23 maja 2025
Ten protokół opisuje użycie mikroMS do sterowanej fluorescencją, jednokomórkowej spektrometrii mas MALDI-2, umożliwiając lepsze profilowanie molekularne pierwotnych komórek neuronalnych szczura.
Nasze badania koncentrują się na opracowywaniu wysokoprzepustowych, sterowanych obrazem, jednokomórkowych przepływów pracy spektrometrii mas MALDI w celu ujawnienia heterogeniczności komórkowej i powiązania profili molekularnych z tożsamością, funkcją i odpowiedzią komórek w złożonych systemach.
Zaawansowane oprzyrządowanie, takie jak MALDI-2 i spektrometry mas o wysokiej rozdzielczości przestrzennej, umożliwiają ukierunkowaną, przestrzennie rozdzielczą analizę pojedynczych komórek, zwiększając czułość i rozszerzając zakres profilowania molekularnego w złożonych tkankach. Obecne wyzwania obejmują ograniczoną czułość, odtwarzalność próbek i złożoną analizę danych. Dane MALDI są często rzadkie, a duże zbiory danych z tysiącami komórek i setkami cząsteczek wymagają solidnych narzędzi obliczeniowych.
Protokół ten wypełnia lukę w wysokoprzepustowych metodach analizy pojedynczych komórek, a nawet organelli, umożliwiając bardzo szczegółowe badania heterogeniczności i uzyskanie wglądu w biologię i funkcję molekularną i komórkową.
Protokół ten umożliwia szybką, ukierunkowaną analizę komórek rozsianych po szkiełku, eliminując potrzebę manipulacji komórkami lub skanowania całego obszaru i znacznie zwiększając przepustowość.
[Narrator] Na początek przepłucz każde szkiełko dwoma do trzech mililitrów 150-milimolowego octanu amonu, aby usunąć kryształy glicerolu i soli, które mogą zakłócać mikroskopię i aplikację matrycy MALDI, a następnie wysusz szkiełka pod delikatnym strumieniem azotu lub pozwól im całkowicie wyschnąć na powietrzu. Załaduj wysuszone szkiełko do stolika mikroskopu. Ustaw ostrość mikroskopu, używając co najmniej 10 punktów podparcia rozmieszczonych równomiernie na całym szkiełku. Korzystając z filtrów odpowiednich do DAPI i obrazowania w jasnym polu, uzyskaj kafelkowy obraz fluorescencyjny całego preparatu przy powiększeniu od 5 do 10 razy, zapewniając, że znaczniki odniesienia na szkiełkach mikroskopowych są wyraźnie uchwycone na obrazie. Zszyj kafelkowe obrazy za pomocą oprogramowania do mikroskopii, takiego jak ZEN ZEISS. Sprawdź, czy sąsiadujące pionowo kafelki nie są przesunięte. Przetwarzaj i eksportuj każdy zszyty obraz jako plik BigTIFF za pomocą oprogramowania mikroskopowego lub jako standardowy plik TIFF, jeśli ostateczny rozmiar obrazu jest mniejszy niż dwa gigabajty. Rozpuść 20 miligramów 2,5-dihydroksyacetofenonu w 1,5 mililitra acetonu. Umieść szkiełka w uchwycie komory sublimacyjnej, a następnie umieść uchwyt w aparacie sublimacyjnym. Odpipetować rozpuszczony roztwór matrycy na płytkę ceramiczną i pozwolić acetonowi całkowicie odparować, a następnie zamknąć komorę sublimacyjną, aby ją uszczelnić. Napełnij komorę chłodziwa błotem pośniegowym z lodowatej wody i umieść go bezpiecznie na komorze sublimacyjnej. Włącz pompę próżniową i pozwól systemowi osiągnąć równowagę przez pięć minut. Rozpocznij sublimację od podgrzania komory do 200 stopni Celsjusza przez pięć minut. Po pięciu minutach wyjmij lodowatą łaźnię wodną z komory. Ustaw temperaturę na 25 stopni Celsjusza i umieść radiator na górze komory. Powoli odpowietrz komorę sublimacyjną, aby uwolnić ciśnienie. Otwórz komorę i ostrożnie wyjmij szkiełka. Otwórz MicroMS i zdziesiątkuj obrazy mikroskopowe BigTIFF, korzystając z opcji grupy obrazów, aby uwzględnić zarówno kanały jasnego pola, jak i kanały fluorescencyjne. Przejdź do narzędzia Opcje obiektu blob i dostosuj maksymalny i minimalny rozmiar obiektu blob, aby zdefiniować dopuszczalny zakres rozmiarów obiektów blob. Ustaw próg kanału fluorescencji dla wykrywania plam. Określ wartość kołowości, aby określić, jak okrągłe muszą być zidentyfikowane komórki, aby można było wziąć pod uwagę, a następnie wybierz kolor. Użyj opcji Znajdź obiekt blob, aby wykryć obiekty blob. Po wyświetleniu monitu zapisz listę obiektów blob pod żądaną nazwą. Użyj narzędzia Filtr odległości, aby ustawić minimalną odległość między każdą komórką. Przetestuj błąd za pomocą punktów testowych, aby dokładnie określić błąd przesunięcia. Załaduj szkiełka do instrumentu za pomocą adaptera suwaka MTP II. Po powrocie do komputera z MicroMS uzyskaj dostęp do komputera ze spektrometrem mas za pomocą aplikacji na zdalny pulpit. Jeśli używasz instrumentu po raz pierwszy, sprawdź jego pozycję, przechodząc do Narzędzia, a następnie Ustawienia instrumentu. W oknie podręcznym wyświetl zestaw współrzędnych wraz z ich położeniami X i Y, a następnie wybierz każdy z tych konkretnych punktów na geometrii adaptera suwakowego II. Zaktualizuj pozycje X i Y w oknie MicroMS. Korzystając z kamery spektrometru mas i elementów sterujących spektrometru, przejdź do łatwego do zidentyfikowania miejsca na szkiełku i skopiuj współrzędne instrumentu. W MicroMS zlokalizuj tę samą pozycję na obrazie mikroskopu, kliknij prawym przyciskiem myszy i wprowadź współrzędne do wyskakującego okienka. Zaokrąglij współrzędne do najbliższych liczb całkowitych i oddziel je spacją. Po dodaniu trzech punktów rejestracyjnych, jedno z kółek zmieni kolor na czerwony, wskazując, że jest to najbardziej odległa pozycja od rejestracji. Usuń punkt rejestracji za pomocą Control + kliknij prawym przyciskiem myszy i spróbuj ponownie. W obszarze Plik przejdź do pozycji Zapisz, a następnie Rejestracja, aby zapisać plik rejestracyjny. Gdy plamy są widoczne na slajdzie, przejdź do Plik, Zapisz, a następnie pozycje instrumentu, aby zapisać plik pozycji instrumentu, a następnie za pomocą oprogramowania pulpitu zdalnego przenieś ten plik na komputer instrumentu. Otwórz niestandardowy plik XEO i skopiuj jego zawartość do adaptera suwaka MTP II . XEO na komputerze instrumentu. Zapisz plik, aby zaktualizować ten plik geometrii o lokalizacje komórek. Kliknij kartę Automatyzacja i wybierz opcję Nowy, aby utworzyć nowy przebieg automatyczny. Przeciągnij wskaźnik myszy przez wyświetlony obszar próbki, aby zaznaczyć komórki, a następnie kliknij prawym przyciskiem myszy, aby dodać je do listy analizy. Zapisz przebieg automatyczny i kliknij przycisk Rozpocznij uruchamianie automatyczne, aby rozpocząć pobieranie. Rysunek ten ilustruje, w jaki sposób profilowanie spektrometrii mas MALDI-2 w pojedynczej komórce ujawnia heterogeniczność komórkową opartą na lipidach w różnych regionach mózgu i w ich obrębie. Jednorodne przybliżenie i projekcja rozmaitości lub analiza UMAP rozdzieliły komórki według regionu mózgu, tworząc odrębne klastry dla prążkowia, hipokampa i kory. Grupowanie w Lejdzie ujawniło cztery subpopulacje komórek oparte na lipidach. Ponadto zaobserwowano sygnatury lipidowe specyficzne dla klastrów, z różnymi profilami intensywności w lipidach z adnotacjami. Widma masowe z sześciu komórek korowych również wykazały spójne wykrywanie lipidów na wszystkich szkiełkach. Co więcej, komórki korowe z różnych slajdów wykazywały nakładające się rozkłady UMAP, co wskazuje na minimalne efekty wsadowe.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
To badanie przedstawia protokół stosowania microMS do fluorescencyjnie sterowanej, jednokomórkowej spektrometrii mas MALDI-2, poprawiającej profilowanie molekularne pierwotnych komórek neuronalnych szczurów. Badania mają na celu zbadanie heterogeniczności komórkowej i powiązanie profili molekularnych z tożsamością i funkcją komórkową w złożonych tkankach.
High-throughput, fluorescence-guided MALDI-2 mass spectrometry enables precise molecular profiling of individual neural cells, addressing the challenge of cellular heterogeneity in complex tissues. This workflow enhances predictive confidence in early discovery by linking molecular signatures to cell identity and function. The approach supports portfolio decisions by providing scalable, reproducible single-cell data critical for target validation and mechanistic de-risking.
This method integrates from early discovery through lead identification, supporting both hypothesis testing and translational research in neuroscience and related fields.