Pobieranie płynu do płukania nosa dla myszy bez zanieczyszczenia krwi

Obecny protokół opisuje nowatorską metodę unikania zanieczyszczenia krwi mysim płynem do płukania nosa (NLF). Ponieważ metoda ta zapewnia pobranie NLF bez zanieczyszczenia krwi, pozwala na dokładniejsze wykrywanie składników immunologicznych i różnych patogenów układu oddechowego.

Nasze badania koncentrują się na opracowaniu metody pobierania płynu z płukania nosa od myszy w dużych ilościach, rozwiązując dwa główne wyzwania: osiągnięcie wysokiej wydajności i zapobieganie zanieczyszczeniu krwi.

Istnieją dwa podejścia do pobierania płynu z płukania nosa: droga gardłowa, która daje większe objętości, oraz droga tchawicza, która zmniejsza zanieczyszczenie krwi.

Nasza metoda umożliwia pobranie dużej objętości płynu z płukania nosa z gardła, a umieszczenie wacików w pysku gryzonia pomaga zminimalizować zanieczyszczenie krwi. Podejście jest zarówno proste, jak i opłacalne.

Aby wykryć zanieczyszczenie krwi w próbce, stosujemy metodę kryminalistyczną, znaną jako reakcja luminolowa. Reakcja luminolu jest prosta i bardziej czuła niż inne metody.

Stężenie IgG we krwi jest znacznie wyższe niż w płynie z płukania nosa. Nasza metoda, która pozwala uniknąć zanieczyszczenia krwi, jest kluczowa w badaniach immunologicznych. Nadaje się również do analizy innych cząsteczek, takich jak mikrobiom, w przypadku których zanieczyszczenie krwi może zagrozić dokładności.

[Narrator] Na początek połóż uśpioną mysz na plecach na płycie chirurgicznej i przymocuj wszystkie cztery kończyny za pomocą szpilek. Za pomocą strzykawki o pojemności jednego mililitra zbierz krew z serca. Za pomocą nożyczek otwórz jamę brzuszną, aby odsłonić narządy trzewne i przeponę. Naciąć przeponę i żebra, aby odsłonić prawy przedsionek. Następnie nakłuj prawy przedsionek nożyczkami, aby odprowadzić pozostałą krew. Umieść trzy waciki w pysku zwierzęcia, ciągnąc język do przodu. Następnie podnieś głowę do pozycji nosa do góry i użyj nożyczek, aby oddzielić dolną szczękę, aby zapobiec zanieczyszczeniu krwi płynem z płukania nosa. Zastąp waciki świeżymi, aby uniknąć zanieczyszczenia krwi. Po ustaniu krwawienia wstrzyknij 200 mikrolitrów sterylnego PBS do choany i zbierz płyn z płukania nosa wyrzucony z nozdrzy do 1,5-mililitrowej probówki. Aby przygotować roztwór podstawowy do detekcji chemiluminescencyjnej, rozpuść jeden miligram luminolu i pięć miligramów nadtlenku sodu w jednym mililitrze sterylnej wody w probówce o pojemności 1,5 mililitra. Przykryj probówkę folią aluminiową i przechowuj ją w temperaturze czterech stopni Celsjusza do czasu użycia. Następnie przygotuj roztwór roboczy, rozcieńczając roztwór podstawowy dziesięciokrotnie wodą dejonizowaną. Pobrać pipetą dwa mikrolitry próbki płynu z płukania nosa do studzienek na 96-dołkowej płytce. Dodaj 100 mikrolitrów rozcieńczonego roztworu luminolu do każdego dołka i krótko wstrząśnij 96-dołkową płytką, aby wymieszać zawartość. Bezpośrednio obserwuj reakcję chemiluminescencji w ciemności. Rysunek ten przedstawia porównanie stężeń immunoglobuliny A w różnych typach próbek. W płynie z płukania nosa stężenie immunoglobuliny A jest niższe w próbkach pobranych nową metodą w porównaniu z metodą konwencjonalną, natomiast w próbkach surowicy i płynu z płukania oskrzelowo-pęcherzykowego nie wykazano istotnych różnic między obiema metodami. Dane te sugerują, że nowatorska metoda zmniejsza zanieczyszczenie próbek z nosa, prowadząc do dokładniejszych pomiarów immunoglobuliny A. Podobny wzorzec obserwuje się w przypadku immunoglobuliny G, ze znacznie niższymi stężeniami w płynie z płukania nosa pobranym nową metodą w porównaniu z metodą konwencjonalną. Natomiast próbki surowicy i płynu z popłuczyn oskrzelowo-pęcherzykowych ponownie nie wykazują znaczących różnic między tymi dwiema metodami, co sugeruje, że nowatorskie podejście konsekwentnie zmniejsza zanieczyszczenie próbek z nosa i poprawia wiarygodność pomiarów immunoglobuliny G.