Name: Desorpcja/jonizacja laserowa wspomagana matrycą pod wpływem fluorescencji ze spektrometrią mas z indukowaną laserem spektrometrią mas z jonizacji poszczególnych komórek nerwowych szczura (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-05-23T14:50:00.000+00:00
Duration: 8 min 48 s
Description: Odkryj analizę pojedynczych komórek nerwowych szczura za pomocą MALDI-2 z przewodzeniem fluorescencyjnym. Ta metoda ujawnia heterogeniczność lipidową i łączy profile molekularne z tożsamością komórkową.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

S.W.C dziękuje za wsparcie udzielone przez Peixin He and Xiaoming Chen PhD4 Fellowship oraz University of Illinois Block Grant Fellowship. Prace te były również wspierane przez National Institute on Drug Abuse w ramach nagrody nr 1. P30DA018310, National Institute on Aging w ramach nagrody nr. R01AG078797 oraz przez Biuro Dyrektora Narodowych Instytutów Zdrowia pod numerem nagrody S10OD032242.

<ol><li>Sunshine, H., Iruela-Arispe, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+lipids+and+cell+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Lipidol%22%5BJournal%5D)">Membrane lipids and cell signaling.</a> Curr Opin Lipidol. 28 (5), 408-413 (2017).</li>
<li>Van Meer, G., Voelker, D. R., Feigenson, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+lipids%3A+where+they+are+and+how+they+behave%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Membrane lipids: where they are and how they behave.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 9 (2), 112-124 (2008).</li>
<li>Cheng, K. W., Su, P. R., Feller, K. J. A., Chien, M. P., Hsu, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigating+the+Metabolic+Heterogeneity+of+Cancer+Cells+Using+Functional+Single-Cell+Selection+and+nLC+Combined+with+Multinozzle+Emitter+Mass+Spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Investigating the Metabolic Heterogeneity of Cancer Cells Using Functional Single-Cell Selection and nLC Combined with Multinozzle Emitter Mass Spectrometry.</a> Anal Chem. 96 (2), 624-629 (2024).</li>
<li>Neumann, E. K., Comi, T. J., Rubakhin, S. S., Sweedler, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+Heterogeneity+between+Astrocytes+and+Neurons+Revealed+by+Single-Cell+MALDI-MS+Combined+with+Immunocytochemical+Classification%5BTitle%5D)+AND+%22Ange+Chem%22%5BJournal%5D)">Lipid Heterogeneity between Astrocytes and Neurons Revealed by Single-Cell MALDI-MS Combined with Immunocytochemical Classification.</a> Ange Chem. 131 (18), 5971-5975 (2019).</li>
<li>Bhaduri, A., Neumann, E. K., Kriegstein, A. R., Sweedler, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+Lipid+Heterogeneity+and+Diversity+in+the+Developing+Human+Brain%5BTitle%5D)+AND+%22JACS+Au%22%5BJournal%5D)">Identification of Lipid Heterogeneity and Diversity in the Developing Human Brain.</a> JACS Au. 1 (12), 2261-2270 (2021).</li>
<li>Saliba, A. E., Westermann, A. J., Gorski, S. A., Vogel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+RNA-seq%3A+advances+and+future+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Nuc+Acid+Res%22%5BJournal%5D)">Single-cell RNA-seq: advances and future challenges.</a> Nuc Acid Res. 42 (14), 8845-8860 (2014).</li>
<li>Karas, M., Hillenkamp, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+desorption+ionization+of+proteins+with+molecular+masses+exceeding+10%2C000+daltons%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Laser desorption ionization of proteins with molecular masses exceeding 10,000 daltons.</a> Anal Chem. 60 (20), 2299-2301 (1988).</li>
<li>Croslow, S. W., Trinklein, T. J., Sweedler, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+multimodal+mass+spectrometry+for+single-cell+analysis+and+imaging+enhancement%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Advances in multimodal mass spectrometry for single-cell analysis and imaging enhancement.</a> FEBS Lett. 598 (6), 591-601 (2024).</li>
<li>Bien, T., Bessler, S., Dreisewerd, K., Soltwisch, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transmission-Mode+MALDI+Mass+Spectrometry+Imaging+of+Single+Cells%3A+Optimizing+Sample+Preparation+Protocols%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Transmission-Mode MALDI Mass Spectrometry Imaging of Single Cells: Optimizing Sample Preparation Protocols.</a> Anal Chem. 93 (10), 4513-4520 (2021).</li>
<li>Rappez, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SpaceM+reveals+metabolic+states+of+single+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">SpaceM reveals metabolic states of single cells.</a> Nat Methods. 18 (7), 799-805 (2021).</li>
<li>Comi, T. J., Neumann, E. K., Do, T. D., Sweedler, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((microMS%3A+A+Python+Platform+for+Image-Guided+Mass+Spectrometry+Profiling%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Soc+Mass+Spec%22%5BJournal%5D)">microMS: A Python Platform for Image-Guided Mass Spectrometry Profiling.</a> J Am Soc Mass Spec. 28 (9), 1919-1928 (2017).</li>
<li>Xie, Y. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiscale+biochemical+mapping+of+the+brain+through+deep-learning-enhanced+high-throughput+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Multiscale biochemical mapping of the brain through deep-learning-enhanced high-throughput mass spectrometry.</a> Nat Methods. 21 (3), 521-530 (2024).</li>
<li>Neumann, E. K., Ellis, J. F., Triplett, A. E., Rubakhin, S. S., Sweedler, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+Analysis+of+30+000+Individual+Rodent+Cerebellar+Cells+Using+High-Resolution+Mass+Spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Lipid Analysis of 30 000 Individual Rodent Cerebellar Cells Using High-Resolution Mass Spectrometry.</a> Anal Chem. 91 (12), 7871-7878 (2019).</li>
<li>Soltwisch, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+spectrometry+imaging+with+laser-induced+postionization%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Mass spectrometry imaging with laser-induced postionization.</a> Science. 348 (6231), 211-215 (2015).</li>
<li>Barré, F. P. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+Sensitivity+Using+MALDI+Imaging+Coupled+with+Laser+Postionization+%28MALDI-2%29+for+Pharmaceutical+Research%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Enhanced Sensitivity Using MALDI Imaging Coupled with Laser Postionization (MALDI-2) for Pharmaceutical Research.</a> Anal Chem. 91 (16), 10840-10848 (2019).</li>
<li>McKinnon, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MALDI-2-Enabled+Oversampling+for+the+Mass+Spectrometry+Imaging+of+Metabolites+at+Single-Cell+Resolution%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Soc+Mass+Spec%22%5BJournal%5D)">MALDI-2-Enabled Oversampling for the Mass Spectrometry Imaging of Metabolites at Single-Cell Resolution.</a> J Am Soc Mass Spec. 35 (11), 2729-2742 (2024).</li>
<li>Comi, T. J., Makurath, M. A., Philip, M. C., Rubakhin, S. S., Sweedler, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MALDI+MS+Guided+Liquid+Microjunction+Extraction+for+Capillary+Electrophoresis-Electrospray+Ionization+MS+Analysis+of+Single+Pancreatic+Islet+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">MALDI MS Guided Liquid Microjunction Extraction for Capillary Electrophoresis-Electrospray Ionization MS Analysis of Single Pancreatic Islet Cells.</a> Anal Chem. 89 (14), 7765-7772 (2017).</li>
<li>Wu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcardiac+Perfusion+of+the+Mouse+for+Brain+Tissue+Dissection+and+Fixation%5BTitle%5D)+AND+%22Bio+Protoc%22%5BJournal%5D)">Transcardiac Perfusion of the Mouse for Brain Tissue Dissection and Fixation.</a> Bio Protoc. 11 (5), e3988(2021).</li>
<li>Aboghazleh, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rodent+brain+extraction+and+dissection%3A+A+comprehensive+approach%5BTitle%5D)+AND+%22MethodsX%22%5BJournal%5D)">Rodent brain extraction and dissection: A comprehensive approach.</a> MethodsX. 12, 102516(2024).</li>
<li>Jager, L. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+enzymatic+and+mechanical+methods+of+dissociation+on+neural+progenitor+cells+derived+from+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Med+Sci%22%5BJournal%5D)">Effect of enzymatic and mechanical methods of dissociation on neural progenitor cells derived from induced pluripotent stem cells.</a> Adv Med Sci. 61 (1), 78-84 (2016).</li>
<li>Chan-Andersen, P. C., Romanova, E. V., Rubakhin, S. S., Sweedler, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Profiling+26%2C000+Aplysia+californica+neurons+by+single+cell+mass+spectrometry+reveals+neuronal+populations+with+distinct+neuropeptide+profiles%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Profiling 26,000 Aplysia californica neurons by single cell mass spectrometry reveals neuronal populations with distinct neuropeptide profiles.</a> J Biol Chem. 298 (8), 102254(2022).</li>
<li>Castro, D. C., Xie, Y. R., Rubakhin, S. S., Romanova, E. V., Sweedler, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Image-guided+MALDI+mass+spectrometry+for+high-throughput+single-organelle+characterization%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Image-guided MALDI mass spectrometry for high-throughput single-organelle characterization.</a> Nat Methods. 18 (10), 1233-1238 (2021).</li>
<li>Castro, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-Cell+and+Subcellular+Analysis+Using+Ultrahigh+Resolution+21+T+MALDI+FTICR+Mass+Spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Single-Cell and Subcellular Analysis Using Ultrahigh Resolution 21 T MALDI FTICR Mass Spectrometry.</a> Anal Chem. 95 (17), 6980-6988 (2023).</li>
<li>Ibáñez, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+spectrometry-based+metabolomics+of+single+yeast+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Mass spectrometry-based metabolomics of single yeast cells.</a> Proc Natl Acad Sci. 110 (22), 8790-8794 (2013).</li>
<li>Krestensen, K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+Profiling+of+Glioblastoma+Patient-Derived+Single+Cells+Using+Combined+MALDI-MSI+and+MALDI-IHC%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Molecular Profiling of Glioblastoma Patient-Derived Single Cells Using Combined MALDI-MSI and MALDI-IHC.</a> Anal Chem. 97 (7), 3846-3854 (2025).</li>
<li>Niehaus, M., Soltwisch, J., Belov, M. E., Dreisewerd, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transmission-mode+MALDI-2+mass+spectrometry+imaging+of+cells+and+tissues+at+subcellular+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Transmission-mode MALDI-2 mass spectrometry imaging of cells and tissues at subcellular resolution.</a> Nat Methods. 16 (9), 925-931 (2019).</li>
<li>Xie, Y. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Data-Driven+and+Machine+Learning-Based+Framework+for+Image-Guided+Single-Cell+Mass+Spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Data-Driven and Machine Learning-Based Framework for Image-Guided Single-Cell Mass Spectrometry.</a> J Proteome Res. 22 (2), 491-500 (2023).</li>
<li>Luu, G. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TIMSCONVERT%3A+a+workflow+to+convert+trapped+ion+mobility+data+to+open+data+formats%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">TIMSCONVERT: a workflow to convert trapped ion mobility data to open data formats.</a> Bioinformatics. 38 (16), 4046-4047 (2022).</li>
<li>Vandergrift, G. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+and+Computational+Evaluation+of+Lipidomic+In-Source+Fragmentation+as+a+Result+of+Postionization+with+Matrix-Assisted+Laser+Desorption%2FIonization%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Experimental and Computational Evaluation of Lipidomic In-Source Fragmentation as a Result of Postionization with Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization.</a> Anal Chem. 96 (41), 16127-16133 (2024).</li>
<li>Zhang, Y., Parmigiani, G., Johnson, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ComBat-seq%3A+batch+effect+adjustment+for+RNA-seq+count+data%5BTitle%5D)+AND+%22NAR+Genom+Bioinfo%22%5BJournal%5D)">ComBat-seq: batch effect adjustment for RNA-seq count data.</a> NAR Genom Bioinfo. 2 (3), lqaa078(2020).</li>
<li>Nemes, P., Knolhoff, A. M., Rubakhin, S. S., Sweedler, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-Cell+Metabolomics%3A+Changes+in+the+Metabolome+of+Freshly+Isolated+and+Cultured+Neurons%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chem+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Single-Cell Metabolomics: Changes in the Metabolome of Freshly Isolated and Cultured Neurons.</a> ACS Chem Neurosci. 3 (10), 782-792 (2012).</li>
</ol>

Autorzy nie mają żadnych sprzecznych interesów, które mogliby ujawnić.

Wysokoprzepustowe, sterowane obrazem pojedyncze komórki MALDI MS jest cennym narzędziem do zrozumienia niejednorodności chemicznej w skali pojedynczej komórki. Dodanie postjonizacji indukowanej laserem (MALDI-2) zapewnia głębsze pokrycie analitem, co ma kluczowe znaczenie w przypadku próbek o ograniczonej masie i objętości, takich jak izolowane komórki ssaków.
Podczas gdy zdecydowana większość opublikowanych przepływów pracy z lipidami i metabolitami w SM w pojedynczych komórkach wykorzystuje ...

Lipidy i metabolity są podstawą funkcji komórkowej i służą jako niezbędne składniki błon, źródeł energii i cząsteczek sygnałowych1,2. Jednak ich skład i liczebność mogą się znacznie różnić między poszczególnymi komórkami, odzwierciedlając różnice w typach komórek oraz stanach rozwojowych i funkcjonalnych3,4,5. Analiza tych różnic ma kluczowe znaczenie dla zrozumienia zmienności biologicznej i identyfikacji odrębnych subpopulacji komórek. Techniki pomiaru pojedynczych komórek, takie jak sekwencjonowanie RNA, zapewniają przydatne profile transkryptów specyficzne dla komórki6. Jednak te pomiary na poziomie transkryptu nie odzwierciedlają bezpośrednio rzeczywistych komórkowych ilości lipidów i metabolitów, ponieważ ekspresja genów nie zawsze koreluje z rzeczywistą obfitością tych analitów. Specjalistyczne metody bezpośrednich pomiarów lipidów i metabolitów są zatem niezbędne do kompleksowej analizy składu chemicznego pojedynczych komórek i ich populacji.
Obrazowanie metodą spektrometrii mas (MSI) wspomaganej laserową desorpcją/jonizacją (MALDI) jest narzędziem do mapowania przestrzennego endogennych biomolekuł in situ7,8. Zazwyczaj w przypadku MALDI laser UV jest używany do ablacji materiału z cienkiej warstwy próbki skrystalizowanej z matrycą organiczną, tworząc pióropusz jonów i obojętnych cząsteczek. Powstałe jony są następnie rozdzielane przez analizator MS i wykrywane w spektrometrze mas. Biorąc pod uwagę dokładne pozycjonowanie nowoczesnych stopni spektrometru masowego, laser może być ustawiony tak, aby celować w określone obszary próbki lub rastrować w różnych regionach w celu generowania obrazów molekularnych przez MSI. MSI w komórkowej lub subkomórkowej rozdzielczości przestrzennej (< 10 μm), osiągnięty dzięki skupionej wiązce laserowej i dokładnemu ruchowi stolika, może być wykorzystany do uzyskania informacji chemicznych o poszczególnych komórkach9,10. Jednak pomiary MSI w tej skali są nieefektywne, szczególnie w przypadku próbek o niskiej docelowej gęstości komórek, ze względu na ilość czasu poświęconego na obrazowanie pustych obszarów między komórkami. Ponadto wykrywalność wielu analitów jest ograniczona ze względu na małą objętość pobieranych próbek. Aby sprostać tym wyzwaniom, opracowaliśmy oparte na obrazie podejście MALDI MS do wysokoprzepustowej analizy pojedynczych komórek11,12. W tym podejściu lokalizacje rozproszonych komórek są programowo określane na podstawie obrazów fluorescencyjnych całego szkiełka i wykorzystywane do kierowania stolika spektrometru mas do pozycji, w których znajdują się pojedyncze komórki o określonych parametrach (np. wielkości i kształcie), a następnie są analizowane za pomocą naświetlania laserem MALDI. Wcześniejsze prace wykorzystujące to ukierunkowane podejście zostały wykorzystane do scharakteryzowania lipidów, peptydów i innych biomolekuł w heterogenicznych populacjach komórek5,13.
Biorąc pod uwagę ograniczony masowo charakter pojedynczych komórek, liczba analitów wykrywanych w takich próbkach jest zazwyczaj mniejsza niż ta obserwowana bezpośrednio z tkanki. Dlatego, aby zwiększyć pokrycie analitem w analizie stwardnienia rozsianego w pojedynczych komórkach, kluczowe znaczenie ma zwiększenie czułości wykrywania analitu. Jednym z ostatnio opracowanych podejść, które pomaga w przezwyciężeniu tego wyzwania wykrywania, jest MALDI z laserową postjonizacją (MALDI-2), która, jak wykazano, zwiększa czułość dla szerokiej gamy analitów9,14,15,16. W rezultacie, MALDI-2 generuje bardziej kompleksowe zestawy danych pojedynczych komórek i zapewnia głębsze pokrycie molekularne w próbkach o ograniczonej masie, takich jak izolowane komórki.
Celem tej metody jest uzyskanie pomiarów lipidów z tysięcy pojedynczych komórek. W tym celu opisujemy przepływ pracy, który umożliwia wysokoprzepustową spektrometrię mas MALDI-2 w pojedynczej komórce i można go ogólnie rozszerzyć na dowolne podejście do spektrometrii mas oparte na sondzie z precyzyjną kontrolą etapu17. W tym przepływie pracy tkanka z obszaru (regionów) mózgu będącego przedmiotem zainteresowania jest preparowana, a poszczególne komórki są uzyskiwane z tkanki po procedurze dysocjacji papainy. Komórki są następnie znakowane barwnikiem jądrowym i rozpraszane na przewodzących szkiełkach przewodzących wytrawionych znacznikami odniesienia, gdzie mogą przylegać. Następnie wykonywane są obrazy całego preparatu za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. Matryca jest osadzana w procesie sublimacji, generując powtarzalną jednorodną warstwę krystaliczną i wysoki stosunek sygnału do szumu do analizy MS w jednej komórce. Korzystając z oprogramowania open source microMS11, względne współrzędne lokalizacji komórek z obrazu mikroskopowego są mapowane i wyrównywane ze współrzędnymi stopnia spektrometru mas za pomocą rejestracji punktowej przy użyciu znaczników odniesienia wytrawionych na szkiełkach, na których zdeponowano komórki. Wreszcie, korzystając z tych informacji, z każdej pojedynczej komórki uzyskuje się precyzyjne, ukierunkowane widma MS, co pozwala na profilowanie tysięcy komórek w jednym przebiegu (<1 h)12,13.

<table><tbody><tr><td>2',5'-dihydroksyacetofenon</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D107603</td><td>DHAP, czystość 97%</td></tr><tr><td>Octan amonu</td><td>Sigma Aldrich</td><td>238074</td><td>odczynnik ACS, &ge; 97%</td></tr><tr><td>Axio M2 Imager</td><td>Zeiss</td><td>N/A</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Dziurkacz do biopsji, 2 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-460-399</td><td>integra miltex standardowy dziurkacz do biopsji, 2mm</td></tr><tr><td>Chlorek wapnia</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C4901</td><td>bezwodny, proszek &ge; 97%</td></tr><tr><td>Eppendorf Wirówka</td><td>Sigma Aldrich</td><td>EP5405000441</td> wirówka <td>5425 z wirnikiem FA-24x2</td></tr><tr><td>Gentamyna</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G1272</td><td>płyn, BioReagent</td></tr><tr><td>Szkiełko do wytrawiania</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Z225568</td><td>czas węglika, opakowanie 1</td></tr><tr>odczynnika<td>Glycerol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G7893</td><td>ACS, &ge; 99,5%</td></tr><tr><td>Bufor HEPES</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H3375</td><td>&ge; 99,5% (miareczkowanie)</td></tr><tr><td>Hoechst 33258 Roztwór</td><td>Sigma Aldrich</td><td>94403</td><td>1 mg/ml w H2O, &ge; 98,0% (HPLC)</td></tr><tr><td>W linii Filtr HEPA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>WHA67225001</td><td>VACU-GUARD Tarcza 60 mm, obudowa 0,45 PFTE</td></tr><tr><td>Szkiełka mikroskopowe z powłoką ITO</td><td>Delta Technologies</td><td>CG-90IN-S115</td><td>70-100&Omega; odporność</td></tr><tr><td>Chlorek magnezu</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M8266</td><td>bezwodny, &ge; 98%</td></tr><tr><td>Siarczan magnezu</td><td>Sigma Aldrich</td><td>208094</td><td>bezwodny, &ge; 97%</td></tr><tr><td>Probówki do mikrowirówek</td><td>Sigma Aldrich</td><td>HS4323K</td><td>probówka o pojemności 1,5 ml, opakowanie 500</td></tr><tr><td>sztuk System dysocjacji papainy</td><td>Worthington Biochemical&nbsp;</td><td>LK003150</td><td>jednym pudełku, 5 fiolek jednorazowego użytku</td></tr><tr><td>Penicylina-Streptomycyna</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P4458</td><td>płyn, BioReagent</td></tr><tr><td>Chlorek potasu</td><td>Sigma Aldrich</td><td>529552</td><td>Klasa biologii molekularnej</td></tr><tr><td>Fosforan potasu jednozasadowy</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P5379</td><td>Odczynnik Plus</td></tr><tr><td>Biowęglan sodu</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S6014</td><td>ACS, &ge; 99,7%</td></tr> <tr><td>Chlorek sodu</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S9888</td><td>Odczynnik ACS, &ge; 99%</td></tr> <tr><td>Wodorotlenek sodu</td><td>Sigma Aldrich</td><td>221465</td><td>odczynnik ACS, &ge; 97%, granulki</td></tr><tr><td>Fosforan sodu dwuzasadowy</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S9763</td><td>Odczynnik ACS, &ge; 99%</td></tr><tr><td>Sublimate</td><td>HTX</td><td>N/A</td><td>N/A</td></tr><tr><td>timsTOF FleX MALDI-2</td><td>Bruker</td><td>N/A</td><td>microGRID enabled</td></tr><tr><td>Rurki próżniowe&nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>8701-0080</td><td>Rurki PVC bez ftalanów Nalgene&nbsp;</td></tr></tbody></table>

desorpcja/jonizacja laserowa wspomagana matrycą pod wpływem fluorescencji ze spektrometrią mas z indukowaną laserem spektrometrią mas z jonizacji poszczególnych komórek nerwowych szczura

Fluorescence-Guided Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization with Laser-Induced Postionization Mass Spectrometry of Individual Rat Neural Cells

Pomiary pojedynczych komórek są kluczowe dla zrozumienia bogatej heterogeniczności czasochemicznej mózgu. Spektrometria mas (MS) z jonizacją laserową/desorpcyjną wspomaganą matrycą (MALDI) jest w stanie bezznacznikową, wysokoprzepustową charakteryzować endogenne cząsteczki w pojedynczych komórkach. Ostatnie postępy w rozwoju spektrometrów masowych MALDI z postjonizacją indukowaną laserem (MALDI-2) zapewniają znacznie zwiększoną czułość wykrywania różnych lipidów i innych małych cząsteczek. Jednak obrazowanie SM dużych próbek za pomocą MALDI-2 w rozdzielczości komórkowej jest zbyt wolne w większości zastosowań. W tym protokole komórki pierwotne są izolowane i rozpraszane na szkiełkach przewodzących. Względne lokalizacje komórek są określane za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej na całym szkiełku, a następnie dokładnej korejestracji współrzędnych mikroskopii ze współrzędnymi stopnia spektrometru mas MALDI-2. Ukierunkowana analiza MS tylko w lokalizacjach komórek zapewnia wysokowydajne, jednokomórkowe pomiary z dużym pokryciem analitu i zmniejszonym rozmiarem danych w porównaniu z obrazowaniem MS całej próbki. Opisujemy krytyczne etapy niezbędne do przygotowania pojedynczej komórki, obrazowania fluorescencyjnego na całym szkiełku, aplikacji matrycy i spektrometrii mas MALDI-2.

Przegląd schematu postępowania dla fluorescencyjnie sterowanej analizy MALDI-2 MS pojedynczych komórek przedstawiono na Rysunku 1. Najpierw tkankę wyciętą z wybranych obszarów mózgu (Rysunek 1A) dysocjuje się do pojedynczych komórek i nanosi na przewodzące szkiełka mikroskopowe powlekane ITO (Rysunek 1B). Pozycje komórek są określane za pomocą obrazowania fluorescencyjnego całego preparatu (Rysunek 1C>)...

Ten protokół opisuje użycie mikroMS do sterowanej fluorescencją, jednokomórkowej spektrometrii mas MALDI-2, umożliwiając lepsze profilowanie molekularne pierwotnych komórek neuronalnych szczura.

Desorpcja/jonizacja laserowa wspomagana matrycą pod wpływem fluorescencji ze spektrometrią mas z indukowaną laserem spektrometrią mas z jonizacji poszczególnych komórek nerwowych szczura

Single-cell measurements are critical to understanding the rich spatiochemical heterogeneity of the brain. Matrix-assisted laser/desorption ionization ...

Nasze badania koncentrują się na opracowywaniu wysokoprzepustowych, sterowanych obrazem, jednokomórkowych przepływów pracy spektrometrii mas MALDI w celu ujawnienia heterogeniczności komórkowej i powiązania profili molekularnych z tożsamością, funkcją i odpowiedzią komórek w złożonych systemach.Zaawansowane oprzyrządowanie, takie jak MALDI-2 i spektrometry mas o wysokiej rozdzielczości przestrzennej, umożliwiają ukierunkowaną, przestrzennie rozdzielczą analizę pojedynczych komórek, zwiększając czułość i rozszerzając zakres profilowania molekularnego w złożonych tkankach. Obecne wyzwania obejmują ograniczoną czułość, odtwarzalność próbek i złożoną analizę danych. Dane MALDI są często rzadkie, a duże zbiory danych z tysiącami komórek i setkami cząsteczek wymagają solidnych narzędzi obliczeniowych.Protokół ten wypełnia lukę w wysokoprzepustowych metodach analizy pojedynczych komórek, a nawet organelli, umożliwiając bardzo szczegółowe badania heterogeniczności i uzyskanie wglądu w biologię i funkcję molekularną i komórkową.Protokół ten umożliwia szybką, ukierunkowaną analizę komórek rozsianych po szkiełku, eliminując potrzebę manipulacji komórkami lub skanowania całego obszaru i znacznie zwiększając przepustowość.[Narrator] Na początek przepłucz każde szkiełko dwoma do trzech mililitrów 150-milimolowego octanu amonu, aby usunąć kryształy glicerolu i soli, które mogą zakłócać mikroskopię i aplikację matrycy MALDI, a następnie wysusz szkiełka pod delikatnym strumieniem azotu lub pozwól im całkowicie wyschnąć na powietrzu. Załaduj wysuszone szkiełko do stolika mikroskopu. Ustaw ostrość mikroskopu, używając co najmniej 10 punktów podparcia rozmieszczonych równomiernie na całym szkiełku. Korzystając z filtrów odpowiednich do DAPI i obrazowania w jasnym polu, uzyskaj kafelkowy obraz fluorescencyjny całego preparatu przy powiększeniu od 5 do 10 razy, zapewniając, że znaczniki odniesienia na szkiełkach mikroskopowych są wyraźnie uchwycone na obrazie. Zszyj kafelkowe obrazy za pomocą oprogramowania do mikroskopii, takiego jak ZEN ZEISS. Sprawdź, czy sąsiadujące pionowo kafelki nie są przesunięte. Przetwarzaj i eksportuj każdy zszyty obraz jako plik BigTIFF za pomocą oprogramowania mikroskopowego lub jako standardowy plik TIFF, jeśli ostateczny rozmiar obrazu jest mniejszy niż dwa gigabajty. Rozpuść 20 miligramów 2,5-dihydroksyacetofenonu w 1,5 mililitra acetonu. Umieść szkiełka w uchwycie komory sublimacyjnej, a następnie umieść uchwyt w aparacie sublimacyjnym. Odpipetować rozpuszczony roztwór matrycy na płytkę ceramiczną i pozwolić acetonowi całkowicie odparować, a następnie zamknąć komorę sublimacyjną, aby ją uszczelnić. Napełnij komorę chłodziwa błotem pośniegowym z lodowatej wody i umieść go bezpiecznie na komorze sublimacyjnej. Włącz pompę próżniową i pozwól systemowi osiągnąć równowagę przez pięć minut. Rozpocznij sublimację od podgrzania komory do 200 stopni Celsjusza przez pięć minut. Po pięciu minutach wyjmij lodowatą łaźnię wodną z komory. Ustaw temperaturę na 25 stopni Celsjusza i umieść radiator na górze komory. Powoli odpowietrz komorę sublimacyjną, aby uwolnić ciśnienie. Otwórz komorę i ostrożnie wyjmij szkiełka. Otwórz MicroMS i zdziesiątkuj obrazy mikroskopowe BigTIFF, korzystając z opcji grupy obrazów, aby uwzględnić zarówno kanały jasnego pola, jak i kanały fluorescencyjne. Przejdź do narzędzia Opcje obiektu blob i dostosuj maksymalny i minimalny rozmiar obiektu blob, aby zdefiniować dopuszczalny zakres rozmiarów obiektów blob. Ustaw próg kanału fluorescencji dla wykrywania plam. Określ wartość kołowości, aby określić, jak okrągłe muszą być zidentyfikowane komórki, aby można było wziąć pod uwagę, a następnie wybierz kolor. Użyj opcji Znajdź obiekt blob, aby wykryć obiekty blob. Po wyświetleniu monitu zapisz listę obiektów blob pod żądaną nazwą. Użyj narzędzia Filtr odległości, aby ustawić minimalną odległość między każdą komórką. Przetestuj błąd za pomocą punktów testowych, aby dokładnie określić błąd przesunięcia. Załaduj szkiełka do instrumentu za pomocą adaptera suwaka MTP II. Po powrocie do komputera z MicroMS uzyskaj dostęp do komputera ze spektrometrem mas za pomocą aplikacji na zdalny pulpit. Jeśli używasz instrumentu po raz pierwszy, sprawdź jego pozycję, przechodząc do Narzędzia, a następnie Ustawienia instrumentu. W oknie podręcznym wyświetl zestaw współrzędnych wraz z ich położeniami X i Y, a następnie wybierz każdy z tych konkretnych punktów na geometrii adaptera suwakowego II. Zaktualizuj pozycje X i Y w oknie MicroMS. Korzystając z kamery spektrometru mas i elementów sterujących spektrometru, przejdź do łatwego do zidentyfikowania miejsca na szkiełku i skopiuj współrzędne instrumentu. W MicroMS zlokalizuj tę samą pozycję na obrazie mikroskopu, kliknij prawym przyciskiem myszy i wprowadź współrzędne do wyskakującego okienka. Zaokrąglij współrzędne do najbliższych liczb całkowitych i oddziel je spacją. Po dodaniu trzech punktów rejestracyjnych, jedno z kółek zmieni kolor na czerwony, wskazując, że jest to najbardziej odległa pozycja od rejestracji. Usuń punkt rejestracji za pomocą Control + kliknij prawym przyciskiem myszy i spróbuj ponownie. W obszarze Plik przejdź do pozycji Zapisz, a następnie Rejestracja, aby zapisać plik rejestracyjny. Gdy plamy są widoczne na slajdzie, przejdź do Plik, Zapisz, a następnie pozycje instrumentu, aby zapisać plik pozycji instrumentu, a następnie za pomocą oprogramowania pulpitu zdalnego przenieś ten plik na komputer instrumentu. Otwórz niestandardowy plik XEO i skopiuj jego zawartość do adaptera suwaka MTP II . XEO na komputerze instrumentu. Zapisz plik, aby zaktualizować ten plik geometrii o lokalizacje komórek. Kliknij kartę Automatyzacja i wybierz opcję Nowy, aby utworzyć nowy przebieg automatyczny. Przeciągnij wskaźnik myszy przez wyświetlony obszar próbki, aby zaznaczyć komórki, a następnie kliknij prawym przyciskiem myszy, aby dodać je do listy analizy. Zapisz przebieg automatyczny i kliknij przycisk Rozpocznij uruchamianie automatyczne, aby rozpocząć pobieranie. Rysunek ten ilustruje, w jaki sposób profilowanie spektrometrii mas MALDI-2 w pojedynczej komórce ujawnia heterogeniczność komórkową opartą na lipidach w różnych regionach mózgu i w ich obrębie. Jednorodne przybliżenie i projekcja rozmaitości lub analiza UMAP rozdzieliły komórki według regionu mózgu, tworząc odrębne klastry dla prążkowia, hipokampa i kory. Grupowanie w Lejdzie ujawniło cztery subpopulacje komórek oparte na lipidach. Ponadto zaobserwowano sygnatury lipidowe specyficzne dla klastrów, z różnymi profilami intensywności w lipidach z adnotacjami. Widma masowe z sześciu komórek korowych również wykazały spójne wykrywanie lipidów na wszystkich szkiełkach. Co więcej, komórki korowe z różnych slajdów wykazywały nakładające się rozkłady UMAP, co wskazuje na minimalne efekty wsadowe.

fluorescence-guided-matrix-assisted-laser-desorptionionization-with

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Farmakoterapia polegająca na zastępowaniu dopaminy za pomocą L-DOPA jest najczęściej stosowanym leczeniem objawowym choroby Parkinsona, jednak wiąże się z efektami ubocznymi, w tym z mimowolnymi, nieprawidłowymi ruchami, określanymi mianem dyskinezy 1. W niniejszym materiale przedstawiono protokół obrazowania metodą spektrometrii mas MALDI, który pozwala wykryć zmiany w poziomach neuropeptydów w mózgu szczura związane z dyskinezą.

Obrazowanie spektrometrią mas MALDI neuropeptydów w chorobie Parkinsona

Źródło: Hare, D. J., et.al.  Obrazowanie metali w tkance mózgowej metodą ablacji laserowej - plazma sprzężona indukcyjnie - spektrometria mas (LA-ICP-MS). J. Vis. Exp. (2017)Ten film demonstruje zastosowanie spektrometrii mas plazmy sprzężonej indukcyjnie z ablacją laserową (LA-ICP-MS) do wizualizacji i ilościowego określenia rozkładu metali w tkance mózgowej myszy. Protokół obejmuje ablację laserową w celu wytworzenia aerozolu cząstek próbki, jonizację cząstek w plazmie wysokotemperaturowej...

Spektrometria mas plazmy sprzężonej z ablacją laserową do wizualizacji metali w tkance mózgowej myszy

Opisujemy, jak korzystać z mikrodysekcji laserowej (LCM) w celu uzyskania wzbogaconych populacji neuronów hipokampa lub pojedynczych neuronów z zamrożonych fragmentów uszkodzonego mózgu szczura do późniejszej analizy ekspresji genów przy użyciu ilościowego PCR w czasie rzeczywistym i/lub mikromacierzy całego genomu.

Laserowe wychwytywanie mikrodysekcji wzbogaconych populacji neuronów lub pojedynczych neuronów do analizy ekspresji genów po urazowym uszkodzeniu mózgu

Ludzkie komórki neuroprogenitorowe (NPC) były rozwijane w warunkach proliferacji. NPC różnicowano w kultury bogate w neurony w obecności kombinacji neurotrofin. Markery neuronalne wykryto za pomocą barwienia immunofluorescencyjnego. Aby wyizolować czystą populację neuronów, NPC różnicowano na szkiełkach membranowych PEN i przeprowadzono mikrodysekcję wychwytywania laserowego.

Laserowe wychwytywanie mikrodysekcji neuronów ze zróżnicowanych ludzkich komórek neuroprogenitorowych w hodowli

Ten protokół opisuje projektowanie i chirurgiczne wszczepienie mechanizmu krępującego głowę do monitorowania aktywności neuronalnej w podkorowych strukturach mózgu u szczurów czujnych.  Wyznacza procedury izolowania pojedynczych neuronów w konfiguracji przyściennej i skutecznego identyfikowania ich lokalizacji anatomicznych.

Monitorowanie i lokalizacja pojedynczych neuronów w podkorowych strukturach mózgu czujnych, skrępowanych głową szczurów

Izolacja pojedynczych neuronów dopaminowych lub brzusznego obszaru nakrywki za pomocą bezpośredniej lub pośredniej immunohistochemii jest demonstrowana za pomocą mikrodysekcji laserowej. Omówiono parametry izolacji tkanki ze szkiełka podstawowego za pomocą lasera na podczerwień oraz od szkiełek membranowych z wykorzystaniem kombinacji lasera podczerwonego i ultrafioletowego.

Mikrodysekcja laserowa - demonstracja izolacji pojedynczych neuronów dopaminowych i całego brzusznego obszaru nakrywki

Analiza ekspresji genów w podzbiorze komórek w określonej tkance stanowi duże wyzwanie. W tym artykule opisano, jak wyizolować wysokiej jakości całkowite RNA z określonej populacji komórek, łącząc metodę szybkiego znakowania immunologicznego z mikrodysekcją wychwytu laserowego.

Izolacja RNA z subpopulacji specyficznych dla komórek za pomocą mikrodysekcji laserowej w połączeniu z szybkim znakowaniem immunologicznym

Celem tego protokołu jest użycie techniki sortowania komórek aktywowanych fluorescencją (FACS) do sortowania określonych typów komórek nerwowych w celu późniejszej analizy ekspresji genów specyficznych dla typu komórki, markerów epigenetycznych i/lub ekspresji białek.

Wykorzystanie sortowania komórek aktywowanego fluorescencją do zbadania ekspresji genów specyficznych dla typu komórki w tkance mózgowej szczura

Opisujemy technikę oznaczania neuronów i ich procesów poprzez iniekcje śladowe do jąder mózgowych za pomocą preparatu in vitro. Zmodyfikowaliśmy istniejącą metodę elektroporacji znaczników invitro, wykorzystując znakowane fluorescencyjnie mutanty myszy i podstawowy sprzęt optyczny w celu zwiększenia dokładności znakowania.

Laserowe śledzenie neuronów w eksplantatach mózgu

Przedstawiono protokół sublimacji matrycy DAN na tkankę mózgową szczura w celu wykrycia gangliozydów za pomocą spektrometrii mas obrazowania MALDI.

Sublimacja matrycy DAN do wykrywania i wizualizacji gangliozydów w tkance mózgowej szczura do obrazowania MALDI Spektrometria mas

Ten protokół wyjaśnia, jak zbierać pojedyncze neurony, mikroglej i astrocyty z centralnego jądra ciała migdałowatego z dużą dokładnością i anatomiczną specyficznością za pomocą mikrodysekcji laserowej. Dodatkowo wyjaśniamy nasze zastosowanie mikroprzepływowego RT-qPCR do pomiaru podzbioru transkryptomu tych komórek.

Połączenie mikrodysekcji wychwytu laserowego i mikroprzepływowego qPCR w celu analizy profili transkrypcyjnych pojedynczych komórek: podejście biologii systemowej do uzależnienia od opioidów

Odkryj analizę pojedynczych komórek nerwowych szczura za pomocą MALDI-2 z przewodzeniem fluorescencyjnym. Ta metoda ujawnia heterogeniczność lipidową i łączy profile molekularne z tożsamością komórkową.

Desorpcja/jonizacja laserowa wspomagana matrycą pod wpływem fluorescencji ze spektrometrią mas z indukowaną laserem spektrometrią mas z jonizacji poszczególnych komórek nerwowych szczura (Wideo) | JoVE Journal

Desorpcja/jonizacja laserowa wspomagana matrycą pod wpływem fluorescencji ze spektrometrią mas z indukowaną laserem spektrometrią mas z jonizacji poszczególnych komórek nerwowych szczura

Przeglądaj więcej filmów