Name: Transmisyjna mikroskopia elektronowa jako technika wizualizacji do analizy okołodobowej plastyczności synaptycznej w korze mięśniowej myszy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-08-19T13:30:00.000+00:00
Duration: 12 min 6 s
Description: Poznaj transmisyjną mikroskopię elektronową do analizy okołodobowej plastyczności synaptycznej w korze mięśniowej myszy. Ta metoda pozwala badać zmiany liczby synaps w cyklu dobowym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Praca jest finansowana z grantów Narodowego Centrum Nauki, NCN OPUS20 nr UMO-2020/39/B/NZ7/03366 dla EP oraz Collegium Medicum Uniwersytetu Jagiellońskiego, nr N41/DBS/001129 dla MJ.

<ol><li>Jasinska, M., Pyza, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circadian+plasticity+of+mammalian+inhibitory+interneurons%5BTitle%5D)+AND+%22Neural+Plast%22%5BJournal%5D)">Circadian plasticity of mammalian inhibitory interneurons.</a> Neural Plast. 2017, 1-12 (2017).</li>
<li>Krzeptowski, W., Hess, G., Pyza, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circadian+plasticity+in+the+brain+of+insects+and+rodents%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Neural+Circuits%22%5BJournal%5D)">Circadian plasticity in the brain of insects and rodents.</a> Front Neural Circuits. 12, 32(2018).</li>
<li>Mansilla, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanisms+that+change+synapse+number%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurogenet%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanisms that change synapse number.</a> J Neurogenet. 32 (3), 155-170 (2018).</li>
<li>Frank, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Renormalizing+synapses+in+sleep%3A+the+clock+is+ticking%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Renormalizing synapses in sleep: the clock is ticking.</a> Biochem Pharmacol. 191, 114533(2021).</li>
<li>Jasinska, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Daily+rhythm+of+synapse+turnover+in+mouse+somatosensory+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neurobiol+Exp%22%5BJournal%5D)">Daily rhythm of synapse turnover in mouse somatosensory cortex.</a> Acta Neurobiol Exp. 74 (1), 104-110 (2014).</li>
<li>Jasinska, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circadian+rhythmicity+of+synapses+in+mouse+somatosensory+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Circadian rhythmicity of synapses in mouse somatosensory cortex.</a> Eur J Neurosci. 42 (8), 2585-2594 (2015).</li>
<li>Jasinska, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circadian+clock+regulates+the+shape+and+content+of+dendritic+spines+in+mouse+barrel+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+ONE%22%5BJournal%5D)">Circadian clock regulates the shape and content of dendritic spines in mouse barrel cortex.</a> PLOS ONE. 14 (11), e0225394(2019).</li>
<li>Jasinska, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circadian+changes+of+dendritic+spine+geometry+in+mouse+barrel+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Circadian changes of dendritic spine geometry in mouse barrel cortex.</a> Front Neurosci. 14, 578881(2020).</li>
<li>Jasinska, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-modulated+circadian+synaptic+plasticity+in+the+somatosensory+cortex%3A+link+to+locomotor+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Light-modulated circadian synaptic plasticity in the somatosensory cortex: link to locomotor activity.</a> Int J Mol Sci. 25 (23), 12870(2024).</li>
<li>Woolsey, T. A., Vander Loos, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+structural+organization+of+layer+IV+in+the+somatosensory+region+%28SI%29+of+mouse+cerebral+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">The structural organization of layer IV in the somatosensory region (SI) of mouse cerebral cortex.</a> Brain Res. 17 (2), 205-242 (1970).</li>
<li>Woolsey, T. A., Welker, C., Schwartz, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+anatomical+studies+of+the+Sml-face+cortex+with+special+reference+to+the+occurrence+of+%26%2334%3Bbarrels%26%2334%3B+in+layer+IV%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Comparative anatomical studies of the Sml-face cortex with special reference to the occurrence of &#34;barrels&#34; in layer IV.</a> J Comp Neurol. 164 (1), 79-94 (1975).</li>
<li>Armstrong-James, M., Fox, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatiotemporal+convergence+and+divergence+in+the+rat+SI+barrel+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Spatiotemporal convergence and divergence in the rat SI barrel cortex.</a> J Comp Neurol. 263 (2), 265-281 (1987).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Barrel+cortex%22">Barrel cortex</a>. Fox, K. , Cambridge University Press. (2008).</li>
<li>Jasinska, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid%2C+learning-induced+inhibitory+synaptogenesis+in+murine+barrel+field%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Rapid, learning-induced inhibitory synaptogenesis in murine barrel field.</a> J Neurosci. 30 (3), 1176-1184 (2010).</li>
<li>Knott, G. W., Quairiaux, C., Genoud, C., Welker, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+of+dendritic+spines+with+GABAergic+synapses+induced+by+whisker+stimulation+in+adult+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Formation of dendritic spines with GABAergic synapses induced by whisker stimulation in adult mice.</a> Neuron. 34 (2), 265-273 (2002).</li>
<li>Jasinska, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+associative+learning+on+memory+spine+formation+in+mouse+barrel+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Neural+Plast%22%5BJournal%5D)">Effect of associative learning on memory spine formation in mouse barrel cortex.</a> Neural Plast. 2016, 1-11 (2015).</li>
<li>Jasinska, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fear+learning+increases+the+number+of+polyribosomes+associated+with+excitatory+and+inhibitory+synapses+in+the+barrel+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+ONE%22%5BJournal%5D)">Fear learning increases the number of polyribosomes associated with excitatory and inhibitory synapses in the barrel cortex.</a> PLOS ONE. 8 (2), e54301(2013).</li>
<li>White, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrastructure+and+synaptic+contacts+in+barrels+of+mouse+SI+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Ultrastructure and synaptic contacts in barrels of mouse SI cortex.</a> Brain Res. 105 (2), 229-251 (1976).</li>
<li>Keller, P. J., Ahrens, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+whole-brain+activity+and+development+at+the+single-cell+level+using+light-sheet+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Visualizing whole-brain activity and development at the single-cell level using light-sheet microscopy.</a> Neuron. 85 (3), 462-483 (2015).</li>
<li>Serrano, M. E., Kim, E., Petrinovic, M. M., Turkheimer, F., Cash, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+synaptic+density%3A+the+next+holy+grail+of+neuroscience%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Imaging synaptic density: the next holy grail of neuroscience.</a> Front Neurosci. 16, 796129(2022).</li>
<li>Woelfle, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CLARITY+increases+sensitivity+and+specificity+of+fluorescence+immunostaining+in+long-term+archived+human+brain+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biol%22%5BJournal%5D)">CLARITY increases sensitivity and specificity of fluorescence immunostaining in long-term archived human brain tissue.</a> BMC Biol. 21 (1), 113(2023).</li>
<li>Weibel, E. R. Stereological methods. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWeibel%2C+ER+%22Vol.+1%3A+practical+methods+for+biological+morphometry%22">Vol. 1: practical methods for biological morphometry</a>. , Academic Press. London. (1979).</li>
<li>Sterio, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+unbiased+estimation+of+number+and+sizes+of+arbitrary+particles+using+the+disector%5BTitle%5D)+AND+%22J+Microsc%22%5BJournal%5D)">The unbiased estimation of number and sizes of arbitrary particles using the disector.</a> J Microsc. 134 (2), 127-136 (1984).</li>
<li>Gundersen, H. J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stereology+of+arbitrary+particles%5BTitle%5D)+AND+%22J+Microsc%22%5BJournal%5D)">Stereology of arbitrary particles.</a> J Microsc. 143 (1), 3-45 (1986).</li>
<li>Fiala, J. C., Harris, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cylindrical+diameters+method+for+calibrating+section+thickness+in+serial+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Microsc%22%5BJournal%5D)">Cylindrical diameters method for calibrating section thickness in serial electron microscopy.</a> J Microsc. 202 (3), 468-472 (2001).</li>
<li>Napper, R. M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Total+number+is+important%3A+using+the+disector+method+in+design-based+stereology+to+understand+the+structure+of+the+rodent+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Neuroanat%22%5BJournal%5D)">Total number is important: using the disector method in design-based stereology to understand the structure of the rodent brain.</a> Front Neuroanat. 12, 16(2018).</li>
<li>Perez-Cruz, C., Simon, M., Czéh, B., Flügge, G., Fuchs, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hemispheric+differences+in+basilar+dendrites+and+spines+of+pyramidal+neurons+in+the+rat+prelimbic+cortex%3A+activity-+and+stress-induced+changes%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Hemispheric differences in basilar dendrites and spines of pyramidal neurons in the rat prelimbic cortex: activity- and stress-induced changes.</a> Eur J Neurosci. 29 (4), 738-747 (2009).</li>
<li>Kasthuri, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Saturated+reconstruction+of+a+volume+of+neocortex%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Saturated reconstruction of a volume of neocortex.</a> Cell. 162 (3), 648-661 (2015).</li>
<li>Mikula, S., Binding, J., Denk, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Staining+and+embedding+the+whole+mouse+brain+for+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Staining and embedding the whole mouse brain for electron microscopy.</a> Nat Methods. 9 (12), 1198-1201 (2012).</li>
<li>Videnovic, A., Zee, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Consequences+of+circadian+disruption+on+neurologic+health%5BTitle%5D)+AND+%22Sleep+Med+Clin%22%5BJournal%5D)">Consequences of circadian disruption on neurologic health.</a> Sleep Med Clin. 10 (4), 469-480 (2015).</li>
<li>Logan, R. W., McClung, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rhythms+of+life%3A+circadian+disruption+and+brain+disorders+across+the+lifespan%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Rhythms of life: circadian disruption and brain disorders across the lifespan.</a> Nat Rev Neurosci. 20 (1), 49-65 (2018).</li>
<li>Nassan, M., Videnovic, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circadian+rhythms+in+neurodegenerative+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurol%22%5BJournal%5D)">Circadian rhythms in neurodegenerative disorders.</a> Nat Rev Neurol. 18 (1), 7-24 (2021).</li>
<li>Shen, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circadian+disruption+and+sleep+disorders+in+neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Transl+Neurodegener%22%5BJournal%5D)">Circadian disruption and sleep disorders in neurodegeneration.</a> Transl Neurodegener. 12 (1), 8(2023).</li>
<li>Dufort-Gervais, J., Mongrain, V., Brouillette, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bidirectional+relationships+between+sleep+and+amyloid-beta+in+the+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol+Learn+Mem%22%5BJournal%5D)">Bidirectional relationships between sleep and amyloid-beta in the hippocampus.</a> Neurobiol Learn Mem. 160, 108-117 (2019).</li>
<li>Adler, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aging+disrupts+the+circadian+patterns+of+protein+expression+in+the+murine+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Aging+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Aging disrupts the circadian patterns of protein expression in the murine hippocampus.</a> Front Aging Neurosci. 11, 368(2020).</li>
</ol>

Autorzy nie mają do zadeklarowania konfliktu interesów.

W niniejszej pracy przedstawiono metodologię zastosowaną do badania plastyczności okołodobowej synaps oraz rekonstrukcji kolców dendrytycznych w korze beczkowatej myszy. Aby zapewnić wiarygodne wyniki, badanie plastyczności okołodobowej powinno obejmować co najmniej cztery punkty czasowe. Nasze badania wykazały, że dane z dwóch punktów czasowych – jednego w fazie odpoczynku (dzień) i jednego w fazie aktywności (noc) – dostarczyły informacji na temat dziennych różnic między fazami aktywności zwierząt w warunkach LD 12:12....

Rytmy okołodobowe są generowane przez zegary okołodobowe w prawie wszystkich procesach zachodzących w organizmie. U zwierząt i ludzi wykryto je na poziomie molekularnym, komórkowym i całego organizmu, a także w ich zachowaniu. System okołodobowy organizmu składa się z głównego zegara okołodobowego (rozrusznika serca) i zegarów obwodowych. Wszystkie zegary okołodobowe generują oscylacje okołodobowe poprzez cykliczną ekspresję genów zegara, które są kontrolowane przez ich białka. Mechanizm molekularny zegara generuje rytmy okołodobowe z okresem ~1 dnia (dłuższym lub krótszym niż 24 godziny), ale w warunkach dzień/noc okres rytmów endogennych jest zsynchronizowany z 24 godzinami. W fizjologii układu nerwowego bezkręgowców i kręgowców wykryto wiele rytmów okołodobowych; Jednak niektóre badania wykazały, że są one również obecne w plastyczności synaptycznej i neuronalnej, czyli zmianach w liczbie i strukturze synaps i dendrytów 1,2,3,4.
Kora somatosensoryczna myszy stanowi doskonałe miejsce do badania plastyczności synaptycznej w ciągu dnia ze względu na dobrze zdefiniowaną organizację i bezpośrednie powiązanie z aktywnością lokomotoryczną zwierząt 5,6,7,8,9. W warstwie IV kory somatosensorycznej znajdują się wyraźne struktury nerwowe (beczki), które są bardzo zauważalne nawet w niezabarwionym mózgu10,11. Ich ułożenie odzwierciedla morfologię i organizację wąsów na pysku zwierzęcia, umożliwiając precyzyjne odwzorowanie bodźców sensorycznych. Duże beczki są zorganizowane w pięciu regularnych rzędach, z których każdy zawiera od czterech do siedmiu beczek. Rzędy beczek, które odpowiadają dużym wąsom, są oznaczone wielkimi literami od A do E i reprezentują wąsy ułożone od okolicy oczu w dół wzdłuż pyska. Każda beczka składa się z dwóch głównych obszarów: zagłębienia, środkowej części wypełnionej neuropilem oraz ściany zwanej bokiem, która jest zdominowana przez ciała komórek gwiaździstych. Beczki są oddzielone od siebie obszarami o mniejszej gęstości komórek, zwanymi przegrodami. Każda beczka odbiera impulsy z określonego wąsa znajdującego się po przeciwnej stronie pyska zwierzęcia10,12.
Podział na konkretne beczki, ustawione w regularnych rzędach, pozwala na szybką i łatwą identyfikację wybranego obszaru 10,13. Wybór beczek z rzędu B do analizy zmian okołodobowych opiera się na badaniach plastyczności zależnej od aktywności 14,15,16,17. Rząd B charakteryzuje się dobrze zdefiniowanymi granicami somatotopowymi i zawiera tylko cztery wyraźne duże beczki, co upraszcza jego lokalizację w próbkach. Ze względu na swoje centralne położenie, aktywność neuronalna rzędu B jest skorelowana z naturalnymi zachowaniami myszy, takimi jak eksploracja środowiska i aktywność lokomotoryczna. Do liczenia synaps na kolcach i trzonach dendrytycznych ważne jest, aby wybrać środkowe części beczek, w których ciała komórkowe są rzadkie 12,15,18.
Immunohistochemia w połączeniu z obrazowaniem w mikroskopii konfokalnej jest techniką, która odegrała kluczową rolę w wyjaśnieniu kluczowych mechanizmów plastyczności synaptycznej u myszy. Podczas gdy zastosowanie mikroskopii konfokalnej zapewnia obrazy o wysokiej rozdzielczości ze zmniejszoną fluorescencją tła i poprawą klarowności struktury komórkowej, cierpi z powodu fotobielenia i wymaga skomplikowanego przygotowania próbki, co może zmienić stan tkanek biologicznych. Poleganie na markerach fluorescencyjnych może ograniczyć rodzaje białek, które mogą być badane jednocześnie, ze względu na ich nakładanie się. Konfokalna mikroskopia immunofluorescencyjna zapewnia środki do znakowania określonych białek, ich poziomów ekspresji i lokalizacji związanych z aktywnością synaptyczną za pomocą przeciwciał do wykrywania docelowych antygenów w ustalonych odcinkach tkanki. Chociaż metoda ta oferuje specyficzność i elastyczność w badaniu różnych białek zaangażowanych w neuroprzekaźnictwo, jest ograniczona przez niezdolność do dostarczania danych w czasie rzeczywistym na temat procesów dynamicznych ze względu na związany z tym etap fiksacji. Niespójność w wiązaniu przeciwciał może również skutkować niewiarygodnymi wynikami 19,20,21.
Zastosowanie mikroskopii elektronowej zamiast metod immunofluorescencyjnych z mikroskopią świetlną pozwala na uzyskanie znacznie wyższej rozdzielczości i większej precyzji zarówno w doborze lokalizacji, jak i rozróżnieniu struktur neuronalnych. Sekcje mikroskopii elektronowej z transmisją szeregową (TEM) pomagają uwidocznić strukturę synaptyczną na poziomie ultrastrukturalnym i mają tę zaletę, że są wykorzystywane do badania tworzenia lub eliminacji synaps. TEM umożliwia naukowcom analizę właściwości fizycznych synaps oraz zmian w gęstości i strukturze, które nazywa się plastycznością synaps. Chociaż przygotowanie próbki i obrazowanie są pracochłonne, TEM zapewnia bardziej szczegółowe zrozumienie zmian, które zachodzą podczas uczenia się, tworzenia pamięci i przetwarzania informacji sensorycznych, a także w ciągu dnia, roku i wieku zwierząt.
Nasza metoda ma na celu zbadanie dobowej dynamiki gęstości synaptycznej i morfologii przy użyciu podejścia opartego na co najmniej czterech punktach czasowych w połączeniu z metodą dyssektora stereologicznego opartą na seryjnych obrazach TEM. Metoda dysektora stereologicznego pozwala na wiarygodne oszacowanie liczby synaps nawet przy użyciu tylko kilku ultracienkich odcinków szeregowych 22,23,24,25,26. Dobrze zdefiniowana organizacja somatotopowa kory beczkowatej zapewnia precyzyjną anatomiczną selekcję miejsc badania, natomiast szeregowy TEM pozwala na różnicowanie typów synaps (pobudzających i hamujących) oraz ich lokalizacji (na kolcach i trzonach dendrytycznych). Metoda ta stanowi cenne narzędzie dla naukowców badających neuroplastyczność dobową i okołodobową, umożliwiając zbadanie, w jaki sposób czynniki środowiskowe i wewnętrzne wpływają na dynamikę synaptyczną. Poszczególne składowe naszej metody umożliwiają jej zastosowanie do analizy zmian neuroplastyczności w znacznie szerszym zakresie badań, niekoniecznie ograniczających się do zmian okołodobowych.

<table><tbody><tr><td>Folia Aclar</td><td>Agar naukowy</td><td>AGL4458</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie Blender&nbsp;</td><td></td><td></td><td>Wersja: v. 2.91.2</td></tr><tr><td>Kwas kakodylowy, sól sodowa trójwodzian</td><td>Nauki polilogiczne</td><td>01131-100</td><td></td></tr><tr><td>Zjeżdżalnia wklęsła</td><td>Menzel powiedział:</td><td>9.161 151</td><td></td></tr><tr><td>Nóż diamentowy&nbsp;</td><td>Diatom</td><td>15-Amerykański</td><td>Kąt noża: Ultra 45&deg; &nbsp;</td></tr><tr><td>Aparat cyfrowy&nbsp;</td><td>Nikon&nbsp;</td><td>DXM 1200 F</td><td></td></tr><tr><td>Wodorofosforan di-sodowy dwunastowodny</td><td>POCH</td><td>799280115</td><td></td></tr><tr><td>Żywica do zatapiania</td><td>Nauki polilogiczne</td><td>08792-1</td><td>Formuła Luft&nbsp;</td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Pol-Aura</td><td>PA-11-0004</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie GIMP</td><td></td><td></td><td>Wersja: V 3.0.4</td></tr><tr><td>Cytrynian ołowiu</td><td>TAAB (Biblioteka TAAB)</td><td>L018</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskopia świetlna&nbsp;</td><td>Nikon&nbsp;</td><td>Optymacyjna</td><td></td></tr><tr><td>Tetrtlenek osmu&nbsp;</td><td>Nauki polilogiczne</td><td>Numer katalogowy: 0223C-10</td><td>krystaliczny (99.95%)</td></tr><tr><td>Pędzel</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie Photoshop</td><td></td><td></td><td>wersja: CS5</td></tr><tr><td>Żelazocyjanek potasu</td><td>Sigmaaldrich</td><td>Zobacz materiał P8131 powiedział:</td><td></td></tr><tr><td>Tlenek propylenu&nbsp;</td><td>Sigmaaldrich</td><td>82320</td><td>Puriss. p.a., &ge; 99,5% (GC)</td></tr><tr><td>Siatki z pojedynczymi szczelinami</td><td>Agar naukowy</td><td>AGG2525</td><td>2 x 0,75 mm lub 2 x 1 mm</td></tr><tr><td>Chlorek sodu&nbsp;</td><td>Chempur powiedział:</td><td>117941206</td><td></td></tr><tr><td>Diwodorofosforan sodu dwuwodny</td><td>Chempur powiedział:</td><td>117991808</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop stereoskopowy</td><td>PZO</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Filtr strzykawkowy&nbsp;</td><td>Firma Biosens</td><td>BS25PES045</td><td></td></tr><tr><td>TEM&nbsp;</td><td>Joel</td><td>JEM-2100 powiedział:</td><td></td></tr><tr><td>Ultramikrotom</td><td>Księga Leica</td><td>UC7 (wersja angielska)</td><td></td></tr><tr><td>Octan uranylu</td><td>Lachema (Księga)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wibratomizm</td><td>Księga Leica</td><td>VT1000 S</td><td></td></tr></tbody></table>

transmisyjna mikroskopia elektronowa jako technika wizualizacji do analizy okołodobowej plastyczności synaptycznej w korze mięśniowej myszy

Transmission Electron Microscopy as the Visualization Technique for Analysis of Circadian Synaptic Plasticity in the Mouse Barrel Cortex

Badanie okołodobowej plastyczności synaptycznej wymaga trzymania myszy w różnych warunkach oświetleniowych (cykl światła/ciemności, LD 12:12 i stała ciemność, DD), zapewnienia dostępu do kół do jazdy i poświęcenia ich w czterech określonych punktach czasowych w ciągu 24 godzin - na początku i w środku dnia/subiektywnego dnia oraz na początku i w środku nocy/subiektywnej nocy. Mózgi są następnie odpowiednio mocowane do transmisyjnej mikroskopii elektronowej (TEM). Kora beczkowa, ze swoją precyzyjną organizacją somatotopową, stanowi idealny model do takiej analizy. Aby uzyskać wymagany obszar mózgu, mózgi są nacinane stycznie za pomocą wibratomu, a następnie sekcje zawierające korę beczkowatą są wybierane i zatapiane w żywicy Polybed. Z przygotowanych bloków zawierających wybrane beczki wycinane są kolejne ultracienkie sekcje. Gęstość synaptyczną, pobudzającą i hamującą, analizuje się na podstawie mikrofotografii elektronowych przy użyciu metody dyssektora stereologicznego. Dodatkowo obrazy TEM są wykorzystywane do rekonstrukcji 3D kolców dendrytycznych. Zmiany w kształcie kolców dendrytycznych wskazują na przebudowę neuronów w ciągu dnia. Liczba synaps pobudzających osiąga szczyt podczas snu (w ciągu dnia) u myszy, podczas gdy synapsy hamujące osiągają szczyt w fazie aktywności (w środku nocy).

Aby prawidłowo zastosować naszą metodę do analizy dobowych zmian synaptycznych, należy rozpocząć od wybrania co najmniej czterech punktów czasowych w równych odstępach, z dwoma punktami dla każdej fazy aktywności zwierząt (co 6 h). W tych wyznaczonych punktach czasowych zwierzęta są uśmiercane, a ich mózgi pobierane. Takie podejście pozwala na identyfikację dziennych lub dobowych wzorców plastyczności synaptycznej i powiązanie ich ze zmianami w aktywności lokomocyjnej zwierząt (Rycina 1). Wy...

Prezentowany protokół opisuje zastosowanie transmisyjnej mikroskopii elektronowej (TEM) do ilościowego określania zmian okołodobowych w korze myszy, koncentrując się głównie na liczbie synaps i morfologii kolców dendrytycznych.

Transmisyjna mikroskopia elektronowa jako technika wizualizacji do analizy okołodobowej plastyczności synaptycznej w korze mięśniowej myszy

Examining circadian synaptic plasticity requires housing mice under different lighting conditions (light/dark cycle, LD 12:12, and constant darkness, DD), ...

Interesuje nas plastyczność neuronalna, a w szczególności okołodobowe zmiany plastyczności synaps, neuronów i komórek glejowych. Staramy się odpowiedzieć na pytanie, w jaki sposób synapsy przekształcają się w ciągu dnia i nocy oraz w warunkach patologicznych. Najnowszym osiągnięciem w naszej dziedzinie badań jest wykorzystanie różnych narzędzi genetycznych do manipulowania ekspresją genów, a także wykorzystanie metod wizualizacji zmian w mózgu, a także rośnie liczba modeli zwierzęcych do badania chorób neurodegeneracyjnych. Odkryliśmy, używając mikroskopu transmisyjnego elektronów, że liczba synaps w korze beczkowatej myszy zmienia się w ciągu dnia i nocy. I ten rytm jest również okołodobowy, przynajmniej w przypadku synaps hamujących. Ponieważ synapsy hamujące, ich liczba wzrasta w nocy, podczas gdy synapsy pobudzające zwiększają się w ciągu dnia. Podobne zmiany zaszłyśmy w mózgu muszki owocowej. U tego gatunku zmienia się również liczba synaps w ciągu dnia i nocy. Ponadto odkryliśmy zmiany strukturalne w kształcie neuronów i komórek glejowych.[Narrator] Na początek weź móżdżek myszy i podziel mózg na dwie półkule. Wybierz jedną półkulę i ustaw ją tak, aby sekcje można było ciąć stycznie do kory lufy. Następnie pokrój skrawki o grubości 60 mikrometrów i przenieś je do roztworu zawierającego 0,1-molowy bufor fosforanowy i utrwalacz w stosunku jeden do pięciu. Zbadaj skrawki pod mikroskopem świetlnym i zbierz tylko te sekcje, które wyraźnie pokazują korę pola beczkowego. Za pomocą pędzla delikatnie przenieś sekcje na małą szklaną szalkę Petriego. Opłucz sekcje mózgu w 0,1-molowym kakodylacie. Następnie umocować skrawki w 1% tetratlenku osmu w 0,1-molowym buforze kakodylowym z 1,5% żelazocyjankiem potasu. Po przepłukaniu skrawków w wodzie destylowanej użyj strzykawki z 25-milimetrowym filtrem, aby powoli dozować 70% etanolu zawierającego 1% octanu uranylu do każdej szalki Petriego z tkankami. Po całonocnej inkubacji w 70% etanolu w temperaturze czterech stopni Celsjusza umyj chusteczki w 80%, 90% i 100% etanolu. Następnie umyj chusteczki dwukrotnie w tlenku propylenu przez 10 minut każda. Następnie zastąp tlenek propylenu dwoma mililitrami mieszaniny jeden do jednego żywicy poliamidowej i tlenku propylenu. Przykryj pokrywką i inkubuj przez 40 minut. Osadź sekcje mózgu w dwóch mililitrach mieszaniny żywicy Poly / Bed i tlenku propylenu w proporcji trzy do jednego. Przykryj i odstaw na 1,5 godziny. Następnie pokrój folię ACLAR na kawałki odpowiadające rozmiarowi standardowego szkiełka podstawowego. Za pomocą plastikowej pipety nałóż niewielką ilość żywicy na każdy kawałek folii ACLAR. Za pomocą pędzla przenieś skrawki mózgu z szalki Petriego na żywicę na folii ACLAR. Osadź każdą sekcję między dwiema foliami ACLAR i inkubuj w celu polimeryzacji. Używając mikroskopu świetlnego z dwukrotnym obiektywem, sfotografuj osadzone sekcje mózgu. Aby otworzyć obrazy, kliknij przycisk Plik i otwórz, zaznacz obrazy, przytrzymując Shift, a następnie kliknij przycisk Otwórz. Rozpocznij układanie obrazów z kory mózgowej. Kliknij prawym przyciskiem myszy Warstwa 1 na każdym obrazie, wybierz Zduplikuj warstwę i wprowadź numer obrazu jako nazwę w oknie dialogowym. Wybierz jeden obraz jako plik docelowy i kliknij przycisk OK. Następnie użyj narzędzia Przesuń, aby ręcznie wyrównać obrazy i dostosuj orientację za pomocą opcji Edycja, Przekształć, Obróć lub Odwróć w zależności od potrzeb. Aby uzyskać dokładniejsze dopasowania, użyj funkcji Edycja, Przekształć, Zniekształc i przesuń narożniki pojedynczo, aby dopasować je do anatomicznych punktów orientacyjnych. Ustaw tryb mieszania górnej warstwy na nakładkę w panelu Warstwy, aby ułatwić wyrównanie. W każdej sekcji, która wyświetla korę beczki, użyj mikroskopu stereoskopowego, aby zidentyfikować wybraną lufę i wytnij ją wraz z sąsiednią za pomocą żyletki. Po zatopieniu sekcji w bloku żywicy, zbierz ultracienkie sekcje na jednoszczelinowych siatkach niklowych pokrytych Formvarem. Po wyrównaniu stosu obrazów TEM, jak pokazano wcześniej, zdefiniuj obszar analizy. Kliknij Warstwa, a następnie Nowy i Warstwa, a następnie kliknij OK. Wybierz narzędzie Prostokąt, przejdź do Warstwa, Styl warstwy, Obrys. Ustaw kolor, grubość i położenie obrysu na wewnątrz, a następnie kliknij przycisk OK. Teraz narysuj prostokąt, aby zdefiniować obwiednię analizy, a następnie wybierz opcję Wypełnij 0%. Aby dodać nową warstwę do adnotacji, wybierz opcję Warstwa, Nowa, Warstwa, a następnie kliknij przycisk OK. Użyj narzędzia Pędzel, aby oznaczyć synapsy na tej warstwie. Użyj narzędzi Lupka i Rączka, aby zapewnić precyzję podczas dodawania adnotacji. Teraz otwórz stos obrazów przeznaczony do rekonstrukcji 3D. Wybierz narzędzie Kadrowanie, zaznacz obszar zawierający grzbiet dendrytyczny w poprzek stosu i naciśnij Enter, aby przyciąć ten obszar we wszystkich widocznych warstwach. Aby w danym momencie była widoczna tylko jedna warstwa, przełącz ikonę oka w panelu Warstwy. Kliknij Plik, Zapisz jako, nazwij plik, wybierz format JPG i kliknij OK, aby zapisać każdy przycięty obraz osobno. Otwórz oprogramowanie do rekonstrukcji 3D. Przed przekazaniem kliknij przycisk Z na metauchwytu nawigacyjnym lub naciśnij numeryczny 7, aby wyrównać perspektywę rzutni. Następnie, aby przesłać obrazy, kliknij Dodaj, Obraz, Odniesienie, a następnie wybierz pierwszy obraz i kliknij dwukrotnie, aby potwierdzić. Aby ustawić końcowy obraz TEM wzdłuż osi z, kliknij obraz. W panelu Właściwości obiektu na prawym pasku bocznym wprowadź odpowiednią wartość w polu Lokalizacja Z. Aby równomiernie rozmieścić wszystkie obrazy wzdłuż osi z, zaznacz wszystkie obiekty obrazu. Naciśnij przycisk Koniec, aby otworzyć panel Koniec. Przejdź do karty Edytuj i kliknij Rozmieść Z, aby automatycznie rozmieścić je na podstawie grubości przekroju. Aby ręcznie obrysować kształt grzbietu dendrytycznego na każdym obrazie TEM przy użyciu jednej krzywej dla każdego obrazu, kliknij przycisk Dodaj, Krzywa i Okrąg. Aby przesunąć okrąg, przytrzymaj g, przeciągnij myszą, a następnie kliknij, aby potwierdzić położenie. Przytrzymaj s, aby dostosować rozmiar, a następnie kliknij, aby potwierdzić. Następnie przeskaluj obiekt, aby wyrównał się z kształtem grzbietu dendrytycznego. Teraz zmodyfikuj zakrzywiony kształt, aby dopasować go do granicy grzbietu. Wybierz punkt kontrolny, naciśnij g, przesuń punkt i kliknij, aby potwierdzić. W razie potrzeby użyj g lub s, aby wyregulować punkty uchwytu, udoskonalając kierunek i intensywność krzywej. Aby dodać więcej szczegółów, przytrzymaj Shift i wybierz dwa sąsiadujące ze sobą punkty kontrolne. Następnie kliknij prawym przyciskiem myszy i wybierz opcję Podziel, aby wstawić nowy punkt między nimi. Gdy krzywa dokładnie obrysuje grzbiet, wejdź w zakładkę Układ, kliknij prawym przyciskiem myszy obiekt okręgu Beziera i wybierz opcję Powiel obiekt bez poruszania myszą. Aby połączyć krawędzie połączonego obiektu i utworzyć zamkniętą siatkę, należy wejść w zakładkę Modelowanie. Naciśnij 2, aby przełączyć się na tryb wyboru krawędzi. Kliknij przycisk Wybierz, Wszystkie, kliknij prawym przyciskiem myszy i wybierz polecenie Mostuj pętle krawędzi, aby połączyć ze sobą pierścienie krawędzi. Aby wypełnić lukę u góry obiektu, usuń zaznaczenie opcji wszystko, klikając obok niej. Przytrzymaj Alt i kliknij jedną krawędź górnej półki, aby zaznaczyć całą pętlę. Kliknij prawym przyciskiem myszy i wybierz polecenie Wyciągnij krawędzie, przeciągnij w górę wzdłuż osi z. Teraz naciśnij s, przesuń mysz do wewnątrz, aby zmniejszyć nową pętlę, i kliknij, aby potwierdzić. Trzymając pętlę wybraną, kliknij prawym przyciskiem myszy i wybierz opcję Nowa powierzchnia z krawędzi. Aby wygładzić ostateczną strukturę, przejdź do zakładki Modyfikatory na prawym pasku bocznym. Kliknij przycisk Dodaj modyfikator, przejdź do opcji Generuj i wybierz opcję Powierzchnia podpodziału. Ustaw poziomy rzutni i renderowania na jeden, aby uzyskać spójne wygładzanie. Aby przypisać kolor do poszczególnych konstrukcji, wybierz żądany obiekt. Otwórz kartę Materiał na prawym pasku bocznym, kliknij Nowy i ustaw kolor bazowy. Wybierz jasny obiekt, aby dostosować oświetlenie sceny. Naciśnij i przytrzymaj g, przesuń mysz, aby zmienić położenie światła, a następnie kliknij, aby potwierdzić jego nowe położenie. Aby ustawić kamerę do renderowania, ustaw rzutnię tak, aby była skierowana w stronę grzbietu dendrytycznego, tak jak powinien wyglądać w końcowym wyniku. Naciśnij Control + Alt + klawiatura numeryczna 0, aby przyciągnąć kamerę do bieżącego widoku. Dostosuj klatkę aparatu, zaznaczając ją, przytrzymując g i przesuwając, aby poprawić kadrowanie. Kora somatosensoryczna myszy była możliwa do zidentyfikowania nawet w niezabarwionych sekcjach mózgu, a całe pole beczkowe można było zrekonstruować za pomocą narzędzi cyfrowych, pomimo rozmieszczenia pojedynczych beczek w wielu sekcjach. Kolejne ultracienkie obrazy TEM umożliwiły wiarygodną klasyfikację synaps na typy pobudzające lub hamujące w oparciu o seryjne dowody wizualne. Trójwymiarowa rekonstrukcja kolców dendrytycznych z odcinków szeregowych pozwoliła na wizualizację morfologii kręgosłupa, ujawniając różne kształty, takie jak cienkie, grzybkowe, przysadziste i pośrednie. Kształty kręgosłupa określono ilościowo na podstawie pomiarów, w tym długości kręgosłupa, długości szyi oraz średnic kręgosłupa, głowy i szyi.

transmission-electron-microscopy-as-visualization-technique-for

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Niniejszy raport demonstruje technikę mechanicznej izolacji pojedynczych żywych neuronów z zachowaniem przytwierdzonych boutonów presynaptycznych. Neurony poddane wibrodysocjacji charakteryzują się zaletami takimi jak szybki czas przygotowania, doskonała kontrola farmakologiczna oraz usprawniona stabilizacja potencjału błonowego (space-clamp) bez wpływu komórek sąsiednich. Metoda ta może być wykorzystywana do obrazowania elementów synaptycznych oraz rejestracji metodą patch-clamp.

Wibrodysocjacja neuronów z plastrów mózgu gryzoni w celu badania transmisji synaptycznej i obrazowania terminali presynaptycznych

Źródło: Villarreal, S., et. al., Pomiar endocytozy pęcherzyków synaptycznych w hodowanych neuronach hipokampa. J. Vis. Exp. (2017)Ten film przedstawia analizę endocytozy pęcherzyków synaptycznych w hodowanych neuronach hipokampa poprzez znakowanie peroksydazą chrzanową i mikroskopię elektronową.

Transmisyjne obrazowanie mikroskopowe elektronów endocytozy pęcherzyków synaptycznych w neuronach hipokampa myszy 

Źródło: Maruoka, H., et. al. Jednoczesne obrazowanie dynamiki mikrogleju i aktywności neuronalnej u obudzonych myszy. J. Vis. Exp. (2022) Ten film przedstawia procedurę mikroskopii dwufotonowej do obrazowania aktywności neuronalnej i dynamiki mikrogleju u obudzonej myszy podczas stymulacji wzrokowej, podkreślając stany przejściowe wapnia i interakcje komórkowe.

Jednoczesne obrazowanie dynamiki mikrogleju i aktywności neuronalnej u wybudzonej myszy

Obrazowanie poklatkowe u żywego zwierzęcia dostarcza cennych informacji na temat reorganizacji strukturalnej w nienaruszonym mózgu. Tutaj wprowadzamy preparat z rozcieńczoną czaszką, który umożliwia przezczaszkowe obrazowanie znakowanych fluorescencyjnie struktur synaptycznych w żywej korze myszy za pomocą mikroskopii dwufotonowej.

Dwufotonowe obrazowanie in vivo kolców dendrytycznych w korze myszy przy użyciu preparatu z rozrzedzoną czaszką

Ta metoda tworzy namacalne, znajome środowisko dla myszy do nawigacji i eksploracji podczas obrazowania mikroskopowego lub jednokomórkowych zapisów elektrofizjologicznych, które wymagają mocnego unieruchomienia głowy zwierzęcia.

Płaska podłoga podniesiona powietrznie: nowa metoda łączenia zachowania z mikroskopią lub elektrofizjologią na obudzonych, swobodnie poruszających się gryzoniach

Ten film pokazuje procedurę kraniotomii, która umożliwia przewlekłe obrazowanie neuronów w korze zaśledziony myszy za pomocą mikroskopii dwufotonowej in vivo w linii transgenicznej Thy1-GFP. Podejście to łączy się z wstrzyknięciem do grzbietowego hipokampa wirusa związanego z ekspresją mCherry. Techniki te pozwalają na długoterminowe monitorowanie plastyczności strukturalnej zależnej od doświadczenia w RSC.

Jednoczesne dwufotonowe obrazowanie in vivo wejść synaptycznych i celów postsynaptycznych w korze zaśledzinowej myszy

Opracowaliśmy nowatorską technikę w mikroskopii elektronowej, "flash-and-freeze", która umożliwia wizualizację dynamiki membrany z rozdzielczością czasową ms. Technika ta łączy optogenetyczną stymulację neuronów z zamrażaniem pod wysokim ciśnieniem. W tym miejscu demonstrujemy procedury i szczegółowo opisujemy protokoły.

Flash-and-Freeze: nowatorska technika uchwycenia dynamiki membrany za pomocą mikroskopii elektronowej

Ta metoda opisuje chroniczne przygotowanie, które umożliwia optyczny dostęp do hipokampa żywych myszy. Preparat ten może być stosowany do wykonywania podłużnego obrazowania optycznego plastyczności strukturalnej neuronów i plastyczności komórkowej wywołanej aktywnością przez okres kilku tygodni.

Podłużne obrazowanie dwufotonowe grzbietowego hipokampa CA1 u żywych myszy

Prezentowany tutaj jest protokół wszczepienia przewlekłego okna czaszkowego do podłużnego obrazowania komórek mózgowych u obudzonych, skrępowanych głową myszy.

Implantacja okna czaszkowego w celu powtórzenia obrazowania in vivo u obudzonych myszy

Tutaj prezentujemy protokół opisujący transdukcję wirusa w dyskretnych obszarach mózgu za pomocą konstruktów optogenetycznych, które umożliwiają specyficzną dla synaps charakterystykę elektrofizjologiczną w ostrych wycinkach mózgu gryzoni.

Ex vivo Badanie optogenetyczne transmisji synaptycznej dalekiego zasięgu i plastyczności od przyśrodkowej kory przedczołowej do bocznej kory śródwęchowej

Tutaj opisujemy protokół łączący wstrzyknięcie wirusa związanego z adenowirusem z implantacją okna czaszkowego w celu jednoczesnego obrazowania dynamiki mikrogleju i aktywności neuronalnej u obudzonych myszy.

Jednoczesne obrazowanie dynamiki mikrogleju i aktywności neuronalnej u obudzonych myszy

Poznaj transmisyjną mikroskopię elektronową do analizy okołodobowej plastyczności synaptycznej w korze mięśniowej myszy. Ta metoda pozwala badać zmiany liczby synaps w cyklu dobowym.

Transmisyjna mikroskopia elektronowa jako technika wizualizacji do analizy okołodobowej plastyczności synaptycznej w korze mięśniowej myszy (Wideo) | JoVE Journal

Transmisyjna mikroskopia elektronowa jako technika wizualizacji do analizy okołodobowej plastyczności synaptycznej w korze mięśniowej myszy

Przeglądaj więcej filmów