Name: Pomiar cyklicznego monofosforanu guanozyny (cGMP) w tkankach stałych przy użyciu konkurencyjnego testu immunoenzymatycznego (ELISA) (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-07-03T13:25:00.000+00:00
Duration: 7 min 15 s
Description: Naucz się mierzyć stężenie cyklicznego monofosforanu guanozyny (cGMP) w tkankach stałych przy użyciu konkurencyjnego testu ELISA. Ta metoda pozwala badać metabolizm tlenku azotu i jego wpływ na funkcje fizjologiczne.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Praca ta była wspierana przez grant 1ZIADK025104-18 przyznany Alanowi N. Schechterowi przez NIDDK/NIH.

<ol><li>Dierks, E. A., Burstyn, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nitric+oxide+%28NO%29%2C+the+only+nitrogen+monoxide+redox+form+capable+of+activating+soluble+guanylyl+cyclase%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Nitric oxide (NO), the only nitrogen monoxide redox form capable of activating soluble guanylyl cyclase.</a> Biochem Pharmacol. 51 (12), 1593-1600 (1996).</li>
<li>Koglin, M., Behrends, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+functional+domain+of+the+alpha1+subunit+of+soluble+guanylyl+cyclase+is+necessary+for+activation+of+the+enzyme+by+nitric+oxide+and+YC-1+but+is+not+involved+in+heme+binding%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">A functional domain of the alpha1 subunit of soluble guanylyl cyclase is necessary for activation of the enzyme by nitric oxide and YC-1 but is not involved in heme binding.</a> J Biol Chem. 278 (14), 12590-12597 (2003).</li>
<li>Olson, L. J., Knych, E. T., Herzig, T. C., Drewett, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+guanylyl+cyclase+inhibitor+reverses+nitric+oxide-induced+vasorelaxation%5BTitle%5D)+AND+%22Hypertension%22%5BJournal%5D)">Selective guanylyl cyclase inhibitor reverses nitric oxide-induced vasorelaxation.</a> Hypertension. 29 (1), 254-261 (1997).</li>
<li>Bailey, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dietary+nitrate+supplementation+reduces+the+O2+cost+of+low-intensity+exercise+and+enhances+tolerance+to+high-intensity+exercise+in+humans%5BTitle%5D)+AND+%22J+Appl+Physiol+%281985%29%22%5BJournal%5D)">Dietary nitrate supplementation reduces the O2 cost of low-intensity exercise and enhances tolerance to high-intensity exercise in humans.</a> J Appl Physiol (1985). 107 (4), 1144-1155 (2009).</li>
<li>Vanhatalo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acute+and+chronic+effects+of+dietary+nitrate+supplementation+on+blood+pressure+and+the+physiological+responses+to+moderate-intensity+and+incremental+exercise%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Regul+Integr+Comp+Physiol%22%5BJournal%5D)">Acute and chronic effects of dietary nitrate supplementation on blood pressure and the physiological responses to moderate-intensity and incremental exercise.</a> Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 299 (4), R1121-R1131 (2010).</li>
<li>Qin, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Balancing+role+of+nitric+oxide+in+complement-mediated+activation+of+platelets+from+mcd59a+and+mcd59b+double-knockout+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Hematol%22%5BJournal%5D)">Balancing role of nitric oxide in complement-mediated activation of platelets from mcd59a and mcd59b double-knockout mice.</a> Am J Hematol. 84 (4), 221-227 (2009).</li>
<li>Radomski, M. W., Palmer, R. M., Moncada, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+l-arginine%2Fnitric+oxide+pathway+present+in+human+platelets+regulates+aggregation%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">An l-arginine/nitric oxide pathway present in human platelets regulates aggregation.</a> PNAS. 87 (13), 5193-5197 (1990).</li>
<li>Thomas, D. D., Liu, X., Kantrow, S. P., Lancaster, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+biological+lifetime+of+nitric+oxide%3A+Implications+for+the+perivascular+dynamics+of+NO+and+O2%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">The biological lifetime of nitric oxide: Implications for the perivascular dynamics of NO and O2.</a> PNAS. 98 (1), 355-360 (2001).</li>
<li>Park, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+rat+skeletal+muscle+homogenates+for+nitrate+and+nitrite+measurements%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Preparation of rat skeletal muscle homogenates for nitrate and nitrite measurements.</a> J Vis Exp. (173), e62427(2021).</li>
<li>Park, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potential+roles+of+nitrate+and+nitrite+in+nitric+oxide+metabolism+in+the+eye%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Potential roles of nitrate and nitrite in nitric oxide metabolism in the eye.</a> Sci Rep. 10 (1), 13166(2020).</li>
<li>Srihirun, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nitrate+uptake+and+metabolism+in+human+skeletal+muscle+cell+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Nitric+Oxide%22%5BJournal%5D)">Nitrate uptake and metabolism in human skeletal muscle cell cultures.</a> Nitric Oxide. 94, 1-8 (2020).</li>
<li>Montoliu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlation+of+nitric+oxide+and+atrial+natriuretic+peptide+changes+with+altered+cGMP+homeostasis+in+liver+cirrhosis%5BTitle%5D)+AND+%22Liver+Int%22%5BJournal%5D)">Correlation of nitric oxide and atrial natriuretic peptide changes with altered cGMP homeostasis in liver cirrhosis.</a> Liver Int. 25, 787-795 (2005).</li>
<li>Origlia, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Platelet+cGMP+inversely+correlates+with+age+in+healthy+subjects%5BTitle%5D)+AND+%22J+Endocrinol+Invest%22%5BJournal%5D)">Platelet cGMP inversely correlates with age in healthy subjects.</a> J Endocrinol Invest. 27 (2), RC1-RC4 (2004).</li>
<li>Calamera, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fret-based+cyclic+GMP+biosensors+measure+low+cGMP+concentrations+in+cardiomyocytes+and+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Commun+Biol%22%5BJournal%5D)">Fret-based cyclic GMP biosensors measure low cGMP concentrations in cardiomyocytes and neurons.</a> Commun Biol. 2, 394(2019).</li>
<li>Rutkowski, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+imaging+of+cGMP+signaling+shows+pronounced+differences+between+glomerular+endothelial+cells+and+podocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Real-time imaging of cGMP signaling shows pronounced differences between glomerular endothelial cells and podocytes.</a> Sci Rep. 14, 26099(2024).</li>
<li>Straub, A. C., Beuve, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+primer+for+measuring+cGMP+signaling+and+cGMP-mediated+vascular+relaxation%5BTitle%5D)+AND+%22Nitric+Oxide%22%5BJournal%5D)">A primer for measuring cGMP signaling and cGMP-mediated vascular relaxation.</a> Nitric Oxide. 117, 40-45 (2021).</li>
<li>Huang, K. T., Lin, T. J., Hsu, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+cyclic+GMP+concentration+using+a+gold+nanoparticle-modified+optical+fiber%5BTitle%5D)+AND+%22Biosens+Bioelectron%22%5BJournal%5D)">Determination of cyclic GMP concentration using a gold nanoparticle-modified optical fiber.</a> Biosens Bioelectron. 26 (1), 11-15 (2010).</li>
<li>Cyclic gmp elisa kit. , 
 <a target="_blank" href="https://cdn.caymanchem.com/cdn/seawolf/insert/581021.pdf">https://cdn.caymanchem.com/cdn/seawolf/insert/581021.pdf</a> (2024).</li>
<li>Park, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dietary+nitrate+metabolism+in+porcine+ocular+tissues+determined+using+15N-labeled+sodium+nitrate+supplementation%5BTitle%5D)+AND+%22Nutrients%22%5BJournal%5D)">Dietary nitrate metabolism in porcine ocular tissues determined using 15N-labeled sodium nitrate supplementation.</a> Nutrients. 16 (8), 1154(2024).</li>
<li>Cgmp enzyme immunoassay kit, direct technical bulletin. , 
 <a target="_blank" href="https://www.sigmaaldrich.com/deepweb/assets/sigmaaldrich/product/documents/289/571/cg200bul.pdf?srsltid=AfmBOoqWnOVurQ549ESXk_E7DJoqNs7v268ktTabHHYc6I_6NZkc-j_V">https://www.sigmaaldrich.com/deepweb/assets/sigmaaldrich/product/documents/289/571/cg200bul.pdf?srsltid=AfmBOoqWnOVurQ549ESXk_E7DJoqNs7v268ktTabHHYc6I_6NZkc-j_V</a> (2025).</li>
<li>Cyclic gmp competitive elisa lysate and homogenate samples. , 
 <a target="_blank" href="https://assets.thermofisher.com/TFS Assets/LSG/certificate/Certificates%20of%20Analysis/RA229061_EMSCGMPL.pdf">https://assets.thermofisher.com/TFS Assets/LSG/certificate/Certificates%20of%20Analysis/RA229061_EMSCGMPL.pdf</a> (2025).</li>
<li>Hamad, A. M., Range, S., Holland, E., Knox, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+cGMP+by+soluble+and+particulate+guanylyl+cyclases+in+cultured+human+airway+smooth+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Regulation of cGMP by soluble and particulate guanylyl cyclases in cultured human airway smooth muscle.</a> Am J Physiol. 273 (4), L807-L813 (1997).</li>
<li>Mo, E., Amin, H., Bianco, I. H., Garthwaite, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetics+of+a+cellular+nitric+oxide%2FcGMP%2Fphosphodiesterase-5+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Kinetics of a cellular nitric oxide/cGMP/phosphodiesterase-5 pathway.</a> J Biol Chem. 279 (25), 26149-26158 (2004).</li>
<li>Corbin, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%5B3h%5Dsildenafil+binding+to+phosphodiesterase-5+is+specific%2C+kinetically+heterogeneous%2C+and+stimulated+by+cGMP%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">[3h]sildenafil binding to phosphodiesterase-5 is specific, kinetically heterogeneous, and stimulated by cGMP.</a> Mol Pharmacol. 63 (6), 1364-1372 (2003).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konfliktu interesów.

Protokół zawiera instrukcje dotyczące kroków wymaganych do pomiaru stężeń cGMP w tkankach stałych przy użyciu konkurencyjnego testu ELISA. Różnice w stężeniach cGMP mogą wskazywać na różnice w obfitości NO w tkankach. Badając te różnice w tkankach stałych, można uzyskać informacje na temat NO w różnych narządach.
W protokole próbki tkanek zostały najpierw zhomogenizowane w ramach przygotowań do testu ELISA. Zaczęło się od błyskawicznego zamrożenia masy tkanki stałej, a następnie sproszkowania jej. Rozbijanie tkanek przed etapem homogenizacji ma na celu pomóc homogenizatorowi kulkowemu w lizie komórek. Tkanki homogenizowano w 0,1 N kwasie solnym w celu wytrącenia białek, technika stosowana w innych metodach 20,21. Na koniec ciała stałe i osad oddzielono od rozpuszczalnych składników poprzez odwirowanie. Aby uzyskać krzywą wzorcową, zapas cGMP (300 pmol cGMP/ml) został seryjnie rozcieńczony w celu wytworzenia ośmiu różnych wzorców. Wzorce i próbki poddano acetylacji w celu poprawy czułości testu poprzez wykrywanie stężeń do 0,1 pmol cGMP/ml. Ten wzrost czułości osiąga się, gdy grupa acetylowa tworzy wiązanie z cGMP, poprawiając zdolność każdego przeciwciała (obecnego w surowicy) do wiązania się z acetylowanym cGMP18. Acetylacja zarówno wzorców, jak i próbek zapewnia jednorodność wiązania cGMP między studzienkami. Etap acetylacji można pominąć zarówno w przypadku wzorców, jak i próbek, jeżeli oczekuje się, że stężenie cGMP w studzienkach mikropłytki przekroczy 1,0 pmol/ml18.
W ramach przygotowań do dodania próbek do studzienek, próbki rozcieńczano buforem ELISA. Dodatkowe rozcieńczenie pozwoliło na to, aby próbki spadły na krzywą wzorcową i bardziej przypominały zawartość studni NSB, B0 i standardowych, tworząc jednorodność. Wraz z próbkami i wzorcami w studzienkach miesza się kilka innych roztworów. W studzienkach NSB dodaje się bufor ELISA (z odczynnikami acetylacji i bez nich), podczas gdy surowica jest wstrzymywana. Ma to na celu określenie ilości znacznika AChE (acetylocholinoesterazy związanej z cGMP), który wiąże się z mysią IgG przylegającą do dołka przy braku specyficznego przeciwciała wchodzącego w skład surowicy. Studzienki B0 zawierały bufor ELISA (z odczynnikami acetylacji), znacznik AChE i surowicę odpornościową; w związku z tym studzienki B0 wykazują zdolność wiązania znacznika AChE bez konkurencji cGMP. Po odpowiednim napełnieniu wszystkich studzienek mikropłytka jest inkubowana, a następnie myta. Do studni dodano odczynnik Ellmana. Wreszcie, znacznik AChE został dodany do TA dobrze po dodaniu odczynnika Ellmana. To dobrze reprezentuje aktywność katalityczną znacznika AChE niezależnie od tego, ile znacznika było związane z mikropłytką przez przeciwciała. Mikropłytka została opracowana w temperaturze pokojowej, dzięki czemu znacznik AChE może katalizować reakcję kolorymetryczną.
Kilka etapów protokołu może zmienić wyniki testu; Należy zachować szczególną ostrożność podczas wykonywania kolejnych kroków, aby uzyskać optymalne wyniki. Określenie odpowiednich rozcieńczeń dla każdego typu tkanki dla etapu homogenizacji i po acetylacji jest konieczne w celu zagwarantowania, że próbki mieszczą się na krzywej wzorcowej. Podczas przygotowywania wzorców, roztwory powinny być dokładnie zawirowane lub wymieszane przed usunięciem podwielokrotności lub po dodaniu podwielokrotności. Ten krok jest ważny, aby osiągnąć oczekiwane stężenia cGMP dla każdego wzorca. Podczas etapów acetylacji każdy wzorzec i próbka powinny być wirowane przez ten sam czas, aby uzyskać spójne odczyty absorbancji. Wzorce i próbki powinny być również wirowane bezpośrednio przed dodaniem podwielokrotności do odpowiedniego studzienki. Praktyka ta skutkuje dokładniejszymi stężeniami cGMP. Dokładne mycie mikropłytki poprawia również dokładność wartości absorbancji, ponieważ usuwa cały niezwiązany znacznik AChE ze studzienki. Po dodaniu odczynnika Ellmana należy pozostawić odpowiedni czas na rozwinięcie się mikropłytki, zwracając uwagę na kolor i, co najważniejsze, absorbancję studzienek B0 . Ważne jest, aby zdać sobie sprawę, że stężenie cGMP między duplikatami lub potrójnymi może różnić się bardziej w próbkach o niższych poziomach cGMP w porównaniu z próbkami o wyższych stężeniach. Pomiar bardziej skoncentrowanej próbki może pomóc w rozwiązaniu tego problemu. Dodatkowo, aby uwzględnić wszelkie różnice między mikropłytkami, próbki tego samego typu tkanki powinny być mierzone na tej samej płytce, gdy tylko jest to możliwe. Oczekuje się, że przestrzeganie tych wytycznych poprawi jakość danych wynikowych testu.
Powyższy protokół można ekstrapolować na inne tkanki miękkie, stałe. Dalszy rozwój podrozdziału dotyczącego przygotowania tkanek w powyższym protokole może doprowadzić do opracowania metody odpowiedniej do przetwarzania tkanek twardych, w tym kości, które mogą być interesujące ze względu na swoje unaczynienie. Ciągły rozwój tej techniki może zaowocować uzyskaniem metody odpowiedniej do pomiaru stężeń cGMP w szerokiej gamie tkanek stałych, co zaowocuje użyteczną metodą zbierania dodatkowych informacji na temat obfitości NO w praktycznie każdej tkance. Chociaż konkurencyjny protokół ELISA, o którym mowa powyżej, jest przydatną techniką pomiaru cGMP i szacowania obfitości NO, ma dwa istotne ograniczenia: (1) Ten test nie rozróżnia cGMP syntetyzowanego przez rozpuszczalną cyklazę guanylilu i cGMP syntetyzowanego przez cząsteczkową cyklazę guanylilu (pGC). Peptydy natriuretyczne stymulują aktywność pGC22 , a zatem zmiany w cGMP przez ten szlak nie wskazują na zmiany w obfitości NO; (2) Dodatkowo enzymy fosfodiesterazy (PDE) wpływają na wyniki testu ELISA. Kilka PDE hydrolizuje cGMP, zmniejszając jego stężenie po stymulacji sGC przez NO23. W związku z tym aktywność katalityczna PDE może przesłaniać związek między stężeniami cGMP a obfitością NO. Dodanie inhibitora PDE5, takiego jak sildenafil, w celu zapobieżenia utracie cGMP jest wskazane w przypadku eksperymentów skoncentrowanych przede wszystkim na uzyskaniu dokładnych stężeń cGMP, w przeciwieństwie do uzyskiwania pomiarów w celu obserwacji trendów stężeń cGMP. Inhibitory PDE5 mogą być podawane zwierzętom w postaci syldenafilu na około 1 godzinę przed pobraniem próbki (efekty utrzymują się do 4 godzin24) lub, jeśli takie podanie nie jest możliwe, syldenafil można dodać do pobranych próbek. Podczas hamowania PDE po pobraniu tkanek należy dodać syldenafil do 0,1 N kwasu solnego, aby tkanki były homogenizowane w obecności syldenafilu. Należy wykonać pomiary z syldenafilem i bez niego, aby upewnić się, że nie ma wzajemnych oddziaływań między leczeniem zwierząt a syldenafilem.
Nawet ze swoimi ograniczeniami, test jest wykorzystywany jako informacyjny wgląd w dalszą transmisję sygnału NO. Podsumowując, sprzężenie pomiaru stężeń cGMP w tkankach stałych z innymi metodami pomiaru NO pozwala na lepsze zrozumienie wpływu NO na narządy.

Cykliczny monofosforan guanozyny (cGMP) jest cząsteczką sygnałową zdolną do wywoływania zmian fizjologicznych poprzez szlak tlenku azotu (NO)-cGMP. W szlaku NO-cGMP NO wiąże się z rozpuszczalną cyklazą guanyliową, enzymem cytozolowym, który przekształca trifosforan guanozyny w cGMP, zwiększając jego aktywność katalityczną 1,2. Późniejszy wzrost stężeń cGMP aktywuje szlaki sygnałowe, które sprzyjają rozszerzeniu naczyń krwionośnych3, prowadząc do obniżenia ciśnienia krwi 4,5, głównej reakcji fizjologicznej charakterystycznej dla obecności NO in vivo. Ponadto wiadomo, że NO wpływa na funkcjeodpornościowe6, poprawia wytrzymałośćpodczas aktywności fizycznej4 i zapobiega krzepnięciu krwi poprzez hamowanie agregacji płytek krwi7.
Bezpośredni pomiar NO jest utrudniony ze względu na jego krótszy niż sekundowy okres półtrwania in vivo8 w większości tkanek biologicznych. W związku z tym wyjaśnienie fizjologicznych skutków NO wymaga metody pomiaru jego obfitości ex vivo. W związku z tym w stosowanych metodach ilościowych unika się bezpośredniego pomiaru NO. Powszechną metodą szacowania stężeń NO w tkankach jest pomiar bardziej stabilnych metabolitów NO: azotynów i azotanów 4,5,9,10,11. Główną komplikacją stosowania stężeń azotynów i azotanów jako miar obfitości NO jest to, że oba metabolity służą również odpowiednio jako prekursor NO i cząsteczka magazynująca. Metabolity NO, zwłaszcza azotany, występują obficie w niektórych produktach spożywczych. W związku z tym zmiany w stężeniach cGMP, przy czym cGMP jest następcą NO, są przydatne do szacowania ilości aktywnego NO, a obfitość NO można określić bez ingerencji wcześniej obecnych azotynów i azotanów.
Wcześniejsze badania opierały się na pomiarze stężeń cGMP w osoczu12 i płytkach krwi13, ale rzadziej spotykany jest pomiar stężeń cGMP w tkankach stałych. Możliwość pomiaru stężeń cGMP w tkankach stałych pozwoliłaby na scharakteryzowanie aktywności NO w konkretnych narządach. Celem było zidentyfikowanie uproszczonej metody pomiaru cGMP w tkankach stałych za pomocą konkurencyjnego testu ELISA. Jedną z zalet korzystania z konkurencyjnego testu ELISA jest to, że wymaga on sprzętu powszechnie spotykanego w większości laboratoriów zainteresowanych NO, takiego jak czytnik mikropłytek często używany do innych celów. Dla porównania, niektóre inne metody pomiarowe wymagają sprzętu rzadko używanego podczas eksperymentów skoncentrowanych na NO, takiego jak mikroskopy14,15, licznik scyntylacyjny16 lub laser17. Oprócz dostępności, pomiar cGMP za pomocą konkurencyjnego testu ELISA jest czuły; Stężenia cGMP można wykryć z dokładnością do 0,1 pikomolu (pmol) cGMP/ml18. Z niewielkimi modyfikacjami w protokole18 zestawu cGMP ELISA (Tabela materiałów) ustalono metodę pomiaru cGMP w tkankach stałych przy użyciu konkurencyjnego ELISA.

<table><tbody><tr><td>1 ml przezroczystej strzykawki doustnej BD</td><td>Becton Dickinson</td><td>50382903052177</td><td></td></tr><tr><td>14 ml probówka z okrągłym dnem</td><td>Sokół</td><td>352059</td><td></td></tr><tr><td>Mikroprobówki 2,0 ml, różne</td><td>Olympus Plastics</td><td>24-283A</td><td></td></tr><tr><td>30-300 i mikro; Pipeta wielokanałowa L&nbsp;</td><td>Eppendorf powiedział:</td><td>3125000052</td><td></td></tr><tr><td>Bezwodnik octowy (w zestawie cGMP)</td><td>Firma chemiczna Kajmanów</td><td>400031</td><td>98% czysty <silny>Zagrożenie</silny>: Łatwopalny,: poważnie poparzenia skóry, uszkodzenie oczu, Ostra toksyczność <silny>Bezpieczna obsługa</mocny>: Przechowywać z dala od źródeł zapłonu, pracować w przewiewnym miejscu, nosić rękawice</td></tr><tr><td>cGMP Acetylocholinoesterazy Znacznik (w zestawie cGMP)</td><td>Firma chemiczna Kajmanów</td><td>481020</td><td>fosforan potasu dwuzasadowy, chlorek sodu,&nbsp; fosforan potasu jednozasadowy, albumina bydlęca, azydek sodu, EDTA, cGMP AChE tracer Hazard: Zagrożenie dla zdrowia: toksyczność narządowa spowodowana powtarzającym się narażeniem, : uszkodzenie oczu, Działa drażniąco na skórę i drogi oddechowe Bezpieczna obsługa: Praca w wentylowanym pomieszczeniu, Nosić rękawiczki</td></tr><tr><td>Surowica odpornościowa cGMP ELISA (w zestawie cGMP)</td><td>Firma chemiczna Kajmanów</td><td>481022</td><td>fosforan potasu dwuzasadowy, chlorek sodu,&nbsp; fosforan potasu jednozasadowy, albumina bydlęca,&nbsp; Azydek sodu, EDTA, królicze anty-cGMP poliklonalne Antysurowica <silny>Zagrożenie</silny>: Zagrożenie dla zdrowia: toksyczność narządowa spowodowana powtarzającym się narażeniem, : uszkodzenie oczu, Działa drażniąco na skórę i drogi oddechowe, Toksyczność ostra <silny>Bezpieczna obsługa</silny>: Pracuj w wentylowanym pomieszczeniu, nosić rękawice</td></tr><tr><td>Wzorzec cGMP ELISA (w zestawie cGMP)</td><td>Firma chemiczna Kajmanów</td><td>481024</td><td>fosforan potasu dwuzasadowy, chlorek sodu,&nbsp; fosforan potasu jednozasadowy, albumina bydlęca,&nbsp; azydek sodu, EDTA, norma cGMP <silny>Zagrożenie</silny>: Zagrożenie dla zdrowia: toksyczność narządowa spowodowana powtarzającym się narażeniem, : uszkodzenie oczu, Działa drażniąco na skórę i drogi oddechowe <silny>Bezpieczny Obsługa</silny>: Pracuj w wentylowanym pomieszczeniu, nosić rękawice</td></tr><tr><td>Cykliczny zestaw ELISA GMP</td><td>Firma chemiczna Kajmanów</td><td>581021</td><td></td></tr><tr><td>Koncentrat buforowy ELISA 10X (w zestawie cGMP)</td><td>Firma chemiczna Kajmanów</td><td>400060</td><td>1 M fosforan, 1% BSA, 4 M chlorek sodu, 10 mM EDTA, 0,1% azydek sodu <silny>Zagrożenie</silny>: Zagrożenie dla zdrowia: toksyczność narządów spowodowana powtarzającym się narażeniem, : uszkodzenie oczu, Działa drażniąco na skórę i drogi oddechowe <silny>Bezpieczny Obsługa</silny>: Pracuj w przewiewnym miejscu, przechowuj w pojemniku z zamykaną pokrywą, nosić rękawice</td></tr><tr><td>Zbiornik odczynnika ELISA</td><td>Pierce (obecnie Thermo Fisher Scientific)</td><td>15075</td><td></td></tr><tr><td>Odczynnik Ellmana (w zestawie cGMP)</td><td>Firma chemiczna Kajmanów</td><td>400050</td><td>fosforan potasu dwuzasadowy, chlorek sodu, fosforan potasu jednozasadowy, acetylotiocholina (jodek), kwas 5,5'-ditiobis-(2-nitrobenzoesowy) <silny>Zagrożenie</silny>: Ostra toksyczność, Zagrożenie dla zdrowia: toksyczność narządowa,: Uszkodzenie oczu, Drażniące skórę, Drażniący reprymalny <silny>Bezpieczna obsługa: Pracuj w przewiewnym miejscu, nosić rękawice</td></tr><tr><td>Kwas solny</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>320331</td><td>Hazard:: powoduje korozję metalu, silne oparzenia skóry, Uszkodzenie oczu, Działa drażniąco na drogi oddechowe Bezpieczna obsługa: Pracuj w przewiewnym miejscu, nosić rękawice</td></tr><tr><td>Ciekły azot</td><td>Tlen Roberta</td><td></td><td>Azot <silny>Zagrożenie</silny>: Sprężony gaz: Ryzyko oparzeń kriogenicznych, frosbite, uduszenia <silny>Bezpieczna obsługa</silny>: Pracuj w wentylowanym miejscu, nosić rękawice</td></tr><tr><td>Mysia płytka pokryta IgG Anti-Rabbit (w zestawie cGMP)</td><td>Firma chemiczna Kajmanów</td><td>400006</td><td> Zagrożenie: Brak</td></tr><tr><td>Nowy klasyczny balans MF</td><td>Mettler Toledo</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wytrząsarka orbitalna&nbsp;</td><td>Stovall Life Science, Inc. (obecnie IBI Scientific)</td><td>15-453-211 (Różnie)</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Firma Bemis, Inc.</td><td>3023-4526 (Różnie)</td><td></td></tr><tr><td>Polisorbat 20 (w zestawie cGMP)</td><td>Firma chemiczna Kajmanów</td><td>400035</td><td> Zagrożenie: Brak</td></tr><tr><td>Wodorotlenek potasu (w zestawie cGMP)</td><td>Firma chemiczna Kajmanów</td><td>400029</td><td>85% czysty <silny>Zagrożenie</silny>:: powoduje korozję metali i skóry, Uszkodzenie oczu, Toksyczność ostra <silny>Bezpieczna obsługa</silny>: Pracuj w przewiewnym miejscu, nosić rękawice</td></tr><tr><td>Homogenizator Precellys Evolution</td><td>Technologie Bertin</td><td>PE000062-PEVO0-A</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do lizowania Precellys Homogenizacja tkanek twardych</td><td>Technologie Bertin</td><td>P000911-LYSK0-A</td><td></td></tr><tr><td>Czytnik mikropłytek Sense</td><td>KRYJÓWKA</td><td>425-301</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka Sorvall Legend Micro 17R</td><td>Thermo Fisher Naukowy</td><td>75002441</td><td></td></tr><tr><td>Rozdrabniacz tkanek</td><td>Kruszarka do komórek</td><td>Zestaw do kruszenia komórek</td><td></td></tr><tr><td>Dżin wirowy 2</td><td>Branże naukowe&nbsp;</td><td>SI-0246 powiedział:</td><td></td></tr><tr><td>Butelka do mycia</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z423092</td><td></td></tr><tr><td>Koncentrat buforowy do przemywania 400X (w zestawie cGMP)</td><td>Firma chemiczna Kajmanów</td><td>400062</td><td>fosforan potasu dwuzasadowy, fosforan potasu jednozasadowy, woda <silny>Zagrożenie</silny>:: Uszkodzenie oczu, Ostra toksyczność, Działa drażniąco na skórę, Toksyczność narządowa <silny>Bezpieczna obsługa</silny>: Pracuj w przewiewnym miejscu, nosić rękawice</td></tr></tbody></table>

pomiar cyklicznego monofosforanu guanozyny (cgmp) w tkankach stałych przy użyciu konkurencyjnego testu immunoenzymatycznego (elisa)

Measurement of Cyclic Guanosine Monophosphate (cGMP) in Solid Tissues using Competitive Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA)

Głównym szlakiem, który wytwarza cykliczny monofosforan guanozyny (cGMP), jest szlak tlenku azotu (NO)-cGMP. W tym szlaku NO stymuluje aktywność katalityczną rozpuszczalnej cyklazy guanylowej (sGC), która przekształca trifosforan guanozyny w cGMP. NO jest interesujący, ponieważ u ssaków działa jako główny środek rozszerzający naczynia krwionośne, inhibitor agregacji płytek krwi, mediator funkcji immunologicznej, neuroprzekaźnik i poprawia wytrzymałość podczas aktywności fizycznej, a także pełni inne funkcje fizjologiczne. Pomiar obfitości NO w różnych tkankach może pomóc w wyjaśnieniu jego funkcji. Jednak NO nie może być mierzony bezpośrednio ze względu na jego krótszy niż sekundowy okres półtrwania. Zazwyczaj metabolity NO, azotany i azotyny, są mierzone w celu oszacowania obfitości NO. Dzieje się tak, ponieważ cząsteczki te mogą być przekształcane in vivo w reakcjach redoks. Mniej powszechna metoda szacowania obfitości NO wymaga pomiaru stężenia cGMP, cząsteczki sygnałowej za NO. Jednak pomiar cGMP w tkankach jest rzadko wykonywany, mimo że stwarza możliwość lepszego zrozumienia funkcji NO w narządach. W związku z tym istnieje potrzeba opracowania protokołu do pomiaru stężeń cGMP w narządach i tkankach stałych. W tym protokole pobrane tkanki świni poddano homogenizacji, na przetworzonych próbkach przeprowadzono konkurencyjny test ELISA, a absorbancje przekształcono w nanomole cGMP na gram oryginalnej tkanki. Krótko mówiąc, protokół ten określa uproszczoną metodę pomiaru stężeń cGMP w tkankach stałych przy użyciu cyklicznego zestawu GMP ELISA.

Świnie domowe rasy Yorkshire, którym podawano w diecie chlorek sodu (0,15 mmol/kg) lub azotan znakowany 15N (0,15 mmol/kg) raz dziennie przez pięć kolejnych dni w formie bolusa w karmie, zostały poddane perfuzji roztworem heparyny sodowej (0,9% chlorku sodu) przed pobraniem tkanek; wszystkie szczegóły poboru zostały opublikowane wcześniej19. Stężenia cGMP w mięśniach pośladkowych i wątrobach czterech świń domowych rasy Yorkshire zmierzono zgodnie z opisanym protokołem ELISA. Tkanki wątroby rozcieńczono w stosunku 1:5, a mięśnie pośladkowe w stosunku 1:10, używając 0,1 N kwasu solnego (HCl) w celu wytrącenia białek. Homogenaty rozcieńczone HCl poddano acetylacji, a następnie rozcieńczono buforem ELISA w stosunku 1:2 i 1:3 dla próbek wątroby i mięśnia pośladkowego. Stężenia cGMP zmierzono zgodnie z powyższym opisem. Wartości absorbancji przeliczono na pikomole cGMP na mililitr przygotowanej próbki, a następnie na nanomole cGMP na gram tkanki (nmol/g tkanki), zgodnie z powyższym protokołem.
Stężenia cGMP zmierzone w tkance wątroby dostarczyły optymalnych wyników eksperymentalnych w powyższych warunkach. Stężenia cGMP w grupie kontrolnej i grupie traktowanej azotanami w wątrobie świni wyniosły odpowiednio 0,0202 nmol/g ± 0,003 nmol/g tkanki oraz 0,0364 nmol/g ± 0,011 nmol/g tkanki (Rysunek 3). Kilka wartości potwierdza wiarygodność wyników. Absorbancje studni B0 po odjęciu ślepej próby, mieszczące się w zakresie od 0,466 do 0,475, mieszczą się w przedziale od 0,3 AU do 1,0 AU, co potwierdza prawidłowy rozwój mikro płytki z odczynnikiem Ellmana. Wysoka jakość krzywej wzorcowej jest wykazana zarówno przez stopniowy wzrost absorbancji od standardu 1 do standardu 8, jak i liniowość krzywej wzorcowej, potwierdzoną współczynnikiem determinacji wynoszącym 0,99. Procent <img alt="Diagram równania stanu równowagi, B/B₀ wskazujący analizę wzoru bilansu." src="/files/ftp_upload/68432/68432eq001.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Równanie 1"> dla każdej zmierzonej studni (31,5%-71,2%) mieści się między 20% a 80%, co potwierdza, że wszystkie próbki mieszczą się na krzywej wzorcowej. Próbki posiadające określone charakterystyki nadają się do interpretacji.
Stężenia cGMP zmierzone w tkance mięśnia pośladkowego przyniosły suboptimalne wyniki eksperymentalne. Oznaczenie suboptimalne przypisano wynikom dla mięśnia pośladkowego, ponieważ większość wartości procentowych <img alt="Diagram równania stanu równowagi statycznej, B/B₀ wskazujące na analizę wzoru bilansowego." src="/files/ftp_upload/68432/68432eq001.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Równanie 1"> dla dołków z mięśnia pośladkowego (3,69%–27,3%) spadła poniżej 20%, co wskazuje, że do uzyskania absorbancji mieszczących się na krzywej wzorcowej wymagane były bardziej rozcieńczone próbki. Stężenia cGMP w grupie kontrolnej oraz w grupie traktowanej azotanami w mięśniu pośladkowym świni wynoszą odpowiednio 1,22 nmol/g ± 0,49 nmol/g tkanki oraz 0,732 nmol/g ± 0,18 nmol/g tkanki (wykres nie przedstawiono). Próbki mięśnia pośladkowego dzielą wartości absorbancji z dołkami B0 i standardami próbek wątroby. Wykorzystanie tych suboptimalnych próbek może prowadzić do błędnych wniosków; w związku z tym konieczne jest przygotowanie bardziej rozcieńczonych próbek i ponowny pomiar stężeń cGMP.
<img alt="Porównanie poziomów cGMP w wątrobie świń, kontrola vs. azotan, wykres słupkowy z słupkami błędów, brak istotności (ns)." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68432/68432fig3v2.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3: Stężenie cGMP w tkance wątroby. Średnie stężenie cGMP w wątrobie świń traktowanych chlorkiem sodu (0,15 mmol/kg) lub azotanem znakowanym 15N (0,15 mmol/kg) w nmol/g tkanki. n = 4; słupki błędów oznaczają odchylenie standardowe; dane analizowano za pomocą testu t Welcha; ns oznacza brak istotności statystycznej. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68432/68432fig3v2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>

Protokół ten mierzy stężenia cyklicznego monofosforanu guanozyny (cGMP) w tkankach stałych za pomocą konkurencyjnego testu immunoenzymatycznego (ELISA). Protokół opisuje, w jaki sposób przetwarzać tkankę stałą, przeprowadzać konkurencyjny test ELISA, przeliczać absorbancję na stężenia cGMP w pikomolach na mililitr i obliczać końcowe stężenia jako nanomole cGMP na gram tkanki.

Pomiar cyklicznego monofosforanu guanozyny (cGMP) w tkankach stałych przy użyciu konkurencyjnego testu immunoenzymatycznego (ELISA)

A major pathway that produces cyclic guanosine monophosphate (cGMP) is the nitric oxide (NO)-cGMP pathway. In this pathway, NO stimulates the catalytic ...

Laboratorium Dechter prowadzi badania nad metabolizmem tlenku azotu. Tlenek azotu stymuluje cykliczne tworzenie GMP poprzez adaptacyjną kaskadę homeostazy. Naszym celem jest dowiedzenie się, w jaki sposób starzenie się, dieta i inne czynniki wpływają na tę kaskadę. Dotychczasowe badania koncentrowały się na powstawaniu tlenku azotu i wynikających z tego fizjologicznych skutkach zaniedbywania łączącej je kaskady. Nasz protokół mierzy cykliczny GMP, drugiego posłańca w kaskadzie. Nasz protokół jest prosty, dostępny i można go łatwo dostosować do różnych typów tkanek.[Narrator] Na początek,Umieść rozdrabniacz do chusteczek, pęsetę i łyżkę na suchym lodzie na 10 minut. Odważyć nadmiar tkanki wieprzowej, aby uwzględnić ubytek podczas sproszkowania. Przenieść tkankę do schłodzonego rozdrabniacza umieszczonego na suchym lodzie. Błyskawicznie zamroź tkankę, wlewając ciekły azot do rozpylacza i pozwól mu całkowicie odparować przed kontynuowaniem. Następnie załóż pokrywę rozdrabniacza i uderz w nią 15 razy za pomocą młotka. Teraz wytaruj rurkę homogenizatora kulek na wadze. Za pomocą schłodzonej łyżki i pęsety przenieś sproszkowaną tkankę do probówki. Odpipetować 0,1 zwykłego kwasu solnego do probówki homogenizującej, upewniając się, że objętość w mikrolitrach jest wielokrotnością masy tkanki w miligramach . Następnie homogenizować próbkę tkanki za pomocą homogenizatora młyna perełkowego. Odwirować homogenat o masie 17 000 g przez 30 minut, utrzymując temperaturę próbki wynoszącą cztery stopnie Celsjusza. Przenieść powstały supernatant do probówki mikrowirówkowej. Wirować ponownie przez 10 minut, utrzymując temperaturę próbki wynoszącą cztery stopnie Celsjusza. Odpipetować porcję końcowego supernatantu do probówki do mikrowirówki i umieścić ją na lodzie. Następnie odpipetować 9,9 mililitra buforu ELISA do probówki oznaczonej jako Wzorzec B. Odpipetować 100 mikrolitrów wzorcowego roztworu podstawowego do standardowej probówki B. Dokładnie wymieszaj, aby zapewnić równomierne zawieszenie. Przenieś 1,000 mikrolitrów roztworu z wzorca B do probówki oznaczonej jako Norma 1. Następnie dodaj 500 mikrolitrów buforu ELISA do probówek oznaczonych Standardem 0 i Standardami od 2 do 8. Wir Standardowy 1. Następnie przenieś 500 mikrolitrów roztworu do Wzorca 2. Następnie zwiruj Standard 2 i przenieś 500 mikrolitrów roztworu do wzorca 3. Kontynuuj przenoszenie 500 mikrolitrów z każdego poprzedniego wzorca do następnego, dokładnie wirując po każdym wydaniu, aż zostanie przygotowany Standard 8. W celu acetylacji próbek dodać 50 mikrolitrów czteromolowego wodorotlenku potasu do podwielokrotności próbki o objętości 250 mikrolitrów. Natychmiast dodaj 12,5 mikrolitra bezwodnika octowego. Wiruj roztwór przez 15 sekund. Następnie odpipetować 12,5 mikrolitra czterech molowych wodorotlenków potasu i ponownie odwirować. Do probówki oznaczonej Standardem 0 dodać 100 mikrolitrów czteromolowego wodorotlenku potasu, a następnie natychmiast 25 mikrolitrów bezwodnika octowego. Po wirowaniu odpipetować 25 mikrolitrów czteromolowego wodorotlenku potasu do probówki i krótko odwirować. Powtórzyć dodawanie wodorotlenku potasu i bezwodnika octowego, a następnie wirować dla pozostałych wzorców, dodać wstępnie określony stosunek buforu ELISA i podwielokrotności acetylowanej próbki do probówki mikrowirówkowej. Wir Standardowy 0. Przenieś 50 mikrolitrowych podwielokrotności wzorca 0 do pięciu studzienek oznaczonych jako dołki NSB i B mikropłytki ELISA. Następnie dodać 50 mikrolitrów buforu ELISA do dwóch studzienek NSB zawierających Standard 0. Używając pojedynczej końcówki do pipety, dodaj 50 mikrolitrów podwielokrotności wzorców od 1 do 8 w zduplikowanych studzienkach, zaczynając od wzorca 8 i przechodząc do wzorca 1. Odwiruj każdą próbkę. Następnie dodaj 50 mikrolitrów do odpowiednich studzienek w dwóch lub trzech dołach. Teraz odpipetuj 50 mikrolitrów znacznika acetylocholinoesterazy do wszystkich studzienek oznaczonych jako NSB, B naught, standard i próbka. Dodaj 50 mikrolitrów surowicy antysurowicy do każdego B naught, wzorca i studzienki próbki. Przykryj płytkę ELISA i inkubuj w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 18 godzin. Po inkubacji należy odwrócić płytkę ELISA nad pojemnikiem na odpady, aby usunąć zawartość. Napełnij studzienki buforem do płukania za pomocą butelki do mycia. Delikatnie mieszaj przez pięć sekund. Następnie wylej bufor do mycia i strzepnij pozostały płyn na ręcznik papierowy. Teraz przenieś odczynnik Ellmana do zbiornika. Pracując szybko, użyj pipety wielokanałowej, aby dodać 200 mikrolitrów odczynnika Ellmana do ślepej próby, NSB, B naught, TA, wzorca i dołków na próbki. Dodaj pięć mikrolitrów znacznika acetylocholinoesterazy do studzienki TA. Następnie przykryj płytkę ELISA Parafilmem. Umieść go w lekko chronionym pojemniku do inkubacji w temperaturze pokojowej z mieszaniem przez 60 do 90 minut. Usuń Parafilm i odczytaj gęstość optyczną przy 412 nanometrach Cykliczne stężenie GMP w wątrobie świni w grupie kontrolnej wynosiło około 0,0202 nanomoli na gram tkanki. W grupie leczonej azotanami cykliczne stężenie GMP wzrosło do około 0,0364 nanomoli na gram tkanki.

measurement-cyclic-guanosine-monophosphate-cgmp-solid-tissues-using

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Badanie in vitro funkcji komórek β przy użyciu izolowanych mysich wysepek Langerhansa jest ważnym elementem badań nad patofizjologią i terapią cukrzycy. Chociaż dostępnych jest wiele dalszych zastosowań, protokół ten szczegółowo opisuje pomiar wewnątrzkomórkowego cyklicznego monofosforanu adenozyny (cAMP) jako podstawowego parametru określającego funkcję komórek β.

Metoda izolacji wysp trzustkowych myszy i wewnątrzkomórkowego oznaczania cAMP

Kodujemy genetycznie nienaturalny aminokwas, p-azydo-L-fenyloalaninę w różnych docelowych miejscach w GPCR i pokazujemy wszechstronność grupy azydologicznej w różnych zastosowaniach. Obejmują one ukierunkowaną technologię fotosieciowania w celu identyfikacji reszt w kieszeni wiążącej ligand GPCR oraz specyficzną dla miejsca bioortogonalną modyfikację GPCR za pomocą znacznika peptydowo-epitopowego lub sondy fluorescencyjnej.

Genetycznie kodowane sondy molekularne do badania receptorów sprzężonych z białkiem G

Pomiar biomarkerów w złożonych próbkach biologicznych coraz częściej pomaga w podejmowaniu decyzji klinicznych. Opisujemy wysoce czułą metodę jednoczesnego pomiaru białka C wiążącego miozynę sercową, kinazy kreatynowej MB i troponiny sercowej I w próbkach surowicy od osób z zawałem mięśnia sercowego i zdrowych osób z grupy kontrolnej.

Czuła i specyficzna metoda ilościowa do oznaczania białka C wiążącego miozynę sercową w surowicy za pomocą elektrochemiluminescencyjnego testu immunologicznego

Uporczywa aktywacja hamujących receptorów sprzężonych z białkiem G powoduje uwrażliwienie na sygnalizację cyklazy adenylowej. Aby zidentyfikować podstawowe szlaki molekularne, konieczne jest bezstronne podejście; jednak strategia ta wymaga opracowania skalowalnego testu uczulającego na cAMP opartego na komórkach. W niniejszym artykule opisujemy test uczulający do badań przesiewowych małych cząsteczek i siRNA.

Uwrażliwienie cyklazy adenylowej na leki: usprawnienie i miniaturyzacja testów do zastosowań przesiewowych małych cząsteczek i siRNA

Wszechobecny drugi przekaźnik c-di-GMP kontroluje wzrost i zachowanie wielu bakterii. Opracowaliśmy nowatorską technologię opartą na spektrometrii mas wychwytywania związków do biochemicznej identyfikacji i charakterystyki białek wiążących c-di-GMP u praktycznie każdego gatunku bakterii.

Spektrometria mas związków chemicznych - potężne narzędzie do identyfikacji nowych białek efektorowych c-di-GMP

S1P wywiera swoje różnorodne efekty fizjologiczne poprzez podrodzinę receptorów S1P (S1PRs). W tym miejscu opisano potok w celu wyjaśnienia struktur i funkcji S1PR.

Rurociąg do badania struktur i szlaków sygnałowych receptorów sfingozyno-fosforanowych

Opublikowane dane dotyczące stężeń peptydu związanego z genem kalcytoniny (CGRP) w ludzkim osoczu są niespójne. Niespójności te mogą wynikać z braku znormalizowanej, zwalidowanej metodologii ilościowego oznaczania tego neuropeptydu. W tym miejscu opisujemy zwalidowany protokół testu immunoenzymatycznego (ELISA) w celu oczyszczenia i ilościowego określenia CGRP w ludzkim osoczu.

Wykrywanie i oznaczanie ilościowe peptydu związanego z genem kalcytoniny (CGRP) w osoczu ludzkim przy użyciu zmodyfikowanego testu immunoenzymatycznego

Protokół przedstawiony w tym badaniu ilustruje skuteczność detektora różnic cAMP In Situ w pomiarze cAMP za pomocą dwóch metod. Jedna z metod wykorzystuje 96-dołkowy spektrofotometr do odczytu płytek z ogniwami HEK-293. Druga metoda polega na demonstracji pojedynczych komórek HASM pod mikroskopem fluorescencyjnym.

Dynamika cAMP w czasie rzeczywistym w żywych komórkach przy użyciu fluorescencyjnego detektora różnic cAMP in situ

Prezentujemy zwalidowany test ELISA z użyciem nowych przeciwciał monoklonalnych anty-HER2. Test ten umożliwia precyzyjne określenie ilościowe związanego z komórkami i uwolnionego białka HER2 z komórek hodowanych in vitro i innych próbek, w tym krwi i tkanek.

Zwalidowany test immunochemiczny do kompleksowego określenia receptora ludzkiego naskórkowego czynnika wzrostu 2 uwalnianego z komórek i związanego z komórkami

Powszechnie wiadomo, że siły mechaniczne w organizmie mogą wpływać na różnicowanie i proliferację komórek. Przedstawiamy protokół wideo demonstrujący zastosowanie bioreaktora zbudowanego na zamówienie do przykładania jednowymiarowego cyklicznego odkształcenia rozciągającego do komórek macierzystych hodowanych na elastycznych podłożach z mikrowzorami.

Mechaniczna stymulacja komórek macierzystych z wykorzystaniem cyklicznego odkształcenia jednowymiarowego

Naucz się mierzyć stężenie cyklicznego monofosforanu guanozyny (cGMP) w tkankach stałych przy użyciu konkurencyjnego testu ELISA. Ta metoda pozwala badać metabolizm tlenku azotu i jego wpływ na funkcje fizjologiczne.

Pomiar cyklicznego monofosforanu guanozyny (cGMP) w tkankach stałych przy użyciu konkurencyjnego testu immunoenzymatycznego (ELISA) (Wideo) | JoVE Journal

Pomiar cyklicznego monofosforanu guanozyny (cGMP) w tkankach stałych przy użyciu konkurencyjnego testu immunoenzymatycznego (ELISA)

Przeglądaj więcej filmów