Transmisyjna mikroskopia elektronowa jako technika wizualizacji do analizy okołodobowej plastyczności synaptycznej w korze mięśniowej myszy

Interesuje nas plastyczność neuronalna, a w szczególności okołodobowe zmiany plastyczności synaps, neuronów i komórek glejowych. Staramy się odpowiedzieć na pytanie, w jaki sposób synapsy przekształcają się w ciągu dnia i nocy oraz w warunkach patologicznych. Najnowszym osiągnięciem w naszej dziedzinie badań jest wykorzystanie różnych narzędzi genetycznych do manipulowania ekspresją genów, a także wykorzystanie metod wizualizacji zmian w mózgu, a także rośnie liczba modeli zwierzęcych do badania chorób neurodegeneracyjnych. Odkryliśmy, używając mikroskopu transmisyjnego elektronów, że liczba synaps w korze beczkowatej myszy zmienia się w ciągu dnia i nocy. I ten rytm jest również okołodobowy, przynajmniej w przypadku synaps hamujących. Ponieważ synapsy hamujące, ich liczba wzrasta w nocy, podczas gdy synapsy pobudzające zwiększają się w ciągu dnia. Podobne zmiany zaszłyśmy w mózgu muszki owocowej. U tego gatunku zmienia się również liczba synaps w ciągu dnia i nocy. Ponadto odkryliśmy zmiany strukturalne w kształcie neuronów i komórek glejowych.

[Narrator] Na początek weź móżdżek myszy i podziel mózg na dwie półkule. Wybierz jedną półkulę i ustaw ją tak, aby sekcje można było ciąć stycznie do kory lufy. Następnie pokrój skrawki o grubości 60 mikrometrów i przenieś je do roztworu zawierającego 0,1-molowy bufor fosforanowy i utrwalacz w stosunku jeden do pięciu. Zbadaj skrawki pod mikroskopem świetlnym i zbierz tylko te sekcje, które wyraźnie pokazują korę pola beczkowego. Za pomocą pędzla delikatnie przenieś sekcje na małą szklaną szalkę Petriego. Opłucz sekcje mózgu w 0,1-molowym kakodylacie. Następnie umocować skrawki w 1% tetratlenku osmu w 0,1-molowym buforze kakodylowym z 1,5% żelazocyjankiem potasu. Po przepłukaniu skrawków w wodzie destylowanej użyj strzykawki z 25-milimetrowym filtrem, aby powoli dozować 70% etanolu zawierającego 1% octanu uranylu do każdej szalki Petriego z tkankami. Po całonocnej inkubacji w 70% etanolu w temperaturze czterech stopni Celsjusza umyj chusteczki w 80%, 90% i 100% etanolu. Następnie umyj chusteczki dwukrotnie w tlenku propylenu przez 10 minut każda. Następnie zastąp tlenek propylenu dwoma mililitrami mieszaniny jeden do jednego żywicy poliamidowej i tlenku propylenu. Przykryj pokrywką i inkubuj przez 40 minut. Osadź sekcje mózgu w dwóch mililitrach mieszaniny żywicy Poly / Bed i tlenku propylenu w proporcji trzy do jednego. Przykryj i odstaw na 1,5 godziny. Następnie pokrój folię ACLAR na kawałki odpowiadające rozmiarowi standardowego szkiełka podstawowego. Za pomocą plastikowej pipety nałóż niewielką ilość żywicy na każdy kawałek folii ACLAR. Za pomocą pędzla przenieś skrawki mózgu z szalki Petriego na żywicę na folii ACLAR. Osadź każdą sekcję między dwiema foliami ACLAR i inkubuj w celu polimeryzacji. Używając mikroskopu świetlnego z dwukrotnym obiektywem, sfotografuj osadzone sekcje mózgu. Aby otworzyć obrazy, kliknij przycisk Plik i otwórz, zaznacz obrazy, przytrzymując Shift, a następnie kliknij przycisk Otwórz. Rozpocznij układanie obrazów z kory mózgowej. Kliknij prawym przyciskiem myszy Warstwa 1 na każdym obrazie, wybierz Zduplikuj warstwę i wprowadź numer obrazu jako nazwę w oknie dialogowym. Wybierz jeden obraz jako plik docelowy i kliknij przycisk OK. Następnie użyj narzędzia Przesuń, aby ręcznie wyrównać obrazy i dostosuj orientację za pomocą opcji Edycja, Przekształć, Obróć lub Odwróć w zależności od potrzeb. Aby uzyskać dokładniejsze dopasowania, użyj funkcji Edycja, Przekształć, Zniekształc i przesuń narożniki pojedynczo, aby dopasować je do anatomicznych punktów orientacyjnych. Ustaw tryb mieszania górnej warstwy na nakładkę w panelu Warstwy, aby ułatwić wyrównanie. W każdej sekcji, która wyświetla korę beczki, użyj mikroskopu stereoskopowego, aby zidentyfikować wybraną lufę i wytnij ją wraz z sąsiednią za pomocą żyletki. Po zatopieniu sekcji w bloku żywicy, zbierz ultracienkie sekcje na jednoszczelinowych siatkach niklowych pokrytych Formvarem. Po wyrównaniu stosu obrazów TEM, jak pokazano wcześniej, zdefiniuj obszar analizy. Kliknij Warstwa, a następnie Nowy i Warstwa, a następnie kliknij OK. Wybierz narzędzie Prostokąt, przejdź do Warstwa, Styl warstwy, Obrys. Ustaw kolor, grubość i położenie obrysu na wewnątrz, a następnie kliknij przycisk OK. Teraz narysuj prostokąt, aby zdefiniować obwiednię analizy, a następnie wybierz opcję Wypełnij 0%. Aby dodać nową warstwę do adnotacji, wybierz opcję Warstwa, Nowa, Warstwa, a następnie kliknij przycisk OK. Użyj narzędzia Pędzel, aby oznaczyć synapsy na tej warstwie. Użyj narzędzi Lupka i Rączka, aby zapewnić precyzję podczas dodawania adnotacji. Teraz otwórz stos obrazów przeznaczony do rekonstrukcji 3D. Wybierz narzędzie Kadrowanie, zaznacz obszar zawierający grzbiet dendrytyczny w poprzek stosu i naciśnij Enter, aby przyciąć ten obszar we wszystkich widocznych warstwach. Aby w danym momencie była widoczna tylko jedna warstwa, przełącz ikonę oka w panelu Warstwy. Kliknij Plik, Zapisz jako, nazwij plik, wybierz format JPG i kliknij OK, aby zapisać każdy przycięty obraz osobno. Otwórz oprogramowanie do rekonstrukcji 3D. Przed przekazaniem kliknij przycisk Z na metauchwytu nawigacyjnym lub naciśnij numeryczny 7, aby wyrównać perspektywę rzutni. Następnie, aby przesłać obrazy, kliknij Dodaj, Obraz, Odniesienie, a następnie wybierz pierwszy obraz i kliknij dwukrotnie, aby potwierdzić. Aby ustawić końcowy obraz TEM wzdłuż osi z, kliknij obraz. W panelu Właściwości obiektu na prawym pasku bocznym wprowadź odpowiednią wartość w polu Lokalizacja Z. Aby równomiernie rozmieścić wszystkie obrazy wzdłuż osi z, zaznacz wszystkie obiekty obrazu. Naciśnij przycisk Koniec, aby otworzyć panel Koniec. Przejdź do karty Edytuj i kliknij Rozmieść Z, aby automatycznie rozmieścić je na podstawie grubości przekroju. Aby ręcznie obrysować kształt grzbietu dendrytycznego na każdym obrazie TEM przy użyciu jednej krzywej dla każdego obrazu, kliknij przycisk Dodaj, Krzywa i Okrąg. Aby przesunąć okrąg, przytrzymaj g, przeciągnij myszą, a następnie kliknij, aby potwierdzić położenie. Przytrzymaj s, aby dostosować rozmiar, a następnie kliknij, aby potwierdzić. Następnie przeskaluj obiekt, aby wyrównał się z kształtem grzbietu dendrytycznego. Teraz zmodyfikuj zakrzywiony kształt, aby dopasować go do granicy grzbietu. Wybierz punkt kontrolny, naciśnij g, przesuń punkt i kliknij, aby potwierdzić. W razie potrzeby użyj g lub s, aby wyregulować punkty uchwytu, udoskonalając kierunek i intensywność krzywej. Aby dodać więcej szczegółów, przytrzymaj Shift i wybierz dwa sąsiadujące ze sobą punkty kontrolne. Następnie kliknij prawym przyciskiem myszy i wybierz opcję Podziel, aby wstawić nowy punkt między nimi. Gdy krzywa dokładnie obrysuje grzbiet, wejdź w zakładkę Układ, kliknij prawym przyciskiem myszy obiekt okręgu Beziera i wybierz opcję Powiel obiekt bez poruszania myszą. Aby połączyć krawędzie połączonego obiektu i utworzyć zamkniętą siatkę, należy wejść w zakładkę Modelowanie. Naciśnij 2, aby przełączyć się na tryb wyboru krawędzi. Kliknij przycisk Wybierz, Wszystkie, kliknij prawym przyciskiem myszy i wybierz polecenie Mostuj pętle krawędzi, aby połączyć ze sobą pierścienie krawędzi. Aby wypełnić lukę u góry obiektu, usuń zaznaczenie opcji wszystko, klikając obok niej. Przytrzymaj Alt i kliknij jedną krawędź górnej półki, aby zaznaczyć całą pętlę. Kliknij prawym przyciskiem myszy i wybierz polecenie Wyciągnij krawędzie, przeciągnij w górę wzdłuż osi z. Teraz naciśnij s, przesuń mysz do wewnątrz, aby zmniejszyć nową pętlę, i kliknij, aby potwierdzić. Trzymając pętlę wybraną, kliknij prawym przyciskiem myszy i wybierz opcję Nowa powierzchnia z krawędzi. Aby wygładzić ostateczną strukturę, przejdź do zakładki Modyfikatory na prawym pasku bocznym. Kliknij przycisk Dodaj modyfikator, przejdź do opcji Generuj i wybierz opcję Powierzchnia podpodziału. Ustaw poziomy rzutni i renderowania na jeden, aby uzyskać spójne wygładzanie. Aby przypisać kolor do poszczególnych konstrukcji, wybierz żądany obiekt. Otwórz kartę Materiał na prawym pasku bocznym, kliknij Nowy i ustaw kolor bazowy. Wybierz jasny obiekt, aby dostosować oświetlenie sceny. Naciśnij i przytrzymaj g, przesuń mysz, aby zmienić położenie światła, a następnie kliknij, aby potwierdzić jego nowe położenie. Aby ustawić kamerę do renderowania, ustaw rzutnię tak, aby była skierowana w stronę grzbietu dendrytycznego, tak jak powinien wyglądać w końcowym wyniku. Naciśnij Control + Alt + klawiatura numeryczna 0, aby przyciągnąć kamerę do bieżącego widoku. Dostosuj klatkę aparatu, zaznaczając ją, przytrzymując g i przesuwając, aby poprawić kadrowanie. Kora somatosensoryczna myszy była możliwa do zidentyfikowania nawet w niezabarwionych sekcjach mózgu, a całe pole beczkowe można było zrekonstruować za pomocą narzędzi cyfrowych, pomimo rozmieszczenia pojedynczych beczek w wielu sekcjach. Kolejne ultracienkie obrazy TEM umożliwiły wiarygodną klasyfikację synaps na typy pobudzające lub hamujące w oparciu o seryjne dowody wizualne. Trójwymiarowa rekonstrukcja kolców dendrytycznych z odcinków szeregowych pozwoliła na wizualizację morfologii kręgosłupa, ujawniając różne kształty, takie jak cienkie, grzybkowe, przysadziste i pośrednie. Kształty kręgosłupa określono ilościowo na podstawie pomiarów, w tym długości kręgosłupa, długości szyi oraz średnic kręgosłupa, głowy i szyi.