Pomiar cyklicznego monofosforanu guanozyny (cGMP) w tkankach stałych przy użyciu konkurencyjnego testu immunoenzymatycznego (ELISA)

Laboratorium Dechter prowadzi badania nad metabolizmem tlenku azotu. Tlenek azotu stymuluje cykliczne tworzenie GMP poprzez adaptacyjną kaskadę homeostazy. Naszym celem jest dowiedzenie się, w jaki sposób starzenie się, dieta i inne czynniki wpływają na tę kaskadę. Dotychczasowe badania koncentrowały się na powstawaniu tlenku azotu i wynikających z tego fizjologicznych skutkach zaniedbywania łączącej je kaskady. Nasz protokół mierzy cykliczny GMP, drugiego posłańca w kaskadzie. Nasz protokół jest prosty, dostępny i można go łatwo dostosować do różnych typów tkanek.

[Narrator] Na początek,

Umieść rozdrabniacz do chusteczek, pęsetę i łyżkę na suchym lodzie na 10 minut. Odważyć nadmiar tkanki wieprzowej, aby uwzględnić ubytek podczas sproszkowania. Przenieść tkankę do schłodzonego rozdrabniacza umieszczonego na suchym lodzie. Błyskawicznie zamroź tkankę, wlewając ciekły azot do rozpylacza i pozwól mu całkowicie odparować przed kontynuowaniem. Następnie załóż pokrywę rozdrabniacza i uderz w nią 15 razy za pomocą młotka. Teraz wytaruj rurkę homogenizatora kulek na wadze. Za pomocą schłodzonej łyżki i pęsety przenieś sproszkowaną tkankę do probówki. Odpipetować 0,1 zwykłego kwasu solnego do probówki homogenizującej, upewniając się, że objętość w mikrolitrach jest wielokrotnością masy tkanki w miligramach . Następnie homogenizować próbkę tkanki za pomocą homogenizatora młyna perełkowego. Odwirować homogenat o masie 17 000 g przez 30 minut, utrzymując temperaturę próbki wynoszącą cztery stopnie Celsjusza. Przenieść powstały supernatant do probówki mikrowirówkowej. Wirować ponownie przez 10 minut, utrzymując temperaturę próbki wynoszącą cztery stopnie Celsjusza. Odpipetować porcję końcowego supernatantu do probówki do mikrowirówki i umieścić ją na lodzie. Następnie odpipetować 9,9 mililitra buforu ELISA do probówki oznaczonej jako Wzorzec B. Odpipetować 100 mikrolitrów wzorcowego roztworu podstawowego do standardowej probówki B. Dokładnie wymieszaj, aby zapewnić równomierne zawieszenie. Przenieś 1,000 mikrolitrów roztworu z wzorca B do probówki oznaczonej jako Norma 1. Następnie dodaj 500 mikrolitrów buforu ELISA do probówek oznaczonych Standardem 0 i Standardami od 2 do 8. Wir Standardowy 1. Następnie przenieś 500 mikrolitrów roztworu do Wzorca 2. Następnie zwiruj Standard 2 i przenieś 500 mikrolitrów roztworu do wzorca 3. Kontynuuj przenoszenie 500 mikrolitrów z każdego poprzedniego wzorca do następnego, dokładnie wirując po każdym wydaniu, aż zostanie przygotowany Standard 8. W celu acetylacji próbek dodać 50 mikrolitrów czteromolowego wodorotlenku potasu do podwielokrotności próbki o objętości 250 mikrolitrów. Natychmiast dodaj 12,5 mikrolitra bezwodnika octowego. Wiruj roztwór przez 15 sekund. Następnie odpipetować 12,5 mikrolitra czterech molowych wodorotlenków potasu i ponownie odwirować. Do probówki oznaczonej Standardem 0 dodać 100 mikrolitrów czteromolowego wodorotlenku potasu, a następnie natychmiast 25 mikrolitrów bezwodnika octowego. Po wirowaniu odpipetować 25 mikrolitrów czteromolowego wodorotlenku potasu do probówki i krótko odwirować. Powtórzyć dodawanie wodorotlenku potasu i bezwodnika octowego, a następnie wirować dla pozostałych wzorców, dodać wstępnie określony stosunek buforu ELISA i podwielokrotności acetylowanej próbki do probówki mikrowirówkowej. Wir Standardowy 0. Przenieś 50 mikrolitrowych podwielokrotności wzorca 0 do pięciu studzienek oznaczonych jako dołki NSB i B mikropłytki ELISA. Następnie dodać 50 mikrolitrów buforu ELISA do dwóch studzienek NSB zawierających Standard 0. Używając pojedynczej końcówki do pipety, dodaj 50 mikrolitrów podwielokrotności wzorców od 1 do 8 w zduplikowanych studzienkach, zaczynając od wzorca 8 i przechodząc do wzorca 1. Odwiruj każdą próbkę. Następnie dodaj 50 mikrolitrów do odpowiednich studzienek w dwóch lub trzech dołach. Teraz odpipetuj 50 mikrolitrów znacznika acetylocholinoesterazy do wszystkich studzienek oznaczonych jako NSB, B naught, standard i próbka. Dodaj 50 mikrolitrów surowicy antysurowicy do każdego B naught, wzorca i studzienki próbki. Przykryj płytkę ELISA i inkubuj w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 18 godzin. Po inkubacji należy odwrócić płytkę ELISA nad pojemnikiem na odpady, aby usunąć zawartość. Napełnij studzienki buforem do płukania za pomocą butelki do mycia. Delikatnie mieszaj przez pięć sekund. Następnie wylej bufor do mycia i strzepnij pozostały płyn na ręcznik papierowy. Teraz przenieś odczynnik Ellmana do zbiornika. Pracując szybko, użyj pipety wielokanałowej, aby dodać 200 mikrolitrów odczynnika Ellmana do ślepej próby, NSB, B naught, TA, wzorca i dołków na próbki. Dodaj pięć mikrolitrów znacznika acetylocholinoesterazy do studzienki TA. Następnie przykryj płytkę ELISA Parafilmem. Umieść go w lekko chronionym pojemniku do inkubacji w temperaturze pokojowej z mieszaniem przez 60 do 90 minut. Usuń Parafilm i odczytaj gęstość optyczną przy 412 nanometrach Cykliczne stężenie GMP w wątrobie świni w grupie kontrolnej wynosiło około 0,0202 nanomoli na gram tkanki. W grupie leczonej azotanami cykliczne stężenie GMP wzrosło do około 0,0364 nanomoli na gram tkanki.