Przewodnik krok po kroku dotyczący izolacji i analizy powierzchni liści i apoplastycznego RNA przy użyciu rozet Arabidopsis

Staramy się zrozumieć, w jaki sposób rośliny regulują swoje mikrobiomy i czy RNA wydzielane przez rośliny regulują ekspresję genów zarówno w mikroorganizmach prokariotycznych, jak i eukariotycznych, które kolonizują rośliny. Używamy kombinacji elektroforezy otoczki o wysokiej rozdzielczości i analizy opartej na Illumina, aby ocenić RNA obecne na powierzchni liścia i sposób, w jaki zmieniają się one w odpowiedzi na stres biotyczny. Podczas gdy ostatnie badania sugerują, że zewnątrzkomórkowe RNA są wychwytywane przez patogeny grzybowe i bakteryjne, mechanizmy leżące u podstaw wychwytu RNA i funkcjonalne konsekwencje tego wychwytu pozostają w dużej mierze niezbadane.

Na początek weź sześcio- do siedmiotygodniowych roślin rzodkiewnika do każdej repliki. Dodaj sylwetkę L-77 do sterylnego VIB przed rozpoczęciem izolacji powierzchni liści. Następnie za pomocą cylindra miarowego przenieś 100 mililitrów przygotowanego roztworu VIB do 500-mililitrowej butelki z rozpylaczem.

Za pomocą cienkich nożyczek ostrożnie oderwij rozety arabidopsis od ich korzeni. Następnie użyj miękkiej szczotki, aby usunąć nadmiar ziemi z płatków. Umieść oderwane rozety na płaskiej tacy, powierzchnią aosiową skierowaną do góry.

Następnie spryskaj powierzchnię abaxial za pomocą pięciu pompek butelki z rozpylaczem wypełnionej VIB i środkiem zwilżającym. Ostrożnie odwróć rozety i spryskaj powierzchnię adaxialną. Przygotować zmodyfikowane strzykawki z otworami na dnie, owijając je folią para, wokół szyjki, aby zawiesić końcówkę nad dnem butelki.

Aby odzyskać płyn do mycia powierzchni liści, delikatnie włóż spryskane rozety do bezigłowych 60-mililitrowych zmodyfikowanych strzykawek umieszczonych w 250-mililitrowych butelkach wirówkowych i spryskaj strzykawkę dwiema mocnymi pompkami buforu. Następnie odwirować załadowane butelki o stężeniu 100 G przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Teraz przefiltruj odzyskaną powierzchnię liści, przepłucz ją przez filtr strzykawkowy o średnicy 0,22 mikrometra i zbierz filtrat do 50-mililitrowej probówki wirówkowej, trzymanej na lodzie.

W przypadku metody wymazu z powierzchni liści spryskaj oderwane rozety roztworem VIB i środka zwilżającego w taki sam sposób, jak opisano w poprzednim kroku. Aby odzyskać wymaz z powierzchni liścia, użyj sterylnych bawełnianych patyczków, aby przetrzeć zarówno powierzchnię adaksjalną, jak i abaksjalną rozet. Następnie dociśnij nasączone końcówki do wewnętrznej ścianki 15-mililitrowej probówki wirówkowej, aby wyekstrahować płyn.

Przefiltruj pobraną próbkę wymazu z powierzchni liści przez filtr strzykawkowy o średnicy 0,22 mikrometra do dwumililitrowej probówki umieszczonej na lodzie. Umieść ten sam zestaw roślin, które były wcześniej używane do mycia powierzchni liści lub izolacji wacików, w czystej zlewce i delikatnie spłucz je dwukrotnie wodą destylowaną. Aby naciekać próżniowo rozety za pomocą VIB, ostrożnie umieść wypłukane rozety w ekspresie do kawy French Press zawierającym od 300 do 500 mililitrów VIB.

Zabezpiecz pokrywę i delikatnie opuść tłok, aż rozety zostaną całkowicie zanurzone. Włóż francuską prasę do komory próżniowej i stosuj próżnię przez 20 sekund za pomocą pompy próżniowej, aż rośliny będą dobrze zinfiltrowane. Po zwolnieniu podciśnienia wyjmij prasę francuską z komory i zdejmij pokrywę.

Wlej VIB do plastikowej zlewki o pojemności 500 mililitrów i usuń rozety. Następnie delikatnie potrząśnij rozetami i przetrzyj liście ręcznikiem papierowym, aby usunąć nadmiar bufora. Teraz za pomocą bibuły delikatnie osusz powierzchnie liści, aby usunąć pozostały bufor.

Aby zebrać aplastyczny płyn do mycia, włóż rozety infiltrowane VIB do 60-mililitrowych strzykawek bezigłowych, umieszczonych w 250-mililitrowych butelkach wirówek, tak jak poprzednio. Odwirować butelki o stężeniu 600 g przez 30 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza z powolnym przyspieszaniem. Następnie przefiltruj zebrany aplastikowy płyn myjący przez filtr strzykawkowy o średnicy 0,22 mikrometra w 15-mililitrowej probówce umieszczonej na lodzie.

Przygotuj lub kup mini żel zawierający 10 lub 15% poliakrylamidu i siedem molowych moczników w buforze EDTA kwasu trisborowego, używając roztworu akrylamidu i bis. Następnie wymieszaj próbki RNA z dwukrotnie denaturującym buforem ładującym. Podgrzej mieszaninę w temperaturze 65 stopni Celsjusza przez pięć minut i natychmiast umieść ją na lodzie.

Teraz rozpuść próbki RNA w 0,5-krotnym buforze TBE w temperaturze pokojowej, stosując napięcie 220 woltów przez około godzinę i 15 minut. Następnie zabarwić żel barwnikiem z kwasem nukleinowym cyber gold w 0,5 razy TBE przez 10 minut. Spłucz żel dwukrotnie wodą destylowaną i zobrazuj go za pomocą systemu obrazowania.

Aby określić ilościowo rozwiązane prążki RNA, należy użyć metody analizy żelu z dokumentacji obrazu J w menu analizy i analizy żelu. Przygotuj wzorce RNA dla dwóch kontrprób technicznych, rozcieńczając RNA lizatu komórkowego w wodzie wolnej od RNaz i DNaz. Aby przygotować 1,5-krotny barwnik żelowy z kwasem nukleinowym cyber gold, rozpuść go w 500-milimolowym buforze tris HCL o pH ośmiu.

Aby przygotować mikropłytkę, dodaj 99 mikrolitrów wody destylowanej do każdej studzienki. Następnie dodaj jeden mikrolitr RNA do każdej studzienki, używając tej samej objętości zarówno dla próbek RNA, jak i wzorców. Na koniec dodaj 50 mikrolitrów roztworu cyber złota do każdej studzienki.

Aby ustawić parametry czytnika mikropłytek, wybierz wytrząsanie liniowe lub orbitalne przez trzy sekundy. Ustaw czytnik mikropłytek w tryb punktu końcowego fluorescencji z długością fali wzbudzenia 496 nanometrów i długością fali emisji 540 nanometrów. Skonstruuj linię kalibracyjną, używając wartości intensywności fluorescencji z wzorców RNA.

Analiza żelu RNA denaturacji wykazała, że zarówno próbki płynu do płukania powierzchni liści, jak i aplastikowego płynu do płukania zawierają szeroki zakres rozmiarów RNA, w tym zarówno długie, jak i małe gatunki RNA. Całkowite ilości RNA wyizolowane z aplastycznego płynu myjącego i płukania powierzchni liści były podobne, po znormalizowaniu do świeżej masy rośliny. Profile RNA płukania powierzchni liści, płukania aplastiku i lizatu komórkowego różnią się znacząco, potwierdzając minimalne wewnątrzkomórkowe zanieczyszczenie RNA i pokazując, że aplastyczne RNA jest wysoce przetworzone z rozproszonymi pasmami o niskiej masie cząsteczkowej, dodatek 0,001% sylwetki L-77 do bufora izolacji pęcherzyków prawie podwoił wydajność RNA z powierzchni liści w porównaniu z buforem bez środka zwilżającego.

Jednak zwiększenie tego stężenia do 0,01% nie zwiększyło jeszcze bardziej odzysku RNA. Drugie płukanie tych samych liści odzyskało około 63% RNA uzyskanego w pierwszym myciu, co wskazuje na trwające wydzielanie RNA na powierzchni liścia. Kwantyfikacja RNA, przy użyciu testów mikropłytkowych opartych na fluorescencji, wykazała wysoką liniowość stężenia RNA zarówno dla metod wykrywania cyberzłota, jak i RIBO 488.

Wykazaliśmy, że tRNA i fragmenty pochodzące z tRNA lub TDR są szczególnie obfite w zewnątrzkomórkowym RNA, prawdopodobnie ze względu na ich odporność na degradację. Uważamy więc, że te TDR-y prawdopodobnie regulują ekspresję genów u bakterii. Chcemy zidentyfikować komórkowe źródła RNA na powierzchni liścia i biologiczne role, jakie ta RNaza na powierzchni liścia może odgrywać w kontekście planowanych interakcji mikroorganizmów.