Ookluc: Linia Plasmodium berghei do identyfikacji związków blokujących transmisję

Nasze badania mają na celu zidentyfikowanie i scharakteryzowanie związków blokujących transmisję i niezbędnych genów w stadiach płciowych Plasmodium przy użyciu systemu o wysokiej przepustowości w celu wspierania nowych strategii przerywania transmisji malarii. Protokół ten rozwiązuje problem braku ustandaryzowanych, wysokoprzepustowych metod identyfikacji związków blokujących transmisję przy użyciu transgenicznej linii P.berghei z automatycznym wykrywaniem rozwoju pasożyta po zapłodnieniu w fazie luminescencji. Protokół ten umożliwia badania przesiewowe stadiów płciowych Plasmodium, wykrywa wczesne związki blokujące transmisję i wspiera precyzyjne oznaczanie IC50, oferując przewagę nad konwencjonalnymi metodami.

Na początek należy przygotować próbki związków, rozcieńczając podstawowy związek do jednego milimola za pomocą pożywki ookinette. Przygotować próbki robocze, rozcieńczając ten jednomilimolowy materiał w pożywce ookinte w stosunku jeden do 100, aby osiągnąć końcowe stężenie 10 mikromolowych. Dla jednego testu należy przygotować końcową objętość 200 mikrolitrów próbki roboczej w dwóch egzemplarzach.

Jeżeli związek rozpuszcza się w rozpuszczalniku innym niż woda, należy przygotować próbkę kontrolną, rozcieńczając rozpuszczalnik w pożywce ookinte w tej samej proporcji, jaka została użyta dla badanej próbki. Używając dwóch 96-dołkowych płytek, umieść 80 mikrolitrów każdej próbki w wyznaczonych dołkach do kontroli pozytywnej, kontroli ujemnej, kontroli rozpuszczalnika i próbek testowych w dwóch egzemplarzach zgodnie z podanym układem. Dodaj cztery mikrolitry spasożytowanej krwi myszy do każdej studzienki w stosunku jeden do 20, z wyjątkiem studzienek kontroli ujemnej.

Delikatnie homogenizować, pipetując w górę iw dół. W celu kontroli ujemnej dodaj niezakażoną krew myszy do każdej studzienki w stosunku 1 do 20 i delikatnie homogenizuj przez pipetowanie. Umieść płytki w inkubatorze ustawionym na 21 stopni Celsjusza i inkubuj przez sześć godzin lub 24 godziny.

Po inkubacji homogenizować każdą próbkę, pipetując w górę i w dół, aby zapewnić prawidłowe wymieszanie pożywki krwi. Bezpośrednio przed użyciem należy przygotować bufor do lizy i mieszaninę substratu lucyferazy w stosunku jeden do 50. Wymieszaj tę mieszaninę substratu buforu do lizy z każdą próbką w stosunku jeden do jednego, zapewniając delikatne mieszanie bez wprowadzania pęcherzyków.

Inkubuj płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez trzy do pięciu minut. Teraz przenieś próbki na 96-dołkową białą płytkę z płaskim dnem i zmierz luminescencję za pomocą czytnika płytek. Po wykonaniu testu luminescencji zapisz surowe dane dotyczące luminescencji wyświetlane przez czytnik płytek.

Korzystając z arkusza kalkulacyjnego, oblicz średnią z każdego pomiaru, korzystając z podanego wzoru. Zastąp XX adresem pierwszej komórki pomiarowej, a YY adresem drugiej komórki pomiarowej. Powtórzyć wzór dla wszystkich próbek.

Przelicz dane na procentową inhibicję przy użyciu podanego wzoru, gdzie A jest względną wartością jednostki światła próbki, a B jest kontrolną względną wartością jednostki światła. Wybierz związki, które wykazują więcej niż 95% inhibicję dla stężenia hamującego 50%oznaczania. Po zakażeniu myszy Ookluc i pobraniu spasożytowanej krwi, przygotuj próbki złożone, używając pożywki ookinete jako rozcieńczalnika o początkowym stężeniu, które wykazało 100% zahamowanie konwersji.

Trzykrotnie odpipetować próbki do płytki 96-dołkowej zgodnie z określonym układem. Za pomocą pipety wykonać dwukrotne seryjne rozcieńczenia, przenosząc 80 mikrolitrów z dołka D1 do D2, dokładnie mieszając, a następnie przenosząc 80 mikrolitrów z D2 do D3 i kontynuując ten proces do D12. Wyrzuć ostatnie 80 mikrolitrów usuniętych z D12, aby utrzymać 80 mikrolitrów na studzienkę.

Teraz dodaj spasożytowaną krew myszy do każdej studzienki w stosunku 1 do 20 i delikatnie homogenizuj przez pipetowanie. W studzienkach kontroli ujemnej dodaj niezakażoną krew myszy w stosunku 1 do 20 i delikatnie homogenizuj. Umieść płytkę w inkubatorze ustawionym na 21 stopni Celsjusza i inkubuj przez sześć lub 24 godziny przed wykonaniem testu luminescencji.

Po obliczeniu procentowej inhibicji otwórz oprogramowanie analityczne i utwórz tabelę XY do wykreślania. Ustaw oś y tak, aby wprowadzała trzy wartości replikacji w podkolumnach obok siebie. Wklej dane do tabeli, gdzie x oznacza stężenie związku, a y oznacza procentowe zahamowanie.

Teraz kliknij Analizuj. Wybierz opcję Regresja nieliniowa, dopasowanie krzywej, a następnie wybierz Krzywe dawka-odpowiedź, Hamowanie, a następnie Inhibitor a odpowiedź znormalizowana, zmienne nachylenie i kliknij przycisk OK. Wyświetl krzywą dawka-odpowiedź na lewym panelu i zastosuj dostosowania, takie jak zmiana koloru lub formatu punktowego.

Znajdź tabelę dopasowania nieliniowego, aby znaleźć obliczony IC50 i 95% przedział ufności. Pirymidyna azepina 90 wykazywała wyraźne, zależne od stężenia hamowanie aktywności docelowej z ponad 95% hamowaniem obserwowanym przy stężeniach od 0,125 do jednego mikromola i całkowitą utratą aktywności poniżej 0,007 mikromola, co sugeruje ostry efekt progowy w jego odpowiedzi hamującej. Krzywa dawka-odpowiedź dopasowana do danych dotyczących azepiny pirymidynowej 90 dała wartość IC50 wynoszącą 0,013 mikromola, co wskazuje na dużą siłę hamowania docelowej aktywności.