Name: Przewodnik krok po kroku dotyczący izolacji i analizy powierzchni liści i apoplastycznego RNA przy użyciu rozet Arabidopsis (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-08-08T13:50:00.000+00:00
Duration: 9 min 56 s
Description: Naucz się izolować RNA z powierzchni liści i apoplastu Arabidopsis przy użyciu elektroforezy i sekwencjonowania Illumina. Ta metoda pozwala badać dynamikę RNA w odpowiedzi na stres biotyczny.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Praca ta została wsparta dwoma grantami z Narodowej Fundacji Nauki Stanów Zjednoczonych,
IOS-2243531 i IOS-2141969 do RW

<ol><li>Vorholt, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbial+life+in+the+phyllosphere%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Microbial life in the phyllosphere.</a> Nat Rev Microbiol. 10 (12), 828-840 (2012).</li>
<li>Ritpitakphong, U., Falquet, L., Vimoltust, A., Berger, A., M'etraux, J., L'Haridon, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+microbiome+of+the+leaf+surface+of+Arabidopsis+protects+against+a+fungal+pathogen%5BTitle%5D)+AND+%22New+Phytol%22%5BJournal%5D)">The microbiome of the leaf surface of Arabidopsis protects against a fungal pathogen.</a> New Phytol. 210 (3), 1033-1043 (2016).</li>
<li>Chaudhry, V., Runge, P., Sengupta, P., Doehlemann, G., Parker, J. E., Kemen, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shaping+the+leaf+microbiota%3A+plant-microbe-microbe+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Bot%22%5BJournal%5D)">Shaping the leaf microbiota: plant-microbe-microbe interactions.</a> J Exp Bot. 72 (1), 36-56 (2021).</li>
<li>Vacher, C., Hampe, A., Port'e, A. J., Sauer, U., Compant, S., Morris, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+phyllosphere%3A+microbial+jungle+at+the+plant-climate+interface%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Rev+Ecol+Evol+Syst%22%5BJournal%5D)">The phyllosphere: microbial jungle at the plant-climate interface.</a> Ann Rev Ecol Evol Syst. 47, 1-24 (2016).</li>
<li>Mahmoudi, M., Almario, J., Lutap, K., Nieselt, K., Kemen, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbial+communities+living+inside+plant+leaves+or+on+the+leaf+surface+are+differently+shaped+by+environmental+cues%5BTitle%5D)+AND+%22ISME+Commun%22%5BJournal%5D)">Microbial communities living inside plant leaves or on the leaf surface are differently shaped by environmental cues.</a> ISME Commun. 4 (1), ycae103(2024).</li>
<li>Borniego, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diverse+plant+RNAs+coat+Arabidopsis+leaves+and+are+distinct+from+apoplastic+RNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Diverse plant RNAs coat Arabidopsis leaves and are distinct from apoplastic RNAs.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 122 (1), e2409090121(2025).</li>
<li>Ren, B., Wang, X., Duan, J., Ma, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rhizobial+tRNA-derived+small+RNAs+are+signal+molecules+regulating+plant+nodulation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Rhizobial tRNA-derived small RNAs are signal molecules regulating plant nodulation.</a> Science. 365 (6456), 919-922 (2019).</li>
<li>Chery, M., Drouard, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plant+tRNA+functions+beyond+their+major+role+in+translation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Bot%22%5BJournal%5D)">Plant tRNA functions beyond their major role in translation.</a> J Exp Bot. 74 (7), 2352-2363 (2022).</li>
<li>Panstruga, R., Spanu, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transfer+RNA+and+ribosomal+RNA+fragments-Emerging+players+in+plant-microbe+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22New+Phytol%22%5BJournal%5D)">Transfer RNA and ribosomal RNA fragments-Emerging players in plant-microbe interactions.</a> New Phytol. 241 (2), 567-577 (2024).</li>
<li>Baldrich, P., Rutter, B. D., Karimi, H. Z., Podicheti, R., Meyers, B. C., Innes, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plant+extracellular+vesicles+contain+diverse+small+RNA+species+and+are+enriched+in+10-+to+17-nucleotide+%26%2334%3BTiny%26%2334%3B+RNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Plant extracellular vesicles contain diverse small RNA species and are enriched in 10- to 17-nucleotide &#34;Tiny&#34; RNAs.</a> Plant Cell. 31 (2), 315-324 (2019).</li>
<li>Rutter, B. D., Rutter, K. L., Innes, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+quantification+of+plant+extracellular+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Bio+Protoc%22%5BJournal%5D)">Isolation and quantification of plant extracellular vesicles.</a> Bio Protoc. 7 (17), e2533(2017).</li>
<li>Zhang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((OsHSD1%2C+a+hydroxysteroid+dehydrogenase%2C+is+involved+in+cuticle+formation+and+lipid+homeostasis+in+rice%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Sci%22%5BJournal%5D)">OsHSD1, a hydroxysteroid dehydrogenase, is involved in cuticle formation and lipid homeostasis in rice.</a> Plant Sci. 249, 35-45 (2016).</li>
<li>Zhou, L., Ni, E., Yang, J., Zhou, H., Liang, H., Li, J., Jiang, D., Wang, Z., Liu, Z., Zhuang, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rice+OsGL1-6+is+involved+in+leaf+cuticular+wax+accumulation+and+drought+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Rice OsGL1-6 is involved in leaf cuticular wax accumulation and drought resistance.</a> PLoS One. 8 (5), e65139(2013).</li>
</ol>

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Protokół ten szczegółowo opisuje, jak wyizolować płyn do mycia powierzchni liści (LSW), wymaz z powierzchni liści (LSS) i apoplastyczny płyn do mycia (AWF) ze zdrowych rozet Arabidopsis, a następnie ekstrakcję RNA. Krytyczne etapy obejmują przygotowanie i sterylizację VIB przed wykonaniem eksperymentu, uprawę roślin w kontrolowanych warunkach oraz użycie Silwet-L77 w celu zapewnienia prawidłowego pokrycia powierzchni liścia przez VIB. Procedury te powinny dać równe ilości RNA zarówno z LSW, jak i AWF, znormalizowane przez świeżą masę liści. Odzyskiwanie RNA z tych frakcji zewnątrzkomórkowych wymaga ostrożnego obchodzenia się, zwłaszcza w odniesieniu do granulek RNA po etapach wytrącania.
Chociaż powyższy protokół został zoptymalizowany pod kątem liści Arabidopsis, z powodzeniem stosowaliśmy go również na innych gatunkach roślin z niewielkimi modyfikacjami. Ekstrakcję RNA z powierzchni liścia można zoptymalizować, wdrażając dwie podstawowe regulacje: po pierwsze, przeprowadzając wiele rund izolacji LSW, a po drugie, zwiększając stężenie środka zwilżającego. Gatunki roślin, które mają bardzo hydrofobową powierzchnię liści, takie jak ryż12,13, mogą wymagać wyższych stężeń środka zwilżającego.
Dodatkowo opisaliśmy nieinwazyjną metodę pobierania RNA z powierzchni liści za pomocą wacików z bawełnianą końcówką. Dzięki tej metodzie izolacji RNA powierzchni liścia zapewniamy, że probówka zbiorcza jest umieszczona w pojemniku na lód. Biorąc pod uwagę, że RNA na powierzchni liścia jest wydzielane i gromadzi się w temperaturze pokojowej, zakładamy, że pozostanie stabilne nawet podczas procesu zbierania. Porównaliśmy również wzorce prążkowania LSW i LSS RNA i nie wykazują one dużej różnicy pod względem degradacji.
Powyższy protokół wykorzystuje odczynnik TRIzol do oczyszczania RNA z LSW, LSS lub AWF. Ten odczynnik wykorzystuje fenol do usuwania białek. Odkryliśmy jednak, że oczyszczanie oparte na trizolu nie usuwa polisacharydów, takich jak pektyny, które są obfite w LSW i AWF6. Takie cząsteczki oczyszczające mogą powodować problemy z kwantyfikacją RNA za pomocą spektrofotometrii lub fluorometrii. Dlatego polegamy na analizie densytometrii na bazie żelu RNA w celu oceny stężeń exRNA. Obecnie badamy metody oczyszczania oparte na kolumnach, które powinny zapewnić lepsze oddzielenie RNA od polisacharydów. Jednak metody te często ograniczają odzyskiwanie małych RNA, ponieważ błona krzemionkowa jest zoptymalizowana do wiązania cząsteczek RNA większych niż ~200 nukleotydów. Małe RNA mogą przechodzić przez błonę podczas wiązania lub zostać utracone na etapach płukania. Dlatego do tej pory polegaliśmy tylko na metodzie opartej na trizolu w celu bardziej kompleksowego odzyskiwania wszystkich rozmiarów RNA, w tym małych RNA, chociaż wymaga to ostrożnego obchodzenia się i separacji faz.
Dodatkowo, przeprowadzając analizę żelu RNA, nie widzimy fragmentów mniejszych niż 80 nt dla wszystkich próbek komórkowego RNA w porównaniu z RNA AWF i LSW, głównie ze względu na niską liczebność w stosunku do dużych ilości rRNA i tRNA. Obecność mniejszych prążków w AWF i LSW wynika z degradacji obfitych rRNA i tRNA, która zachodzi naturalnie po wydzielaniu RNA w przedziale zewnątrzkomórkowym roślin i nie jest artefaktem wprowadzanym podczas zbierania i obchodzenia się z roślinami, co potwierdza sekwencjonowanie i analiza northern blot6.
Nasza metoda izolacji powierzchni liści jest wszechstronnym narzędziem o znacznym potencjale dla szerokiego zakresu zastosowań badawczych. Powinno to umożliwić izolację biomolekuł z powierzchni liści, takich jak RNA, białka i inne metabolity, które mogą mieć kluczowe znaczenie dla zrozumienia interakcji między roślinami a drobnoustrojami. Jeśli pożądana jest identyfikacja drobnoustrojów obecnych w AWF i LSW, można to osiągnąć, eliminując filtrację przez filtr 0,22 μm.
Rośliny wchodzą w interakcje z szeroką gamą drobnoustrojów, w tym bakteriami, grzybami i wirusami, które tworzą złożone społeczności na ich powierzchni1. Te zbiorowiska mikrobiologiczne mogą mieć głęboki wpływ na wzrost roślin, odporność na choroby i pobieranie składników odżywczych 2,3,4. Izolując i analizując mycie powierzchni liści przy użyciu tej metody, naukowcy mogą wyizolować exRNA, metabolity drobnoustrojów, zidentyfikować społeczności drobnoustrojów obecne na powierzchni liści i zbadać, w jaki sposób te społeczności są regulowane na poziomie molekularnym.

Liście są kolonizowane przez różne drobnoustroje, w tym bakterie, grzyby, lęgniowce i protisty, które mogą pomóc chronić rośliny przed biotycznymi i abiotycznymi stresorami, ostatecznie promując wzrost i rozwój roślin 1,2,3,4. Liść rośliny ma dwa główne przedziały, w których znajdują się oddziałujące na siebie drobnoustroje: epifityczne (powierzchnia liścia) i endofityczne (apoplast)2. Powierzchnia liścia jest chroniona hydrofobową warstwą naskórka, która zapobiega utracie wody i zawiera składniki takie jak wosk i kutyna. Górna (adaksjalna) powierzchnia liścia często zawiera wyspecjalizowane komórki naskórka przypominające włosy, zwane włoskami, zwane trichomami, które chronią przed światłem UV, regulują temperaturę i służą jako środki odstraszające roślinożerność. W przeciwieństwie do tego, apoplast ułatwia wymianę gazu i wody do fotosyntezy i zapewnia wilgotne środowisko sprzyjające kolonizacji mikrobiologicznej5. Pomimo tych różnic oba przedziały liści faworyzują niektóre drobnoustroje, przy czym epifityczne sieci mikrobiologiczne są bardziej złożone pod względem różnorodności w porównaniu z endofitycznymi sieciami mikrobiologicznymi5. Sposób, w jaki skład tych społeczności mikrobiologicznych jest regulowany w każdym kompartmencie zewnątrzkomórkowym, pozostaje słabo poznany. Spekulujemy, że struktura społeczności drobnoustrojów może być częściowo determinowana przez zewnątrzkomórkowy RNA (exRNA) wydzielany przez roślinę żywicielską.
W naszym ostatnim badaniu opisaliśmy obecność różnych gatunków RNA na powierzchni liści, które różnią się od RNA w apoplastach lub lizatach komórkowych6. Podczas gdy większość badań nad exRNA w roślinach koncentrowała się na małych niekodujących RNA, takich jak mikroRNA (miRNA) i małe interferujące RNA (siRNA), mniej uwagi poświęcono innym gatunkom RNA, takim jak fragmenty pochodzące z rRNA i tRNA, które mogą potencjalnie regulować procesy komórkowe niezależnie od komplementarności sekwencji, szczególnie u gatunków pozbawionych mechanizmów interferencji RNA 7,8. Rozdział 9.
Opisana przez nas metoda umożliwia sekwencyjną izolację RNA zarówno z płukania powierzchni liści (LSW), jak i z apoplastycznego płynu myjącego (AWF) przy użyciu tego samego zestawu roślin Arabidopsis. Dodatkowo opisujemy nieinwazyjną technikę ortogonalną polegającą na wymazie z powierzchni liścia (LSS), która umożliwia pobranie RNA poprzez delikatne przetarcie spryskanej powierzchni liścia sterylnymi patyczkami z bawełnianą końcówką6. Aby zminimalizować ryzyko zanieczyszczenia mikrobiologicznego, przed wyizolowaniem zewnątrzkomórkowego RNA filtrujemy zarówno frakcję LSW, jak i AWF. Aby ocenić ilość i rozkład wielkości próbek exRNA, opisano protokół wykorzystujący elektroforezę w żelu poliakrylamidowym połączoną z analizą obrazu za pomocą ogólnodostępnego oprogramowania ImageJ. Protokół ten zapewnia wydajne i opłacalne podejście do izolowania i analizowania niewielkich ilości exRNA. Te preparaty RNA można dalej scharakteryzować za pomocą sekwencjonowania i analiz molekularnych, oferując wgląd w dynamiczne role zewnątrzkomórkowego RNA w interakcjach roślina-drobnoustroje.
Opisany poniżej protokół różni się od wcześniej opisanego protokołu izolowania RNA z pęcherzyków zewnątrzkomórkowych roślin10. Obecny protokół nie wymaga żadnych etapów ultrawirowania i umożliwia izolację RNA z całkowitego zewnątrzkomórkowego płynu płuczkowego, a nie tylko z pęcherzyków zewnątrzkomórkowych. Co najważniejsze, zapewnia dwie ortogonalne metody izolowania RNA z powierzchni liścia. O ile nam wiadomo, izolacja RNA z powierzchni liści nie została opisana przed naszą niedawną publikacją6.

<table><tbody><tr><td>14-30 nt marker drabinkowy ssRNA</td><td>Takara</td><td>3416</td><td></td></tr><tr><td>Probówki do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml</td><td>Firma VWR</td><td>20170-038</td><td></td></tr><tr><td>Strzykawka bezigłowa 10 ml</td><td>BD</td><td>303347</td><td></td></tr><tr><td>15 ml probówek sokoła</td><td>Firma VWR</td><td>89039-668</td><td></td></tr><tr><td>15% Mini-PROTEAN TBE-Urea Gel, 10 dołków/12 dołków, 30 &mikro; L/20 i mikro; L</td><td>Bio-Rad</td><td>4566053 / 4566055</td><td></td></tr><tr><td>Wkłady do tac 36-komorowych</td><td>Prawdziwy rynek liści</td><td></td><td></td></tr><tr><td>40% roztwór akrylamidu i bis-akrylamidu, 37,5:1</td><td>Bio-Rad</td><td>1610148</td><td></td></tr><tr><td>4-calowe okrągłe doniczki</td><td>Prawdziwy rynek liści</td><td></td><td></td></tr><tr><td>50 ml probówek Falcon</td><td>Firma VWR</td><td>89039-656</td><td></td></tr><tr><td>Strzykawka bezigłowa 50 ml</td><td>BD</td><td>309653</td><td></td></tr><tr><td>96-dołkowa płytka z czarnym dnem</td><td>Grenier</td><td>655090</td><td></td></tr><tr><td>Acrodisc 0.22 &mu; M Filtr strzykawkowy</td><td>Pall</td><td>4192</td><td></td></tr><tr><td>Acrodisc 0,45 &mu; M Filtr strzykawkowy</td><td>Pall</td><td>4454</td><td></td></tr><tr><td>Nadsiarczan amonu (APS)&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3678 (wersja angielska)</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek wapnia&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Zobacz materiał C1016</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform (bez RNaz)</td><td>Macron Chemikalia wysokowartościowe</td><td>MK444110</td><td></td></tr><tr><td>Przezroczyste kopułki z tworzywa sztucznego</td><td>Hummert Międzynarodowy</td><td>11 3348</td><td>Do przykrycia roślin i utrzymania wilgotności można użyć dowolnej plastikowej kopuły</td></tr><tr><td>Sztyft z bawełnianą końcówką klasy medycznej</td><td>Uline powiedział:</td><td>S-21102</td><td></td></tr><tr><td>Etanol (bez rnazy)</td><td>Decon Laboratories, Inc.</td><td>2716GEA (od GEA)</td><td></td></tr><tr><td>Ekspres do kawy French Press, 24 uncje</td><td>Śnieżny szczyt</td><td>Zobacz materiał CS-111</td><td></td></tr><tr><td>Taca do uprawy bez otworów 10 x 20</td><td>Prawdziwy rynek liści</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wiaderko na lód&nbsp;</td><td>Schuett-Biotech, Spongex</td><td>3-680 052</td><td></td></tr><tr><td>Izopropanol</td><td>Thermo Scientific</td><td>149320050</td><td></td></tr><tr><td>Wirnik JA-14 o stałym kącie nachylenia</td><td>Beckmana Coultera; Modelu: JA-14</td><td>339247</td><td></td></tr><tr><td>Chusteczki Kimwipes</td><td>KCWW, Kimberly-Clark</td><td>34120</td><td></td></tr><tr><td>Niski zakres ssRNA lader</td><td>NEB</td><td>N0364S</td><td></td></tr><tr><td>Hydrat MES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Zobacz materiał M8250</td><td></td></tr><tr><td>Czytnik mikropłytek</td><td>BioTek</td><td>&nbsp; Synergia H1</td><td></td></tr><tr><td>Miracle-Gro (Cudowne Gro)</td><td>Miracle-Gro (Cudowne Gro)</td><td>24-8-16</td><td>Jest to uniwersalny pokarm roślinny. W zależności od źródła gleby używanego do uprawy roślin, aplikację można dostosować.</td></tr><tr><td>Butelka Nalgene centifuge 250 ml (bez nakrętki)</td><td>Nalgene powiedział:</td><td>3120</td><td></td></tr><tr><td>Ręczniki papierowe</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ParaFilm&nbsp; Folia laboratoryjna M</td><td>Parafilm</td><td>S-25929 (wersja angielska)</td><td></td></tr><tr><td>Zlewka plastikowa (500 ml)</td><td>Uline powiedział:</td><td>S-21658</td><td></td></tr><tr><td>Glikogen wolny od RNaz (20 mg/ml)</td><td>Thermo Scientific</td><td>Czynnik R0561</td><td></td></tr><tr><td>RootShield Plus WP Biologiczny środek grzybobójczy</td><td>BioWorks (Prace biologiczne)</td><td>68539-9</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Silwet L-77</td><td>Laboratoria fitotechniczne</td><td>Numer katalogowy S7777 powiedział:</td><td>Można użyć dowolnej marki Silwet L-77. Jednak z biegiem czasu Silwet traci swoją skuteczność. Idealnie jest wymieniać go raz w roku.</td></tr><tr><td>Chlorek sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Zobacz materiał S7653</td><td></td></tr><tr><td>Miękka nylonowa szczotka do malowania włosów</td><td>NAM. Zaopatrzenie w sztukę</td><td>Nr 6</td><td></td></tr><tr><td>Butelka z rozpylaczem</td><td>Uline powiedział:</td><td>S-7272</td><td>Można użyć dowolnej butelki z rozpylaczem, ale ustawienia spryskiwacza powinny być pod prysznicem.</td></tr><tr><td>Sungro Profesjonalna mieszanka do uprawy</td><td>Sungro powiedział:</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mieszanka rozmnożeniowa Sungro</td><td>Sungro powiedział:</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SYBR Gold Barwnik żelowy z kwasem nukleinowym (10 000x koncentrat w DMSO)</td><td>Thermo Scientific</td><td>Zobacz materiał S11494</td><td></td></tr><tr><td>TEMED</td><td>Thermo Scientific</td><td>17919</td><td></td></tr><tr><td>Odczynnik TRIzol</td><td>Invitrogen</td><td>15596026</td><td></td></tr><tr><td>Ultraczysta woda wolna od Dnazy/Rnazy</td><td>Invitrogen</td><td>10977015</td><td></td></tr><tr><td>Mocznik</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>U5378 powiedział:</td><td></td></tr><tr><td>Komora próżniowa, 0,20 stopy sześciennej</td><td>SP Scienceware - Bel-Art Products - H-B Instrument</td><td>F42031-0000</td><td></td></tr><tr><td>Pompa próżniowa, 3,5 CFM</td><td>Idealne produkty próżniowe</td><td>P101532</td><td></td></tr><tr><td>Waga</td><td>Escali powiedział:</td><td>WBB480535</td><td>To tylko przykład. Można użyć dowolnej wagi.</td></tr></tbody></table>

przewodnik krok po kroku dotyczący izolacji i analizy powierzchni liści i apoplastycznego rna przy użyciu rozet arabidopsis

A Stepwise Guide to the Isolation and Analysis of Leaf Surface and Apoplastic RNA Using Arabidopsis Rosettes

Powierzchnia liści roślin i przestrzeń międzykomórkowa w liściach (apoplast) służą jako kluczowe interfejsy wymiany molekularnej między roślinami a oddziałującymi z nimi drobnoustrojami. W poprzednich pracach wykazaliśmy obecność różnorodnych gatunków RNA w apoplaście rozet Arabidopsis. Niedawno nasze odkrycia ujawniły, że rośliny Arabidopsis również aktywnie wydzielają RNA na powierzchni liści. Aby to zbadać, opracowaliśmy wysoce powtarzalną metodę zbierania zarówno płynu do mycia powierzchni liści (LSW), jak i apoplastycznego płynu myjącego (AWF) z tego samego zestawu roślin Arabidopsis. Dodatkowo zbadaliśmy nieinwazyjną technikę polegającą na wymazie z powierzchni liścia (LSS), która umożliwiła nam pobranie RNA poprzez delikatne przetarcie powierzchni liścia sterylnymi patyczkami z bawełnianą końcówką. Aby zminimalizować ryzyko zanieczyszczenia mikrobiologicznego, przefiltrowaliśmy frakcje LSW, AWF i LSS przed wyizolowaniem zewnątrzkomórkowego RNA (exRNA). Po przeanalizowaniu oczyszczonego exRNA za pomocą elektroforezy żelowej denaturacji RNA, zaobserwowaliśmy różnorodny szereg długich i małych gatunków RNA w próbkach LSW, LSS i AWF RNA. Dalsza kwantyfikacja i analiza porównawcza między próbkami exRNA a warunkami eksperymentalnymi przeprowadzono przy użyciu ogólnodostępnego oprogramowania ImageJ. Protokół ten zapewnia wydajne, opłacalne podejście do izolowania i analizowania niewielkich ilości exRNA z liści roślin. Te preparaty RNA można dalej scharakteryzować za pomocą sekwencjonowania i innych analiz molekularnych, oferując wgląd w dynamiczne role exRNA w interakcjach roślina-mikroorganizm.

Schematyczny przegląd opisanego powyżej protokołu krokowego izolowania płukania powierzchni liści (LSW) i apoplastycznych frakcji płuczących (AWF) z roślin Arabidopsis przedstawiono na rysunku 2A. Metoda ta pozwala na ekstrakcję zarówno LSW, jak i AWF z zaledwie trzech do sześciu roślin na replikę, przy jednoczesnym konsekwentnym uzyskiwaniu równoważnych ilości RNA z obu frakcji. Do pomiaru stężenia RNA w lizatach komórkowych wykorzystujemy spektrofotometrię NanoDrop. Jednak w przypadku próbek RNA pochodzących z LSW, LSS i AWF polegamy na densytometrycznej kwantyfikacji żeli poliakrylamidowych barwionych złotem SYBR. Ten etap kwantyfikacji jest konieczny, ponieważ frakcje zewnątrzkomórkowe zawierają nieznane zanieczyszczenie - prawdopodobnie polisacharydy - które czasami mogą się oczyszczać i zakłócać metody kwantyfikacji RNA oparte na absorbancji, prowadząc do przeszacowania stężenia RNA. Aby przezwyciężyć to ograniczenie, planujemy wykorzystać w naszych przyszłych pracach metody oczyszczania RNA nieoparte na fenolach.
Analiza żelu denaturacyjnego RNA ujawniła obecność szerokiego zakresu gatunków RNA w LSW i AWF, w tym zarówno długich, jak i małych RNA (Figura 3). Warto zauważyć, że równoważne ilości RNA udało się wyizolować zarówno z powierzchni liści, jak i frakcji apoplastycznej, przy czym ilości RNA zostały znormalizowane na świeżą masę rośliny (FW). Co zaskakujące, profile wielkości RNA frakcji LSW i AWF znacznie różniły się od siebie oraz od profilu RNA całkowitego lizatu komórkowego (CL). Różnice te sugerują, że frakcje exRNA nie są zanieczyszczone komórkowym RNA. Spośród tych trzech frakcji, apoplastyczny RNA (AWF) wykazywał największą różnorodność w rozkładzie wielkości, co sugeruje, że apoplastyczny RNA jest bardziej zdegradowany niż RNA na powierzchni liści.
Do dalszych badań nad obecnością RNA na powierzchni liści rzodkiewnika użyliśmy wacików bawełnianych. Metoda ta pozwoliła nam na selektywne i sekwencyjne pobranie RNA z powierzchni liścia adaksjalnego (górnego) i abaksjalnego (dolnego)6. Analizy te wykazały, że obie powierzchnie liści zawierały podobne ilości RNA. Co więcej, zdolność do zbierania RNA po prostu poprzez absorpcję buforu z powierzchni liścia bez konieczności wirowania dodatkowo potwierdza wniosek, że RNA rzeczywiście znajduje się na powierzchni liścia, a nie jest ekstrahowany przez aparaty szparkowe podczas wirowania.
Jedną z podstawowych zmian, która pozwoliła nam wyodrębnić dużą ilość RNA na powierzchni liści, było dodanie środka zwilżającego. Odzyskaliśmy prawie dwa razy więcej RNA po dodaniu środka zwilżającego (o bardzo niskim stężeniu 0,001%) do VIB. Ta różnica w stężeniu RNA uzyskanego z Silwet L-77 i bez niego wskazuje, że zastosowanie środka zwilżającego poprawia rozpuszczanie RNA na powierzchni liścia. Jednak zwiększenie stężenia środka zwilżającego z 0,001% do 0,01% nie poprawiło izolacji RNA LSW (ryc. 4). Warto zauważyć, że powtórzenie izolacji RNA LSW z tych samych liści dało dodatkowe RNA (około 63% odzysku uzyskanego z pierwszego mycia), co sugeruje, że liście stale wydzielają RNA na powierzchnię, przy czym prawie dwie trzecie z niego jest zastępowane w ciągu około 30 minut wymaganych do przetworzenia liści. Aby zwiększyć całkowitą wydajność RNA LSW, gdy materiał roślinny jest ograniczony, możliwe jest mycie tych samych liści wiele razy z rzędu. Nie zalecamy jednak więcej niż trzech prań, ponieważ związane z tym obchodzenie się może prowadzić do skumulowanego uszkodzenia materiału liści, co można ocenić na podstawie zielonego zabarwienia płynu myjącego. W tych eksperymentach stężenie RNA oszacowano za pomocą analizy densytometrycznej na bazie żelu RNA. Jednak opisana powyżej metoda kwantyfikacji RNA na płytkach mikromiareczkowych może być stosowana do dokładnej kwantyfikacji RNA podczas oceny wielu próbek jednocześnie (ryc. 5).

Opisujemy prostą, ale wysoce powtarzalną metodę izolowania zewnątrzkomórkowego RNA z powierzchni liści i apoplastu roślin Arabidopsis.

Przewodnik krok po kroku dotyczący izolacji i analizy powierzchni liści i apoplastycznego RNA przy użyciu rozet Arabidopsis

The surface of plant leaves and intercellular space within leaves (the apoplast) serve as key interfaces for molecular exchange between plants and their ...

Staramy się zrozumieć, w jaki sposób rośliny regulują swoje mikrobiomy i czy RNA wydzielane przez rośliny regulują ekspresję genów zarówno w mikroorganizmach prokariotycznych, jak i eukariotycznych, które kolonizują rośliny. Używamy kombinacji elektroforezy otoczki o wysokiej rozdzielczości i analizy opartej na Illumina, aby ocenić RNA obecne na powierzchni liścia i sposób, w jaki zmieniają się one w odpowiedzi na stres biotyczny. Podczas gdy ostatnie badania sugerują, że zewnątrzkomórkowe RNA są wychwytywane przez patogeny grzybowe i bakteryjne, mechanizmy leżące u podstaw wychwytu RNA i funkcjonalne konsekwencje tego wychwytu pozostają w dużej mierze niezbadane.Na początek weź sześcio- do siedmiotygodniowych roślin rzodkiewnika do każdej repliki. Dodaj sylwetkę L-77 do sterylnego VIB przed rozpoczęciem izolacji powierzchni liści. Następnie za pomocą cylindra miarowego przenieś 100 mililitrów przygotowanego roztworu VIB do 500-mililitrowej butelki z rozpylaczem.Za pomocą cienkich nożyczek ostrożnie oderwij rozety arabidopsis od ich korzeni. Następnie użyj miękkiej szczotki, aby usunąć nadmiar ziemi z płatków. Umieść oderwane rozety na płaskiej tacy, powierzchnią aosiową skierowaną do góry.Następnie spryskaj powierzchnię abaxial za pomocą pięciu pompek butelki z rozpylaczem wypełnionej VIB i środkiem zwilżającym. Ostrożnie odwróć rozety i spryskaj powierzchnię adaxialną. Przygotować zmodyfikowane strzykawki z otworami na dnie, owijając je folią para, wokół szyjki, aby zawiesić końcówkę nad dnem butelki.Aby odzyskać płyn do mycia powierzchni liści, delikatnie włóż spryskane rozety do bezigłowych 60-mililitrowych zmodyfikowanych strzykawek umieszczonych w 250-mililitrowych butelkach wirówkowych i spryskaj strzykawkę dwiema mocnymi pompkami buforu. Następnie odwirować załadowane butelki o stężeniu 100 G przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Teraz przefiltruj odzyskaną powierzchnię liści, przepłucz ją przez filtr strzykawkowy o średnicy 0,22 mikrometra i zbierz filtrat do 50-mililitrowej probówki wirówkowej, trzymanej na lodzie.W przypadku metody wymazu z powierzchni liści spryskaj oderwane rozety roztworem VIB i środka zwilżającego w taki sam sposób, jak opisano w poprzednim kroku. Aby odzyskać wymaz z powierzchni liścia, użyj sterylnych bawełnianych patyczków, aby przetrzeć zarówno powierzchnię adaksjalną, jak i abaksjalną rozet. Następnie dociśnij nasączone końcówki do wewnętrznej ścianki 15-mililitrowej probówki wirówkowej, aby wyekstrahować płyn.Przefiltruj pobraną próbkę wymazu z powierzchni liści przez filtr strzykawkowy o średnicy 0,22 mikrometra do dwumililitrowej probówki umieszczonej na lodzie. Umieść ten sam zestaw roślin, które były wcześniej używane do mycia powierzchni liści lub izolacji wacików, w czystej zlewce i delikatnie spłucz je dwukrotnie wodą destylowaną. Aby naciekać próżniowo rozety za pomocą VIB, ostrożnie umieść wypłukane rozety w ekspresie do kawy French Press zawierającym od 300 do 500 mililitrów VIB.Zabezpiecz pokrywę i delikatnie opuść tłok, aż rozety zostaną całkowicie zanurzone. Włóż francuską prasę do komory próżniowej i stosuj próżnię przez 20 sekund za pomocą pompy próżniowej, aż rośliny będą dobrze zinfiltrowane. Po zwolnieniu podciśnienia wyjmij prasę francuską z komory i zdejmij pokrywę.Wlej VIB do plastikowej zlewki o pojemności 500 mililitrów i usuń rozety. Następnie delikatnie potrząśnij rozetami i przetrzyj liście ręcznikiem papierowym, aby usunąć nadmiar bufora. Teraz za pomocą bibuły delikatnie osusz powierzchnie liści, aby usunąć pozostały bufor.Aby zebrać aplastyczny płyn do mycia, włóż rozety infiltrowane VIB do 60-mililitrowych strzykawek bezigłowych, umieszczonych w 250-mililitrowych butelkach wirówek, tak jak poprzednio. Odwirować butelki o stężeniu 600 g przez 30 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza z powolnym przyspieszaniem. Następnie przefiltruj zebrany aplastikowy płyn myjący przez filtr strzykawkowy o średnicy 0,22 mikrometra w 15-mililitrowej probówce umieszczonej na lodzie.Przygotuj lub kup mini żel zawierający 10 lub 15% poliakrylamidu i siedem molowych moczników w buforze EDTA kwasu trisborowego, używając roztworu akrylamidu i bis. Następnie wymieszaj próbki RNA z dwukrotnie denaturującym buforem ładującym. Podgrzej mieszaninę w temperaturze 65 stopni Celsjusza przez pięć minut i natychmiast umieść ją na lodzie.Teraz rozpuść próbki RNA w 0,5-krotnym buforze TBE w temperaturze pokojowej, stosując napięcie 220 woltów przez około godzinę i 15 minut. Następnie zabarwić żel barwnikiem z kwasem nukleinowym cyber gold w 0,5 razy TBE przez 10 minut. Spłucz żel dwukrotnie wodą destylowaną i zobrazuj go za pomocą systemu obrazowania.Aby określić ilościowo rozwiązane prążki RNA, należy użyć metody analizy żelu z dokumentacji obrazu J w menu analizy i analizy żelu. Przygotuj wzorce RNA dla dwóch kontrprób technicznych, rozcieńczając RNA lizatu komórkowego w wodzie wolnej od RNaz i DNaz. Aby przygotować 1,5-krotny barwnik żelowy z kwasem nukleinowym cyber gold, rozpuść go w 500-milimolowym buforze tris HCL o pH ośmiu.Aby przygotować mikropłytkę, dodaj 99 mikrolitrów wody destylowanej do każdej studzienki. Następnie dodaj jeden mikrolitr RNA do każdej studzienki, używając tej samej objętości zarówno dla próbek RNA, jak i wzorców. Na koniec dodaj 50 mikrolitrów roztworu cyber złota do każdej studzienki.Aby ustawić parametry czytnika mikropłytek, wybierz wytrząsanie liniowe lub orbitalne przez trzy sekundy. Ustaw czytnik mikropłytek w tryb punktu końcowego fluorescencji z długością fali wzbudzenia 496 nanometrów i długością fali emisji 540 nanometrów. Skonstruuj linię kalibracyjną, używając wartości intensywności fluorescencji z wzorców RNA.Analiza żelu RNA denaturacji wykazała, że zarówno próbki płynu do płukania powierzchni liści, jak i aplastikowego płynu do płukania zawierają szeroki zakres rozmiarów RNA, w tym zarówno długie, jak i małe gatunki RNA. Całkowite ilości RNA wyizolowane z aplastycznego płynu myjącego i płukania powierzchni liści były podobne, po znormalizowaniu do świeżej masy rośliny. Profile RNA płukania powierzchni liści, płukania aplastiku i lizatu komórkowego różnią się znacząco, potwierdzając minimalne wewnątrzkomórkowe zanieczyszczenie RNA i pokazując, że aplastyczne RNA jest wysoce przetworzone z rozproszonymi pasmami o niskiej masie cząsteczkowej, dodatek 0,001% sylwetki L-77 do bufora izolacji pęcherzyków prawie podwoił wydajność RNA z powierzchni liści w porównaniu z buforem bez środka zwilżającego.Jednak zwiększenie tego stężenia do 0,01% nie zwiększyło jeszcze bardziej odzysku RNA. Drugie płukanie tych samych liści odzyskało około 63% RNA uzyskanego w pierwszym myciu, co wskazuje na trwające wydzielanie RNA na powierzchni liścia. Kwantyfikacja RNA, przy użyciu testów mikropłytkowych opartych na fluorescencji, wykazała wysoką liniowość stężenia RNA zarówno dla metod wykrywania cyberzłota, jak i RIBO 488.Wykazaliśmy, że tRNA i fragmenty pochodzące z tRNA lub TDR są szczególnie obfite w zewnątrzkomórkowym RNA, prawdopodobnie ze względu na ich odporność na degradację. Uważamy więc, że te TDR-y prawdopodobnie regulują ekspresję genów u bakterii. Chcemy zidentyfikować komórkowe źródła RNA na powierzchni liścia i biologiczne role, jakie ta RNaza na powierzchni liścia może odgrywać w kontekście planowanych interakcji mikroorganizmów.

a-stepwise-guide-to-isolation-analysis-leaf-surface-apoplastic-rna

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

W niniejszym filmie przedstawiono procedurę izolacji nienaruszonych protoplastów z tkanek 14-dniowych siewek Arabidopsis. Biorąc pod uwagę, że wyizolowane protoplasty pozostają nienaruszone przez co najmniej 96h i są izolowane z siewek zamiast z miesięcznych, dojrzałych roślin, procedura ta przyspiesza analizy wymagające zastosowania nienaruszonych protoplastów.

Izolacja protoplastów z tkanek 14-dniowych siewek Arabidopsis thaliana

Metoda otrzymywania protoplastów z liści Arabidopsis kompatybilna z fluorescencyjnym sortowaniem komórek (FACS), umożliwiająca badania specyficznych populacji komórkowych. Metoda ta jest zgodna z każdą linią Arabidopsis wykazującą ekspresję GFP w podzbiorze komórek.

Analiza specyficzna dla komórek liści Arabidopsis z wykorzystaniem sortowania komórek aktywowanego fluorescencją

Informujemy o skutecznej i prostej metodzie izolowania zarodków we wczesnych stadiach rozwoju z nasion Arabidopsis thaliana. W ciągu 1 godziny do 4 godzin można wyizolować do 40 zarodków, w zależności od dalszej aplikacji. Procedura jest odpowiednia do transkryptomu, metylacji DNA, ekspresji genów reporterowych, barwienia immunologicznego i fluorescencyjnych analiz hybrydyzacji in situ.

Skuteczna i szybka izolacja zarodków we wczesnym stadium rozwoju z nasion Arabidopsis thaliana

Ten protokół opisuje prostą metodę ekstrakcji i frakcjonowania transkryptów z tkanek roślinnych na podstawie liczby związanych rybosomów. Pozwala na globalne oszacowanie aktywności translacyjnej i określenie statusu translacyjnego określonych mRNA.

Łatwa metoda profilowania polisomów roślin

Tutaj prezentujemy protokół przechwytywania interaktomii zastosowany do protoplastów mezofilu z liści Arabidopsis thaliana. Metoda ta opiera się w dużej mierze na sieciowaniu UV in vivo i pozwala na izolację i identyfikację białek wiążących mRNA roślin ze środowiska fizjologicznego.

Wychwytywanie interaktomu mRNA z protoplastów roślinnych

Tutaj prezentujemy protokół do badania zachowań związanych ze wzrostem roślin, a zwłaszcza fenotypów w powtarzalny sposób. Pokazujemy, jak zapewnić zmienne, a jednocześnie stabilne warunki oświetleniowe. Prawidłowe analizy zależą od wystarczającej liczby prób i prawidłowych ocen statystycznych.

Analiza zachowania wzrostu Arabidopsis thaliana w różnych jakościach światła

Tutaj prezentujemy zmodyfikowaną metodę przesiewową, która może być szeroko stosowana do szybkiego badania przesiewowego supresorów wyciszających RNA u patogenów roślinnych.

Badania przesiewowe i identyfikacja supresorów wyciszających RNA z wydzielanych efektorów patogenów roślinnych

Tłumaczenie oczyszczania powinowactwa rybosomów (TRAP) oferuje możliwość analizowania programów rozwojowych przy minimalnym przetwarzaniu narządów i tkanek. Protokół zapewnia wysokiej jakości RNA z komórek ukierunkowanych na podjednostkę rybosomalną znakowaną zielonym białkiem fluorescencyjnym (GFP). Narzędzia do dalszej analizy, takie jak qRT-PCR lub sekwencja RNA, ujawniają profile ekspresji specyficzne dla typu tkanki i komórki.

Translacja oczyszczania powinowactwa rybosomów (TRAP) w celu zbadania rozwoju korzeni rzodkiewnika pospolitego (Arabidopsis thaliana) w skali specyficznej dla typu komórki

Wykonalność i skuteczność wysokoprzepustowych metod sekwencyjnych scRNA zwiastuje erę jednokomórkowych w badaniach roślinnych. Przedstawiono tutaj solidną i kompletną procedurę izolowania określonych typów komórek korzenia rzodkiewnika (Arabidopsis thaliana) oraz późniejszej budowy i analizy biblioteki transkryptomu.

Izolacja i analiza transkryptomu typów komórek roślinnych

Protokół ten opisuje zoptymalizowaną metodę izolowania pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (EV) z liści Arabidopsis thaliana , wspierającą dalsze analizy molekularne i funkcjonalne.

Izolacja i oczyszczanie zewnętrznych pęcherzyków roślinnych z liści Arabidopsis przy użyciu zoptymalizowanej metody zbierania apoplastów

Naucz się izolować RNA z powierzchni liści i apoplastu Arabidopsis przy użyciu elektroforezy i sekwencjonowania Illumina. Ta metoda pozwala badać dynamikę RNA w odpowiedzi na stres biotyczny.

Przewodnik krok po kroku dotyczący izolacji i analizy powierzchni liści i apoplastycznego RNA przy użyciu rozet Arabidopsis

Przeglądaj więcej filmów