Name: Aktywność napadowa wywołana elektrowstrząsami u larw Drosophila (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-06-06T16:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 10 s
Description: Poznaj metodę identyfikacji nowych związków przeciwpadaczkowych przy użyciu larw Drosophila. To podejście pozwala badać mechanizmy napadów i oceniać potencjalne terapie w leczeniu epilepsji.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy wielu pracownikom laboratorium Baines, którzy wspólnie rozwijali tę technikę przez wiele lat, a w szczególności Richardowi Marleyowi, który włożył wiele wysiłku, aby ta technika była solidna i niezawodna. Dziękujemy Annie Munro za narysowanie larw, które pokazano na rysunku 2. Prace w laboratorium Bainesa, które przyczyniły się do opracowania tej techniki, były hojnie wspierane przez BBSRC, MRC i Wellcome Trust. Prace te są obecnie wspierane przez fundusze z nagrody Wellcome Trust dla badaczy dla R.A.B. (Grant 217099/Z/19/Z). Do rozwoju tej techniki przyczynił się również Manchester Fly Facility, który powstał dzięki funduszom Uniwersytetu i Wellcome Trust (Grant 087742/Z/08/Z).

Muszka owocowa, Drosophila melanogaster, jest używana w tym badaniu (szczegółowe informacje można znaleźć w sekcji Wyniki). Ta technika najlepiej nadaje się do wędrownych larw w trzecim stadium rozwojowym (L3). Protokół eksperymentalny jest stosunkowo prosty, ale wymaga praktyki, aby go udoskonalić. Z naszego doświadczenia wynika, że nowi studenci potrzebują około 2 tygodni, aby opanować test i czerpią ogromne korzyści z oglądania innych, bardziej doświadczonych badaczy wykonujących test w czasie rzeczywistym za pomocą mikroskopu preparacyjnego z kamerą lub podobnego. Odczynniki i sprzęt używany w tym badaniu są wymienione w Tabeli Materiałów.
1. Selekcja larw
<ol>
	<li>Zebrać larwy z boków fiolek/butelek zawierających standardowy pokarm (5 l wody, 390 g glukozy, 360 g kukurydzy, 250 g drożdży, 40 g agaru, 135 ml nipaginy, 15 ml kwasu propionowego).</li>
	<li>Używaj tylko larw, które aktywnie się poruszają i opuściły pokarm, aby czołgać się po bokach pojemnika (wędrujące trzecie stadium rozwojowe, L3). Nie wybieraj poczwarek, które wykazują znacznie zmniejszoną lokomocję.</li>
</ol>
2. Procedura elektrowstrząsów
<ol>
	<li>Wyjmij pojedynczy wędrujący L3 i przenieś go na małą plastikową szalkę Petriego (rozmiar nie ma znaczenia) i delikatnie umyj go ddH2O, aby usunąć resztki jedzenia. Nadaje się do tego mały (000) pędzel.</li>
	<li>Przenieś pojedynczo umytą larwę za pomocą pędzla do pustego plastikowego naczynia (ponownie, rozmiar nie ma znaczenia). Osusz larwę małym fragmentem ręcznika papierowego trzymanego kleszczami. Usuń nadmiar ddH2O, ale nie susz całkowicie larw, aby uniknąć przyklejenia się do plastikowego naczynia.</li>
	<li>Pozwól larwie dojść do siebie przez 30 sekund. Ułatwi to łatwe umieszczenie sondy elektrowstrząsowej (patrz poniżej).</li>
	<li>Obejrzyj larwy pod mikroskopem preparacyjnym o małej mocy (15-20x), a gdy normalne zachowanie pełzania zostanie wznowione, delikatnie umieść sondę elektrowstrząsową (patrz krok 3, aby uzyskać szczegółowe informacje i rysunek 2A) na przedniej powierzchni grzbietowej larwy powyżej przybliżonej pozycji OUN (patrz Figura 2C). UWAGA: Ten krok ma kluczowe znaczenie, należy zastosować wystarczający nacisk, aby zapewnić dobrą przewodność między drutem sondy a naskórkiem, ale należy uważać, aby nie uszkodzić larw. W ten sposób zmiażdż larwę o około jedną trzecią do połowy jej głębokości.</li>
	<li>Zastosować impuls o stałym napięciu o długości 2 s, którego siła została wstępnie określona za pomocą krzywej miareczkowania (rysunek 3). Odpowiedni jest tutaj każdy izolowany stymulator napięcia. Ten użyty tutaj jest pokazany na rysunku 2B.</li>
	<li>Po porażeniu prądem uruchom minutnik. W odpowiedzi na wstrząs larwy inicjują przejściowy paraliż, po którym od czasu do czasu pojawiają się skurcze aktywności mięśni ściany ciała i toczenie się, zatrzymując normalne zachowanie pełzania.</li>
	<li>Zatrzymaj stoper, gdy larwa wyraźnie odsunęła się od swojego pierwotnego umieszczenia na talerzu. Czas trwania napadu lub czas powrotu do zdrowia (RT) definiuje się jako okres między wystąpieniem bodźca a wznowieniem normalnego zachowania pełzania (np. pełnej fali perystaltycznej do przodu, która powoduje ruch do przodu).</li>
	<li>Pod koniec każdego dnia ostrożnie wyczyść przewody sondy, najpierw płucząc je w 100% etanolu, a następnie ddH2O. Dokładnie sprawdź druty w powiększeniu i, jeśli to konieczne, użyj kleszczyków, aby delikatnie zeskrobać wszelkie pozostałości z drutów. Uważaj, aby nie zmieniać przy tym odległości między dwoma przewodami.</li>
</ol>
3. Konstrukcja sondy elektrowstrząsowej
<ol>
	<li>Wymagane będą przewody elektryczne o długości 2 x 1 m (powinny być cienkie i elastyczne, tj. o natężeniu ~3 A). Do końca każdego przewodu drut wolframowy o długości 5 cm (aby zmaksymalizować kontakt, przed nawiń drut wolframowy wokół odsłoniętego końca przewodu elektrycznego). złącza wtykowe (np. wtyki bananowe) do drugiego końca przewodów, odpowiednie do łatwego podłączenia do stymulatora napięcia.</li>
	<li>Przymocuj oba druty wolframowe do uchwytu elektrody tak, aby druty były równoległe do siebie (Rysunek 2). Małe odcinki szklanych kapilar (~2 cm długości) służą do utrzymywania przewodów na miejscu pod śrubą blokującą sondę.</li>
	<li>Użyj kleszczyków, aby zgiąć druty tak, aby znalazły się na odległość 1-2 mm blisko miejsca, w którym wychodzą z uchwytu drutu. Gięcie drutów wolframowych nie jest łatwe, ponieważ druty zachowują "pamięć" - dlatego wymagana jest wytrwałość. Wskazówki, które pomogą w tym procesie, obejmują użycie taśmy elektroizolacyjnej i/lub kleju (lub podobnej szpachli modelarskiej), aby pomóc utrzymać przewody we właściwej orientacji/odległości.</li>
</ol>
4. Kalibracja sondy
<ol>
	<li>Należy upewnić się, że istnieją stada wędrujących L3 odpowiedniego typu dzikiego (kontrola ujemna) i mutanta napadowego (kontrola pozytywna). Potrzebne będzie ~100 sztuk każdego z nich.</li>
	<li>Przygotuj larwy, pojedynczo, jak opisano powyżej.</li>
	<li>Użyj sondy, aby przyłożyć zakres napięć do wystarczającej liczby larw każdego genotypu dla każdego badanego napięcia. Sugeruje się, że 0 V, 2 V, 4 V, 6 V, 8 V, 10 V i 12 V należy stosować przez 2 sekundy między 10-15 larwami na napięcie. Poraż każdą larwę tylko raz.</li>
	<li>Zmierz czas rekonwalescencji dla każdej larwy i oblicz średnią dla każdego kroku napięcia zastosowanego dla obu genotypów.</li>
	<li>Wykreśl średnie na wykresie i dopasuj dane do linii prostej.</li>
	<li>Wybierz napięcie z wyraźną i znaczącą różnicą między mutantem kontrolnym a mutantem napadowym. Uważaj, aby nie wybrać napięcia, które powoduje zbyt długi czas regeneracji; W przeciwnym razie produktywność ucierpi z powodu długiego czasu oczekiwania na powrót do zdrowia. UWAGA: W tym badaniu często stosowano napięcie stymulacji, które skutkuje czasem regeneracji wynoszącym 50-100 s dla typu dzikiego i 200-300 s dla parabss. Przykładowe krzywe kalibracyjne przedstawiono na rysunku 3. Ważne jest, aby użyć 0 V, aby uwzględnić czynność dociskania sondy do grzbietowej powierzchni larwy. Spowoduje to pewien stopień paraliżu, który prawdopodobnie jest mechanizmem obronnym larwy.</li>
</ol>
5. Przeprowadzanie eksperymentów
<ol>
	<li>Poddać się elektrowstrząsowi, larwom o pożądanym genotypie (genotypach) lub ekspozycji na lek i zmierzyć czas rekonwalescencji po napadzie. UWAGA: W przypadku larw badanych n = 20 jest zwykle wystarczające, ale obliczenie mocy oparte na analizie pilotażowej zapewni bardziej ostateczną liczbę n.</li>
	<li>Zawsze przeprowadzaj negatywną (np. dziką typ) i pozytywną ( np. parabss) kontrolę podczas każdego eksperymentu. Liczby n nie muszą być wysokie; n = 5 jest wystarczające. Zapewni to pewność, że test zadziałał zgodnie z oczekiwaniami (np. nie ma problemów z sondą lub stymulatorem).</li>
	<li>Zastosuj granicę (np. 300 s), aby uniknąć zbyt długiego czasu rekonwalescencji i uwzględniaj tylko napady ilościowe jako te, których czas powrotu do zdrowia przekracza 30 s.</li>
</ol>
6. Badania przesiewowe na obecność narkotyków
<ol>
	<li>Dodać leki rozpuszczone w odpowiednim rozpuszczalniku bezpośrednio na powierzchnię żywności i pozostawić do wchłonięcia (a w przypadku stosowania etanolu czas na odparowanie rozpuszczalnika). Lub, alternatywnie, można dodać lek (w odpowiednim rozpuszczalniku) do stopionego pokarmu dla much. Szczegółowe informacje można znaleźć w sekcji Wyniki.</li>
	<li>Aby dodać lek do stopionego pokarmu, należy wyjąć pokarm z fiolek, ponownie stopić, a gdy żywność ostygnie do 40 °C, dodać lek, wymieszać za pomocą mieszalnika wirowego, a następnie ponownie wlać 5 ml stopionego pokarmu z powrotem do fiolek i pozostawić do ostygnięcia przed użyciem.</li>
	<li>Uruchom gradient stężeń, aby określić optymalne stężenie leku. UWAGA: Dobrym punktem wyjścia jest dodanie 3 mM roztworu leku bezpośrednio na powierzchnię żywności (200 μL na standardową fiolkę Drosophila ) lub uzyskanie stężenia 3 mM w stopionej żywności. Dorosłe samice mogą składać jaja bezpośrednio w tym pokarmie lub larwy mogą być dodawane na wybranych etapach, w zależności od potrzeb. Użyty rozpuszczalnik(-i) musi być dodawany samodzielnie do wybranych fiolek jako kontrola(-e) nośnika(-ów).</li>
</ol>

<ol><li>Fiest, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prevalence+and+incidence+of+epilepsy%3A+A+systematic+review+and+meta-analysis+of+international+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Neurology%22%5BJournal%5D)">Prevalence and incidence of epilepsy: A systematic review and meta-analysis of international studies.</a> Neurology. 88 (3), 296-303 (2017).</li>
<li>Knezevic, C. E., Marzinke, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+use+and+monitoring+of+antiepileptic+drugs%5BTitle%5D)+AND+%22J+Appl+Lab+Med%22%5BJournal%5D)">Clinical use and monitoring of antiepileptic drugs.</a> J Appl Lab Med. 3 (1), 115-127 (2018).</li>
<li>Denton, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Definitions+and+risk+factors+for+drug-resistant+epilepsy+in+an+adult+cohort%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Neurol%22%5BJournal%5D)">Definitions and risk factors for drug-resistant epilepsy in an adult cohort.</a> Front Neurol. 12, 777888(2021).</li>
<li>Meldrum, B. S., Rogawski, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+targets+for+antiepileptic+drug+development%5BTitle%5D)+AND+%22Neurotherapeutics%22%5BJournal%5D)">Molecular targets for antiepileptic drug development.</a> Neurotherapeutics. 4 (1), 18-61 (2007).</li>
<li>Sanchez, J. D., Gomez-Carpintero, J., Gonzalez, J. F., Menendez, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Twenty-first+century+antiepileptic+drugs%3A+An+overview+of+their+targets+and+synthetic+approaches%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Med+Chem%22%5BJournal%5D)">Twenty-first century antiepileptic drugs: An overview of their targets and synthetic approaches.</a> Eur J Med Chem. 272, 116476(2024).</li>
<li>Cunliffe, V. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epilepsy+research+methods+update%3A+Understanding+the+causes+of+epileptic+seizures+and+identifying+new+treatments+using+non-mammalian+model+organisms%5BTitle%5D)+AND+%22Seizure%22%5BJournal%5D)">Epilepsy research methods update: Understanding the causes of epileptic seizures and identifying new treatments using non-mammalian model organisms.</a> Seizure. 24, 44-51 (2015).</li>
<li>Baines, R. A., Giachello, C. N. G., Lin, W. H. Drosophila. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBaines%2C+RA+%22In+Models+of+seizures+and+epilepsy.%C2%A0%282nd+ed.%29%22">In Models of seizures and epilepsy. (2nd ed.)</a>. , 345-358 (2017).</li>
<li>Burrows, D. R. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+epilepsy+in+larval+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Paediatr+Neurol%22%5BJournal%5D)">Imaging epilepsy in larval zebrafish.</a> Eur J Paediatr Neurol. 24, 70-80 (2020).</li>
<li>Reynolds, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Treatment+with+the+antiepileptic+drugs+phenytoin+and+gabapentin+ameliorates+seizure+and+paralysis+of+Drosophila+bang-sensitive+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Treatment with the antiepileptic drugs phenytoin and gabapentin ameliorates seizure and paralysis of Drosophila bang-sensitive mutants.</a> J Neurobiol. 58 (4), 503-513 (2004).</li>
<li>Baraban, S. C., Dinday, M. T., Hortopan, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drug+screening+in+SCN1A+zebrafish+mutant+identifies+clemizole+as+a+potential+Dravet+syndrome+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Drug screening in SCN1A zebrafish mutant identifies clemizole as a potential Dravet syndrome treatment.</a> Nat Commun. 4, 2410(2013).</li>
<li>Scheffer, L. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+connectome+and+analysis+of+the+adult+Drosophila+central+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">A connectome and analysis of the adult Drosophila central brain.</a> Elife. 9, e57443(2020).</li>
<li>Winding, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+connectome+of+an+insect+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The connectome of an insect brain.</a> Science. 379 (6636), eadd9330(2023).</li>
<li>Ganetzky, B., Wu, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+mutants+with+opposing+effects+on+nerve+excitability%3A+Genetic+and+spatial+interactions+in+repetitive+firing%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Drosophila mutants with opposing effects on nerve excitability: Genetic and spatial interactions in repetitive firing.</a> J Neurophysiol. 47 (3), 501-514 (1982).</li>
<li>Song, J., Tanouye, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+bench+to+drug%3A+Human+seizure+modeling+using+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">From bench to drug: Human seizure modeling using Drosophila.</a> Prog Neurobiol. 84 (2), 182-191 (2008).</li>
<li>Parker, L., Howlett, I. C., Rusan, Z. M., Tanouye, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Seizure+and+epilepsy%3A+Studies+of+seizure+disorders+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Int+Rev+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Seizure and epilepsy: Studies of seizure disorders in Drosophila.</a> Int Rev Neurobiol. 99, 1-21 (2011).</li>
<li>Parker, L., Padilla, M., Du, Y., Dong, K., Tanouye, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+as+a+model+for+epilepsy%3A+BSS+is+a+gain-of-function+mutation+in+the+para+sodium+channel+gene+that+leads+to+seizures%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Drosophila as a model for epilepsy: BSS is a gain-of-function mutation in the para sodium channel gene that leads to seizures.</a> Genetics. 187 (2), 523-534 (2011).</li>
<li>Schutte, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Knock-in+model+of+Dravet+syndrome+reveals+a+constitutive+and+conditional+reduction+in+sodium+current%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Knock-in model of Dravet syndrome reveals a constitutive and conditional reduction in sodium current.</a> J Neurophysiol. 112 (4), 903-912 (2014).</li>
<li>Das, A., Smith, M. A., O'Dowd, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+behavioral+screen+for+heat-induced+seizures+in+mouse+models+of+epilepsy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">A behavioral screen for heat-induced seizures in mouse models of epilepsy.</a> J Vis Exp. (173), e62846(2021).</li>
<li>Baines, R. A., Bate, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophysiological+development+of+central+neurons+in+the+Drosophila+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Electrophysiological development of central neurons in the Drosophila embryo.</a> J Neurosci. 18 (12), 4673-4683 (1998).</li>
<li>Mituzaite, J., Petersen, R., Claridge-Chang, A., Baines, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+seizure+induction+methods+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22eNeuro%22%5BJournal%5D)">Characterization of seizure induction methods in Drosophila.</a> eNeuro. 8 (4), (2021).</li>
<li>Pavlidis, P., Ramaswami, M., Tanouye, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Drosophila+easily+shocked+gene%3A+A+mutation+in+a+phospholipid+synthetic+pathway+causes+seizure%2C+neuronal+failure%2C+and+paralysis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The Drosophila easily shocked gene: A mutation in a phospholipid synthetic pathway causes seizure, neuronal failure, and paralysis.</a> Cell. 79 (1), 23-33 (1994).</li>
<li>Horne, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((julius+seizure%2C+a+Drosophila+mutant%2C+defines+a+neuronal+population+underlying+epileptogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">julius seizure, a Drosophila mutant, defines a neuronal population underlying epileptogenesis.</a> Genetics. 205 (3), 1261-1269 (2017).</li>
<li>Menezes, L. F. S., Sabia Junior, E. F., Tibery, D. V., Carneiro, L. D. A., Schwartz, E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epilepsy-related+voltage-gated+sodium+channelopathies%3A+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Epilepsy-related voltage-gated sodium channelopathies: A review.</a> Front Pharmacol. 11, 1276(2020).</li>
<li>Kuebler, D., Tanouye, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anticonvulsant+valproate+reduces+seizure-susceptibility+in+mutant+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Anticonvulsant valproate reduces seizure-susceptibility in mutant Drosophila.</a> Brain Res. 958 (1), 3642(2002).</li>
<li>Marley, R., Baines, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+persistent+Na%2B+current+contributes+to+seizure+in+the+slamdance+bang-sensitive+Drosophila+mutant%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Increased persistent Na+ current contributes to seizure in the slamdance bang-sensitive Drosophila mutant.</a> J Neurophysiol. 106 (1), 18-29 (2011).</li>
<li>Lin, W. H., Giachello, C. N., Baines, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Seizure+control+through+genetic+and+pharmacological+manipulation+of+Pumilio+in+Drosophila%3A+A+key+component+of+neuronal+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Dis+Model+Mech%22%5BJournal%5D)">Seizure control through genetic and pharmacological manipulation of Pumilio in Drosophila: A key component of neuronal homeostasis.</a> Dis Model Mech. 10 (2), 141-150 (2017).</li>
<li>Mulroe, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+firing+rate+neuronal+homeostasis+can+prevent+seizures%5BTitle%5D)+AND+%22Dis+Model+Mech%22%5BJournal%5D)">Targeting firing rate neuronal homeostasis can prevent seizures.</a> Dis Model Mech. 15 (10), dmm049703(2022).</li>
<li>Saras, A., Wu, V. V., Brawer, H. J., Tanouye, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigation+of+seizure-susceptibility+in+a+Drosophila+melanogaster+model+of+human+epilepsy+with+optogenetic+stimulation%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Investigation of seizure-susceptibility in a Drosophila melanogaster model of human epilepsy with optogenetic stimulation.</a> Genetics. 206 (4), 1739-1746 (2017).</li>
<li>Giachello, C. N., Baines, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inappropriate+neural+activity+during+a+sensitive+period+in+embryogenesis+results+in+persistent+seizure-like+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Inappropriate neural activity during a sensitive period in embryogenesis results in persistent seizure-like behavior.</a> Curr Biol. 25, 1-5 (2015).</li>
<li>Baraban, S. C., Taylor, M. R., Castro, P. A., Baier, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pentylenetetrazole-induced+changes+in+zebrafish+behavior%2C+neural+activity+and+c-fos+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Pentylenetetrazole-induced changes in zebrafish behavior, neural activity and c-fos expression.</a> Neuroscience. 131 (3), 759-768 (2005).</li>
<li>Gauthier, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((State+of+the+art+on+insect+nicotinic+acetylcholine+receptor+function+in+learning+and+memory%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Exp+Med+Biol%22%5BJournal%5D)">State of the art on insect nicotinic acetylcholine receptor function in learning and memory.</a> Adv Exp Med Biol. 683, 97-115 (2010).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów.

Metoda elektrowstrząsów w celu wywołania napadu padaczkowego u larw Drosophila zapewnia proste, ale skuteczne badanie przesiewowe do identyfikacji nowych związków przeciwpadaczkowych lub manipulacji genetycznych. Ponieważ jednak jest to test jakościowy, jego głównym ograniczeniem jest to, że metoda nie może łatwo zidentyfikować małych rozmiarów efektu. Niemniej jednak, średnia przepustowość, na którą pozwala, nadająca się do badania przesiewowego do ~ 5 związków tygodniowo na badacza, zapewnia bardzo potężny tes...

Padaczka pozostaje poważnym obciążeniem zdrowotnym, dotykającym około 1% populacji na całym świecie. Mimo że obecnie istnieje ponad 30 leków przeciwpadaczkowych (ASM) stosowanych w leczeniu klinicznym, około jedna trzecia osób z padaczką nadal reaguje na leki, co oznacza, że nie reagują dobrze na leczenie farmakologiczne 1,2. Dostępne leki są również wyłącznie paliatywne i jako takie nie zapobiegają epileptogenezie ani nie zapewniają wyleczenia3. W związku z tym istnieje pilna potrzeba zidentyfikowania lepszych metod leczenia padaczki. Przeszkodą na drodze do opracowania skuteczniejszych metod leczenia jest identyfikacja nowych celów terapeutycznych. Rzeczywiście, prawie wszystkie obecne ASM wpływają na podobne cele: kanały jonowe, w tym kanał sodowy bramkowany napięciem (Nav) i hamujące neuroprzekaźnictwo, w którym pośredniczy kwas γ-aminomasłowy (GABA)4,5. Powszechnie przyjmuje się, że dalsze stosowanie tradycyjnych metod opracowywania leków prawdopodobnie nie zmieni radykalnie tego scenariusza.
Modele laboratoryjne, w tym między innymi muszka owocowa Drosophila melanogaster i danio pręgowany Danio rerio, mają użyteczność w identyfikacji nowych ASM 6,7,8. Rzeczywiście, wyszukiwanie w PubMed "Drosophila + seizure" zwraca 342 wyniki, podczas gdy to samo wyszukiwanie danio pręgowanego zwraca 578 wyników (oba wyszukiwania przeprowadzono 29 stycznia 2025r.). Chociaż liczba podobnych badań na myszach jest mniejsza niż liczba podobnych badań na myszach (~15 000), liczba badań z wykorzystaniem systemów modelowych nadal rośnie. Badania te są możliwe dzięki mechanistycznemu zachowaniu funkcji OUN w całej gromadzie. Co więcej, indukowane napady padaczkowe u much i ryb są skutecznie leczone klinicznie stosowanymi ASM, co pokazuje, że chociaż niuanse zachowania napadowego mogą wydawać się pozornie różne, mechanizmy leżące u ich podstaw mają wiele wspólnego 7,9,10.
Muszka owocowa, Drosophila, wniosła wiele znaczącego wkładu w zrozumienie biologii człowieka. Jeśli chodzi o padaczkę, ten model systemu zapewnia niezrównany zestaw narzędzi genetycznych w połączeniu z identyfikowalnymi i eksperymentalnie dostępnymi neuronami7. Co więcej, opublikowano konektomy zarówno dla larwalnego, jak i dorosłego OUN, a także zidentyfikowano liczne specyficzne dla komórek genetyczne linie napędowe11,12. Co istotne, przypadkowo zidentyfikowano klasę mutacji, w wyniku której dorosłe muchy reagują na silną stymulację mechaniczną utratą postawy i aktywnością podobną do napadów (np. brzęczenie skrzydeł, drżenie nóg itp.). Ta klasa mutacji została określona jako "wrażliwa na huk"13,14,15,16. Od tego czasu zidentyfikowano drugą klasę mutacji napadowych, która reaguje na podwyższoną temperaturę, odzwierciedlając drgawki gorączkoweu ludzi 17,18. Jednak doświadczalna podatność dorosłych much jest nieco zmniejszona w porównaniu ze stadium larwalnym tego samego modelu owada. Na przykład karmienie dorosłych much może być trudne, a bardziej inwazyjne techniki, takie jak elektrofizjologia i optogenetyka, mogą być trudniejsze. W przeciwieństwie do tego, larwa Drosophila je stale, aby zwiększyć objętość swojego ciała o ~100-krotnie w ciągu zaledwie 5 dni, aby umożliwić przepoczwarzenie. Dlatego możemy być pewni odpowiedniego żywienia lekami w stadiach larwalnych. Embriogeneza jest dobrze udokumentowana i może być dokładnie określona w etapach, a to z kolei pozwoliło zidentyfikować kluczowe kamienie milowe w rozwoju OUN, w tym pierwsze nabycie właściwości elektrycznych neuronów aż do powstania obwodu19. Po wykluciu larwa przechodzi przez 3 linienia (lub stadium rozwojowe), aż w 5 dniu zaczyna "wędrować", po czym opuszcza pokarm, aby znaleźć bezpieczne miejsce do przepoczwarzenia. Po ~100 h przepoczwarzenia wyłania się dorosła mucha z nowym ciałem i OUN (ryc. 1).
Techniki wywoływania napadów padaczkowych u dorosłych nie są dobrze dostosowane do stadiów larwalnych. Larwy nie mają włosków czuciowych, których zsynchronizowana aktywacja podczas stymulacji mechanicznej może prowadzić do napadu. Tak więc, aby przezwyciężyć te trudności, opracowano technikę elektrowstrząsów w celu wywołania napadów w stadium wędrujących larw. Późniejsza analiza porównawcza technik indukcji napadów zarówno u larw, jak i dorosłych ujawnia, że elektrowstrząsy larwalne są znacznie mniej zależne od typu mutacji (np. wrażliwej na huk w porównaniu z temperaturą). W związku z tym sugerujemy, że technika ta powinna być preferowaną metodą testowania nowych mutacji, w przypadku gdy optymalna metoda indukcji napadów jest nieznana20. Technika elektrowstrząsów larwalnych jest prosta, szybka i wymaga minimalnego sprzętu. Technika ta zapewnia skuteczny sposób badania przesiewowego nowych związków lub terapii genetycznych pod kątem skuteczności przeciwpadaczkowej w zakresie mutacji, które odzwierciedlają różnorodność genetyczną padaczki u ludzi.

<table><tbody><tr><td>Uchwyt elektrody</td><td>Światowe instrumenty precyzyjne&nbsp;</td><td>Zobacz materiał M3301</td><td></td></tr><tr><td>Kapilary szklane</td><td>Instrumenty Harvarda</td><td>GC100F-10</td><td></td></tr><tr><td>Drut wolframowy (99,95%)</td><td>Goodfellow Cambridge, Wielka Brytania</td><td></td><td>Średnica 0,1 mm</td></tr><tr><td>Stymulator napięcia</td><td>Digitimer Ltd, Wielka Brytania</td><td>DS2A mkII&nbsp;</td><td>Stymulator izolowany o stałym napięciu&nbsp;</td></tr></tbody></table>

aktywność napadowa wywołana elektrowstrząsami u larw drosophila

Seizure Activity Induced by Electroshock in Drosophila Larvae

Padaczka stanowi znaczne obciążenie zdrowotne, które nasila się z powodu dużej liczby osób opornych na działanie leków. Podczas gdy niektórzy pacjenci oporni na leczenie farmakologiczne reagują na leczenie niefarmakologiczne (np. stymulacja nerwu błędnego, dieta ketogeniczna itp.), ostatnią deską ratunku dla wielu jest trudna i kosztowna operacja mająca na celu złagodzenie napadów. Chociaż powszechnie uznaje się, że wymagane są leki przeciwpadaczkowe o szerszym zakresie celów, przeszkodą w osiągnięciu tego celu jest identyfikacja nowych celów terapeutycznych. Genetycznie podatne zwierzęta modelowe są obiecujące pod tym względem. Muszka owocowa, Drosophila melanogaster, stała się potężnym modelem do badania mechanistycznych podstaw i lepszych metod leczenia napadów. Wiele zidentyfikowanych mutacji much powoduje, że larwy i dorosłe osobniki wykazują aktywność podobną do napadów w odpowiedzi na silną stymulację (elektryczną, mechaniczną i/lub termiczną). Wiele z tych mutacji dotyczy genów homologicznych do tych, które przyczyniają się do padaczki genetycznej u ludzi (np. kanał Na+ bramkowany napięciem). Obecnie możliwe jest również zastąpienie genu muchy jego ludzkim odpowiednikiem, który dodatkowo niesie ze sobą mutację związaną z chorobą. W ten sposób skromna mucha stała się awatarem modelującym ludzką chorobę. W badaniu tym opisano odpowiednią metodę wykorzystania larw Drosophila do nisko- i średnioprzepustowych badań przesiewowych leków w celu identyfikacji unikalnych związków i ich celów, które mają potencjał przeciwpadaczkowy.

Liczne mutacje u Drosophila wykazują nasilone zachowania przypominające napady drgawek7,20. Podłoże genetyczne tych mutacji jest zróżnicowane, co w korzystny sposób naśladuje równie różnorodne przyczyny genetyczne epilepsji u ludzi. Trzema z najintensywniej badanych mutacji u Drosophila są parabangsenseless (parabss), julius seizure (jus) oraz easily-shocked (eas). Mutac...

Protokół ten szczegółowo opisuje zastosowanie larw Drosophila do identyfikacji unikalnych związków przeciwpadaczkowych w leczeniu padaczki.

Aktywność napadowa wywołana elektrowstrząsami u larw Drosophila

Epilepsy presents a significant health burden that is exacerbated by high numbers of individuals who are drug-refractory. Whilst some drug-refractory ...

Wykorzystujemy larwy muszki owocowej do identyfikacji nowych metod leczenia padaczki. Podobnie jak ludzie, muchy mogą być nosicielami mutacji genetycznych, które sprawiają, że są podatne na napady, a my możemy zmniejszyć nasilenie napadów u much za pomocą klinicznie stosowanych leków przeciwpadaczkowych. Głównym wyzwaniem jest pełne zrozumienie działania układu nerwowego muchy, tak abyśmy mogli mapować obszary do odpowiadających im obszarów w ludzkim mózgu.Około 1% populacji cierpi na padaczkę, a z tej liczby około 1/3 nie reaguje dobrze na obecnie stosowane leki przeciwpadaczkowe. Badamy nowe sposoby leczenia padaczki. Wykorzystanie larw much zamiast dorosłych much jest korzystne, ponieważ larwy żyją w jedzeniu, które jedzą. To sprawia, że dodawanie eksperymentalnych leków jest bardzo proste. Technika, której używamy do wywoływania napadów, jest również prosta, ale skuteczna.Zidentyfikowaliśmy kilka potencjalnych leków, które mają silne działanie przeciwpadaczkowe. Skupimy się teraz na zrozumieniu, jak działają te leki i przetestowaniu, czy są one bezpieczne do stosowania u ssaków.[Instruktor] Aby rozpocząć, skonstruuj sondę elektrowstrząsową do zabiegu. Upewnij się, że dostępne są łodygi około 100 wędrujących larw trzeciego stadium rozwojowego zarówno ze szczepu kontrolnego typu dzikiego, jak i szczepu zmutowanego napadowo. Usuń pojedynczą wędrującą larwę trzeciego stadium z fiolki i umieść ją na małej plastikowej szalce Petriego. Za pomocą małego pędzla delikatnie umyj larwy podwójnie destylowaną wodą, aby usunąć wszelkie resztki jedzenia. Teraz przenieś umyte larwy do pustego plastikowego naczynia. Za pomocą kleszczy przytrzymaj mały fragment ręcznika papierowego i delikatnie osusz larwy. Usuń nadmiar wody bez całkowitego wysuszenia larw, aby zapobiec przywieraniu do naczynia. Pozwól larwie dojść do siebie przez 30 sekund, aby zapewnić łatwą obsługę podczas umieszczania sondy. Następnie obejrzyj larwę pod mikroskopem preparacyjnym w powiększeniu od 15 do 20 razy. Gdy larwa wznowi normalne raczkowanie, delikatnie umieść sondę elektrowstrząsową na przedniej powierzchni grzbietowej powyżej ośrodkowego układu nerwowego. Zastosuj wystarczający nacisk, aby ścisnąć larwę do około jednej trzeciej do połowy jej głębokości, aby zapewnić odpowiednią przewodność bez powodowania uszkodzeń. Zastosować dwusekundowy impuls o stałym napięciu za pomocą izolowanego stymulatora napięcia, którego intensywność została wcześniej skalibrowana za pomocą krzywej miareczkowania. Natychmiast uruchom timer, gdy tylko zostanie dostarczony wstrząs. Obserwuj larwę pod kątem oznak przejściowego paraliżu, skurczów lub toczenia się. Zatrzymaj stoper, gdy larwa wyraźnie odsunie się od swojej pierwotnej pozycji, wskazując na powrót do zdrowia poprzez ruch perystaltyczny do przodu. Następnie najpierw przepłucz przewody sondy 100% etanolem, a następnie wodą podwójnie destylowaną. Po sprawdzeniu drutów w powiększeniu, delikatnie zeskrob wszelkie pozostałości za pomocą kleszczy bez zmiany odstępów między drutami. Użyj sondy, aby dostarczyć dwusekundowy impuls o różnym napięciu do około 15 larw na napięcie dla każdego genotypu. Poraż każdą larwę tylko raz. Zmierz czas rekonwalescencji dla każdej larwy i oblicz średni czas regeneracji dla każdego napięcia w różnych genotypach. Wykreśl średni czas odzyskiwania na wykresie i dopasuj linię prostą do danych. Wybierz napięcie, które pokazuje wyraźną i znaczącą różnicę w czasie rekonwalescencji między larwami zmutowanymi typu dzikiego a zmutowanymi larwami napadowymi. Upewnij się, że wybrane napięcie nie powoduje długotrwałego odzyskiwania, które mogłoby utrudnić przepustowość. W celu przygotowania leku należy dodać leki rozpuszczone w odpowiednim rozpuszczalniku bezpośrednio na powierzchnię stałego pokarmu dla much i odczekać, aż wsiąknie i odparuje. Alternatywnie, zgarnij jedzenie z fiolek i rozpuść je ponownie. Gdy temperatura spadnie do 40 stopni Celsjusza, dodaj roztwór leku i dokładnie wymieszaj za pomocą miksera wirowego. Wlej około pięciu mililitrów poddanego działaniu środka spożywczego z powrotem do fiolek i pozwól mu zastygnąć przed użyciem. Uruchom gradient stężeń, testując zakres stężeń leku, aby określić optymalną dawkę. Zastosować elektrowstrząsy do larw badanego genotypu lub narażonych na działanie leku i zmierzyć czas powrotu do zdrowia po napadzie. Zastosuj czas odcięcia wynoszący 300 sekund, aby wyeliminować zbyt długi czas trwania odzyskiwania. Rejestruj tylko napady, w których czas powrotu do zdrowia jest dłuższy niż 30 sekund, jako wymierny. Sonda została skalibrowana i z pasowań liniowych wynikało, że mutant wykazywał zwiększony czas odzyskiwania po napadach przy wszystkich napięciach w porównaniu z typem dzikim. Czas rekonwalescencji po napadzie różnił się znacznie w zależności od genotypu przełyku, przy czym parabang bezsensowny wykazywał najdłuższy czas rekonwalescencji, a napad Julius najkrótszy wśród mutantów. Leczenie walproinianem sodu i fenytoiną znacznie skróciło czas powrotu do zdrowia po napadach u bezsensownego mutanta parabang w porównaniu z grupą kontrolną w pojeździe.

seizure-activity-induced-by-electroshock-in-drosophila-larvae

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

W niniejszej pracy opisujemy metody elektrofizjologiczne służące do pomiaru przekaźnictwa synaptycznego w złączu nerwowo-mięśniowym larwy Drosophila. Uwalnianie wywołane inicjuje się sztucznie poprzez stymulację aksonów neuronów ruchowych, a przekaźnictwo w złączu NMJ można zmierzyć na podstawie odpowiedzi postsynaptycznej wywołanej w mięśniu.

Metody elektrofizjologiczne rejestracji potencjałów synaptycznych z złącza nerwowo-mięśniowego larw Drosophila

Za pomocą elektrycznej stymulacji o wysokiej częstotliwości w organizmach Drosophila można wywołać aktywność przypominającą napady drgawkowe. Aktywność ta jest łatwo rejestrowana z systemu włókien olbrzymich.

Analizy obwodów neuronowych w celu badania napadów u mutantów Drosophila z epilepsją

W niniejszej procedurze wykorzystano aktywowany niebieskim światłem kanał glonowy oraz narzędzia do specyficznej dla komórek ekspresji genetycznej w celu wywołania potencjałów synaptycznych za pomocą impulsów świetlnych w złączu nerwowo-mięśniowym (NMJ) u larw Drosophila. Technika ta stanowi niedrogą i łatwą w użyciu alternatywę dla stymulacji elektrodami ssącymi w badaniach nad fizjologią synaptyczną w laboratoriach badawczych i dydaktycznych.

Stymulacja potencjałów synaptycznych w złączach nerwowo-mięśniowych Drosophila za pośrednictwem kanalorodopsyny 2

Rejestracje elektrofizjologiczne z embrionów Drosophila umożliwiają analizę właściwości elektrycznych rozwijających się mięśni i neuronów, a także charakterystykę funkcjonalnej synaptogenezy w glutaminergicznych złączach neuromięśniowych oraz w centralnych synapsach cholinergicznych i GABAergicznych.

Rejestracja elektrofizjologiczna w zarodku Drosophila

Wideo demonstruje zewnątrzkomórkowy zapis aktywności neuronalnej z ośrodkowego układu nerwowego (OUN) larw Drosophila. Przecięty OUN jest umieszczany w komorze rejestracyjnej, a aktywność elektryczna z nerwu zstępującego jest rejestrowana w celu ustalenia podstawowej częstotliwości wypalania. Następnie wprowadza się czynnik testowy i rejestruje się zmianę częstotliwości wypalania w celu określenia działania pobudzającego lub hamującego czynnika.

Zewnątrzkomórkowy zapis aktywności elektrycznej w ośrodkowym układzie nerwowym Drosophila

Opisana jest prosta metoda rejestrowania potencjałów pola zewnątrzkomórkowego w przodomózgowiu larwy danio pręgowanego. Metoda ta zapewnia solidny odczyt in vivo aktywności podobnej do napadowej. Technika ta może być stosowana w przypadku genetycznie zmodyfikowanych larw danio pręgowanego będących nosicielami genów związanych z padaczką lub napadów wywołanych podawaniem leków przeciwdrgawkowych.

Zapis elektrofizjologiczny przodomózgowia u larw danio pręgowanego

Opisano metodę pomiaru pamięci asocjacyjnej dorosłego Drosophila. Test opiera się na zdolności muchy do kojarzenia prezentowanego zapachu z negatywnym wzmacniaczem (porażeniem prądem), a następnie przywoływania tych informacji w późniejszym czasie, co pozwala na pomiar pamięci.

Drosophila Uczenie się szoku węchowego u dorosłych

Korzystając z kamery internetowej oraz kombinacji darmowych i niedrogich programów, wzorce lokomotyw u Drosophila melanogaster mogą być analizowane w celu wykrycia różnic w prędkości, odległości i czasie różnych aktywności motorycznych.

Tania metoda analizy aktywności i ruchu podobnego do napadów u Drosophila

Ten protokół opisuje metodę rejestrowania malejącej aktywności elektrycznej ośrodkowego układu nerwowego Drosophila melanogaster, aby umożliwić ekonomiczne i wygodne testowanie środków farmakologicznych, mutacji genetycznych białek nerwowych i/lub roli niezbadanych ścieżek fizjologicznych.

Elektrofizjologiczny zapis aktywności ośrodkowego układu nerwowego Drosophila melanogaster w trzecim stadium rozwojowym

Tutaj prezentujemy protokół rozwoju i charakterystyki epilepsji u danio pręgowanego, wynikającej z przejściowego zahamowania genu DEPDC5.

Analiza behawioralna i fizjologiczna w modelu padaczki danio pręgowanego

Tutaj prezentujemy protokół obrazowania ex vivo wapnia u dorosłych Drosophila wykazujących ekspresję GCaMP6 w celu monitorowania aktywności epileptiformalnej. Protokół stanowi cenne narzędzie do badania zdarzeń moczowych u dorosłych Drosophila poprzez obrazowanie wapnia ex vivo, co pozwala na zbadanie potencjalnych mechanizmów padaczki na poziomie komórkowym.

Ex vivo Obrazowanie wapnia w modelu padaczki Drosophila

Poznaj metodę identyfikacji nowych związków przeciwpadaczkowych przy użyciu larw Drosophila. To podejście pozwala badać mechanizmy napadów i oceniać potencjalne terapie w leczeniu epilepsji.

Aktywność napadowa wywołana elektrowstrząsami u larw Drosophila

Przeglądaj więcej filmów