Pobieranie próbek środowiskowych mikroorganizmów fotosyntetycznych i ich wirusów: od terenu do laboratorium

Celem tych projektów jest ilościowe określenie parametrów fizjologicznych w infekcjach wirusowych, a następnie przypisanie substratów omicznych do obserwowanego stanu fizjologicznego, co prowadzi do opracowania modeli lub praw w wirologii przewidujących zmiany w dynamice wirus-gospodarz. Dzięki postępom w sekwencjonowaniu wysokoprzepustowym i usprawnionym przepływom pracy bioinformatycznej, analizy multiomiczne są łatwo dostępne, co stwarza możliwość wyjaśnienia zjawisk fizjologicznych jako funkcji konkretnych substratów omicznych. Wykorzystując infekcje eksperymentalne, mikroskopię elektronową, ilościowe PCR, sekwencjonowanie nowej generacji oraz solidne potoki bioinformatyczne, analizy sieciowe mogą zidentyfikować zależności między zmiennymi omicznymi a fizjologicznymi, co umożliwia opracowanie modeli prognostycznych.

Największym wyzwaniem jest generowanie czystych zapasów wirusów o pojedynczym genotypie z dokładnymi mianami, aby można było określić wielokrotność zakażenia (MOI) dla infekcji eksperymentalnych. Wyznaczanie miana pozostaje problematyczne w wirologii. Opracowaliśmy wskaźniki pozwalające obliczyć względną wirulencję między dwoma wirusami infekującymi jednego gospodarza lub jednym wirusem infekującym różnych gospodarzy w przypadku infekcji typu jeden gospodarz/jeden wirus.

Zestandaryzowaliśmy schemat postępowania, który można zastosować w przypadku różnych systemów wirusowych.

W pierwszej kolejności należy przeprowadzić pobieranie próbek środowiskowych na obszarach morskich wzdłuż wybrzeża Południowej Kalifornii. Do wylotu pompy należy przymocować odporny na zapadanie się, 10-stopowy gumowy wąż elastyczny. Wtyczkę zasilającą pompy transferowej należy podłączyć do generatora inwertera. Po złożeniu układu należy zapowietrzyć pompę transferową i przeprowadzić test w celu upewnienia się, że system pompowy jest sprawny. Jeden koniec 25-metrowej nylonowej liny morskiej o średnicy 1,25 centymetra należy przymocować do oczka 14-kilogramowej kotwicy grzybkowej.

Użyj taśmy naprawczej, aby przymocować linę do niebieskiej rurki PVC co trzy metry. Gdy zostanie ustanowiony stały przepływ wody, odprowadź od jednej do dwóch objętości rurki z powrotem do oceanu, aby upewnić się, że przez pompę przepływa woda z pożądanej głębokości. Pobierz próbki wody do 20-litrowych kanistrów, aby przetransportować je do stacji terenowej.

Przefiltruj próbkę wody przez zestaw z filiżanką filtrującą, a następnie połącz filiżankę z przenośną próżniową pompą membranową za pomocą przezroczystego wężyka winylowego. Przelej próbkę do filiżanki filtrującej i rozpocznij filtrację. Po zakończeniu procesu przelej filtrate do butelki na wodę i odpowiednio ją opisz.

Następnie za pomocą skalpela wyciąć filtr z zespołu uchwytu filtra. Przeciąć go na pół i przenieść do 50-mililitrowej probówki do wirowania. Przenieść 50 mililitrów przefiltrowanej wody morskiej do tej samej probówki do wirowania.

Aby zagęścić zmieszane próbki dla każdej głębokości pobrania w danej lokalizacji, należy odesłać do laboratorium ultrafiltrat wraz z filtrem 0,45 mikrometra zawierającym pozostałości komórkowe, a następnie poddać go wirowaniu. Przenieś 60 mililitrów filtratu do filtra wirowego. Wirować przy 6 000 g przez 10 do 20 minut w celu zagęszczenia próbki.

Powtarzać wirowanie do momentu otrzymania 1,5 do 2 mililitrów koncentratu zawiesiny wirusów lub bakteriofagów. Przenieść otrzymany koncentrat do probówki Eppendorfa o pojemności dwóch mililitrów w celu dalszego obrazowania wirusów lub bakteriofagów z przetworzonej próbki środowiskowej za pomocą transmisyjnego mikroskopu elektronowego. Wysiać próbki środowiskowe na przygotowane płytki z agarem.

Aby wyizolować pojedyncze kolonie domniemanych gospodarzy wirusów lub bakteriofagów, należy użyć sterylnej pętli do przeniesienia izolatu na nową płytkę. Następnie tą samą pętlą należy pobrać inną kolonię i przenieść ją do kolby stożkowej zawierającej pożywkę płynną. Przygotuj 10 kultur startowych w probówkach o pojemności 20 ml zawierających pięć mililitrów pożywki BG-11.

Dodaj pięć mililitrów mieszaniny ultrafiltratu z miejsca pobrania próbek i BG-11. Wyizoluj pojedynczą kolonię z płytki z kulturą za pomocą sterylnego wymazika, a następnie zaszczep każdą probówkę z osobna, wrzucając jeden wymazik do każdej probówki. Po wykryciu wzrostu w kulturze startowej, powtórz procedurę posiewu kreskowym do momentu, aż na płytkach pojawi się tylko jeden fenotyp kolonii.

Gdy cykle hodowli w kulturze płynnej i na pożywkach stałych doprowadzą do uzyskania fenotypu pojedynczej komórki, należy scharakteryzować morfotypy mikrobiologiczne za pomocą mikroskopii świetlnej. Aby wykryć aktywność wirusów, należy wyhodować trawniki potencjalnych gospodarzy z cyjanobakterii lub mikroalg z zapasów roboczych na płytkach z agarem BG-11. Po pojawieniu się pojedynczych plamek na płytkach po naniesieniu kropelkowym lub rozcieraniu zawiesiny wirusowej, należy użyć sterylnej pętli do pobrania materiału z pojedynczej plamki.

Zawirować pętlę w 10-mililitrowej kulturze startowej gospodarza. Aby określić zakres gospodarzy, przygotować posiewy trawnikowe wielu potencjalnych gospodarzy wyizolowanych z próbek środowiskowych lub otrzymanych z innych laboratoriów bądź kolekcji kultur. Wyznaczyć krzywe wzrostu gospodarzy, wykonując pomiary gęstości optycznej przy 730 nanometrach w regularnych odstępach czasu z kultur zakażonych i niezakażonych.

Czyste kultury mikroorganizmów fotosyntetyzujących wykazały odmienne morfologie w badaniu pod mikroskopem świetlnym. Na podstawie cech morfologicznych oraz sekwencjonowania 16S rRNA i następującej po nim analizy filogenetycznej, izolat zidentyfikowano jako gatunek cyjanobakterii z rodziny Merismopediaceae. Alternatywny izolat wykazujący owalne zielone komórki sugeruje obecność Synechococcus.

Szczep SWII podobny do Synechocytis tworzy gęste, jednolite trawniki na agarze BG-11, co jest idealne do płytkowych testów plackowych. Infekcja phiSBL-14 spowodowała widoczne przejaśnienia w postaci placków w seryjnych rozcieńczeniach metodą nakładania na trawnik oraz zahamowała wzrost szczepu SWII w kulturze płynnej. Krzywe wzrostu wykazały, że szczep SWII zainfekowany stężoną zawiesiną phiSBL-14 wykazywał znacznie wolniejszy przyrost gęstości optycznej w porównaniu zarówno z rozcieńczoną zawiesiną fagową, jak i z niezinfekowaną kontrolą.

Maksymalna specyficzna szybkość wzrostu była najwyższa w niezakażonych kulturach SWII. Transmisyjna mikroskopia elektronowa zakażonych kultur SWII ujawniła efekty cytopatyczne, w tym pogrubienie błony, obecność ziarnistości wewnętrznych oraz pęcherzykowanie błony, których nie zaobserwowano w niezakażonych kontrolach.