Name: Modelowanie uporczywego zakażenia Pseudomonas aeruginosa u zranionych larw danio pręgowanego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-06-13T13:50:00.000+00:00
Duration: 6 min 4 s
Description: Poznaj modelowanie uporczywego zakażenia Pseudomonas aeruginosa u zranionych larw danio pręgowanego. Ta metoda umożliwia badanie tolerancji antybiotykowej i przyspiesza odkrywanie nowych terapii przeciwbakteryjnych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Stéphane'owi Pontowi (LPHI, Montpellier), który w znacznym stopniu przyczynił się do opracowania metodologii i osiągnął wyniki pokazane na rysunku 3, jak opisano w towarzyszącym mu artykule13. Dziękujemy P. Plésiat (Francuski Krajowy Ośrodek Referencyjny ds. Oporności na Środki Przeciwdrobnoustrojowe, Besançon, Francja) za dostarczenie szczepów klinicznych A6520, B6513 i C6490 oraz A. Bragonzi (Mediolan, Włochy) za dostarczenie szczepu RP73. Dziękujemy C. Gonzalezowi i V. Goulianowi za urządzenie do modelowania wody ZEFIX firmy LPHI. Prace te były wspierane przez Vaincre La Mucoviscidose (RF20200502703, RF20210502864, RF20220503060) i Stowarzyszenie Gregory Lemarchal. Obiekt wodny jest wspierany przez program Wspólnoty Europejskiej "Horyzont 2020" [Inflanet Innowacyjnej Sieci Szkoleniowej Marie-Curie: umowa o udzielenie dotacji nr 955576].

Wszystkie eksperymenty z użyciem danio pręgowanego opisane w niniejszym badaniu zostały przeprowadzone na Uniwersytecie w Montpellier zgodnie z zasadami 3R – zastąpienia (Replacement), ograniczenia (Reduction) i udoskonalenia (Refinement) – zgodnie z wytycznymi Unii Europejskiej dotyczącymi obchodzenia się ze zwierzętami laboratoryjnymi i zostały zatwierdzone przez Direction Sanitaire et Vétérinaire de l'Hérault oraz Comité d'Ethique pour l'utilisation d'animaux à des fins scientifiques pod numerem referencyjnym CEEA-LR-B4-172-37. Wszystkie eksperymenty dotyczące infekcji przeprowadzono na embrionach do 5 dni po zapłodnieniu. Hodowla dorosłych osobników danio pręgowanego (Danio rerio) z linii AB lub Golden odbywała się zgodnie z międzynarodowymi wytycznymi określonymi w dyrektywie UE 2010/63/EU w sprawie ochrony zwierząt. W ośrodku hodowli danio pręgowanego na Uniwersytecie w Montpellier zastosowano standardowe warunki: cykl światła i ciemności 12 h:12 h, poliwęglanowe zbiorniki o pojemności 3,5 L (maksymalnie 22 ryby na zbiornik) podłączone do systemu recyrkulacyjnego z zasoleniem 4% / przewodnością 400 µS i temperaturą wody 28 °C. Ryby karmiono 2 razy dziennie pokarmem dla ryb.
1. Przygotowanie roztworów
<ol>
	<li>Przygotować 1x roztwór roboczy wody dla ryb z lub bez błękitu metylenowego do hodowli embrionów zebrafish (patrz Tabela 1).</li>
	<li>Przygotować 20x roztwór zapasowy (0,4%) oraz 1x roztwór roboczy znieczulający z trykainą zgodnie z opisem w Tabeli 1. Aby uniknąć wielokrotnego zamrażania i rozmrażania roztworu zapasowego, przygotować alikwoty 10 mL 20x trykainy i przechowywać w temperaturze -20 °C.</li>
	<li>Przygotować 2% roztwór Tritonu rozcieńczony w 1x soli fizjologicznej z buforem fosforanowym (PBS; Tabela 1).</li>
</ol>
2. Przygotowanie inokulum fluorescencyjnego  P. aeruginosa konstytutywnie ekspresyjnego dla GFP
UWAGA: Wszystkie prace z P. aeruginosa prowadzone są z zachowaniem środków ostrożności BSL-2 w komorze bezpieczeństwa biologicznego. Szczepy P. aeruginosa powinny być zmodyfikowane genetycznie w celu konstytutywnej ekspresji reportera fluorescencyjnego, takiego jak GFP (użyty w niniejszej metodzie i opisany w13). W przypadku stosowania reportera fluorescencyjnego kodowanego plazmidowo, silnie zaleca się użycie szczepów z chromosomalnie zakodowanym reporterem fluorescencyjnym, aby uniknąć utraty plazmidu.
<ol>
	<li>Na 2 dni przed zakażeniem wysiać z zapasów przechowywanych w -80 °C genetycznie zmodyfikowane P. aeruginosa eksprimujące GFP na płytkach z agarem LB (Tabela 1) i inkubować przez noc w 37 °C.</li>
	<li>Sprawdzić fluorescencję kolonii za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego (powiększenie 6x), aby zaszczepić kolonię GFP+P. aeruginosa w 1 mL bulionu LB (Tabela 1) i hodować przez noc w 37 °C z wytrząsaniem (180 rpm).</li>
	<li>W dniu zakażenia rozcieńczyć powyższą nocną kulturę P. aeruginosa w stosunku 1:20 w 5 mL świeżego bulionu LB. Hodować bakterie w 37 °C z wytrząsaniem (180 rpm), aż kultura osiągnie OD600 = 0.8. Powinno to zająć około 2-3 h.</li>
	<li>Wirować kulturę bakteryjną przez 10 min w temperaturze pokojowej (RT) przy 3584 x g. Usunąć nadsącz i resuspendować osad w 4 mL wody rybiej bez błękitu metylenowego.</li>
	<li>Dostosować objętość kultury za pomocą wody rybiej, aby uzyskać stężenie od 7 x 107 do 1 x 108 CFU/mL. Odpowiada to OD600 wynoszącemu około 0.15 (należy dostosować dla każdego szczepu).</li>
	<li>Aby określić ilość inokulum, wykonać rozcieńczenia seryjne zawiesiny bakteryjnej, wysiać 20 µL rozcieńczenia 10-4 na płytkę z agarem LB i inkubować przez noc w 37 °C.</li>
	<li>Policzyć kolonie GFP+ pod mikroskopem fluorescencyjnym, aby wyznaczyć CFU inokulum.</li>
</ol>
3. Pobieranie i przygotowanie embrionów danio pręgowanego
<ol>
	<li>Na 3 dni przed eksperymentem z zanurzeniem w bakterii przygotować pary hodowlane danio pręgowanych. Umieścić samca i samicę w zbiorniku do krzyżowania.</li>
	<li>Następnego ranka zebrać zapłodnione jaja za pomocą gęstego sita. Umieścić zebrane jaja w szalce Petri zawierającej wodę dla ryb z błękitem metylenowym.</li>
	<li>Aby uniknąć kontaminacji, dodać 1 kroplę wybielacza do szalki Petri. Po 5 min wymienić wodę dla ryb z błękitem metylenowym, aby usunąć wybielacz.</li>
	<li>Odrzucić jaja z nieprawidłowym rozwojem embrionu (jaja niezapłodnione przypominają stadium jednej komórki) lub martwe (o białym wyglądzie).</li>
	<li>W dniu infekcji rano (w 2 dpf) przeprowadzić dechlorionację embrionów za pomocą dwóch bardzo cienkich pęset pod mikroskopem stereoskopowym (powiększenie 11x). Rozdarć chorion pęsetą, nie ściskając embrionu, aby go uwolnić.</li>
	<li>Umieścić dechlorionowane embriony w szalce Petri zawierającej wodę dla ryb z błękitem metylenowym. Inkubować szalki w temperaturze 28 °C aż do momentu infekcji.</li>
</ol>
4. Uszkodzenie zarodka
<ol>
	<li>Zanurz zarodki danio pręgowanego w wodzie dla ryb bez błękitu metylenowego, zawierającej 0,02% Tricaine, na około 5 min przed uszkodzeniem w naczyniu hodowlanym (35 mm x 10 mm), aby je znieczulić. Zarodki przestają się poruszać i nie reagują na bodźce.</li>
	<li>Umieść igły 25G na końcach dwóch pałeczek, aby ułatwić operowanie igłami.</li>
	<li>Pod mikroskopem stereoskopowym odrzuć zarodki martwe lub z nieprawidłowym rozwojem. Wykonując okrężne ruchy naczyniem, zgromadź wszystkie zarodki w jego centrum.</li>
	<li>Izoluj zarodki pojedynczo, używając dwóch igieł ustawionych w pozycji pionowej (głową w dół – ogonem do góry); lewą igłę umieść przy ogonie, aby utrzymać zarodek w linii prostej. Prawą igłą przetnij płetwę na brzegu notochordu. Cięcie wykonaj jednym zdecydowanym ruchem. Odstęp czasu między cięciem a zanurzeniem w roztworze bakteryjnym nie może przekroczyć 10 min.</li>
</ol>
5. Zakażanie zranionych embrionów
<ol>
	<li>W komorze bezpieczeństwa biologicznego typu II wymieszać w wirówce i dodać roztwór P. aeruginosa o stężeniu około 1 x 107 CFU/mL do płytki 6-dołkowej.</li>
	<li>Zebrane za pomocą jednorazowej szklanej pipety Pasteura uszkodzone embriony przenieść do roztworu bakteryjnego w strefie bezpieczeństwa mikrobiologicznego. Inkubować płytkę w temperaturze 28 °C przez 1,5 h. 
	UWAGA: Jeśli wymagana jest duża liczba zainfekowanych larw, należy tworzyć grupy około 50 larw, zadać ranę, zanurzyć je, a następnie powtórzyć czynność dla kolejnej grupy.</li>
	<li>Po infekcji przemyć embriony w strefie bezpieczeństwa mikrobiologicznego zgodnie z poniższym opisem.
	<ol>
		<li>Przenieść embriony szklaną pipetą do 10 mL wody dla ryb bez błękitu metylenowego w celu pierwszego przemycia, dodając jak najmniej cieczy; inkubować przez 30 min w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Ponownie przenieść zainfekowane embriony szklaną pipetą do 4 mL wody dla ryb bez błękitu metylenowego w celu drugiego przemycia na kilka minut.</li>
		<li>Przenieść pojedynczo 24 zainfekowane embriony do płytki wielodołkowej zawierającej 1 mL wody dla ryb bez błękitu metylenowego.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Umieścić płytki w plastikowym pudełku w inkubatorze w temperaturze 28 °C. Nawilżyć pudełko (np. wilgotnymi ręcznikami papierowymi), aby ograniczyć parowanie.</li>
</ol>
6. Przeżywalność zainfekowanych embrionów
<ol>
	<li>W badaniach nad przeżywalnością zarodków należy ocenić żywotność pod mikroskopem stereoskopowym w 18 h, 24 h i 48 h po infekcji (hpi). Zarodek uznaje się za martwy w momencie zatrzymania akcji serca i krążenia krwi.</li>
	<li>Wskaźniki śmiertelności/przeżywalności należy przedstawić za pomocą schodkowych wykresów Kaplana-Meiera (GraphPad Prism 8.3.0), a dane przeanalizować testem log-rank lub innymi odpowiednimi testami statystycznymi.</li>
</ol>
7. Oznaczanie miana bakterii w zakażonych embrionach (Rycina 1)
<ol>
	<li>Wykonaj oznaczanie CFU z zakażonych embrionów w czterech różnych punktach czasowych: 1,5 hpi, tj. bezpośrednio po zakażeniu, oraz po każdym przemyciu w 24, 48 i 72 hpi, używając 5 embrionów na punkt czasowy. Wszystkie czynności wykonuj pod wyciągiem bezpieczeństwa mikrobiologicznego.</li>
	<li>Dla każdej zakażonej larwy przygotuj probówki do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 mL zawierające 95 µL 1x PBS. Objętość larwy wynosi około 5 µL.</li>
	<li>Przenieś larwy do płytki 6-dołkowej z 4 mL wody dla ryb bez błękitu metylenowego, aby przeprowadzić przemywanie i usunąć bakterie planktoniczne.</li>
	<li>Umieść każdy embrion w probówce do mikrocentryfugi zawierającej PBS, dodając jak najmniej cieczy. Dotknij jedynie pipetą szklaną z larwą powierzchni PBS, aby larwa opadła do probówki bez dodawania dodatkowego płynu.</li>
	<li>Rozgnieć embriony pojedynczo, używając tłuczka przy ściance probówki do mikrocentryfugi. Trzymaj tłuczek wewnątrz probówki. Proces zakończ, gdy nie pozostanie żaden nienaruszony embrion.</li>
	<li>Podnieś tłuczek i dodaj 100 µL PBS-Triton 2%, aby wypłukać resztki bakterii z tłuczka (stężenie końcowe wynosi 1%). Wymieszaj w wortexie i odczekaj 10 min. Nie przetwarzaj więcej niż pięciu embrionów jednocześnie.</li>
	<li>Nanieś 3x po 10 µL nierozcieńczonych lizatów na płytki z agarem LB dla każdego embrionu. Wykonaj rozcieńczenia seryjne lizatów w płytce 96-dołkowej do uzyskania rozcieńczenia 10-3 za pomocą pipety wielokanałowej. Nanieś 3x po 10 µL rozcieńczeń 10-1, 10-2 i 10-3 obok próbek nierozcieńczonych na płytkach z agarem LB i inkubuj płytki przez noc w 37 °C.</li>
	<li>Policz fluorescencyjne kolonie dla każdego rozcieńczenia pod mikroskopem i oblicz liczbę CFU na jeden zakażony embrion.</li>
</ol>
<img alt="Oś czasu infekcji w mikroskopii; schemat urazu, infekcji, analizy CFU i testu przeżywalności bakterii." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68464/68464fig1.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Oś czasu eksperymentu w celu oceny wirulencji i trwałości bakterii w embrionie danio pręgowanego. Skróty: CFU = jednostki tworzące kolonie, hpi = godziny po infekcji. Rysunek został stworzony za pomocą BioRender.com. Rysunek został zmodyfikowany na podstawie 13. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68464/68464fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.</a>
8. Testowanie leczenia przeciwko przetrwałej infekcji (Rycina 2)
<ol>
	<li>Przygotować roztwory antybiotyków w stężeniu 40-krotnie przekraczającym minimalne stężenie hamujące (MIC) dla szczepu P. aeruginosa. Przed rozpoczęciem eksperymentu należy sprawdzić, czy wybrane stężenie antybiotyku nie jest toksyczne dla embrionów.</li>
	<li>Postępować zgodnie z krokami 7.1 i 7.2. Do płytki 24-dołkowej nalać 1 mL wody dla ryb z dodatkiem antybiotyków i przygotować próbę kontrolną bez antybiotyków.</li>
	<li>Przenieść pięć embrionów z etapu płukania na każdą próbę do płytki 24-dołkowej, dodając jak najmniejszą ilość cieczy.</li>
	<li>Inkubować z antybiotykami przez 30 min w temperaturze pokojowej. Wrócić do kroku 7.3. w celu określenia ładunku bakteryjnego po zastosowaniu leczenia.</li>
</ol>
<img alt="Oś czasu infekcji i kolonizacji bakteryjnej, przedstawiająca pomiary CFU oraz leczenie antybiotykami." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68464/68464fig2.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2: Procedura eksperymentalna zastosowana do oceny skuteczności leczenia antybiotykami w zakażonych embrionach. Skróty: ATB 30' = leczenie antybiotykami przez 30 min, CFU = jednostki tworzące kolonie, hpi = godziny po infekcji. Rysunek został stworzony za pomocą BioRender.com. Rycina została zmodyfikowana na podstawie źródła13. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68464/68464fig2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>

<ol><li>Garcia-Clemente, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+Pseudomonas+aeruginosa+Infection+on+Patients+with+Chronic+Inflammatory+Airway+Diseases%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Med%22%5BJournal%5D)">Impact of Pseudomonas aeruginosa Infection on Patients with Chronic Inflammatory Airway Diseases.</a> J Clin Med. 9 (12), 3800(2020).</li>
<li>Serra, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+wound+infections%3A+the+role+of+Pseudomonas+aeruginosa+and+Staphylococcus+aureus%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Rev+Anti-Infect%22%5BJournal%5D)">Chronic wound infections: the role of Pseudomonas aeruginosa and Staphylococcus aureus.</a> Expert Rev Anti-Infect. 13 (5), 605-613 (2015).</li>
<li>Tacconelli, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discovery%2C+research%2C+and+development+of+new+antibiotics%3A+the+WHO+priority+list+of+antibiotic-resistant+bacteria+and+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Discovery, research, and development of new antibiotics: the WHO priority list of antibiotic-resistant bacteria and tuberculosis.</a> Lancet Infect Dis. 18, 318-327 (2018).</li>
<li>La Rosa, R., Johansen, H. K., Molin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Persistent+Bacterial+Infections%2C+Antibiotic+Treatment+Failure%2C+and+Microbial+Adaptive+Evolution%5BTitle%5D)+AND+%22Antibiotics%22%5BJournal%5D)">Persistent Bacterial Infections, Antibiotic Treatment Failure, and Microbial Adaptive Evolution.</a> Antibiotics. 11 (3), 419(2022).</li>
<li>Kember, M., Grandy, S., Raudonis, R., Cheng, Z. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-Canonical+Host+Intracellular+Niche+Links+to+New+Antimicrobial+Resistance+Mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Pathogens%22%5BJournal%5D)">Non-Canonical Host Intracellular Niche Links to New Antimicrobial Resistance Mechanism.</a> Pathogens. 11 (2), 220(2022).</li>
<li>Lorenz, A., Pawar, V., Häussler, S., Weiss, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insights+into+host-pathogen+interactions+from+state-of-the-art+animal+models+of+respiratory+Pseudomonas+aeruginosa+infections%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Insights into host-pathogen interactions from state-of-the-art animal models of respiratory Pseudomonas aeruginosa infections.</a> FEBS Lett. 590, 3941-3959 (2016).</li>
<li>Reyne, N., McCarron, A., Cmielewski, P., Parsons, D., Donnelley, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((To+bead+or+not+to+bead%3A+A+review+of+Pseudomonas+aeruginosa+lung+infection+models+for+cystic+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Physiol%22%5BJournal%5D)">To bead or not to bead: A review of Pseudomonas aeruginosa lung infection models for cystic fibrosis.</a> Front Physiol. 14, 1104856(2023).</li>
<li>Pletzer, D., Mansour, S. C., Wuerth, K., Rahanjam, N., Hancock, R. E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+Mouse+Model+for+Chronic+Infections+by+Gram-Negative+Bacteria+Enabling+the+Study+of+Anti-Infective+Efficacy+and+Host-Microbe+Interactions%5BTitle%5D)+AND+%22mBio%22%5BJournal%5D)">New Mouse Model for Chronic Infections by Gram-Negative Bacteria Enabling the Study of Anti-Infective Efficacy and Host-Microbe Interactions.</a> mBio. 8, e00140-e00217 (2017).</li>
<li>Pont, S., Blanc-Potard, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+Embryo+Infection+Model+to+Investigate+Pseudomonas+aeruginosa+Interaction+With+Innate+Immunity+and+Validate+New+Therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Infect+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Zebrafish Embryo Infection Model to Investigate Pseudomonas aeruginosa Interaction With Innate Immunity and Validate New Therapeutics.</a> Front Cell Infect Microbiol. 11, 745851(2021).</li>
<li>Nogaret, P., El Garah, F., Blanc-Potard, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Novel+Infection+Protocol+in+Zebrafish+Embryo+to+Assess+Pseudomonas+aeruginosa+Virulence+and+Validate+Efficacy+of+a+Quorum+Sensing+Inhibitor+In+Vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Pathogens%22%5BJournal%5D)">A Novel Infection Protocol in Zebrafish Embryo to Assess Pseudomonas aeruginosa Virulence and Validate Efficacy of a Quorum Sensing Inhibitor In Vivo.</a> Pathogens. 10 (4), 401(2021).</li>
<li>Phennicie, R. T., Sullivan, M. J., Singer, J. T., Yoder, J. A., Kim, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+resistance+to+Pseudomonas+aeruginosa+infection+in+zebrafish+is+mediated+by+the+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immunity%22%5BJournal%5D)">Specific resistance to Pseudomonas aeruginosa infection in zebrafish is mediated by the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator.</a> Infect Immunity. 78 (11), 4542-4550 (2010).</li>
<li>Kumar, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual+Transcriptomics+of+Host-Pathogen+Interaction+of+Cystic+Fibrosis+Isolate+Pseudomonas+aeruginosa+PASS1+With+Zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Infect+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Dual Transcriptomics of Host-Pathogen Interaction of Cystic Fibrosis Isolate Pseudomonas aeruginosa PASS1 With Zebrafish.</a> Front Cell Infect Microbiol. 8, 406(2018).</li>
<li>Pont, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+Pseudomonas+aeruginosa+persist+and+evade+antibiotic+treatment+in+a+wound+infection+model%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Intracellular Pseudomonas aeruginosa persist and evade antibiotic treatment in a wound infection model.</a> PLoS Pathogens. 21 (2), e1012922(2025).</li>
<li>Facchini, M., De Fino, I., Riva, C., Bragonzi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long+Term+Chronic+Pseudomonas+aeruginosa+Airway+Infection+in+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Long Term Chronic Pseudomonas aeruginosa Airway Infection in Mice.</a> J Vis Exp. (85), e51019(2014).</li>
<li>Bianconi, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+genomics+and+biological+characterization+of+sequential+Pseudomonas+aeruginosa+isolates+from+persistent+airways+infection%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genom%22%5BJournal%5D)">Comparative genomics and biological characterization of sequential Pseudomonas aeruginosa isolates from persistent airways infection.</a> BMC Genom. 16, 1105(2015).</li>
<li>Buyck, J. M., Tulkens, P. M., Van Bambeke, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pharmacodynamic+evaluation+of+the+intracellular+activity+of+antibiotics+towards+Pseudomonas+aeruginosa+PAO1+in+a+model+of+THP-1+human+monocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicro+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Pharmacodynamic evaluation of the intracellular activity of antibiotics towards Pseudomonas aeruginosa PAO1 in a model of THP-1 human monocytes.</a> Antimicro Agents Chemother. 57 (5), 2310-2318 (2013).</li>
<li>Volpe, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Permeability+classification+of+representative+fluoroquinolones+by+a+cell+culture+method%5BTitle%5D)+AND+%22Aaps+Pharmsci%22%5BJournal%5D)">Permeability classification of representative fluoroquinolones by a cell culture method.</a> Aaps Pharmsci. 6 (2), 1-6 (2004).</li>
<li>Pang, Z., Raudonis, R., Glick, B. R., Lin, T. J., Cheng, Z. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibiotic+resistance+in+Pseudomonas+aeruginosa%3A+mechanisms+and+alternative+therapeutic+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Adv%22%5BJournal%5D)">Antibiotic resistance in Pseudomonas aeruginosa: mechanisms and alternative therapeutic strategies.</a> Biotechnol Adv. 37 (1), 177-192 (2019).</li>
<li>Lamberti, Y., Surmann, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+intracellular+phase+of+extracellular+respiratory+tract+bacterial+pathogens+and+its+role+on+pathogen-host+interactions+during+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">The intracellular phase of extracellular respiratory tract bacterial pathogens and its role on pathogen-host interactions during infection.</a> Curr Opin Infect Dis. 34 (3), 197-205 (2021).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów.

Modelowanie przewlekłych zakażeń bakteryjnych in vivo jest niezbędne do zrozumienia patogenezy i oceny skuteczności leczenia. W tym przypadku ustaliliśmy model trwałego zakażenia ran u danio pręgowanego, nadający się do testowania leków przeciwko P. aeruginosa. Wypełnia to lukę w obecnej metodologii związaną z brakiem modeli in vivo nadających się do badań przesiewowych leków przeciwko przewlekłym infekcjom bakteryjnym. Warto zauważyć, że model ten naśladuje główną cechę przewlekłości, tj. adap...

<a href="https://app.jove.com/t/6639">This corrects</a> the article <a href="https://dx.doi.org/10.3791/68464">10.3791/68464</a>

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/68464">Modeling Persistent Pseudomonas aeruginosa Infection in Wounded Zebrafish Larvae</a>. The Authors&#160;section was&#160;updated.

Erratum: Modeling Persistent Pseudomonas aeruginosa Infection in Wounded Zebrafish Larvae

Pseudomonas aeruginosa jest bakterią chorobotwórczyą Gram-ujemną odpowiedzialną za przewlekłą kolonizację u pacjentów z mukowiscydozą (CF) i ranami 1,2. P. aeruginosa należy do grupy patogenów ESKAPEE i jest uznawany przez Światową Organizację Zdrowia za krytyczny priorytet dla nowych terapii3. Przewlekłe infekcje bakteryjne są trudne do leczenia antybiotykami ze względu na adaptacyjną oporność na leki, która jest związana z wieloma czynnikami, w tym stylem życia biofilmu, zmniejszonym wzrostem, niską aktywnością metaboliczną4, a także wewnątrzkomórkowym cyklem życiowym5. Modele in vivo są niezbędne do lepszego zrozumienia i leczenia przewlekłego zakażenia P. aeruginosa.
Podczas gdy do oceny zjadliwości P. aeruginosa wykorzystano kilka modeli in vivo, bardzo niewiele modeli pozwoliło naśladować trwałą kolonizację i przetestować skuteczność leczenia przewlekłej infekcji6. Modele zwierzęce do badania przewlekłej patogenezy P. aeruginosa opierają się głównie na podawaniu bakterii osadzonych w kulkach agarowych do płuc7. Opracowano również mysi model przewlekłej infekcji skórnej8. Danio pręgowany (Danio rerio), który ma wiele zalet (umiarkowane problemy etyczne, niski koszt, wysoka produkcja jaj), jest atrakcyjnym modelem kręgowców in vivo do testów narkotykowych, który umożliwia również wizualizację w czasie rzeczywistym P. aeruginosa i komórek gospodarza w wysokiej rozdzielczości dzięki przezroczystości zarodka9.
Jak podano w przeglądzie, we wcześniejszych badaniach szczepy laboratoryjne P. aeruginosa (PAO1, PA14 i PAK) były stosowane głównie w modelu zakażenia danio pręgowanego, gdzie powodowały ostrą infekcję9. Niedawno opracowaliśmy protokół leczenia ran oparty na zanurzeniu zarodków po amputacji płetwy ogonowej w szczepie P. aeruginosa PAO1, który spowodował ostre zakażenie10. Zakażenie przez zanurzenie uszkodzonych zarodków, które odzwierciedla naturalny sposób zakażenia P. aeruginosa, jest sposobem infekcji, który jest powtarzalny i łatwiejszy niż mikroiniekcja.
Naszym celem było ustalenie protokołu uporczywego zakażenia P. aeruginosa u danio pręgowanego. W tym celu nasza strategia polegała na wykorzystaniu szczepów klinicznych P. aeruginosa, które rzadko były brane pod uwagę w modeludanio pręgowanego 11,12, w połączeniu z drogą zakażenia rany. W tym miejscu opisujemy protokół, który opracowaliśmy w celu modelowania trwałej kolonizacji zarodków danio pręgowanego w oparciu o zakażenie rany przez izolaty kliniczne P. aeruginosa CF. Ten nowatorski model in vivo spełnia nasze oczekiwania i oferuje nowe możliwości oceny skuteczności terapii w kontekście trwałej kolonizacji, jak opisano tutaj i w towarzyszącym mu artykule13.

<table><tbody><tr><td>Metanosulfonian etylo-3-aminobenzoesanu</td><td>Sigma</td><td>E50521 powiedział:</td><td></td></tr><tr><td>Śrut tłokowy</td><td>Eppendorf, Holandia</td><td>33522</td><td></td></tr><tr><td>sole morskie</td><td>Instant Ocean, Systemy akwariowe&nbsp; &nbsp;</td><td>218035</td><td></td></tr><tr><td>Tryton</td><td>Targi Euromedex</td><td>2000-B</td><td></td></tr></tbody></table>

modelowanie uporczywego zakażenia pseudomonas aeruginosa u zranionych larw danio pręgowanego

Modeling Persistent Pseudomonas aeruginosa Infection in Wounded Zebrafish Larvae

Pseudomonas aeruginosa jest głównym czynnikiem chorobotwórczym u ludzi, szczególnie w przewlekłych zakażeniach ran i przewlekłych zakażeniach płuc (zwłaszcza u pacjentów z mukowiscydozą). Przewlekłe infekcje bakteryjne są oporne na antybiotyki i istnieje pilna potrzeba stworzenia modeli przewlekłych zakażeń in vivo nadających się do badań przesiewowych leków w celu opracowania skutecznych terapii. W tym miejscu opisujemy protokół zakażenia izolatem klinicznym P. aeruginosa od pacjenta z mukowiscydozą, wykazującym konstytutywną ekspresję białka zielonej fluorescencji (GFP) w celu wywołania trwałego zakażenia rany u larw danio pręgowanego. Zarodki z uszkodzeniem płetwy ogonowej zanurza się w zawiesinie bakteryjnej na 1,5 godziny, myje i monitoruje pod kątem obciążenia bakteryjnego przez 3 dni. Obciążenie bakteryjne oceniano ilościowo codziennie, licząc fluorescencyjne jednostki tworzące kolonie (CFU) z larw zakażonych lizą, co pozwoliło na trwałą infekcję. Co więcej, przetrwałe bakterie P. aeruginosa były oporne na antybiotykoterapię. Ten nowatorski model in vivo przetrwałego zakażenia P. aeruginosa daje możliwość oceny skuteczności innowacyjnych metod leczenia przewlekłych zakażeń.

Zarodek rybki danio jest odpowiednim modelem do monitorowania przetrwałej infekcji izolatami P. aeruginosa pochodzącymi od pacjentów z mukowiscydozą (CF) 
Wykorzystaliśmy model imersji uszkodzonych zarodków do oceny in vivo zjadliwości trzech izolatów CF (A6520, B6513 oraz C6490)9. Oceniliśmy również zachowanie dobrze scharakteryzowanego późnego izolatu CF, RP73, znanego z długotrwałej kolonizacji dróg oddechowych myszy<sup cl...

Obecnie brakuje modeli in vivo , które można by poddać badaniom przesiewowym w kierunku przewlekłych zakażeń bakteryjnych. W tym miejscu opisujemy protokół zakażenia rany za pomocą izolatu klinicznego Pseudomonas aeruginosa w celu wywołania trwałej infekcji u larw danio pręgowanego.

Modelowanie uporczywego zakażenia Pseudomonas aeruginosa u zranionych larw danio pręgowanego

Pseudomonas aeruginosa is a major human pathogen, particularly in chronic wound infections and chronic pulmonary infections (especially in patients with ...

Przewlekłe zakażenie wywołane przez bakterię Pseudomonas aeruginosa jest tolerancyjne na antybiotyki i bardzo trudne do leczenia. Naszym celem jest opracowanie modelu in vivo, który przyspieszy odkrywanie skutecznych terapii. Leki przeciwbakteryjne są najczęściej poddawane badaniom przesiewowym in vitro, a testowanie leków na przewlekle zakażonych myszach jest złożonym wyzwaniem. Aby wypełnić lukę między tymi dwoma podejściami, proponujemy alternatywny model przedkliniczny z wykorzystaniem zranionych larw danio pręgowanego. Nasz model uporczywego zakażenia u danio pręgowanego oparty na zastosowaniu klinicznego szczepu Pseudomonas aeruginosa odtwarza tolerancję na antybiotyki. Podczas gdy mikroiniekcja jest powszechnie stosowana do infekowania larw danio pręgowanego, nasza metoda zraniania odzwierciedla naturalny tryb infekcji i dobrze nadaje się do badań przesiewowych związków terapeutycznych.[Narrator] Na początek umieść igły o rozmiarze 25 na dwóch pałeczkach, aby ułatwić obsługę. Za pomocą mikroskopu stereoskopowego zidentyfikuj i usuń zarodki, które wykazują nieprawidłowy rozwój lub są niezdolne do życia. Przesuwaj naczynie ruchem okrężnym, aby zebrać pozostałe zarodki w środku. Teraz użyj dwóch pionowo ustawionych igieł, aby wyizolować każdy zarodek, umieszczając lewą igłę na ogonie, aby utrzymać ciało prosto. Prawą igłą wykonaj pojedyncze nacięcie na krawędzi struny grzbietowej, aby usunąć płetwę. Wykonaj każde cięcie szybko, upewniając się, że wszystkie zarodki zostaną zanurzone w roztworze bakteryjnym w ciągu 10 minut. W celu przeprowadzenia procedury infekcji należy zmieszać roztwór Pseudomonas aeruginosa w komorze bezpieczeństwa biologicznego typu drugiego i dodać go w ilości około 10 razy 10 do mocy siedmiu jednostek tworzących kolonie na mililitr do płytki sześciodołkowej. Użyj jednorazowej szklanej pipety Pasteura, aby zebrać zranione zarodki i przenieść je do roztworu bakteryjnego. Inkubować sześciodołkową płytkę w temperaturze 28 stopni Celsjusza przez 1,5 godziny. Po inkubacji pobrać zakażone zarodki i umieścić je w bezpiecznym mikrobiologicznym miejscu do mycia. Teraz przenieś zarodki za pomocą szklanej pipety do 10 mililitrów wody dla ryb bez błękitu metylenowego, minimalizując przenoszoną objętość i inkubuj przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Następnie ponownie przenieś zarodki za pomocą szklanej pipety do czterech mililitrów wody rybnej bez błękitu metylenowego i krótko inkubuj. Następnie za pomocą pipety przenieś zakażone zarodki pojedynczo na 24-dołkową płytkę, dodając jeden mililitr wody rybnej bez błękitu metylenowego do każdej studzienki. Umieścić 24-dołkową płytkę w inkubatorze ustawionym na 28 stopni Celsjusza. Przygotuj 1,5-mililitrowe probówki wirówkowe z 95 mikrolitrami 1X PBS dla każdej zainfekowanej larwy. Przenieś larwy do sześciodołkowej płytki zawierającej cztery mililitry wody dla ryb bez błękitu metylenowego, aby umyć i usunąć bakterie planktonowe. Umieść każdy umyty zarodek w probówce mikrowirówkowej z PBS, przenosząc jak najmniej płynu. Teraz użyj tłuczka, aby zmiażdżyć każdy zarodek o bok probówki do mikrowirówki, pozostawiając następnie tłuczek w probówce. Następnie podnieś tłuczek i dodaj 100 mikrolitrów 2% PBS Triton, aby wypłukać resztki bakterii z tłuczka, osiągając końcowe stężenie 1%. Wiruj probówkę i inkubuj przez 10 minut. Następnie dozuj trzy 10-mikrolitrowe krople nierozcieńczonego lizatu z każdego zarodka na płytki agarowe LB. Za pomocą pipety wielokanałowej seryjnie rozcieńczyć każdy lizat w 96-dołkowej płytce do 10 do mocy rozcieńczenia minus trzy. Na koniec dozuj trzy 10-mikrolitrowe krople rozcieńczeń obok nierozcieńczonych miejsc. I inkubować przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Wszystkie cztery izolaty Pseudomonas aeruginosa mukowiscydozy były znacznie mniej zjadliwe w modelu uszkodzonego zarodka w porównaniu ze szczepem referencyjnym PAO1. W zarodkach zakażonych dwoma izolatami obciążenie bakteryjne uległo znacznemu zmniejszeniu w ciągu trzech dni, co wskazuje na eliminację bakterii. W przeciwieństwie do tego, dwa pozostałe izolaty, B6513 i RP73, utrzymywały stosunkowo stabilne obciążenie bakteryjne od 18 do 65 godzin po infekcji po początkowym spadku, co sugeruje trwałość. Krótka, 30-minutowa kuracja tobramycyną w ciągu 1,5 godziny po zakażeniu drastycznie zmniejszyła obciążenie bakteryjne w zarodkach zakażonych izolatami B6513. Tobramycyna nie miała istotnego wpływu na obciążenie bakteryjne po podaniu 24 lub 48 godzin po zakażeniu, wykazując oporność w utrzymujących się stadiach infekcji.

modeling-persistent-pseudomonas-aeruginosa-infection-wounded

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Przezroczyste zarodki rybek danio-ostrolepisnych okazały się użytecznymi modelami gospodarzy do wizualizacji i funkcjonalnego badania oddziaływań między komórkami odporności wrodzonej a wewnątrzkomórkowymi patogenami bakteryjnymi, takimi jak Salmonella typhimurium oraz Mycobacterium marinum. Mikrowstrzykiwanie bakterii oraz wielobarwne obrazowanie fluorescencyjne to kluczowe techniki stosowane w modelach infekcji zarodków rybek danio-ostrolepisnych.

Zakażanie zarodków danio pręgowanego wewnątrzkomórkowymi patogenami bakteryjnymi

Szybki rozwój, niewielki rozmiar i przezroczystość danio pręgowanego stanowią ogromne zalety w badaniach nad wrodzonym immunologicznym kontrolowaniem infekcji1-4. W niniejszej pracy prezentujemy techniki zakażania larw danio pręgowanego grzybiczym patogenem Candida albicans za pomocą mikroiniekcji – metodologii wykorzystanej niedawno do wykazania roli aktywności NADPH oksydazy fagocytów w kontrolowaniu dimorfizmu grzybów5.

Nieinwazyjne obrazowanie rozsianej kandydozy u larw rybek danio

Ten film opisuje technikę iniekcji dootrzewnowej, metodę dostarczania roztworów do jamy brzusznej dorosłego danio pręgowanego.

Wstrzyknięcie dootrzewnowe: metoda dostarczania roztworu do jamy brzusznej dorosłego danio pręgowanego

Źródło: Luukinen, H. i in. Modelowanie gruźlicy u dorosłych danio zakażonych Mycobacterium marinum .  J. Vis. Exp. (2018).

Ocena roli odporności gospodarza w infekcji grzybiczej z wykorzystaniem modelu danio pręgowanego

Źródło: Flores, E. i inni. Wykorzystanie pierwotniaka Paramecium caudatum jako nośnika infekcji pokarmowych u larw danio danio. J. Vis. Exp. (2019).Ten film demonstruje metodę ustalania modelu bakteryjnego zakażenia jelit przenoszonego przez żywność u larw danio pręgowanego poprzez karmienie ich paramecjami zakażonymi fluorescencyjnym E. coli.

Modelowanie infekcji jelit u larw danio pręgowanego przy użyciu bakterii przenoszonych przez żywność

In vivo czasoprzestrzenne interakcje patogenów i obrony immunologicznej na poziomie błony śluzowej nie są łatwe do zobrazowania u istniejących kręgowców gospodarzy. Przedstawiona metoda opisuje wszechstronną platformę do badania kandydozy błony śluzowej u żywych kręgowców przy użyciu pęcherza pławnego młodego danio pręgowanego jako miejsca zakażenia.

Modelowanie kandydozy błony śluzowej u larw danio pręgowanego przez wstrzyknięcie do pęcherza pławnego

Optycznie przezroczyste embriony danio pręgowanego są szeroko stosowane do badania i wizualizacji w czasie rzeczywistym interakcji między patogennymi mikroorganizmami a wrodzonymi komórkami odpornościowymi. Mikroiniekcja Mycobacterium abscessus, w połączeniu z obrazowaniem fluorescencyjnym, służy do badania podstawowych cech chorobotwórczych, takich jak tworzenie się pępowiny w zarodkach danio pręgowanego.

Rozszyfrowywanie i obrazowanie patogenezy i sznurowania Mycobacterium abscessus w zarodkach danio pręgowanego

Tutaj prezentujemy protokół modelowania ludzkiej gruźlicy u dorosłego danio pręgowanego przy użyciu jego naturalnego patogenu Mycobacterium marinum. Wyekstrahowane DNA i RNA z narządów wewnętrznych zakażonego danio pręgowanego można wykorzystać do ujawnienia całkowitego obciążenia prątkami u ryb i odpowiedzi immunologicznej gospodarza za pomocą qPCR.

Modelowanie gruźlicy u dorosłych ryb pręgowanych zakażonych Mycobacterium marinum

Niniejsze badanie opisuje model zarodka danio pręgowanego do wizualizacji in vivo i analizy przyżyciowej infekcji związanej z biomateriałem w czasie na podstawie mikroskopii fluorescencyjnej. Model ten jest obiecującym systemem uzupełniającym modele zwierzęce ssaków, takie jak modele mysie, do badania zakażeń związanych z biomateriałem in vivo.

Model zarodka danio pręgowanego do wizualizacji in vivo i analizy przyżyciowej zakażenia Staphylococcus aureus związanego z biomateriałem

Opisujemy protokół opóźnionej inokulacji do generowania przewlekłych infekcji ran u myszy immunokompetentnych.

Model opóźnionej inokulacji przewlekłego zakażenia ran Pseudomonas aeruginosa

Ten protokół opisuje model infekcji Aspergillus u larw danio pręgowanego. Zarodniki Aspergillus są mikrowstrzykiwane do tyłomózgowia larw, a leczenie chemiczne stosuje się w celu wywołania immunosupresji. Postęp infekcji jest monitorowany za pomocą codziennego zestawu do obrazowania w celu monitorowania wzrostu grzybów i odpowiedzi immunologicznej, a także liczenia żywych zarodników przez posiewanie jednostek tworzących kolonie.

Zakażenie larw danio pręgowanego zarodnikami Aspergillus w celu analizy interakcji gospodarz-patogen

Poznaj modelowanie uporczywego zakażenia Pseudomonas aeruginosa u zranionych larw danio pręgowanego. Ta metoda umożliwia badanie tolerancji antybiotykowej i przyspiesza odkrywanie nowych terapii przeciwbakteryjnych.

Modelowanie uporczywego zakażenia Pseudomonas aeruginosa u zranionych larw danio pręgowanego

Przeglądaj więcej filmów