Opracowanie innowacyjnego urządzenia oświetleniowego opartego na diodach LED do zastosowania terapii fotodynamicznej in vitro z użyciem róży bengalskiej

Zakres naszych badań polega na opracowaniu projektów fundamentalnych i translacyjnych mających na celu scharakteryzowanie wpływu terapii fotodynamicznej w leczeniu nowotworów bez skutecznych opcji terapeutycznych. Obecne wyzwania eksperymentalne polegają na opracowaniu technologii niezbędnych do wdrożenia terapii fotodynamicznej od in vitro do zastosowania klinicznego, w tym nowych fotouczulaczy i nowych urządzeń oświetleniowych. W porównaniu z innymi technikami, nasz protokół obejmuje niedrogie i domowe urządzenie, umożliwiające bardziej obfite oświetlenie 96-dołkowej płytki i stanu fizjologicznego wewnątrz inkubatora do hodowli komórkowych.

Na początek należy wyjąć wyhodowane komórki HepG2 z inkubatora i umieścić kolbę pod wstępnie oczyszczoną stacją bezpieczeństwa mikrobiologicznego. Za pomocą pipety usunąć pożywkę hodowlaną z kolby hodowlanej. Aby usunąć resztki pożywki, delikatnie mieszając, przepłukać roztworem buforowanym fosforanem, a następnie ostrożnie usunąć bufor.

Następnie nałóż trzy mililitry roztworu trypsyny zawierającego 0,25% trypsyny i 0,53 milimolowego EDTA na komórki i umieść kulturę z powrotem w inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza na pięć minut, aby odłączyć komórki. Po pięciu minutach dodaj siedem mililitrów pożywki hodowlanej do kolby, aby zneutralizować trypsynę i zawiesić komórki. Teraz przenieś trypsynę, pożywkę i oderwane komórki do 15-mililitrowej probówki wirówkowej.

Aby policzyć komórki, odpipetuj 20 mikrolitrów roztworu komórkowego do czystej probówki i dodaj 20 mikrolitrów roztworu błękitu trypanowego. Po wymieszaniu załaduj poplamioną mieszaninę na szkiełko liczące i włóż ją do licznika komórek. Następnie dodaj pożywkę hodowlaną do probówki, a następnie wprowadź komórki, aby osiągnąć końcowe stężenie 150 000 komórek na mililitr.

Wysiewaj 1,5 razy 10 do potęgi czterech komórek na studzienkę na białą 96-dołkową płytkę z przezroczystym, płaskim dnem. Przygotuj dwie tabliczki na każdy czas odczytu żywotności. Inkubować płytki przez 24 godziny przed zabiegiem, aby komórki mogły się przyczepić.

Aby przygotować roztwór podstawowy róży bengalskiej, rozpuść go w 10% roztworze soli fizjologicznej. Rozcieńczyć roztwory do traktowania róży bengalskiej w stężeniach od zera do 100 mikromolów w pożywce do hodowli komórkowych. Teraz usuń pożywkę hodowlaną z płytek komórkowych i dodaj 100 mikrolitrów przygotowanych roztworów do zabiegów z róży bengalskiej do każdej studzienki.

Inkubuj komórki z różą bengalską przez dwie godziny, aby umożliwić internalizację. Po dwóch godzinach usuń roztwór róży bengalskiej z każdej studzienki, umyj komórki dwa razy PBS, odessaj PBS i dodaj 100 mikrolitrów na studzienkę pożywki hodowlanej wolnej od róży bengalskiej. Przykryj mikropłytki folią aluminiową, aby chronić je przed światłem, i odłóż połowę płytek do oświetlenia podczas testu terapii fotodynamicznej.

Podłącz złącze męskie na dystrybutorze światła do złącza żeńskiego źródła światła. Usunąć terapię fotodynamiczną i mikropłytki w ciemnym stanie z inkubatora. Rozwiń płytkę do terapii fotodynamicznej.

Następnie ustaw ściemniacz w sterowniku LED na maksymalny poziom, aby zapewnić średnie natężenie promieniowania 0.62 miliwata na centymetr kwadratowy w 96 dołkach. Następnie umieść płytkę na dystrybutorze światła. Oświetlaj mikropłytkę, aż do uzyskania pożądanej dawki światła na komórkach.

Po osiągnięciu żądanej dawki światła wyłącz urządzenie. Owiń mikropłytkę terapii fotodynamicznej folią aluminiową i umieść ją wraz z płytką kontrolną w inkubatorze do czasu przeprowadzenia testu żywotności. Po zakończeniu testu terapii fotodynamicznej umieść oświetloną płytkę w inkubatorze na 24 godziny, aby umożliwić odpowiedź komórkową po leczeniu.

Po okresie inkubacji pobrać jedną oświetloną i jedną nieoświetloną płytkę. Dodaj 100 mikrolitrów odczynnika z zestawu do oznaczania żywotności komórek do każdej studzienki, aby zmierzyć metabolizm mitochondrialny i produkcję ATP. Inkubuj płytki w ciemności przez 10 minut przed przystąpieniem do pomiaru luminescencji.

Po 10 minutach odczytaj luminescencję w każdej studzience za pomocą czytnika multimodalnego. Rozważ, że luminescencja z nieobrobionych studzienek kontrolnych reprezentuje 100% żywotności. Znormalizuj wartości luminescencji z poddanych działaniu środka studzienek do tej kontroli, aby obliczyć procent żywotności dla każdego warunku leczenia.

Powtórz ten sam protokół do pomiaru żywotności komórek w dodatkowych punktach czasowych po zabiegu, takich jak 24 godziny, 48 godzin i 72 godziny. Samo oświetlenie bez róży bengalskiej nie zmieniło żywotności komórek HepG2 w żadnej z badanych dawek światła, a samo różane zapalenie bengalu bez światła również nie spowodowało znaczących zmian we wszystkich stężeniach. Terapia fotodynamiczna za pośrednictwem róży bengalskiej z użyciem CELL-LED-550/3 znacznie zmniejszyła żywotność komórek HepG2 we wszystkich dawkach światła, wykazując silne działanie cytotoksyczne.

Nakładanie się profilu emisji LED i widma absorpcyjnego różu bengalskiego potwierdziło kompatybilność spektralną urządzenia CELL-LED-550/3 z fotosensybilizatorem. W przyszłości jednym z naszych głównych celów jest opracowanie nowych pakietów PDT, z których każdy będzie zawierał zarówno światłoczuły związek umożliwiający celowanie w określone komórki nowotworowe, jak i związane z nim urządzenie oświetlające.