Wizualizacja organoidów siatkówki w całości z rozdzielczością komórkową

Nasza praca koncentruje się na opracowywaniu i badaniu organoidów siatkówki, które służą jako ludzki model in vitro do badania, jak tworzy się ludzka siatkówka, jak wpływają choroby i jak możemy je leczyć.

Aby posunąć naprzód badania w dziedzinie medycyny regeneracyjnej, używamy organoidów siatkówki 3D w połączeniu z oczyszczaniem optycznym i znakowaniem immunologicznym do wizualizacji całych struktur i badania specjalnej organizacji komórek siatkówki za pomocą mikroskopii konfokalnej.

Obrazowanie całościowe napotyka wyzwania, takie jak nierównomierna penetracja przeciwciał w gęstych tkankach i sferyczna aberracja w organoidach, które powodują znakowanie odchylenia powierzchni i utratę ostrości podczas wizualizacji tkanki.

Nasza metoda ujawnia połączenia komórek siatkówki, typy komórek, w ramach organizacji 3D, dostarczając kluczowych informacji na temat przyczyn leżących u podstaw chorób siatkówki.

[Instruktor] Na początek należy uzyskać podwielokrotności fluoroforu rozpuszczone w bezwodnym DMSO, odwodnione i zamrożone. Dodaj od 1 do 10 mikrolitrów DMSO do podwielokrotności. Teraz połącz 50 mikrolitrów wtórnej immunoglobuliny G lub przeciwciała pierwszorzędowego, sześć mikrolitrów jednego molowego wodorowęglanu sodu i od jednego do pięciu mikrolitrów fluoroforu i inkubuj na platformie kołyszącej przez 40 minut w temperaturze pokojowej, chroniąc przed światłem. Podczas gdy reakcja postępuje, zdjąć pokrywki kolumn wykluczających wielkość oczyszczania i przepuścić bufor. Zrównoważ kolumnę, przeprowadzając trzy rundy po dwa do trzech mililitrów PBS przez kolumnę. Jeśli ostatnia równowaga zakończy się przed zakończeniem inkubacji, odłóż pokrywki z powrotem, aby uniknąć ich ciągnięcia, i poczekaj na zakończenie reakcji. Po inkubacji dodaj 140 mikrolitrów PBS do reakcji znakowania, aby doprowadzić objętość do około 200 mikrolitrów i zawirować. Dodaj roztwór do środka kolumny i pozwól mu wejść do kolumny. Po wydostaniu się ostatniej kropli przepchnij roztwór za pomocą 550 mikrolitrów PBS. Gdy ciecz przestanie opadać, wymyj 300 mikrolitrami PBS i zbierz w 1,5 mililitrowej probówce mikrowirówkowej. Zmierz absorbancję próbki przy 280 nanometrach i przy długościach fal właściwych dla fluoroforu, aby obliczyć stężenie przeciwciał i współczynniki znakowania. Znakowane przeciwciała należy przechowywać w temperaturze czterech stopni Celsjusza, chroniąc przed światłem, przez okres do sześciu miesięcy. Utrwal organoidy siatkówki za pomocą 4% aldehydu paraform w temperaturze pokojowej przez 45 minut. Po utrwaleniu dodaj roztwór do pobierania antygenu na organoidy i inkubuj naczynie w temperaturze 60 stopni Celsjusza, z łagodnym wstrząsaniem z prędkością 30 obrotów na minutę przez godzinę. Następnie przepuścić organoidy za pomocą PBS zawierającego 1% Triton X-100. Inkubować mieszaninę w temperaturze pokojowej, delikatnie wstrząsając przez cztery godziny. Teraz zablokuj organoidy w 2% BSA za pomocą 0,1% Triton X-100 w temperaturze pokojowej przez noc lub przez ponad jeden dzień. Następnego dnia dodaj rozcieńczone przeciwciała pierwszorzędowe do organoidów. Inkubować w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez dwa dni, lekko wstrząsając. Umyj organoidy trzy razy przez 15 minut każdy w roztworze myjącym o temperaturze pokojowej, delikatnie wstrząsając. Teraz dodaj roztwór rozcieńczający przeciwciała drugorzędowe i inkubuj w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez dwa dni z łagodnym wstrząsaniem. Po umyciu organoidów, jak wykazano wcześniej, należy inkubować organoidy z barwnikami fluorescencyjnymi rozcieńczonymi w roztworze myjącym w temperaturze pokojowej przez jedną godzinę z łagodnym wstrząsaniem. Następnie umyj ponownie. Następnie przygotuj roztwory 1-propanolu w wodzie ultraczystej o stężeniach 15%, 30%, 45%, 60%, 75% i 90% i dostosuj każdy do pH 9,5 za pomocą trimetyloaminy. Próbki odwadniać sekwencyjnie w rosnących gradientach roztworów 1-propanolu przez dwie godziny w temperaturze 30 stopni Celsjusza każdy, lekko wstrząsając. Następnie przenieś próbkę do 100% roztworu 1-propanolu i inkubuj przez noc w temperaturze 30 stopni Celsjusza z łagodnym wstrząsaniem. W celu oczyszczenia próbki należy przygotować mieszaninę alkoholu benzylowego i benzoesanu benzylu w stosunku jeden do dwóch, aby uzyskać roztwór BABB. Zanurz próbki w BABB w temperaturze pokojowej na noc. Odśwież roztwór BABB przed obrazowaniem. Za pomocą szklanej pipety umieść organoid na szalce Petriego ze szklanym dnem z kroplą BABB, upewniając się, że styka się z powierzchnią szkła nakrywkowego. Teraz użyj odwróconego konfokalnego laserowego mikroskopu skaningowego z obiektywami o małym i dużym powiększeniu, aby uzyskać obrazy Z-stack w rozdzielczości komórkowej 3D. Ponownie skalibruj rozmiar kroku akwizycji Z-stack, uwzględniając niedopasowanie współczynnika załamania światła między roztworem klarującym a mediami zanurzeniowymi. Teraz uruchom ImageJ, zaktualizuj głębokość woksela, wybierając Obraz i klikając Właściwości, aby utworzyć projekcje obrazu stosu Z. Sprawdź głębokość stosu Z, wybierając Obraz, a następnie Stosy i wybierając Widoki ortogonalne, aby wyświetlić widoki XY, XZ i YZ organoidu siatkówki. Zapisz żądane regiony, klikając Plik i wybierając Zapisz jako. Na koniec utwórz animację renderu 3D stosu Z za pomocą oprogramowania do przetwarzania. Organoidy siatkówki oczyszczone z fruktozy-glicerolu wykazały najmniejszą poprawę przezroczystości, co utrudniało wizualizację rdzenia organoidu. Oczyszczanie ECI poprawiło wizualizację warstw siatkówki, ale nadal nie ujawniło rdzenia organoidu z powodu uporczywego rozpraszania światła. Organoidy oczyszczone z Fluoclear BABB wykazywały najwyższą przezroczystość, wyraźnie odsłaniając zarówno korę, jak i rdzeń o spójnej fluorescencji. Zarówno organoidy oczyszczone przez ECI, jak i fluoclear BABB wykazywały widoczny skurcz na obrazach w jasnym polu z powodu etapów odwodnienia. Skurcz wywołany przez BABB zwiększył zwartość próbki, umożliwiając wykorzystanie obiektywów o dużym powiększeniu do obrazowania głębszych struktur. Znakowanie immunologiczne TUJ1 po 40 dniach in vitro wykazało pojedynczą cienką warstwę neuronalną bez widocznej stratyfikacji. Po 90 dniach komórki gęsto zaludniły obszar wierzchołkowy, a po 170 dniach organoid wykazywał wyraźne oznaki warstwowej organizacji z określoną strefą wierzchołkową. Po 200 dniach wydłużone wypustki komórkowe rozciągały się do wewnątrz od powierzchni do rdzenia, a organoid rozwinął się w trzy odrębne warstwy siatkówki po 250 dniach. Włókna neuronalne rozciągały się od centrum organoidu w kierunku obwodu przez cały okres dojrzewania, stając się grubsze i bardziej złożone przez 250 dni in vitro. Fotoreceptory czopkowe wyrażające niebieskie i zielono-czerwone opsyny pojawiły się w późnych stadiach i wykazywały wydłużone morfologie z jasnymi końcami. Fotoreceptory pręcikowe wyrażające rodopsynę zidentyfikowano na podstawie ich centralnych jąder i obwodowego rozkładu opsyny. Komórki Chx10-dodatnie były początkowo szeroko rozmieszczone, ale później zlokalizowane specyficznie w wewnętrznej warstwie jądrowej podczas dojrzewania organoidów. Endogenna ekspresja GCaMP6s została zachowana po usunięciu BABB, a sygnał GFP był wykrywalny w siatkówce nerwowej po długotrwałym utrwaleniu.