej przez CAF, oferując obiecujące cele interwencji terapeutycznej.

Pary CAF i NF od 7 pacjentów z PCa o wysokim stopniu złośliwości udało się wyizolować za pomocą tego protokołu. Wiek pacjentów w momencie operacji i wyniki Gleasona podsumowano w Tabeli 3. Aby ocenić czystość pochodnych populacji fibroblastów, pasażujące dwa pierwotne CAF i NF odłączono i wybarwiono wskazanymi przeciwciałami fluorescencyjnymi lub jodkiem propidyny w celu oceny apoptozy. Reprezentatywne wyniki późniejszej analizy FACS przedstawiono na <strong class="xfig"...

Protokół ten zapewnia kompleksową procedurę izolacji, ekspansji i unieśmiertelnienia fibroblastów z radykalnej prostatektomii. Ponadto opisano testy opracowane w celu oceny funkcjonalnych skutków przesłuchu fibroblast-komórki nowotworowe, wykorzystujące zarówno leczenie pożywką kondycjonowaną, jak i kokulturę.

Izolacja, hodowla i charakterystyka fibroblastów związanych z rakiem prostaty

Tumor stroma can be actively shaped by tumor cells to adopt pro-tumorigenic properties, making it a focal point of cancer research. Among the stromal ...

Naszym celem jest zrozumienie mechanizmu, za pomocą którego fibroblasty związane z rakiem przyczyniają się do progresji guza w raku prostaty, mając na celu zneutralizowanie tego przesłuchu jako strategii terapeutycznej. Odrębne populacje CAF o różnych właściwościach można ocenić w organoidach 3D uzyskanych przy użyciu komórek nowotworowych i zrębowych po różnych manipulacjach. Nasz protokół pozwala na niezawodne generowanie CAFów do tych celów.Głównymi wyzwaniami są: niezawodna izolacja komórek nowotworowych i prawidłowych komórek z mikrośrodowisk tych samych pacjentów, niejednorodność, brak specyficznych markerów CAF, plastyczność CAF oraz ograniczone modele in vitro podsumowujące złożoność TME. Za pomocą podobnych metod scharakteryzowaliśmy fundamentalną pronowotworową rolę czynnika transkrypcyjnego STAT3 i jego genów docelowych w mysich CAF raka piersi, wykazując ich skuteczność jako celów terapeutycznych. Optymalna izolacja fibroblastów z guza i przyległych normalnych regionów radykalnej prostatektomii próbki uzyskane od pacjentów z rakiem prostaty przy użyciu niewielkiej ilości tkanki.Na początek zważ próbki tkanek na wadze w pierwszym dniu w celu izolacji fibroblastów. Za pomocą sterylnych kleszczy przenieś tkankę do sześciocentymetrowych naczyń. Umyj tkankę dwa razy w czterech mililitrach lodowatego PBS i dwa razy w czterech mililitrach lodowatego kompletnego DMEM.Teraz przenieś tkankę na sześciocentymetrową płytkę na lodzie. Dodaj jeden mililitr DMEM uzupełnionego antybiotykiem na talerz. Następnie za pomocą nożyczek lub ostrzy rozdrobnij tkankę na fragmenty mniejsze niż jeden milimetr kwadratowy.Przenieś zmieloną tkankę do 15-mililitrowej stożkowej probówki zawierającej pięć mililitrów lodowatego kompletnego DMEM. Następnie odwirować zawiesinę o sile 754 g przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Za pomocą pipety o pojemności 10 mililitrów usuń supernatant.Ponownie zawiesić osad w pięciu mililitrach lodowatego zimnego kompletnego DMEM i ponownie odwirować. Po usunięciu supernatantu ponownie zawiesić osad w roztworze kolagenazy II. Przenieś zawiesinę do mikroprobówek o pojemności 1,5 mililitra.Uszczelnij mikroprobówki folią parafinową. Następnie umieść je w temperaturze 37 stopni Celsjusza do trawienia przez noc z ciągłym kołysaniem przez osiem do 12 godzin. Następnego dnia przenieś strawione próbki do 15-mililitrowych stożkowych probówek.Odpipetuj pięć mililitrów lodowatego zimnego, kompletnego DMEM, aby dezaktywować kolagenazę. Następnie odwirować zawiesinę o sile 754 g przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Zawiesić osad w jednym mililitrze 0,05% trypsyny-EDTA po odpipetowaniu supernatantu.Inkubować przez pięć minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza, od czasu do czasu wstrząsając. Następnie odpipetować jeden mililitr świeżo przygotowanego roztworu DNazy I do próbek i dobrze wymieszać. Po odwirowaniu i usunięciu supernatantu, ponownie zawiesić osad w pięciu mililitrach zimnego kompletnego DMEM i ponownie odwirować.Ponownie zawiesić powstałe komórki w kompletnym DMEM uzupełnionym 20% płodową surowicą bydlęcą. Umieść komórki na płytkach i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla i 95% wilgotnością przez co najmniej trzy dni. Po trzech dniach zbadaj komórki pod kątem morfologii i żywotności.Gdy komórki osiągną zbieg, przenieś je do 10-centymetrowego naczynia zawierającego kompletny DMEM z 20% płodową surowicą bydlęcą. Płytki fibroblastów związanych z rakiem lub normalnych fibroblastów przy 70% konfluencji w 12-dołkowych płytkach. Następnego dnia dodaj 0,45 grama agaru o niskiej temperaturze topnienia do 12,5 mililitra PBS w stożkowej probówce o pojemności 50 mililitrów w sterylnych warunkach.Rozpuść mieszaninę za pomocą kuchenki mikrofalowej. Schłodzić roztwór agaru do 37 stopni Celsjusza. Następnie rozcieńczyć w stosunku jeden do czterech wstępnie podgrzanym kompletnym DMEM, aby przygotować roztwór roboczy.Odessać pożywkę z płytki 12-dołkowej. Odpipetować 500 mikrolitrów roboczego roztworu agaru do każdej studzienki. Inkubować przez 20 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza, aby umożliwić zestalenie się agaru.W międzyczasie utrzymuj pozostały roztwór agaru w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Trypsynizuj komórki nowotworowe i przygotuj zawiesinę komórkową 20 000 komórek na mililitr. Wymieszaj równe objętości zawiesiny komórek nowotworowych i roztworu agaru, aby uzyskać końcową objętość siedmiu mililitrów, co odpowiada trzem powtórzeniom technicznym na każdy warunek.Pipetuj w górę i w dół wiele razy, aby zapewnić równomierne mieszanie. Następnie dozować 500 mikrolitrów tej mieszaniny zawierającej około 5 000 komórek na wierzchu zestalonej warstwy podstawowej w każdym dołku. Po pozostawieniu agaru do zestalenia się przez 20 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza, dodaj jeden mililitr kompletnego DMEM do każdej studzienki.Zmieniaj podłoże co drugi dzień, delikatnie zasysając od krawędzi studzienki i dodając świeże podłoże do środka. Wysiaduj tak długo, aż kolonie staną się dobrze widoczne. Gdy kolonie są widoczne, wyrzuć pożywkę hodowlaną.Następnie wybarwić kolonie 200 mikrolitrami roztworu chlorku tetrazolu Nitro blue. Inkubować przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza w wilgotnym inkubatorze. Następnego dnia wyrzuć roztwór barwiący.Uzyskuj obrazy barwionych kolonii za pomocą mikroskopu stereoskopowego. Udało się wyizolować czyste fibroblasty. W wielu przypadkach, szczególnie we wczesnych pasażach, fibroblasty związane z rakiem wykazywały morfologię bardziej wrzecionowatą w porównaniu z normalnymi fibroblastami.Analiza ilościowa potwierdziła, że proliferacja komórek DU145 leczonych pożywką kondycjonowaną fibroblastami związanymi z rakiem była znacznie wyższa w ciągu 120 godzin niż w przypadku osób leczonych normalnymi pożywkami kondycjonowanymi fibroblastami lub pozostawionych nieleczonych. Komórki DU145 hodowane bezpośrednio z fibroblastami związanymi z rakiem i normalnymi fibroblastami również wykazywały zwiększoną proliferację w ciągu 96 godzin w porównaniu z kontrolami. Odpowiednie krzywe wzrostu wykazały, że jednoczesna hodowla z prawidłowymi fibroblastami związanymi z rakiem spowodowała podobny wzrost proliferacji DU145 w czasie.Wpływ kondycjonowanych pożywek na proliferację DU145 różnił się w zależności od par fibroblastów związanych z rakiem i normalnych fibroblastów, przy czym pary wczesnego pasażu wykazywały znacznie silniejsze efekty niż późniejsze. W testach tworzenia miękkich kolonii agarowych zarówno związane z rakiem, jak i normalne fibroblasty zwiększały liczbę i wielkość kolonii DU145 w porównaniu z kontrolami, co wskazuje na zwiększony wzrost niezależny od zakotwiczenia. Oderwane warstwy fibroblastów powstałe w wyniku problemów technicznych uniemożliwiły tworzenie się kolonii w niektórych powtórzeniach.Same kondycjonowane pożywki nie sprzyjały tworzeniu się kolonii niezależnych od zakotwiczenia w komórkach DU145.

isolation-culture-characterization-prostate-cancer-associated

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Badania nad rakiem

Fibroblasty związane z nowotworem (CAFs) wspomagają inicjację, wzrost i progresję guza poprzez sygnalizację promującą proliferację, angiogenezę i stan zapalny. W niniejszej pracy opisujemy metodę izolacji czystych populacji prawidłowych fibroblastów oraz CAFs z pobranych na świeżo tkanek mysich i ludzkich za pomocą sortowania komórek, wykorzystując PDGFRα jako marker powierzchniowy.

Izolacja fibroblastów prawidłowych i związanych z nowotworem z tkanek świeżych za pomocą sortowania komórek aktywowanego fluorescencją (FACS)

Izolacja nowotworowych komórek macierzystych (CSC) bezpośrednio z tkanek ludzkich jest niezbędna do ich biologicznej charakterystyki. Niniejszy manuskrypt opisuje metodologię izolacji CSC prostaty od tkanek ludzkich, a także zawiera wskazówki dotyczące rozwiązywania trudnych etapów.

Izolacja nowotworowych komórek macierzystych z próbek ludzkiego raka prostaty

Tutaj prezentujemy protokół do ko-hodowli w trzech wymiarach, który jest przydatny do badania interakcji wielokomórkowych i zależnej od macierzy zewnątrzkomórkowej modulacji zachowania komórek rakowych. W tym eksperymentalnym modelu komórki rakowe są hodowane na żelach kolagenowych osadzonych w ludzkich fibroblastach związanych z rakiem.

Trójwymiarowy model kokultury dla interakcji guz-zręb

Zachowanie fibroblastów leży u podstaw całego spektrum jednostek klinicznych, ale pozostają one słabo scharakteryzowane, głównie ze względu na ich wrodzoną heterogeniczność. Tradycyjne badania nad fibroblastami opierają się na manipulacji in vitro, maskowaniu zachowania fibroblastów in vivo. Opisujemy oparty na FACS protokół izolacji fibroblastów skóry myszy, który nie wymaga hodowli komórkowej.

Izolacja fibroblastów skórnych myszy metodą FACS

Tutaj prezentujemy metodę tworzenia szybkiego systemu in vitro, który wspiera trójwymiarową hodowlę i późniejsze różnicowanie światła pierwotnych komórek nabłonka prostaty.

System hodowli 3D oparty na szybkiej wkładce filtrującej do pierwotnego różnicowania komórek gruczołu krokowego

Ten manuskrypt opisuje oparty na FACS protokół izolacji brodawkowatych i siateczkowatych fibroblastów z ludzkiej skóry. Omija hodowlę in vitro, która była nieunikniona w przypadku powszechnie stosowanego protokołu izolacji za pomocą kultur eksplantatów. Emanujące podzbiory fibroblastów są funkcjonalnie odrębne i wykazują zróżnicowaną ekspresję i lokalizację genów w skórze właściwej.

Izolacja fibroblastów brodawkowatych i siatkowatych ze skóry ludzkiej za pomocą sortowania komórek aktywowanego fluorescencją

Przedstawiamy protokół do izolacji pierwotnych dorosłych fibroblastów w łatwy, szybki i niezawodny sposób, możliwy do wykonania przez początkujących (np. studentów). Zabieg łączy enzymatyczne trawienie tkanek i mechaniczne mieszanie z falami ultradźwiękowymi w celu uzyskania pierwotnych fibroblastów. Protokół można łatwo dostosować do konkretnych wymagań eksperymentalnych (np. tkanki ludzkiej).

Wspomagana ultradźwiękami pierwotna izolacja fibroblastów dorosłych

Korzystając z ludzkich pierwotnych komórek nabłonka prostaty, przedstawiamy nową, wolną od biomarkerów metodę funkcjonalnej charakterystyki komórek macierzystych za pomocą testu retencji znaczników opartego na sferoidach. Opisano protokół krok po kroku dla znakowania komórek BrdU, CFSE lub Far Red 2D; trójwymiarowe tworzenie sferoid; identyfikacja komórek macierzystych zachowujących znacznik za pomocą immunocytochemii; i izolacja przez FACS.

Izolacja komórek macierzystych z trójwymiarowych kultur sferoidalnych

Uzyskanie czystej populacji fibroblastów jest kluczowe dla badania ich roli w gojeniu ran i zwłóknieniu. Opisano tutaj szczegółową metodę izolowania fibroblastów i miofibroblastów z nieuszkodzonych i uszkodzonych serc myszy, a następnie scharakteryzowanie ich czystości i funkcjonalności za pomocą immunofluorescencji, RTPCR, sortowania komórek wspomaganego fluorescencją i skurczu żelu kolagenowego.

Izolacja i charakterystyka dorosłych fibroblastów i miofibroblastów serca

Ten artykuł ma na celu dostarczenie protokołu izolacji i hodowli pierwotnych fibroblastów związanych z rakiem z syngenicznego mysiego modelu potrójnie ujemnego raka piersi oraz ich zastosowanie w badaniach przedklinicznych nowych nanocząstek zaprojektowanych do celowania w mikrośrodowisko guza.

Izolacja pierwotnych fibroblastów związanych z rakiem z syngenicznego mysiego modelu raka piersi w celu zbadania celowanych nanocząstek

Wielokomórkowe sferoidy guza 3D zostały przygotowane z komórkami gruczolakoraka płuc, fibroblastami i monocytami, a następnie wyizolowano fibroblasty związane z rakiem (CAF) z tych sferoidów. Izolowane CAF porównano z normalnymi fibroblastami w celu oceny zdrowia mitochondriów poprzez badanie potencjału transbłonowego mitochondriów, reaktywnych form tlenu i aktywności enzymatycznej.

Ocena zdrowia mitochondriów w fibroblastach związanych z rakiem wyizolowanych z wielokomórkowych sferoid 3D guza płuc

Poznaj metodę izolacji i hodowli fibroblastów związanych z rakiem prostaty z tkanek po prostatektomii radykalnej. Protokół umożliwia badanie interakcji między fibroblastami a komórkami nowotworowymi w mikrośrodowisku guza.

Izolacja, hodowla i charakterystyka fibroblastów związanych z rakiem prostaty

Przeglądaj więcej filmów