Modelowanie uporczywego zakażenia Pseudomonas aeruginosa u zranionych larw danio pręgowanego
13 czerwca 2025
Obecnie brakuje modeli in vivo , które można by poddać badaniom przesiewowym w kierunku przewlekłych zakażeń bakteryjnych. W tym miejscu opisujemy protokół zakażenia rany za pomocą izolatu klinicznego Pseudomonas aeruginosa w celu wywołania trwałej infekcji u larw danio pręgowanego.
Przewlekłe zakażenie wywołane przez bakterię Pseudomonas aeruginosa jest tolerancyjne na antybiotyki i bardzo trudne do leczenia. Naszym celem jest opracowanie modelu in vivo, który przyspieszy odkrywanie skutecznych terapii. Leki przeciwbakteryjne są najczęściej poddawane badaniom przesiewowym in vitro, a testowanie leków na przewlekle zakażonych myszach jest złożonym wyzwaniem. Aby wypełnić lukę między tymi dwoma podejściami, proponujemy alternatywny model przedkliniczny z wykorzystaniem zranionych larw danio pręgowanego. Nasz model uporczywego zakażenia u danio pręgowanego oparty na zastosowaniu klinicznego szczepu Pseudomonas aeruginosa odtwarza tolerancję na antybiotyki. Podczas gdy mikroiniekcja jest powszechnie stosowana do infekowania larw danio pręgowanego, nasza metoda zraniania odzwierciedla naturalny tryb infekcji i dobrze nadaje się do badań przesiewowych związków terapeutycznych.
[Narrator] Na początek umieść igły o rozmiarze 25 na dwóch pałeczkach, aby ułatwić obsługę. Za pomocą mikroskopu stereoskopowego zidentyfikuj i usuń zarodki, które wykazują nieprawidłowy rozwój lub są niezdolne do życia. Przesuwaj naczynie ruchem okrężnym, aby zebrać pozostałe zarodki w środku. Teraz użyj dwóch pionowo ustawionych igieł, aby wyizolować każdy zarodek, umieszczając lewą igłę na ogonie, aby utrzymać ciało prosto. Prawą igłą wykonaj pojedyncze nacięcie na krawędzi struny grzbietowej, aby usunąć płetwę. Wykonaj każde cięcie szybko, upewniając się, że wszystkie zarodki zostaną zanurzone w roztworze bakteryjnym w ciągu 10 minut. W celu przeprowadzenia procedury infekcji należy zmieszać roztwór Pseudomonas aeruginosa w komorze bezpieczeństwa biologicznego typu drugiego i dodać go w ilości około 10 razy 10 do mocy siedmiu jednostek tworzących kolonie na mililitr do płytki sześciodołkowej. Użyj jednorazowej szklanej pipety Pasteura, aby zebrać zranione zarodki i przenieść je do roztworu bakteryjnego. Inkubować sześciodołkową płytkę w temperaturze 28 stopni Celsjusza przez 1,5 godziny. Po inkubacji pobrać zakażone zarodki i umieścić je w bezpiecznym mikrobiologicznym miejscu do mycia. Teraz przenieś zarodki za pomocą szklanej pipety do 10 mililitrów wody dla ryb bez błękitu metylenowego, minimalizując przenoszoną objętość i inkubuj przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Następnie ponownie przenieś zarodki za pomocą szklanej pipety do czterech mililitrów wody rybnej bez błękitu metylenowego i krótko inkubuj. Następnie za pomocą pipety przenieś zakażone zarodki pojedynczo na 24-dołkową płytkę, dodając jeden mililitr wody rybnej bez błękitu metylenowego do każdej studzienki. Umieścić 24-dołkową płytkę w inkubatorze ustawionym na 28 stopni Celsjusza. Przygotuj 1,5-mililitrowe probówki wirówkowe z 95 mikrolitrami 1X PBS dla każdej zainfekowanej larwy. Przenieś larwy do sześciodołkowej płytki zawierającej cztery mililitry wody dla ryb bez błękitu metylenowego, aby umyć i usunąć bakterie planktonowe. Umieść każdy umyty zarodek w probówce mikrowirówkowej z PBS, przenosząc jak najmniej płynu. Teraz użyj tłuczka, aby zmiażdżyć każdy zarodek o bok probówki do mikrowirówki, pozostawiając następnie tłuczek w probówce. Następnie podnieś tłuczek i dodaj 100 mikrolitrów 2% PBS Triton, aby wypłukać resztki bakterii z tłuczka, osiągając końcowe stężenie 1%. Wiruj probówkę i inkubuj przez 10 minut. Następnie dozuj trzy 10-mikrolitrowe krople nierozcieńczonego lizatu z każdego zarodka na płytki agarowe LB. Za pomocą pipety wielokanałowej seryjnie rozcieńczyć każdy lizat w 96-dołkowej płytce do 10 do mocy rozcieńczenia minus trzy. Na koniec dozuj trzy 10-mikrolitrowe krople rozcieńczeń obok nierozcieńczonych miejsc. I inkubować przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Wszystkie cztery izolaty Pseudomonas aeruginosa mukowiscydozy były znacznie mniej zjadliwe w modelu uszkodzonego zarodka w porównaniu ze szczepem referencyjnym PAO1. W zarodkach zakażonych dwoma izolatami obciążenie bakteryjne uległo znacznemu zmniejszeniu w ciągu trzech dni, co wskazuje na eliminację bakterii. W przeciwieństwie do tego, dwa pozostałe izolaty, B6513 i RP73, utrzymywały stosunkowo stabilne obciążenie bakteryjne od 18 do 65 godzin po infekcji po początkowym spadku, co sugeruje trwałość. Krótka, 30-minutowa kuracja tobramycyną w ciągu 1,5 godziny po zakażeniu drastycznie zmniejszyła obciążenie bakteryjne w zarodkach zakażonych izolatami B6513. Tobramycyna nie miała istotnego wpływu na obciążenie bakteryjne po podaniu 24 lub 48 godzin po zakażeniu, wykazując oporność w utrzymujących się stadiach infekcji.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejsze badanie przedstawia nowy model in vivo z wykorzystaniem zranionych larw zebrafish do badania przewlekłych infekcji wywoływanych przez Pseudomonas aeruginosa. Model ten ma na celu ułatwienie przesiewania leków przeciwko uporczywym infekcjom bakteryjnym.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Mikrobiologia
- Choroby zakaźne
- Farmakologia
Wstęp
- Pseudomonas aeruginosa jest znana z tolerancji na antybiotyki i trudności w leczeniu.
- Obecne metody przesiewowe leków opierają się głównie na modelach in vitro lub złożonych modelach in vivo.
- Istnieje potrzeba opracowania prostszych i skutecznych modeli przedklinicznych do testowania leków.
- Larwy danio pręgowanego zapewniają wyjątkową możliwość badania infekcji w żywym organizmie.
Cel badania
- Opracowanie modelu danio pręgowanego, który naśladuje przewlekłe infekcje bakteryjne.
- Ocena skuteczności leków przeciwbakteryjnych w scenariuszu uporczywej infekcji.
- Zapewnienie bardziej naturalnej metody infekcji w porównaniu do tradycyjnych technik mikroiniekcji.
Zastosowane metody
- Wywołanie ran u larw zebrafish w celu stworzenia modelu infekcji.
- Zakażenie klinicznym izolatem Pseudomonas aeruginosa.
- Ocena ładunku bakteryjnego oraz skuteczności antybiotyków w czasie.
- Zastosowanie różnych etapów inkubacji i przemywania w celu przygotowania zainfekowanych larw do analizy.
Główne wyniki
- Zakażone embriony wykazywały zróżnicowaną liczbę bakterii, co wskazuje na różnice w wirulencji poszczególnych izolatów.
- Leczenie tobramycyną znacząco zredukowało liczbę bakterii, gdy lek podano krótko po zakażeniu.
- Niektóre izolaty utrzymały stabilną liczbę bakterii, co sugeruje ich persistencję w modelu zakażenia.
- Model ten skutecznie odtwarza tolerancję na antybiotyki obserwowaną w zakażeniach przewlekłych.
Wnioski
- Model larw danio pręgowanego jest obiecującym narzędziem do badania zakażeń przewlekłych.
- Podejście to może przyspieszyć odkrywanie skutecznych terapii antybakteryjnych.
- Przyszłe badania mogą opierać się na tym modelu w celu przetestowania dodatkowych związków terapeutycznych.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Przewlekłe zakażenia Pseudomonas aeruginosa stanowią istotne wyzwanie translacyjne ze względu na tolerancję na antybiotyki oraz ograniczoną wartość prognostyczną badań przesiewowych in vitro. Niniejszy model wykorzystujący larwy danio pręgowanego umożliwia badanie dynamiki przewlekłej infekcji oraz skuteczności leków in vivo, wypełniając lukę między testami komórkowymi a złożonymi modelami ssaków. Podejście to wspiera wczesną selekcję portfolio oraz ograniczanie ryzyka w przypadku kandydatów na leki przeciwzakaźne ukierunkowanych na zwalczanie przewlekłej persistencji bakteryjnej.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Umożliwia funkcjonalną walidację celów przeciwdrobnoustrojowych w żywym systemie istotnym dla przebiegu choroby.
- Wspiera redukcję ryzyka mechanistycznego poprzez modelowanie tolerancji na antybiotyki obserwowanej w przewlekłych zakażeniach u ludzi.
- Ułatwia testowanie hipotez dotyczących mechanizmów persistencji oraz punktów interwencji terapeutycznej.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Zapewnia standaryzowaną, powtarzalną platformę in vivo do przesiewania związków przeciwko trwałości obciążenia bakteryjnego.
- Umożliwia uzyskanie ilościowych odczytów obciążenia bakteryjnego poprzez fluorescencyjne liczenie CFU, co zapewnia wiarygodne wyniki analizy.
- Umożliwia ocenę skuteczności związków na wielu etapach infekcji, wspierając gotowość do badań przesiewowych.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Zapewnia spójność z modelami infekcji istotnymi dla danej choroby w celu opracowania biomarkerów translacyjnych.
- Oferuje ciągłość od etapu odkrywania po walidację przedkliniczną poprzez odtworzenie fenotypów przewlekłej infekcji.
- Wspiera podejmowanie decyzji o rozwoju portfeli leków przeciwinfekcyjnych skierowanych przeciwko patogenom przetrwalnikowym w oparciu o analizę ryzyka.
Integracja potoków i przepływów pracy
Niniejszy model z wykorzystaniem danio pręgowanego stanowi ogniwo pośrednie pomiędzy przesiewaniem in vitro a badaniami przedklinicznymi na ssakach, umożliwiając iteracyjne testowanie hipotez oraz optymalizację związków wiodących w terapiach zakażeń przewlekłych.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez zerowych w zakresie mechanizmów przetrwania i tolerancji na antybiotyki.
- Przesiewanie: Dostarcza powtarzalnych, ilościowych danych o obciążeniu infekcją w celu oceny związków.
- Analityka: Umożliwia statystyczne porównanie ładunku bakteryjnego i efektów leczenia w różnych izolatach i punktach czasowych.
- Badania translacyjne: Modeluje klinicznie istotną dynamikę infekcji na potrzeby badań nad biomarkerami i skutecznością.
- Wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Zapewnia skalowalną, wielokrotnego użytku platformę in vivo dla rurociągów badawczo-rozwojowych nad lekami przeciwinfekcyjnymi.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną w zakresie skuteczności przeciwdrobnoustrojowej w warunkach infekcji przetrwałej.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje modelowanie infekcji in vivo w celu uzyskania powtarzalnych i skalowalnych przepływów pracy.
- Wartość strategiczna: Poprawia jakość decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) oraz zmniejsza ryzyko biologiczne na późnych etapach programów dotyczących infekcji przewlekłych.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację kandydatów z uwzględnieniem ryzyka, w oparciu o wykazaną aktywność w zakresie przetrwalności in vivo.
Wskazówki dotyczące implementacji
- Wymagana jest wiedza ekspercka w zakresie obsługi danio pręgowanych, modelowania infekcji oraz ilościowej mikrobiologii.
- Niezbędny jest dostęp do infrastruktury obrazowania fluorescencyjnego i liczenia kolonii w celu kwantyfikacji CFU.
- Wymagana jest standaryzacja protokołów infekcji, przemywania i odczytu pomiędzy zespołami w celu zapewnienia powtarzalności.
- Adaptacja do innych patogenów lub tła genetycznego może wymagać optymalizacji protokołu.
- Ograniczenia modelu obejmują specyficzne dla gatunku odpowiedzi odpornościowe oraz skalowalność do formatów o wyższej przepustowości.
