Name: Wizualizacja organoidów siatkówki w całości z rozdzielczością komórkową (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-06-20T13:35:00.000+00:00
Duration: 9 min 20 s
Description: Poznaj metodę całopowierzchniowej wizualizacji organoidów siatkówki z rozdzielczością komórkową wykorzystującą mikroskopię konfokalną i techniki optycznego przezroczenia. Ta metoda umożliwia szczegółowe badanie struktur siatkówki i ich dojrzewania.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Jesteśmy wdzięczni Angelowi Sandovalowi, Ericowi Calatayudowi, Gustavo Castro-Olverze, Marcie Martin i Alinie Hirschmann (ICFO-Institut de Ciències Fotòniques) za ich wsparcie techniczne. Podmiotami finansującymi, które wsparły te prace, są: Fundació CELLEX; Fundació Mir-Puig; Program Ministerio de Economía y Competitividad - Severo Ochoa dla centrów doskonałości w dziedzinie badań i rozwoju (CEX2019-000910-S, [MCIN/AEI/10.13039/501100011033]); Ministerio de Ciencia, Innovación y Universidades - Agencia Estatal de Investigación (PID2021-122807OB-C31 i PID21-122807OB-C32); Instituto de Salud Carlos III (PI22/01747); Fundación La ONCE; Generalitat de Catalunya w ramach programu CERCA; Laserlab-Europe (EU-H2020 GA nr 871124); oraz Fondo Social Europeo (PRE2020-095721, M.C.).

1. Przygotowanie spersonalizowanych fluorescencyjnych przeciwciał wtórnych
UWAGA: Podejście to stanowi alternatywę dla stosowania komercyjnych przeciwciał fluorescencyjnych (zalety przygotowywania fluorescencyjnych przeciwciał wtórnych omówiono w sekcji dyskusja). Ponadto protokół ten można wykorzystać do koniugacji fluoroforów z przeciwciałami pierwotnymi w przypadku, gdy planowane jest przeprowadzenie bezpośredniej immunofluorescencji, a fluorescencyjne przeciwciało pierwotne nie jest dostępne komercyjnie. Kontrola stosunku fluoroforu do przeciwciała poprzez dostosowanie ilości fluoroforu w reakcji znakowania pozwala na uzyskanie jaśniejszych przeciwciał koniugowanych. Należy jednak pamiętać, że przeciwciała wtórne przygotowane samodzielnie są mniej stabilne, a stężenie otrzymanego koniugatu jest 10x niższe niż w przypadku komercyjnych przeciwciał fluorescencyjnych. Protokół ten został zaadaptowany z pracy opisanej przez Bálint et al9.
<ol>
	<li>Rozpuścić 1 mg fluoroforu w bezwodnym DMSO i rozdzielić na aliquoty do probówek, tak aby w każdej znalazło się 0,02 mg fluoroforu. Usunąć cały DMSO za pomocą wirówki próżniowej (speed vacuum concentrator), prowadząc proces przez 1 h 30 min. Alikwoty przechowywać w temperaturze -20 ºC, chroniąc przed światłem. W przypadku Alexa Fluor 405 odpowiednim rozpuszczalnikiem do przygotowania alikwotów jest ultrazczysta H2O.</li>
	<li>W celu przeprowadzenia reakcji znakowania rozpuścić jeden alikwot fluoroforu w 1-10 µL DMSO (lub ultrazczystej H2O dla Alexa Fluor 405). 
	UWAGA: Dokładna ilość DMSO jest określana na podstawie wcześniejszych kontrolnych testów sprzęgania. Testy te wykonuje się przy rozpoczęciu pracy z nową partią fluoroforu (lub po wyczerpaniu poprzedniej), a także przy pierwszym zastosowaniu nowego fluoroforu w procesie sprzęgania. Kontrolny test sprzęgania polega na przeprowadzeniu reakcji znakowania z różnymi ilościami fluoroforu w celu wyznaczenia optymalnego stosunku fluoroforu do przeciwciała w koniugacie. W naszym przypadku optymalny stosunek zazwyczaj mieści się w zakresie od 3 µL do 5 µL.</li>
	<li>Inkubować 50 µL wtórnego IgG (lub pierwotnego), 6 µL 1 M NaHCO3 oraz 1-5 µL fluoroforu przez 40 min w temperaturze pokojowej (RT) na platformie kołyszącej, chroniąc przed światłem.</li>
	<li>W trakcie trwania reakcji przygotować kolumny do oczyszczania metodą wykluczania wielkości, zdejmując z nich nakrętki i pozwalając buforowi przepłynąć przez złoże. Zrównoważyć kolumnę (jedną dla każdej reakcji znakowania), przepuszczając przez nią 3 x 2-3 mL PBS. Jeśli ostatni etap równoważenia zakończy się przed końcem inkubacji, ponownie założyć nakrętki, aby zapobiec wysychaniu złoża, i odczekać do zakończenia reakcji znakowania. 
	UWAGA: Kolumny do oczyszczania metodą wykluczania wielkości działają grawitacyjnie. Należy upewnić się, że złoże kolumny w żadnym momencie nie wyschnie, w przeciwnym razie proces oczyszczania nie przebiegnie prawidłowo.</li>
	<li>Po zakończeniu reakcji (krok 1.3) dodać 140 µL PBS do mieszaniny reakcyjnej, aby uzyskać objętość około 200 µL, a następnie wymieszać na wortexie. Przenieść ten roztwór do centrum kolumny, pozwolić próbce wniknąć w złoże, a po wypłukaniu ostatniej kropli dopełnić do 550 µL PBS. Gdy ciecz przestanie spływać, eluować, dodając 300 µL PBS i zbierając frakcję do probówki mikrocentryfugowej 1,5 mL.</li>
	<li>Obliczyć stężenie przeciwciał i stosunek znakowania, mierząc absorbancję próbki przy 280 nm oraz absorbancję użytych fluoroforów. Zastosować prawo Beer-Lamberta w celu wyznaczenia stężenia (w molarności) zgodnie z poniższym wzorem: 
	<img alt="Wzór na stężenie IgG, schemat z parametrami absorbancji i współczynnika korekcji dla analizy białek." src="/files/ftp_upload/68384/68384eq1.jpg" style="opacity: 0.9;" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Równanie 1"> 
	Gdzie A oznacza absorbancję, ε współczynnik ekstynkcji molowej, a CF280 jest miarą absorbancji konkretnego fluoroforu przy 280 nm, służącą jako współczynnik korekcji. Następnie stężenie przeciwciała wynosi: 
	<img alt="Wzór na stężenie IgG, Afluorofor*rozcieńczenie/εfluorofor, równanie analizy ilościowej." src="/files/ftp_upload/68384/68384eq2.jpg" style="opacity: 0.9;" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Równanie 2"> 
	A stosunek znakowania wynosi: 
	<img alt="Wzór na stosunek znakowania, fluorofor do IgG (M), równanie analizy fluorescencyjnej." src="/files/ftp_upload/68384/68384eq3.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Równanie 3"></li>
	<li>Przechowywać znakowane przeciwciała w temperaturze 4 ºC, chroniąc przed światłem, przez okres do 6 miesięcy.</li>
</ol>
2. Markowanie immunofluorescencyjne
<ol>
	<li>Utrwal organoidy w 4% paraformaldehydzie (PFA) w RT przez 45 min. 
	UWAGA: OPCJONALNIE: Inkubuj organoidy z roztworem do odzyskiwania antygenów (kroki 2.2 i 2.3), aby zwiększyć immunoreaktywność antygenów.</li>
	<li>Przygotuj 40 mL roztworu do odzyskiwania antygenów, mieszając 0,117 mg cytrynianu sodu trójzasadowego dwuwodnego w ultrapure H2O i dostosuj pH do 9.</li>
	<li>Inkubuj organoidy z roztworem do odzyskiwania antygenów przy łagodnym wstrząsaniu (30 rpm) w 60 °C przez 1 h.</li>
	<li>Przeprowadź permeabilizację organoidów za pomocą PBST (PBS z 1% Triton X-100) przy łagodnym wstrząsaniu w RT przez 4 h.</li>
	<li>Zablokuj organoidy roztworem blokującym (2% albuminy surowicy bydlęcej (BSA) z 0,1% Triton X-100) w RT przez noc (lub ponad 1 dobę). 
	UWAGA: Stężenia przeciwciał pierwszorzędowych i drugorzędowych zależą od konkretnego przeciwciała. W przypadku immunofluorescencji próbek w całości stosujemy wyższe stężenie w porównaniu do próbek sekcjonowanych. Inkubujemy przeciwciało pierwszorzędowe w stężeniu 10 µg/mL, co w większości przypadków odpowiada rozcieńczeniu 1:100 ze stoku (Tabela 1). Nasze autorskie przeciwciała drugorzędowe inkubujemy w stężeniu 20-50 µg/mL.</li>
	<li>Inkubuj organoidy z przeciwciałami pierwszorzędowymi rozcieńczonymi w roztworze płuczącym (0,1% BSA z 0,1% Triton X-100) w 4 °C przez 2 dni przy łagodnym wstrząsaniu.</li>
	<li>Płucz organoidy 3 x 15 min w roztworze płuczącym przy łagodnym wstrząsaniu w RT.</li>
	<li>Inkubuj organoidy z przeciwciałami drugorzędowymi rozcieńczonymi w roztworze płuczącym w 4 °C przez 2 dni przy łagodnym wstrząsaniu.</li>
	<li>Płucz organoidy 3 x 15 min w roztworze płuczącym przy łagodnym wstrząsaniu w RT. 
	UWAGA: Po immunoznakowaniu można inkubować wybrane barwniki fluorescencyjne. Zazwyczaj stosujemy fluorescencyjne markery jąder komórkowych, takie jak DAPI (1:1 000) i DRAQ5 (1:500), lub faloidynę (1:100) do wizualizacji sieci filamentów aktynowych.</li>
	<li>Inkubuj organoidy z barwnikami fluorescencyjnymi rozcieńczonymi w roztworze płuczącym w RT przez 1 h przy łagodnym wstrząsaniu.</li>
	<li>Płucz organoidy 3 x 15 min w roztworze płuczącym przy łagodnym wstrząsaniu w RT.</li>
</ol>
3. Przejaśnianie optyczne z użyciem FluoClear BABB
UWAGA: 1-propanol może uszkodzić pojemniki plastikowe, szczególnie w przypadku długotrwałej ekspozycji. Dla bezpieczeństwa należy stosować pojemniki szklane.
<ol>
	<li>Krok odwadniania
	<ol>
		<li>Przygotować roztwory 1-propanolu w ultraczystej H2O o określonych stężeniach (15%, 30%, 45%, 60%, 75%, 90%), a następnie dostosować pH do 9,5 za pomocą trimetyloaminy. 
		OSTRZEŻENIE: Trietyloamina jest toksyczna w przypadku inhalacji. Pracować pod wyciągiem. Roztwory można wykorzystać ponownie, jeśli są przechowywane prawidłowo (w szczelnie zamkniętym pojemniku). Przed użyciem należy skorygować pH.</li>
		<li>Inkubować próbki w roztworach 1-propanolu o rosnącym stężeniu (15%, 30%, 45%, 60%, 75%, 90%) przez 2 h w każdym stopniu w temperaturze 30 °C przy łagodnym wstrząsaniu.</li>
		<li>Inkubować próbki w 100% 1-propanolu przez noc w temperaturze 30 °C przy łagodnym wstrząsaniu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Krok przejaśniania 
	OSTRZEŻENIE: BABB jest silną mieszaniną rozpuszczalników, znaną ze zdolności do rozpuszczania lub znacznego uszkadzania wielu tworzyw sztucznych. Dla bezpieczeństwa należy używać szklanych pojemników z odpowiednimi pokrywkami i pracować pod wyciągiem.
	<ol>
		<li>Przygotować BABB poprzez zmieszanie alkoholu benzylowego (BA) i benzoesanu benzylu (BB) w stosunku 1:2.</li>
		<li>Zanurzyć próbki w BABB w temperaturze pokojowej (RT) przez noc.</li>
		<li>Przed obrazowaniem wymienić roztwór BABB na świeży. 
		UWAGA: W przypadku organoidów o średnicy ok. 1 mm, BABB wywołuje efekt przejaśniania widoczny w ciągu kilkunastu minut. W zależności od rozmiaru i charakteru próbki stopień przejaśnienia może być inny i/lub może wymagać dłuższego czasu ekspozycji na roztwór przejaśniający. Zalecamy wykonanie obrazowania przed i po zanurzeniu w BABB w celu zoptymalizowania protokołu przejaśniania.</li>
		<li>Próbki przejaśnione w BABB przechowywać długoterminowo w roztworze BABB w temperaturze 4 °C. Chronić przed światłem, aby zachować fluorescencję.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Pozyskiwanie obrazów całych preparatów
<ol>
	<li>Za pomocą szklanej pipety umieść organoid w szklanej płytce Petri z kroplą BABB. Upewnij się, że próbka styka się z powierzchnią szkiełka podstawowego. 
	UWAGA: Należy dopilnować, aby kropla BABB zawierająca próbkę nie miała kontaktu z plastikowymi krawędziami płytki, ponieważ może to doprowadzić do stopienia tworzywa, co zagraża próbce i jakości obrazowania.</li>
	<li>Używając odwróconego konfokalnego mikroskopu skaningowego z obiektywami o małym i dużym powiększeniu, wykonaj obrazy w stosie Z (Z-stack), aby uzyskać pełny wgląd 3D w próbkę z zachowaniem szczegółów komórkowych. 
	UWAGA: W niniejszym badaniu zastosowano obiektyw powietrzny 10x o aperturze numerycznej (NA) 0,4 oraz obiektyw 63x NA 1,4, z rozmiarem kroku odpowiednio 3,5 µm i 1 µm.</li>
</ol>
5. Przetwarzanie obrazów
<ol>
	<li>Ponownie skalibruj wielkość kroku akwizycji stosu Z, biorąc pod uwagę niedopasowanie współczynnika załamania światła (RI) między roztworem do przejaśniania a medium imersyjnym.
	<ol>
		<li>Oblicz ponowną kalibrację wielkości kroku w następujący sposób: 
		<img alt="Wzór na ponowną kalibrację wielkości kroku w mikroskopii, uwzględniający współczynniki załamania światła." src="/files/ftp_upload/68384/68384eq4.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Równanie 4"> 
		Dla próbki zatopionej w BABB, obrazowanej za pomocą obiektywu powietrznego z wielkością kroku 3.5 µm, obliczenia będą wyglądać następująco: 
		<img alt="Wzór na ponowną kalibrację obliczeń wielkości kroku; równanie dla precyzji pomiaru optycznego." src="/files/ftp_upload/68384/68384eq5.jpg" style="opacity: 0.9;" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Równanie 5"></li>
		<li>Używając programu ImageJ, zmień głębokość woksela (kliknij Image | Properties...) na przeliczoną wielkość kroku.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Utwórz projekcje obrazów ze stosu Z.
	<ol>
		<li>Używając programu ImageJ, sprawdź stos Z w głąb (kliknij Image | Stacks | Orthogonal views). Pojawią się widoki XY, XZ i YZ organoidu siatkówki.</li>
		<li>Zapisz interesujące obszary (kliknij File | Save as...).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Utwórz animację renderu 3D stosu Z za pomocą oprogramowania do przetwarzania obrazu (patrz Tabela materiałów).
	<ol>
		<li>Wybierz kanały do wizualizacji, zaznaczając odpowiadające im pola wyboru.</li>
		<li>Dostosuj płaszczyzny Z, aby zwizualizować wnętrze próbki (zaznacz pole Clipping).</li>
		<li>Nagraj animację za pomocą edytora filmów (zaznacz pole Movie editor). Przeciągaj, upuszczaj oraz przybliżaj i oddalaj obraz bezpośrednio za pomocą myszy. Kliknij Add, aby dołączyć do animacji inny klip. W przypadku regulacji płaszczyzn Z włącz opcję Clip planes (kliknij Settings... | zaznacz pole Clip planes).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Lee, Y. J., Jo, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinal+organoids+from+induced+pluripotent+stem+cells+of+patients+with+inherited+retinal+diseases%3A+A+systematic+review%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Rev+Rep%22%5BJournal%5D)">Retinal organoids from induced pluripotent stem cells of patients with inherited retinal diseases: A systematic review.</a> Stem Cell Rev Rep. 21 (1), 167-197 (2025).</li>
<li>Onyak, J. R., Vergara, M. N., Renna, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinal+organoid+light+responsivity%3A+Current+status+and+future+opportunities%5BTitle%5D)+AND+%22Trans+Res%22%5BJournal%5D)">Retinal organoid light responsivity: Current status and future opportunities.</a> Trans Res. 250, 98-111 (2022).</li>
<li>O’Hara-Wright, M., Gonzalez-Cordero, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinal+organoids%3A+A+window+into+human+retinal+development%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Retinal organoids: A window into human retinal development.</a> Development. 147 (24), dev189746(2020).</li>
<li>Wahle, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multimodal+spatiotemporal+phenotyping+of+human+retinal+organoid+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Multimodal spatiotemporal phenotyping of human retinal organoid development.</a> Nat Biotechnol. 41 (12), 1765-1775 (2023).</li>
<li>Isla-Magrané, H., Veiga, A., García-Arumí, J., Duarri, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiocular+organoids+from+human+induced+pluripotent+stem+cells+displayed+retinal%2C+corneal%2C+and+retinal+pigment+epithelium+lineages%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Res+Ther%22%5BJournal%5D)">Multiocular organoids from human induced pluripotent stem cells displayed retinal, corneal, and retinal pigment epithelium lineages.</a> Stem Cell Res Ther. 12 (1), 581(2021).</li>
<li>Isla-Magrané, H., Zufiaurre-Seijo, M., García-Arumí, J., Duarri, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((All-trans+retinoic+acid+modulates+pigmentation%2C+neuroretinal+maturation%2C+and+corneal+transparency+in+human+multiocular+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Res+Ther%22%5BJournal%5D)">All-trans retinoic acid modulates pigmentation, neuroretinal maturation, and corneal transparency in human multiocular organoids.</a> Stem Cell Res Ther. 13 (1), 376(2022).</li>
<li>Avilov, S. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Navigating+across+multi-dimensional+space+of+tissue+clearing+parameters%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Appl+Fluoresc%22%5BJournal%5D)">Navigating across multi-dimensional space of tissue clearing parameters.</a> Methods Appl Fluoresc. 9 (2), 022001(2021).</li>
<li>Brenna, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+tissue+clearing+associated+with+3D+imaging%3A+application+in+preclinical+and+clinical+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Histochem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Optical tissue clearing associated with 3D imaging: application in preclinical and clinical studies.</a> Histochem Cell Biol. 157 (5), 497(2022).</li>
<li>Bálint, Š, Verdeny Vilanova, I., Sandoval Álvarez, Á, Lakadamyali, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlative+live-cell+and+superresolution+microscopy+reveals+cargo+transport+dynamics+at+microtubule+intersections%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Nat+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Correlative live-cell and superresolution microscopy reveals cargo transport dynamics at microtubule intersections.</a> Proc Nat Acad Sci USA. 110 (9), 3375-3380 (2013).</li>
<li>Schwarz, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent-protein+stabilization+and+high-resolution+imaging+of+cleared%2C+intact+mouse+brains%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Fluorescent-protein stabilization and high-resolution imaging of cleared, intact mouse brains.</a> PLoS One. 10 (5), e0124650(2015).</li>
<li>Klingberg, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fully+automated+evaluation+of+total+glomerular+number+and+capillary+tuft+size+in+nephritic+kidneys+using+lightsheet+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Soc+Nephrol%22%5BJournal%5D)">Fully automated evaluation of total glomerular number and capillary tuft size in nephritic kidneys using lightsheet microscopy.</a> J Am Soc Nephrol. 28 (2), 452-459 (2017).</li>
<li>Dekkers, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+3D+imaging+of+fixed+and+cleared+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">High-resolution 3D imaging of fixed and cleared organoids.</a> Nat Protoc. 14 (6), 1756-1771 (2019).</li>
<li>Wang, Y., Zhang, D. -H., Zhang, J. -Y., Chen, N., Zhi, G. -Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-yield+synthesis+of+bioactive+ethyl+cinnamate+by+enzymatic+esterification+of+cinnamic+acid%5BTitle%5D)+AND+%22Food+Chem%22%5BJournal%5D)">High-yield synthesis of bioactive ethyl cinnamate by enzymatic esterification of cinnamic acid.</a> Food Chem. 190, 629-633 (2016).</li>
<li>Schellinger, A. P., Carr, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Solubility+of+buffers+in+aqueous-organic+eluents+for+reversed-phase+liquid+chromatography%5BTitle%5D)+AND+%22LCGC+North+America%22%5BJournal%5D)">Solubility of buffers in aqueous-organic eluents for reversed-phase liquid chromatography.</a> LCGC North America. 22 (6), 544(2004).</li>
<li>Jiang, S. -M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%CE%B2-III-Tubulin%3A+A+reliable+marker+for+retinal+ganglion+cell+labeling+in+experimental+models+of+glaucoma%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">β-III-Tubulin: A reliable marker for retinal ganglion cell labeling in experimental models of glaucoma.</a> Int J Ophthalmol. 8 (4), 643-652 (2015).</li>
<li>Guo, J., Walss‐Bass, C., Ludueña, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+%CE%B2+isotypes+of+tubulin+in+neuronal+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Cytoskeleton%22%5BJournal%5D)">The β isotypes of tubulin in neuronal differentiation.</a> Cytoskeleton. 67 (7), 431-441 (2010).</li>
<li>Lee, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TuJ1+%28class+III+%CE%B2-tubulin%29+expression+suggests+dynamic+redistribution+of+follicular+dendritic+cells+in+lymphoid+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">TuJ1 (class III β-tubulin) expression suggests dynamic redistribution of follicular dendritic cells in lymphoid tissue.</a> Eur J Cell Biol. 84 (2-3), 453-459 (2005).</li>
<li>Fernando, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+brain+and+retinal+organoids+from+confluent+cultures+of+pluripotent+stem+cells+connected+by+nerve-like+axonal+projections+of+optic+origin%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Differentiation of brain and retinal organoids from confluent cultures of pluripotent stem cells connected by nerve-like axonal projections of optic origin.</a> Stem Cell Rep. 17 (6), 1476-1492 (2022).</li>
<li>Belecky-Adams, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pax-6%2C+Prox+1%2C+and+Chx10+homeobox+gene+expression+correlates+with+phenotypic+fate+of+retinal+precursor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Pax-6, Prox 1, and Chx10 homeobox gene expression correlates with phenotypic fate of retinal precursor cells.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 38 (7), 1293-1303 (1997).</li>
<li>Rowan, S., Cepko, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+analysis+of+the+homeodomain+transcription+factor+Chx10+in+the+retina+using+a+novel+multifunctional+BAC+transgenic+mouse+reporter%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Genetic analysis of the homeodomain transcription factor Chx10 in the retina using a novel multifunctional BAC transgenic mouse reporter.</a> Dev Biol. 271 (2), 388-402 (2004).</li>
<li>Andilla, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+tissue-mimic+with+light+sheet+microscopy%3A+A+comparative+guideline%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Imaging tissue-mimic with light sheet microscopy: A comparative guideline.</a> Sci Rep. 7, 44939(2017).</li>
<li>Olarte, O. E., Andilla, J., Gualda, E. J., Loza-Alvarez, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-sheet+microscopy%3A+A+tutorial%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Opt+Photonics%22%5BJournal%5D)">Light-sheet microscopy: A tutorial.</a> Adv Opt Photonics. 10, 111(2018).</li>
<li>Power, R. M., Huisken, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+guide+to+light-sheet+fluorescence+microscopy+for+multiscale+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">A guide to light-sheet fluorescence microscopy for multiscale imaging.</a> Nat Methods. 14 (4), 360-373 (2017).</li>
<li>Darche, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light+sheet+fluorescence+microscopy+of+cleared+human+eyes%5BTitle%5D)+AND+%22Commun+Biol%22%5BJournal%5D)">Light sheet fluorescence microscopy of cleared human eyes.</a> Commun Biol. 6 (1), 1025(2023).</li>
</ol>

Autorzy nie mają do zadeklarowania konfliktu interesów.

Opisany tutaj protokół ułatwia badanie czasoprzestrzennego rozmieszczenia komórek tworzących organoid siatkówki na różnych etapach dojrzewania, zachowując jego naturalną architekturę 3D, co jest kluczowym aspektem dla zrozumienia tych modeli w kontekście przyszłej medycyny spersonalizowanej. Zapewnia szczegółowy wgląd w architekturę siatkówki na poziomie odrębnych warstw i poszczególnych typów komórek, umożliwiając wizualizację struktur subkomórkowych przy zachowaniu globalnego kontekstu 3D.
Alternatywą dla obrazowania całościowego jest obróbka końcowa próbki w celu wykonania obrazowania na konwencjonalnych przekrojach (parafinowych lub krioprezerwowanych). Podczas gdy sekcje dostarczają cennych informacji na temat lokalizacji białek i struktur, dane te są ograniczone do jednej płaszczyzny, co ogranicza zrozumienie przestrzennych połączeń komórkowych. W rezultacie, cechy takie jak proporcja czopków i pręcików lub tworzenie wiązek aksonalnych w określonych regionach mogą nie być dokładnie odwzorowane, co komplikuje interpretację w trzech wymiarach. Organoidy siatkówki są wysoce niejednorodne, z różnymi regionami potencjalnie zawierającymi różne typy komórek i/lub wykazującymi różny stopień złożoności i zróżnicowania. Obrazowanie całościowe rozwiązuje ten problem, ponieważ umożliwia globalną analizę gradientów niejednorodności bez polegania na wyborze podzbioru sekcji, które mogą nie reprezentować całej próbki.
Mikroskopia fluorescencyjna z arkuszami świetlnymi (LSFM)21,22,23 może być stosowana jako alternatywa dla laserowo-skaningowej mikroskopii konfokalnej. W LSFM próbka jest oświetlana cienką warstwą światła o grubości kilku mikronów, a cała fluorescencja generowana z oświetlonego przekroju optycznego jest wykrywana za pomocą kamery. LSFM to technika detekcji oparta na szerokim polu, która stanowi wysoce wydajną strategię szybkiej wizualizacji dużych objętości (próbek w skali do centymetra) przy minimalnym efekcie fotowybielania i fototoksyczności. Jednak organoidy mogą wykazywać znaczną aberrację sferyczną, ponieważ światło przechodzące przez zakrzywione powierzchnie jest załamywane w różny sposób w zależności od kąta padania. W tych eksperymentach zniekształcenie to powodowało utratę ostrości, co prowadziło do rozmycia i pogorszenia rozdzielczości głębszych struktur. Do obrazowania naszych organoidów siatkówki (o średnicy około 1 mm) najskuteczniejszym podejściem okazała się laserowa skaningowa mikroskopia konfokalna.
Protokół ten jest dostosowany do naszych wymagań eksperymentalnych. Może być używany jako przewodnik dla naukowców zapuszczających się w obrazowanie całościowe optycznie oczyszczonych organoidów siatkówki i powinien być dostosowany, jeśli te się różnią. W tej sekcji szczegółowo opisano krytyczne kroki, modyfikacje i ograniczenia metodologii.
Kluczowym krokiem jest podjęcie decyzji w sprawie protokołu rozliczeniowego. Należy wziąć pod uwagę wiele kryteriów. Po pierwsze, należy wziąć pod uwagę typologię próby. Oczyszczanie kości to nie to samo, co oczyszczanie tkanki mózgowej, tak jak oczyszczanie organoidów siatkówki różni się od oczyszczania organoidów żołądka, ponieważ każdy z nich wymaga odrębnego podejścia. Aby zobrazować oczyszczone organoidy innego typu, konieczne jest przejrzenie literatury w celu zidentyfikowania protokołów, które zostały zoptymalizowane specjalnie dla interesującej próbki. Fruktoza/glicerol to szybka i nietoksyczna metoda oczyszczania, która, jak udowodniono, jest przydatna do usuwania organoidów pochodzących z różnych tkanek (organoidy ludzkich dróg oddechowych, okrężnicy, nerek, wątroby i piersi oraz organoidy gruczołów sutkowych myszy)12 , ale nie była odpowiednia do zwiększania przezroczystości ludzkich organoidów siatkówki. Zgodnie z naszą najlepszą wiedzą, żadne badanie nie donosi o zastosowaniu fruktozy/glicerolu w tkance nerwowej/organoidzie. Dlatego dochodzimy do wniosku, że ta metoda oczyszczania nie jest odpowiednia do oczyszczania tkanek nerwowych. Dalsze badania są uzasadnione w celu wyjaśnienia przyczyn leżących u podstaw tej niezgodności.
Innym krytycznym czynnikiem, który należy wziąć pod uwagę, jest wymagane pole widzenia, ponieważ ma ono bezpośredni wpływ na strategię obrazowania i wybór komponentów optycznych. Duże pola widzenia są zwykle osiągane przy użyciu obiektywów o małym powiększeniu, które często są przeznaczone do użytku bez mediów zanurzeniowych (np. powietrze, RI = 1,00). Obiektywy te doświadczają większego niedopasowania RI podczas obrazowania próbek oczyszczonych przez BB (RI = 1,56), co prowadzi do przesunięć w ostrości głębokości, które należy skorygować podczas przetwarzania końcowego. W przeciwieństwie do tego, obiektywy immersyjne z olejem (RI = 1,51) wykazują mniejsze niedopasowanie RI do roztworów czyszczących, takich jak BABB (RI = 1,56) i dlatego nie wymagają ponownej kalibracji.
Proste metody zanurzeniowe zwykle nie zapewniają wysokiej przezroczystości i nie nadają się do uzyskiwania wysokiej jakości obrazów próbek z całego montażu. Protokoły oczyszczania tkanek wpływają na skuteczne rozwiązanie poprzez pęcznienie lub kurczenie się próbek. W zależności od celu eksperymentu, korzystne może być zarówno obrzęk, jak i kurczenie się. Protokoły, które rozszerzają próbkę, mogą zwiększyć rozdzielczość drobnych szczegółów w tym samym układzie optycznym, który wcześniej nie był w stanie pokazać tych samych szczegółów. Skurcz może być pożądany w celu wizualizacji dużych próbek, które w przeciwnym razie nie zmieściłyby się w komorze na próbki lub nie dostosowałyby się do obiektywnych odległości roboczych. Ponieważ jednak skurcz ściska próbkę i może zniekształcać odległości wewnętrzne, technika ta nie nadaje się do oceny wymiarowej ani precyzyjnego pomiaru odległości międzykomórkowych.
Innym ważnym czynnikiem, który należy wziąć pod uwagę, jest kompatybilność z białkami fluorescencyjnymi. W większości protokoły oparte na rozpuszczalnikach organicznych wygaszają białka fluorescencyjne, ponieważ wymagają wysokich temperatur lub degradują białka fluorescencyjne podczas zatapiania w roztworach pasujących do RI. Na szczęście większość metod jest kompatybilna z technikami znakowania immunologicznego. Jednak zgodność każdego epitopu powinna być potwierdzona eksperymentalnie.
Co więcej, przenikanie dużych cząsteczek IgG przez tkankę może być utrudnione, co zmniejsza skuteczność barwienia i ogranicza wizualizację docelowej struktury do powierzchni próbki. Barwienie całych próbek przeciwciałami może zająć kilka dni (a nawet tygodni), w zależności od wielkości i charakteru próbki, co znacznie wydłuża czas trwania protokołu.
Wreszcie, kompatybilność z przyrządem optycznym jest obowiązkowa. Większość metod opartych na rozpuszczalnikach organicznych (z wyjątkiem ECi) jest bardzo korozyjna i nie jest chemicznie kompatybilna z dostępnymi na rynku komorami na próbki i obiektywami zanurzeniowymi. Co więcej, niektóre rozwiązania odśnieżające mają RI który nie odpowiada zakresowi wymaganemu przez dostępne obiektywy (zwykle woda).
Jest kilka kroków w protokole, które wymagają szczególnej uwagi. FluoClear BABB, jako hydrofobowa metoda oczyszczania, wymaga wcześniejszego etapu odwodnienia. pH odgrywa ważną rolę w zachowaniu fluorescencji białek endogennych, takich jak GFP. Następnie ważne jest, aby upewnić się, że roztwory alkoholu mają odpowiednio dostosowane pH. Odwodnienie jest kluczem do całkowitego oczyszczenia. Optymalne wyniki uzyskuje się poprzez inkubację próbek z rosnącym gradientem roztworów alkoholu.
Wielkość próbki odgrywa ważną rolę w umożliwieniu przeciwciałom osiągnięcia określonych celów. Przeciwciała mogą nie przenikać jednorodnie i zostać zatrzymane na zewnątrz próbki. W takim przypadku należy rozważyć zmianę detergentu na inny rodzaj detergentu (Tween-20 lub Saponina), zwiększając stężenie i czas inkubacji detergentu i przeciwciał. Jeśli te dostosowania są niewystarczające, alternatywne strategie mogą poprawić przenikanie przeciwciał. W przypadku znakowania immunologicznego dużych próbek (w skali centymetrowej) naukowcy odkryli, że SDS może ułatwić głębszą penetrację przeciwciał24. SDS indukuje częściową utratę trzeciorzędowej struktury przeciwciał, skutecznie linearyzując białko i umożliwiając mu głębsze wnikanie w tkankę. Następnie wypłukanie SDS przywraca przeciwciałom właściwości wiązania antygenu, umożliwiając bardziej równomierne barwienie grubszych tkanek i zmniejszając powszechnie obserwowany gradient silniejszego znakowania na powierzchni próbki.
Przygotowanie własnych fluorescencyjnych przeciwciał drugorzędowych ma kilka zalet, ponieważ zapewnia większą elastyczność w projektowaniu znakowania immunologicznego, umożliwiając wybór specyficznej kombinacji przeciwciał fluoroforowo-drugorzędowych, zwiększając liczbę kolorów, które można zastosować w tej samej próbce. Dodatkowo stosunek fluoroforu do przeciwciał można dostosować, dzięki czemu są one na ogół jaśniejsze. Należy jednak wziąć pod uwagę pewne aspekty. Przeciwciała drugorzędowe wytwarzane na zamówienie są na ogół mniej stabilne niż te dostępne na rynku i powinny być używane świeże. Większość z nich zachowuje powinowactwo do ligandów przez 3-6 miesięcy w temperaturze 4 °C, ale stabilność musi zostać określona eksperymentalnie, ponieważ niektóre kombinacje mogą ulegać szybszej degradacji. Co więcej, niektóre pary przeciwciało-fluorofor mogą zmieniać powinowactwo przeciwciała do jego epitopu, powodując częściowe lub całkowite niespecyficzne znakowanie. Aby zapewnić wiarygodność, zaleca się najpierw przetestowanie specjalnie wykonanych przeciwciał drugorzędowych przy użyciu kontroli, takich jak komórki w hodowli, przed zastosowaniem ich do próbek eksperymentalnych.
Ten zoptymalizowany protokół integruje oczyszczanie optyczne z immunoznakowaniem, aby ułatwić obrazowanie konfokalne organoidów siatkówki z całym wierzchowaniem. Zachowuje integralność strukturalną i umożliwia identyfikację kluczowych typów komórek siatkówki w organoidzie. W ten sposób protokół zapewnia naukowcom potężne narzędzie do badania dojrzewania organoidów siatkówki i organizacji przestrzennej.

Organoidy siatkówki
Organoidy siatkówki to złożone struktury 3D, które naśladują ludzką siatkówkę, oferując cenną platformę do badania rozwoju siatkówki, mechanizmów chorobowych i potencjalnych strategii terapeutycznych1. Utrzymują naturalną architekturę 3D siatkówki, wykazują wierność transkryptomiczną i kompetencje funkcjonalne, odtwarzając fototransdukcję i łączność synaptyczną2. Ponadto ściśle naśladują rozwój in vivo 3,4, co pozwala na bardziej realistyczne odwzorowanie w porównaniu z płaskimi hodowlami komórkowymi. W poprzednich badaniach Isla-Magrané i in. ustanowili dwuetapowy protokół w celu uzyskania organoidów wielogałkowych pochodzących z ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (hiPSC) w celu modelowania cech komórkowych ludzkiego oka w fazie rozwoju 5,6. Ze względu na niedobór tkanki płodowej, badania nad rozwojem ludzkiego oka zostały ograniczone do badań anatomicznych.
Organoidy siatkówki uzyskane za pomocą tego protokołu wykazywały prawidłowe warstwowanie i zawierały wszystkie główne podtypy komórek siatkówki, takie jak fotoreceptory, komórki dwubiegunowe, komórki zwojowe, komórki amakrynowe i poziome oraz makroglej, wraz z kluczowymi cechami morfologicznymi oraz prawidłową organizacją przestrzenną i połączeniami. Modele organoidowe, choć stanowią potencjalne rozwiązanie, wykazują znaczną zmienność, co utrudnia osiągnięcie spójnych wyników. W związku z tym istnieje pilna potrzeba zastosowania różnych zaawansowanych technologii w bardziej wiarygodnych modelach ludzkich. Do tej pory organoidy te były badane tylko przy użyciu przekrojów histologicznych, ponieważ ich złożony skład komórkowy, gęstość i rozmiar utrudniają penetrację światła, co skutkuje słabą wydajnością obrazowania optycznego w głębszych warstwach, ograniczając w ten sposób kompleksową analizę.
Obrazowanie z pełnym mocowaniem
Tradycyjne techniki histologiczne, które polegają na cięciu i barwieniu utrwalonych tkanek, mogą dostarczyć szczegółowych informacji o określonych regionach, ale nie są w stanie uchwycić ogólnej architektury i relacji przestrzennych w całym organoidzie. Aby przezwyciężyć to ograniczenie, obrazowanie całościowe staje się cennym narzędziem do badania organoidów siatkówki. Obrazowanie w całości umożliwia wizualizację całego organoidu w jego nienaruszonej formie 3D, zachowując przestrzenny rozkład typów komórek i składników macierzy zewnątrzkomórkowej. Takie podejście jest szczególnie korzystne dla badania składu komórkowego w obrębie organoidów i między nimi, zapewniając pełniejsze zrozumienie ich procesów rozwojowych i organizacji funkcjonalnej. Jednak ze względu na ich gęstość komórkową i zagęszczenie, organoidy siatkówki są nieprzezroczyste (ryc. 1, niewyjaśnione). Naturalna nieprzezroczystość próbek powoduje rozpraszanie światła, co utrudnia szczegółową wizualizację struktur wewnętrznych za pomocą mikroskopii. Tutaj techniki czyszczenia optycznego okazują się potężnym narzędziem.
Techniki oczyszczania optycznego
Oczyszczanie optyczne odnosi się do zabiegów fizykochemicznych, które sprawiają, że grube próbki biologiczne stają się przezroczyste poprzez homogenizację gradientów współczynnika załamania światła (RI) tkanki w celu dopasowania do gradientów środka czyszczącego i usuwania substancji pochłaniających światło7. Metody te radykalnie zmniejszają rozpraszanie światła i zwiększają przezroczystość. Ta transformacja pozwala nam zobaczyć cały organoid siatkówki, umożliwiając kompleksową analizę jego skomplikowanej organizacji komórkowej i morfologii za pomocą technik obrazowania całego montażu. W praktyce osiąga się to poprzez impregnację próbki substancją o wysokim RI oraz usunięcie lipidów i pigmentów.
Dostępne są różne metody oczyszczania, różniące się różnymi aspektami (np. stopień przezroczystości, kompatybilność z technikami mikroskopowymi, próbkami i cząsteczkami fluorescencyjnymi, wykonalność, czas trwania), ale żadna z nich nie wyróżnia się jako najlepszy wspólny protokół8. Są one podzielone na cztery główne grupy: (1) proste zanurzenie, (2) hydrofobowe na bazie rozpuszczalników organicznych, (3) oparte na hiperhydratacji i (4) oparte na transformacji tkankowej lub zatapianiu hydrożelu, jak ładnie podsumowali Avilov i wsp.7. Wszystkie metody obejmują etap dopasowania RI, zwykle poprzez zanurzenie próbki w roztworze, który odpowiada średniemu RI tkanki. W metodach hydrofobowych lipidy i woda są usuwane przez zanurzenie próbki w rozpuszczalniku organicznym o rosnącym stężeniu (takim jak metanol lub propanol).
Prezentowany protokół jest zoptymalizowaną metodą, która integruje oczyszczanie optyczne z immunoznakowaniem, aby ułatwić wizualizację 3D organoidów siatkówki w całości za pomocą mikroskopii konfokalnej, umożliwiając obrazowanie pełnej objętości przy zachowaniu integralności strukturalnej. Takie podejście pozwala na identyfikację kluczowych typów komórek siatkówki w organoidzie, zapewniając naukowcom potężne narzędzie do badania dojrzewania organoidów siatkówki i organizacji przestrzennej w fizjologicznie istotnym kontekście.

<table><tbody><tr><td>Obiektyw 10x NA0.40 DRY</td><td>Księga Leica</td><td>HC PL APO CS2</td><td>-</td></tr><tr><td>Obiektyw 63x NA1.40 OIL</td><td>Księga Leica</td><td>HC PL APO CS2</td><td>-</td></tr><tr><td>przeciwciało anty-GFP</td><td>Księga Abcam</td><td>ab13970 powiedział:</td><td>-</td></tr><tr><td>Alkohol benzylowy (BA)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>13162</td><td>-</td></tr><tr><td>Benzoesan benzylu (BB)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>W213802</td><td>-</td></tr><tr><td>Szalka Petriego ze szkła dolnego</td><td>MatTek powiedział:</td><td>P35G-1.5-14-C</td><td>-</td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej (BSA)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A7030 (wersja angielska)</td><td>-</td></tr><tr><td>Przeciwciało Chx10</td><td>Sta Cruz Biotech</td><td>SC-365519</td><td>-</td></tr><tr><td>Kolumny filtracyjne żelowe Cytiva Illustra Nap-5, Sephadex G-25</td><td>Sigma Aldrich</td><td>17-0853-02</td><td>-</td></tr><tr><td>DAPI (interfejs DAPI)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Zobacz materiał D9542</td><td>-</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Zobacz materiał D8418</td><td>-</td></tr><tr><td>DRAQ5 powiedział:</td><td>Rybak termiczny</td><td>62251</td><td>-</td></tr><tr><td>Barwnik (kwas karboksylowy, ester sukcynimidylowy)</td><td>Invitrogen lub Abberior</td><td>-</td><td>-</td></tr><tr><td>ImageJ/Fidżi&nbsp;</td><td>NIH</td><td>&nbsp; Wersja 1.50i</td><td>-</td></tr><tr><td>Odwrócony konfokalny laserowy mikroskop skaningowy</td><td>Mikrosystemy Leica</td><td>TCS SP8 STED 3X-FALCON</td><td>-</td></tr><tr><td>Oprogramowanie do obróbki 3D LAS X</td><td>Mikrosystemy Leica</td><td>-</td><td>-</td></tr><tr><td>mQ H2O</td><td>-</td><td>-</td><td>Ultraczysta woda z systemu oczyszczania wody Synergy</td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Acros Organics</td><td>424270010</td><td>-</td></tr><tr><td>Nieznakowane drugorzędowe IgG</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>-</td><td>-</td></tr><tr><td>Niebieskie przeciwciało opsyny</td><td>Milipore&nbsp; &nbsp;</td><td>AB5407&nbsp;</td><td>-</td></tr><tr><td>Przeciwciało opsyny RG</td><td>Milipory</td><td>AB5745&nbsp;</td><td>-</td></tr><tr><td>Paraformaldehyd (PFA) 4%</td><td>Termo naukowy&nbsp;</td><td>J199943-K2</td><td>-</td></tr><tr><td>Rozwiązanie PBS</td><td>Gibco (firma Gibco)</td><td>18912-014</td><td>-</td></tr><tr><td>Sondy do znakowania falloidyny</td><td>Rybak termiczny</td><td>-</td><td>-</td></tr><tr><td>sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)</td><td>Gibco&nbsp;</td><td>10010023</td><td>-</td></tr><tr><td>Przeciwciało RECOV</td><td>Milipory</td><td>AB5585-I&nbsp;</td><td>-</td></tr><tr><td>Przeciwciało RHO (RET-P1)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>O4886&nbsp;</td><td>-</td></tr><tr><td>Cytrynian sodu trójzasadowy dwuwodny&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Zobacz materiał C8532</td><td>-</td></tr><tr><td>Tryton X-100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Zobacz materiał T8787 TGL</td><td>-</td></tr><tr><td>Przeciwciało TUJ1</td><td>Covance&nbsp;</td><td>MMS-435P&nbsp;</td><td>-</td></tr></tbody></table>

wizualizacja organoidów siatkówki w całości z rozdzielczością komórkową

Whole-mount Retinal Organoid Visualization with Cellular Resolution

Organoidy siatkówki pochodzące z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych to skomplikowane struktury 3D, które naśladują ludzką siatkówkę, oferując potężną platformę do badania rozwoju siatkówki, mechanizmów chorobowych i potencjalnych strategii terapeutycznych. Co więcej, ponieważ pochodzą one od pacjentów, stają się coraz bardziej popularne, ponieważ są bardzo obiecujące jako narzędzie medycyny spersonalizowanej. W przeciwieństwie do konwencjonalnych hodowli komórkowych 2D, organoidy siatkówki zachowują natywną architekturę 3D siatkówki, co pozwala na bardziej realistyczne odwzorowanie i umożliwia bardziej fizjologicznie istotne badania. Jednak ich złożoność strukturalna, wysoka gęstość komórkowa i zróżnicowany skład stanowią poważne wyzwanie dla charakterystyki. 
Aby sprostać tym wyzwaniom i poszerzyć naszą wiedzę na temat dojrzewania organoidów siatkówki przy jednoczesnym zachowaniu kontekstu 3D, połączyliśmy metody oczyszczania optycznego z immunoznakowaniem, aby zobrazować całą strukturę organoidów z całą mocą za pomocą mikroskopii konfokalnej. W tym celu zastosowaliśmy metodę oczyszczania kompatybilną z obiektywami o niskiej i wysokiej aperturze numerycznej, ułatwiając obrazowanie pełnej objętości i uchwycenie niektórych obszarów zainteresowania z rozdzielczością komórkową. Korzystając z tego podejścia, zidentyfikowaliśmy morfologię i rozmieszczenie w 3D trzech głównych ścieżek neuronalnych odpowiedzialnych za przekazywanie informacji wzrokowej: fotoreceptorów czopków i pręcików, komórek afektywnych dwubiegunowych i zwojowych. Nasze odkrycia rzucają więcej światła na techniki wizualizacji w celu zajęcia się organizacją przestrzenną komórek siatkówki w organoidzie.

Protokół ten łączy w sobie oczyszczanie optyczne i znakowanie immunologiczne w celu obrazowania konfokalnego całej objętości organoidów siatkówki z pełnym mocowaniem. Zachowuje strukturę 3D, umożliwiając szczegółową wizualizację kluczowych ścieżek neuronalnych, usprawniając badanie dojrzewania siatkówki, organizacji przestrzennej i jej potencjalnych zastosowań w modelowaniu chorób i medycynie spersonalizowanej.

Wizualizacja organoidów siatkówki w całości z rozdzielczością komórkową

Retinal organoids derived from human induced pluripotent stem cells are intricate 3D structures that mimic the human retina, offering a powerful platform ...

Nasza praca koncentruje się na opracowywaniu i badaniu organoidów siatkówki, które służą jako ludzki model in vitro do badania, jak tworzy się ludzka siatkówka, jak wpływają choroby i jak możemy je leczyć.Aby posunąć naprzód badania w dziedzinie medycyny regeneracyjnej, używamy organoidów siatkówki 3D w połączeniu z oczyszczaniem optycznym i znakowaniem immunologicznym do wizualizacji całych struktur i badania specjalnej organizacji komórek siatkówki za pomocą mikroskopii konfokalnej.Obrazowanie całościowe napotyka wyzwania, takie jak nierównomierna penetracja przeciwciał w gęstych tkankach i sferyczna aberracja w organoidach, które powodują znakowanie odchylenia powierzchni i utratę ostrości podczas wizualizacji tkanki.Nasza metoda ujawnia połączenia komórek siatkówki, typy komórek, w ramach organizacji 3D, dostarczając kluczowych informacji na temat przyczyn leżących u podstaw chorób siatkówki.[Instruktor] Na początek należy uzyskać podwielokrotności fluoroforu rozpuszczone w bezwodnym DMSO, odwodnione i zamrożone. Dodaj od 1 do 10 mikrolitrów DMSO do podwielokrotności. Teraz połącz 50 mikrolitrów wtórnej immunoglobuliny G lub przeciwciała pierwszorzędowego, sześć mikrolitrów jednego molowego wodorowęglanu sodu i od jednego do pięciu mikrolitrów fluoroforu i inkubuj na platformie kołyszącej przez 40 minut w temperaturze pokojowej, chroniąc przed światłem. Podczas gdy reakcja postępuje, zdjąć pokrywki kolumn wykluczających wielkość oczyszczania i przepuścić bufor. Zrównoważ kolumnę, przeprowadzając trzy rundy po dwa do trzech mililitrów PBS przez kolumnę. Jeśli ostatnia równowaga zakończy się przed zakończeniem inkubacji, odłóż pokrywki z powrotem, aby uniknąć ich ciągnięcia, i poczekaj na zakończenie reakcji. Po inkubacji dodaj 140 mikrolitrów PBS do reakcji znakowania, aby doprowadzić objętość do około 200 mikrolitrów i zawirować. Dodaj roztwór do środka kolumny i pozwól mu wejść do kolumny. Po wydostaniu się ostatniej kropli przepchnij roztwór za pomocą 550 mikrolitrów PBS. Gdy ciecz przestanie opadać, wymyj 300 mikrolitrami PBS i zbierz w 1,5 mililitrowej probówce mikrowirówkowej. Zmierz absorbancję próbki przy 280 nanometrach i przy długościach fal właściwych dla fluoroforu, aby obliczyć stężenie przeciwciał i współczynniki znakowania. Znakowane przeciwciała należy przechowywać w temperaturze czterech stopni Celsjusza, chroniąc przed światłem, przez okres do sześciu miesięcy. Utrwal organoidy siatkówki za pomocą 4% aldehydu paraform w temperaturze pokojowej przez 45 minut. Po utrwaleniu dodaj roztwór do pobierania antygenu na organoidy i inkubuj naczynie w temperaturze 60 stopni Celsjusza, z łagodnym wstrząsaniem z prędkością 30 obrotów na minutę przez godzinę. Następnie przepuścić organoidy za pomocą PBS zawierającego 1% Triton X-100. Inkubować mieszaninę w temperaturze pokojowej, delikatnie wstrząsając przez cztery godziny. Teraz zablokuj organoidy w 2% BSA za pomocą 0,1% Triton X-100 w temperaturze pokojowej przez noc lub przez ponad jeden dzień. Następnego dnia dodaj rozcieńczone przeciwciała pierwszorzędowe do organoidów. Inkubować w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez dwa dni, lekko wstrząsając. Umyj organoidy trzy razy przez 15 minut każdy w roztworze myjącym o temperaturze pokojowej, delikatnie wstrząsając. Teraz dodaj roztwór rozcieńczający przeciwciała drugorzędowe i inkubuj w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez dwa dni z łagodnym wstrząsaniem. Po umyciu organoidów, jak wykazano wcześniej, należy inkubować organoidy z barwnikami fluorescencyjnymi rozcieńczonymi w roztworze myjącym w temperaturze pokojowej przez jedną godzinę z łagodnym wstrząsaniem. Następnie umyj ponownie. Następnie przygotuj roztwory 1-propanolu w wodzie ultraczystej o stężeniach 15%, 30%, 45%, 60%, 75% i 90% i dostosuj każdy do pH 9,5 za pomocą trimetyloaminy. Próbki odwadniać sekwencyjnie w rosnących gradientach roztworów 1-propanolu przez dwie godziny w temperaturze 30 stopni Celsjusza każdy, lekko wstrząsając. Następnie przenieś próbkę do 100% roztworu 1-propanolu i inkubuj przez noc w temperaturze 30 stopni Celsjusza z łagodnym wstrząsaniem. W celu oczyszczenia próbki należy przygotować mieszaninę alkoholu benzylowego i benzoesanu benzylu w stosunku jeden do dwóch, aby uzyskać roztwór BABB. Zanurz próbki w BABB w temperaturze pokojowej na noc. Odśwież roztwór BABB przed obrazowaniem. Za pomocą szklanej pipety umieść organoid na szalce Petriego ze szklanym dnem z kroplą BABB, upewniając się, że styka się z powierzchnią szkła nakrywkowego. Teraz użyj odwróconego konfokalnego laserowego mikroskopu skaningowego z obiektywami o małym i dużym powiększeniu, aby uzyskać obrazy Z-stack w rozdzielczości komórkowej 3D. Ponownie skalibruj rozmiar kroku akwizycji Z-stack, uwzględniając niedopasowanie współczynnika załamania światła między roztworem klarującym a mediami zanurzeniowymi. Teraz uruchom ImageJ, zaktualizuj głębokość woksela, wybierając Obraz i klikając Właściwości, aby utworzyć projekcje obrazu stosu Z. Sprawdź głębokość stosu Z, wybierając Obraz, a następnie Stosy i wybierając Widoki ortogonalne, aby wyświetlić widoki XY, XZ i YZ organoidu siatkówki. Zapisz żądane regiony, klikając Plik i wybierając Zapisz jako. Na koniec utwórz animację renderu 3D stosu Z za pomocą oprogramowania do przetwarzania. Organoidy siatkówki oczyszczone z fruktozy-glicerolu wykazały najmniejszą poprawę przezroczystości, co utrudniało wizualizację rdzenia organoidu. Oczyszczanie ECI poprawiło wizualizację warstw siatkówki, ale nadal nie ujawniło rdzenia organoidu z powodu uporczywego rozpraszania światła. Organoidy oczyszczone z Fluoclear BABB wykazywały najwyższą przezroczystość, wyraźnie odsłaniając zarówno korę, jak i rdzeń o spójnej fluorescencji. Zarówno organoidy oczyszczone przez ECI, jak i fluoclear BABB wykazywały widoczny skurcz na obrazach w jasnym polu z powodu etapów odwodnienia. Skurcz wywołany przez BABB zwiększył zwartość próbki, umożliwiając wykorzystanie obiektywów o dużym powiększeniu do obrazowania głębszych struktur. Znakowanie immunologiczne TUJ1 po 40 dniach in vitro wykazało pojedynczą cienką warstwę neuronalną bez widocznej stratyfikacji. Po 90 dniach komórki gęsto zaludniły obszar wierzchołkowy, a po 170 dniach organoid wykazywał wyraźne oznaki warstwowej organizacji z określoną strefą wierzchołkową. Po 200 dniach wydłużone wypustki komórkowe rozciągały się do wewnątrz od powierzchni do rdzenia, a organoid rozwinął się w trzy odrębne warstwy siatkówki po 250 dniach. Włókna neuronalne rozciągały się od centrum organoidu w kierunku obwodu przez cały okres dojrzewania, stając się grubsze i bardziej złożone przez 250 dni in vitro. Fotoreceptory czopkowe wyrażające niebieskie i zielono-czerwone opsyny pojawiły się w późnych stadiach i wykazywały wydłużone morfologie z jasnymi końcami. Fotoreceptory pręcikowe wyrażające rodopsynę zidentyfikowano na podstawie ich centralnych jąder i obwodowego rozkładu opsyny. Komórki Chx10-dodatnie były początkowo szeroko rozmieszczone, ale później zlokalizowane specyficznie w wewnętrznej warstwie jądrowej podczas dojrzewania organoidów. Endogenna ekspresja GCaMP6s została zachowana po usunięciu BABB, a sygnał GFP był wykrywalny w siatkówce nerwowej po długotrwałym utrwaleniu.

whole-mount-retinal-organoid-visualization-with-cellular-resolution

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Niniejszy artykuł wideo demonstruje sposób tworzenia organotypowych kultur całej siatkówki oraz procedurę cytospinową służącą do analizy efektów indukowanych egzogennie. Organotypowe kultury całej siatkówki odwzorowują warunki in vivo i znacząco ułatwiają dostęp do siatkówek myszy w manipulacjach eksperymentalnych, pozwalając jednocześnie uniknąć wad klasycznych modeli zwierzęcych u myszy.

Organotypowa hodowla całego preparatu siatkówki mysiej typu in vivo

Cała struktura 3D i zawartość komórkowa organoidów, jak również ich fenotypowe podobieństwo do oryginalnej tkanki, mogą być uchwycone za pomocą opisanego tutaj protokołu obrazowania 3D o rozdzielczości pojedynczej komórki. Protokół ten może być stosowany do szerokiej gamy organoidów różniących się pochodzeniem, rozmiarem i kształtem.

Trójwymiarowe obrazowanie nienaruszonych organoidów w rozdzielczości pojedynczej komórki

Prezentowana tutaj jest chirurgiczna technika przeszczepiania tkanki siatkówki pochodzącej z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych (hPSC) do przestrzeni podsiatkówkowej dużego modelu zwierzęcego.

Podsiatkówkowy przeszczep ludzkiej embrionalnej tkanki siatkówki pochodzącej z komórek macierzystych w modelu dużego zwierzęcia kota

To badanie ma na celu opracowanie nowego modelu ludzkiej organotypowej hodowli siatkówki (HORC), który zapobiega naruszeniu integralności siatkówki podczas obchodzenia się z eksplantatem. Osiąga się to poprzez hodowlę siatkówki z leżącym nad nią ciałem szklistym i leżącym pod nim barwnikiem siatkówki: nabłonkiem-naczyniówką (RPE-naczyniówką) i twardówką.

Charakterystyka nowatorskiej techniki organotypowej hodowli siatkówki u ludzi

Korzystając z metody samoorganizacji, opracowujemy protokół z dodatkiem COCO, który może znacznie zwiększyć generowanie fotoreceptorów.

Ukierunkowana indukcja organoidów siatkówki z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych

Tutaj opisujemy zoptymalizowany system indukcji organoidów siatkówki, który jest odpowiedni dla różnych linii ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych do generowania tkanek siatkówki o wysokiej powtarzalności i wydajności.

System indukcji organoidów siatkówki do wyprowadzania tkanek siatkówki 3D z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych

Ten protokół opisuje efektywną metodę różnicowania hiPSC w klastry pola gałkowego i generowania organoidów neuro-siatkówkowych przy użyciu uproszczonych warunków hodowli obejmujących zarówno systemy hodowli adherentnych, jak i zawiesinowych. Inne typy komórek oka, takie jak RPE i nabłonek rogówki, można również wyizolować z dojrzałych pól ocznych w hodowlach siatkówki.

Wytwarzanie organoidów siatkówki ze zdrowych i specyficznych dla choroby siatkówki pluripotencjalnych komórek macierzystych indukowanych przez człowieka

Ten protokół zapewnia zoptymalizowaną i skomplikowaną procedurę przygotowania próbek organoidów siatkówki do transmisyjnej mikroskopii elektronowej. Nadaje się do zastosowań, które obejmują analizę synaps w dojrzałych organoidach siatkówki.

Przygotowanie próbek organoidów siatkówki do transmisyjnej mikroskopii elektronowej

Mikroglej to unikalne komórki odpornościowe rezydentne w siatkówce, odgrywające kluczową rolę w różnych chorobach zwyrodnieniowych siatkówki. Stworzenie modelu kohodowli organoidów siatkówki z mikroglejem może ułatwić lepsze zrozumienie patogenezy i postępów w rozwoju chorób siatkówki.

Składanie organoidów siatkówki z mikroglejem

Siatkówka wykazuje złożoną organizację przestrzenną w całej swojej strukturze laminarnej. Nowoczesna transkryptomika przestrzenna i techniki sekwencjonowania wymagają wycinków tkanek o grubości &lt; 20 μm, co ogranicza ich zastosowanie w badaniach siatkówki. Ta świeżo zamrożona metoda kriosekcji pozwala uzyskać cienkie przekroje siatkówki myszy, zachowując jednocześnie płaskie relacje przestrzenne, umożliwiając kompleksowe mapowanie molekularne blaszek.

En face Kriosekcja siatkówki myszy w celu przeprowadzenia wielowymiarowej przestrzennej analizy molekularnej

Poznaj metodę całopowierzchniowej wizualizacji organoidów siatkówki z rozdzielczością komórkową wykorzystującą mikroskopię konfokalną i techniki optycznego przezroczenia. Ta metoda umożliwia szczegółowe badanie struktur siatkówki i ich dojrzewania.

Wizualizacja organoidów siatkówki w całości z rozdzielczością komórkową

Przeglądaj więcej filmów