Name: Szybka dyssekcja i dysocjacja nabłonka węchowego myszy w celu uzyskania zawiesin jednojądrowych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-08-01T14:00:00.000+00:00
Duration: 3 min 42 s
Description: Poznaj szybką metodę dyssekcji nabłonka węchowego myszy w celu uzyskania zawiesin jednojądrowych do sekwencjonowania RNA. Protokół umożliwia efektywne badania genetyczne układu węchowego.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy chcieliby podziękować Baylor College of Medicine's Single Cell Genomics Core. Projekt ten był wspierany przez Cytometry and Cell Sorting Core w Baylor College of Medicine dzięki finansowaniu z NIH (P30 AI036211, P30 CA125123 i SS10 RR024574) oraz pomocy eksperta Joela M. Sederstroma. Projekt ten został częściowo sfinansowany przez NIH/NICHD [P50HD103555], NIH/NINDS [5R01NS078294] oraz NIH/NIA [5F30AG076265]. Rysunek 3 został utworzony w BioRender. https://BioRender.com/5418352.

Wszystkie eksperymenty na zwierzętach w tym badaniu zostały zatwierdzone i przeprowadzone zgodnie z Baylor College of Medicine IACUC. Użyto samic myszy C57BL/6J (JAX:000664). Szczegółowe informacje na temat odczynników i wyposażenia są wymienione w Tabeli materiałów.
1. Rozwarstwienie nabłonka węchowego
<ol>
	<li>Zacznij od głębokiego znieczulenia myszy przy użyciu dowolnej preferowanej metody (zgodnie z instytucjonalnie zatwierdzonymi protokołami). Potwierdź chirurgiczną płaszczyznę znieczulenia mocnym szczypnięciem palca u nogi i przystąp do perfuzji przezsercowej co najmniej 10 ml lodowatego 1x PBS. Usuń skórę, aby odsłonić czaszkę (ryc. 2A). UWAGA: Wyjęcie głowy z korpusu jest opcjonalne. Jeśli ktoś zdecyduje się na usunięcie głowy, zaleca się usunięcie skóry i innych tkanek miękkich wokół czaszki przed dekapitacją.</li>
	<li>Używając cienkich nożyczek z ostrymi końcówkami, wykonaj dwa nacięcia, aby obustronnie odciąć łuki jarzmowe od kości łuskowej, umieszczając jedną końcówkę nożyczek w tylnym oczodole, a drugą w sąsiedztwie kanału słuchowego (zielone linie na rycinie 2B).</li>
	<li>Wykonaj płytkie nacięcie od oczodołu do oczodołu wzdłuż najbardziej przedniej części kości czołowej. Naciąć tylko grzbietową powierzchnię kości czołowej (~1-2 mm głębokości), uważając, aby nie przeciąć żadnych leżących pod spodem struktur lub kości składających się na orbitę (niebieska linia na rysunku 2B). UWAGA: Aby uzyskać płytkie nacięcie między oczodołami, trzymaj nożyczki prostopadle do czaszki i używaj tylko ostrych końcówek do cięcia.</li>
	<li>Przeciąć wzdłuż linii środkowej czaszki od otworu wielkiego, przez szwy strzałkowe i międzyczołowe, aż do osiągnięcia nacięcia międzyoczodołowego wykonanego w kości czołowej w kroku 1.3 (czerwona linia na rycinie 2B).</li>
	<li>Włóż parę kleszczy w nacięcie wykonane wzdłuż linii środkowej czaszki i mocno pociągnij jedną półkulę sklepienia czaszki na boki. Działanie to usunie również kości oczodołu (czołowe, szczękowe i łzowe), odsłaniając boczne aspekty małżowin węchowych (ryc. 2D). UWAGA: Uważaj, aby od tego momentu przypadkowo nie uszkodzić OE.</li>
	<li>Trzymając kość nosową i siekacze, oderwij przeciwległe sklepienie czaszki za pomocą kleszczy. Pozwól, aby mózg (w tym opuszki węchowe) został usunięty wraz z półkulą kości podczas jej odrywania (ryc. 1E). Jedynymi widocznymi strukturami kostnymi, które powinny pozostać po tym etapie, są podstawa czaszki i kości otaczające OE (ryc. 2F).</li>
	<li>Za pomocą szczypiec do kości lub szczypiec do kości usuń pozostałą kość czołową i kość przedszczękową (sieczną) aż do podstawy siekaczy (ryc. 2G).</li>
	<li>Użyj szczypiec do kości, aby przeciąć wzdłuż szwu czołowo-nosowego, aby uwolnić kość nosową z płytki cribriform, zachowując szczególną ostrożność, aby nie uszkodzić leżącego pod spodem odsłoniętego OE lub nie złamać płytki cribriform.</li>
	<li>Podnieś kość nosową z płytki cribriform za pomocą kleszczy, aby odsłonić OE (ryc. 2H). Jeśli szczątkowa kość przedszczękowa zasłania grzbietowy OE, należy ją usunąć przed kontynuowaniem (czarne kółka na rysunku 1I).</li>
	<li>Za pomocą kleszczyków z cienką końcówką delikatnie zabezpiecz grzbietową część przegrody nosowej na jej styku z płytką cribriform i pociągnij do tyłu (ryc. 2J, K). Przy minimalnym oporze główny nabłonek węchowy oderwie się jako całkowicie nienaruszona struktura (ryc. 2L).</li>
	<li>Natychmiast przystąp do dysocjacji OE lub zamroź tkankę do późniejszego przetworzenia.</li>
</ol>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68472/68472fig2.jpg"> 
Rycina 2: Technika szybkiego rozwarstwienia nabłonka węchowego. (A) Głowa myszy po usunięciu otaczającej tkanki miękkiej. (B) Oznaczone kolorami prowadnice do nacięć sklepienia czaszki. (C) Wygląd po nacięciu sklepienia czaszki. (D) Usunięcie pierwszej półkuli sklepienia czaszki wraz z częścią oczodołu przylegającą do nabłonka węchowego. (E) Usunięcie przeciwległej części sklepienia czaszki wraz z mózgiem. (F) Głowa po usunięciu mózgu i sklepienia czaszki. (G) Usunięcie najbardziej przedniej kości czołowej i tylnej kości przedszczękowej, po nacięciu szwu czołowo-szczękowego. (H) Usunięcie kości nosowych. (I) Czarne kółka zaznaczają obszary resztkowej kości przedszczękowej, które można opcjonalnie usunąć. (J) Umieszczenie kleszczy w celu usunięcia nienaruszonego nabłonka węchowego. (K) Pociągnij do tyłu, aby uwolnić nabłonek węchowy. (L) Całkowite uwolnienie nabłonka węchowego. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68472/68472fig2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.</a>
2. Dysocjacja nabłonka węchowego i izolacja pojedynczego jądra
<ol>
	<li>Umieścić na lodzie jedną probówkę C i dwie stożkowe probówki o pojemności 15 ml na próbkę.</li>
	<li>Przygotować bufor do lizy, dodając inhibitor RNAzy (do końcowego stężenia 0,2 U/μL) do wcześniej przygotowanego buforu do ekstrakcji jąder.</li>
	<li>Dodaj 4 ml 1% BSA do każdej stożkowej probówki o pojemności 15 ml, krótko odmieszaj i wyrzuć nadmiar. Powoduje to pokrycie każdej ze stożkowych probówek o pojemności 15 ml BSA, aby zminimalizować przyleganie jąder do probówki.</li>
	<li>Na jedną całą OE dodaj 2 ml lodowatego buforu do lizy do każdej probówki C.</li>
	<li>Dodaj próbki OE do C-probówek. Za pomocą kleszczy #2 przytrzymaj każdą próbkę nad odpowiednią rurką C i pokrój ją na małe kawałki za pomocą nożyczek z cienką końcówką.</li>
	<li>Umieść C-probówki zawierające każdą próbkę do góry nogami na blokach automatycznego dysocjatora tkanek. Na ekranie dysocjatora kwadrat odpowiadający każdemu blokowi zmieni się z Wolny na Wybrany.</li>
	<li>Naciśnij ikonę folderu, aby przejść do folderu Miltenyi . Za pomocą strzałek przewiń do programu 4C_nuclei_1 (wstępnie załadowanego programu w dysocjatorze). Naciśnij OK , aby zastosować program do każdego bloku, a następnie naciśnij Start, aby rozpocząć cykl. Wyjmij rurki C z dysocjatora natychmiast po zakończeniu cyklu. UWAGA: Jeśli to możliwe, utrzymuj rurki C w lodowatym chłodzie podczas cyklu dysocjacji. Ważne jest, aby wyjąć próbki z dysocjatora natychmiast po zakończeniu cyklu i przejść do kolejnych kroków protokołu, aby uniknąć nadmiernej lizy jąder.</li>
	<li>Za pomocą pipety odessać homogenizowaną zawiesinę z rurki C i przefiltrować ją przez sitko o średnicy 70 μm do pierwszej stożkowej probówki z powłoką BSA. Unikaj zasysania fragmentów kości, które nagromadziły się na dnie rurki C.</li>
	<li>Przepłucz sitko 1 ml lodowatego 1x PBS, aby zapewnić pełną filtrację.</li>
	<li>Odwirować przefiltrowaną zawiesinę o stężeniu 500 × g przez 5 minut w temperaturze 4 °C w wirówce z odchylanym wiadrem.</li>
	<li>Delikatnie zassać i wyrzucić supernatant, uważając, aby nie naruszyć osadu. Całkowicie zawiesić osad jądrowy w 1 ml lodowatego 1x PBS przez delikatne pipetowanie.</li>
	<li>Przepuścić zawieszone jądra przez sitko o średnicy 30 μm do drugiej stożkowej rurki pokrytej BSA. Stężenie jąder można określić ilościowo za pomocą hemocytometru lub automatycznego licznika komórek.</li>
	<li>Natychmiast należy postępować zgodnie z wybranym protokołem dalszego przesyłania (z FACS lub bez), aby zachować integralność próbki i zapobiec degradacji (rysunek 3). UWAGA: Zdecydowanie zaleca się, aby użytkownicy wykonywali ćwiczenia całego protokołu, aby zapewnić bezproblemowe i terminowe ukończenie.</li>
</ol>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68472/68472fig3.jpg"> 
Rycina 3: Dysocjacja nabłonka węchowego i przebieg izolacji pojedynczego jądra. Po rozwarstwieniu nabłonek węchowy ulega mechanicznej i chemicznej dysocjacji. Lizat jest następnie filtrowany przez sitko o wielkości 70 μm, przepłukiwany 1x PBS i odwirowywany przy 500 × g przez 5 minut. Osad jest ponownie zawieszany w 1x PBS przed przefiltrowaniem przez sitko 30 μm. Otrzymana zawiesina jąder jest dostępna dla różnych zastosowań w sekwencjonowaniu. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68472/68472fig3large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.</a>

<ol><li>Graziadei, P. P. C., Graziadei, G. A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurogenesis+and+neuron+regeneration+in+the+olfactory+system+of+mammals.+I.+Morphological+aspects+of+differentiation+and+structural+organization+of+the+olfactory+sensory+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurocytol%22%5BJournal%5D)">Neurogenesis and neuron regeneration in the olfactory system of mammals. I. Morphological aspects of differentiation and structural organization of the olfactory sensory neurons.</a> J Neurocytol. 8 (1), 1-18 (1979).</li>
<li>Monti Graziadei, G. A., Graziadei, P. P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurogenesis+and+neuron+regeneration+in+the+olfactory+system+of+mammals.+II.+Degeneration+and+reconstitution+of+the+olfactory+sensory+neurons+after+axotomy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurocytol%22%5BJournal%5D)">Neurogenesis and neuron regeneration in the olfactory system of mammals. II. Degeneration and reconstitution of the olfactory sensory neurons after axotomy.</a> J Neurocytol. 8 (2), 197-213 (1979).</li>
<li>Caggiano, M., Kauer, J. S., Hunter, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Globose+basal+cells+are+neuronal+progenitors+in+the+olfactory+epithelium%3A+a+lineage+analysis+using+a+replication-incompetent+retrovirus%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Globose basal cells are neuronal progenitors in the olfactory epithelium: a lineage analysis using a replication-incompetent retrovirus.</a> Neuron. 13 (2), 339-352 (1994).</li>
<li>Iwai, N., Zhou, Z., Roop, D. R., Behringer, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Horizontal+basal+cells+are+multipotent+progenitors+in+normal+and+injured+adult+olfactory+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Horizontal basal cells are multipotent progenitors in normal and injured adult olfactory epithelium.</a> Stem Cells. 26 (5), 1298-1306 (2008).</li>
<li>Schwob, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+and+progenitor+cells+of+the+mammalian+olfactory+epithelium%3A+Taking+poietic+license%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Stem and progenitor cells of the mammalian olfactory epithelium: Taking poietic license.</a> J Comp Neurol. 525 (4), 1034-1054 (2017).</li>
<li>Fletcher, R. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deconstructing+olfactory+stem+cell+trajectories+at+single-cell+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Deconstructing olfactory stem cell trajectories at single-cell resolution.</a> Cell Stem Cell. 20 (6), 817-830.e8 (2017).</li>
<li>Gadye, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Injury+activates+transient+olfactory+stem+cell+states+with+diverse+lineage+capacities%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Injury activates transient olfactory stem cell states with diverse lineage capacities.</a> Cell Stem Cell. 21 (6), 775-790.e9 (2017).</li>
<li>Saraiva, L. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hierarchical+deconstruction+of+mouse+olfactory+sensory+neurons%3A+from+whole+mucosa+to+single-cell+RNA-seq%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Hierarchical deconstruction of mouse olfactory sensory neurons: from whole mucosa to single-cell RNA-seq.</a> Sci Rep. 5 (1), 18178(2015).</li>
<li>Fletcher, R. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((p63+regulates+olfactory+stem+cell+self-renewal+and+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">p63 regulates olfactory stem cell self-renewal and differentiation.</a> Neuron. 72 (5), 748-759 (2011).</li>
<li>Brann, D. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-neuronal+expression+of+SARS-CoV-2+entry+genes+in+the+olfactory+system+suggests+mechanisms+underlying+COVID-19-associated+anosmia%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Adv%22%5BJournal%5D)">Non-neuronal expression of SARS-CoV-2 entry genes in the olfactory system suggests mechanisms underlying COVID-19-associated anosmia.</a> Sci Adv. 6 (31), eabc5801(2020).</li>
<li>Carter, L. A., MacDonald, J. L., Roskams, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Olfactory+horizontal+basal+cells+demonstrate+a+conserved+multipotent+progenitor+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Olfactory horizontal basal cells demonstrate a conserved multipotent progenitor phenotype.</a> J Neurosci. 24 (25), 5670-5683 (2004).</li>
<li>Lake, B. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparative+strategy+for+single-nucleus+and+single-cell+transcriptomes+confirms+accuracy+in+predicted+cell-type+expression+from+nuclear+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">A comparative strategy for single-nucleus and single-cell transcriptomes confirms accuracy in predicted cell-type expression from nuclear RNA.</a> Sci Rep. 7 (1), 6031(2017).</li>
<li>Bakken, T. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-nucleus+and+single-cell+transcriptomes+compared+in+matched+cortical+cell+types%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Single-nucleus and single-cell transcriptomes compared in matched cortical cell types.</a> PLoS One. 13 (12), e0209648(2018).</li>
<li>Ruiz Tejada Segura, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+3D+transcriptomics+atlas+of+the+mouse+nose+sheds+light+on+the+anatomical+logic+of+smell%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">A 3D transcriptomics atlas of the mouse nose sheds light on the anatomical logic of smell.</a> Cell Rep. 38 (12), 110547(2022).</li>
<li>Li, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+single-cell+transcriptomic+census+of+mammalian+olfactory+epithelium+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">A single-cell transcriptomic census of mammalian olfactory epithelium aging.</a> Dev Cell. 59 (22), 3043-3058.e8 (2024).</li>
<li>Dunston, D., Ashby, S., Krosnowski, K., Ogura, T., Lin, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+effective+manual+deboning+method+to+prepare+intact+mouse+nasal+tissue+with+preserved+anatomical+organization%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">An effective manual deboning method to prepare intact mouse nasal tissue with preserved anatomical organization.</a> J Vis Exp. (78), e50538(2013).</li>
<li>Gurumurthy, R. K., Kumar, N., Chumduri, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+protocol+for+isolation+of+high-quality+single+cells+from+the+female+mouse+reproductive+tract+tissues+for+single-cell+RNA+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protoc%22%5BJournal%5D)">Optimized protocol for isolation of high-quality single cells from the female mouse reproductive tract tissues for single-cell RNA sequencing.</a> STAR Protoc. 2 (4), 100970(2021).</li>
<li>Nguyen, Q. H., Pervolarakis, N., Nee, K., Kessenbrock, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+considerations+for+single-cell+RNA+sequencing+approaches%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Experimental considerations for single-cell RNA sequencing approaches.</a> Front Cell Dev Biol. 6, 108(2018).</li>
<li>Belfort, B. D. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analysis+of+AAV+serotypes+for+transduction+of+olfactory+sensory+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Comparative analysis of AAV serotypes for transduction of olfactory sensory neurons.</a> Front Neurosci. 19, 1531122(2025).</li>
<li>Huang, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immature+olfactory+sensory+neurons+provide+behaviourally+relevant+sensory+input+to+the+olfactory+bulb%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Immature olfactory sensory neurons provide behaviourally relevant sensory input to the olfactory bulb.</a> Nat Commun. 13 (1), 6194(2022).</li>
<li>Barrios, A. W., Nunez, G., Sanchez Quinteiro, P., Salazar, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anatomy%2C+histochemistry%2C+and+immunohistochemistry+of+the+olfactory+subsystems+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Neuroanat%22%5BJournal%5D)">Anatomy, histochemistry, and immunohistochemistry of the olfactory subsystems in mice.</a> Front Neuroanat. 8, 63(2014).</li>
<li>Antunes, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Murine+nasal+septa+for+respiratory+epithelial+air-liquid+interface+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Murine nasal septa for respiratory epithelial air-liquid interface cultures.</a> Biotechniques. 43 (2), 195-204 (2007).</li>
<li>Wu, J., Cai, Y., Wu, X., Ying, Y., Tai, Y., He, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcardiac+perfusion+of+the+mouse+for+brain+tissue+dissection+and+fixation%5BTitle%5D)+AND+%22Bio+Protoc%22%5BJournal%5D)">Transcardiac perfusion of the mouse for brain tissue dissection and fixation.</a> Bio Protoc. 11 (5), e3988(2021).</li>
<li>Bakulski, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+analysis+of+the+gene+expression+effects+of+developmental+lead+%28Pb%29+exposure+on+the+mouse+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicol+Sci%22%5BJournal%5D)">Single-cell analysis of the gene expression effects of developmental lead (Pb) exposure on the mouse hippocampus.</a> Toxicol Sci. 176 (2), 396-409 (2020).</li>
<li>Chang, C. -S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+RNA+sequencing+uncovers+the+individual+alteration+of+intestinal+mucosal+immunocytes+in+Dusp6+knockout+mice%5BTitle%5D)+AND+%22iScience%22%5BJournal%5D)">Single-cell RNA sequencing uncovers the individual alteration of intestinal mucosal immunocytes in Dusp6 knockout mice.</a> iScience. 25 (2), 103738(2022).</li>
<li>Denisenko, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+assessment+of+tissue+dissociation+and+storage+biases+in+single-cell+and+single-nucleus+RNA-seq+workflows%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Systematic assessment of tissue dissociation and storage biases in single-cell and single-nucleus RNA-seq workflows.</a> Genome Biol. 21 (1), 130(2020).</li>
<li>Koenitzer, J. R., Wu, H., Atkinson, J. J., Brody, S. L., Humphreys, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-nucleus+RNA-sequencing+profiling+of+mouse+lung.+Reduced+dissociation+bias+and+improved+rare+cell-type+detection+compared+with+single-cell+RNA+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Respir+Cell+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Single-nucleus RNA-sequencing profiling of mouse lung. Reduced dissociation bias and improved rare cell-type detection compared with single-cell RNA sequencing.</a> Am J Respir Cell Mol Biol. 63 (6), 739-747 (2020).</li>
<li>Xiong, A., Zhang, J., Chen, Y., Zhang, Y., Yang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrated+single-cell+transcriptomic+analyses+reveal+that+GPNMB-high+macrophages+promote+PN-MES+transition+and+impede+T+cell+activation+in+GBM%5BTitle%5D)+AND+%22eBioMedicine%22%5BJournal%5D)">Integrated single-cell transcriptomic analyses reveal that GPNMB-high macrophages promote PN-MES transition and impede T cell activation in GBM.</a> eBioMedicine. 83, 104239(2022).</li>
</ol>

Autorzy deklarują, że badanie to zostało przeprowadzone przy braku jakichkolwiek powiązań handlowych lub finansowych, które mogłyby być interpretowane jako potencjalny konflikt interesów.

Opisana tutaj procedura umożliwia konsekwentne usuwanie nienaruszonego OE po dosercowej perfuzji 1x PBS. Stanowi to znaczną poprawę szybkości w porównaniu z poprzednimi metodami16 i ma szczególne znaczenie, biorąc pod uwagę, że OSN zaczynają się degenerować po aksotomii2, co ma miejsce podczas usuwania mózgu.
Staranne usunięcie kości czołowej, przedszczękowej i nosowej ma kluczowe znaczenie dla konsekwentnego usuwania nienaruszonego OE. Dodatkowo...

Mysi nabłonek węchowy (OE) jest niezbędnym składnikiem układu węchowego i jest odpowiedzialny za wykrywanie i przekazywanie sygnałów zapachowych do ośrodkowego układu nerwowego. Jego najbardziej powierzchowna warstwa zawiera rzęski wykrywające zapachy węchowych neuronów czuciowych, które są pokryte warstwą śluzu i otoczone podporowymi komórkami sustentakularnymi i mikrovillarowymi 1,2. OSN są dwubiegunowe, rozciągając swoje rzęski wierzchołkowo, tworząc siatkę w warstwie śluzu, a ich aksony zasadniczo przez kostną płytkę grzebienia, aby połączyć się w kłębuszki nerkowe w opuszce węchowej. Te kłębuszki nerkowe są miejscem synaps między OSN a neuronami znajdującymi się w dole strumienia. Leżące u podstaw OSN, neuronalne komórki progenitorowe zwane globozowymi komórkami podstawnymi stale uzupełniają OSN, gdy umierają3 po bezpośrednim narażeniu na zniewagi środowiskowe, takie jak toksyny unoszące się w powietrzu, patogeny i urazy fizyczne. Kuliste komórki podstawne pochodzą z puli rezerwowej multipotencjalnych poziomych komórek podstawnych 4,5, położonych najbardziej podstawowo i przylegających do blaszki podstawy wypukłości kostnych zwanych małżowinami nosowymi. Małżowiny nosowe są kręte, co sprawia, że OE jest trudny do oddzielenia i homogenizacji. Co więcej, OE jest otoczony kośćmi czaszki, co utrudnia dostęp do tego obszaru i tradycyjnie wymaga czasochłonnego zabiegu.
Wcześniejsze badania opierały się na przedłużonej inkubacji papainy w celu uwolnienia nabłonka węchowego z kości 6,7,8,9,10, co może jeszcze bardziej opóźnić dalsze przetwarzanie zawiesiny jednokomórkowej. Ponieważ ścinanie aksonów OSN wyzwala apoptozę11, konieczne jest zminimalizowanie czasu od ekstrakcji tkanek do przygotowania biblioteki cDNA. Co więcej, architektura OE i jego projekcje do opuszki węchowej komplikują ekstrakcję nienaruszonych komórek w celu pomyślnego sekwencjonowania RNA pojedynczej komórki. Na szczęście sekwencjonowanie RNA pojedynczego jądra (snRNA-seq) okazało się potężnym narzędziem do profilowania komórek przy jednoczesnym zachowaniu dystrybucji typu komórki, szczególnie w tkankach, w których dysocjacja pojedynczych komórek jest trudna lub niepraktyczna12,13.
Podczas gdy wiele badań 6,7,8,10,14,15 przeprowadziło sekwencjonowanie pojedynczych komórek myszy OE, żadne z nich nie oferuje szczegółowej procedury preparacji zoptymalizowanej pod kątem spójnego i celowego pobierania tkanek, co jest konieczne, biorąc pod uwagę kruchość OE i pokrycie różnymi kośćmi czaszki. Ponadto istniejące prowadnice do sekcji16 koncentrują się na zachowaniu struktury anatomicznej, a nie prędkości, co prowadzi do potencjalnie długiego czasu sekcji. Ponieważ celowe przygotowanie tkanek jest niezbędne do zminimalizowania degradacji RNA i maksymalizacji jakości przygotowanych jąder17,18, uzasadniony jest zoptymalizowany protokół szybkiej sekcji i homogenizacji mysiego OE do zawiesiny jednojądrowej do stosowania w różnych dalszych zastosowaniach.
Protokół ten (ryc. 1) przedstawia uproszczoną metodę zaprojektowaną w celu przezwyciężenia tych wyzwań, umożliwiając szybką dyssekcję mysiego OE i skuteczną dysocjację tkanki w celu wyizolowania jąder. Takie podejście ułatwia wysokiej jakości sekwencjonowanie pojedynczego jądra19, zapewniając niezawodną technikę badania molekularnych podstaw biologii węchu.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68472/68472fig1.jpg"> 
Rycina 1: Anatomia odpowiednich szwów i kości czaszki myszy C57BL/6 oraz reprezentatywny przekrój nabłonka węchowego. (A) Szwy czaszki są oznaczone kolorami. Szwy są oznaczone kolorami po jednej stronie czaszki, podczas gdy druga strona pozostaje nieoznaczona w celach informacyjnych (po lewej). Nazwy szwów są odpowiednio oznaczone kolorami (po prawej). (B) Kości czaszki oznaczone kolorem. Kości są oznaczone kolorami po jednej stronie czaszki, podczas gdy druga strona pozostaje nieoznaczona w celach informacyjnych (po lewej). Nazwy kości są odpowiednio oznaczone kolorami (po prawej). (C) Przekrój poprzeczny środkowej części OE (wyciętej metodą opisaną w tym artykule) z małżowinami oznaczonymi kolorami po jednej stronie i górną po lewej stronie nieoznaczoną w celach informacyjnych (po lewej). Nazwy zwizualizowanych małżowin usznych (po prawej). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68472/68472fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.</a>

<table><tbody><tr><td>Probówka wirówkowa 15 ml</td><td>Leczenie komórkowe</td><td>229411</td><td></td></tr><tr><td>Szczypce do kości&nbsp;</td><td>Narzędzia naukowe</td><td>16102-11</td><td></td></tr><tr><td>Bonn Miniaturowe nożyczki do tęczówki&nbsp;</td><td>Miltex&nbsp;</td><td>18-1392</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór albuminy surowicy bydlęcej</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A1595 (wersja angielska)</td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze Dumont #3&nbsp;</td><td>Narzędzia naukowe</td><td>11231-30</td><td></td></tr><tr><td>Samica myszy C57BL/6J</td><td>Laboratorium Jacksona</td><td>JAX:000664</td><td></td></tr><tr><td>Rurki gentleMACS C&nbsp;</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-237</td><td></td></tr><tr><td>GentleMACS Octo Disocjator&nbsp;</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-096-427</td><td></td></tr><tr><td>Filtry siatkowe MACS SmartStrainers 30 um&nbsp;</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-098-458</td><td></td></tr><tr><td>Filtry siatkowe MACS SmartStrainers 70 um&nbsp;</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-098-462</td><td></td></tr><tr><td>Mikro Friedman-Pearson Rongeurs</td><td>Narzędzia naukowe</td><td>16220-14</td><td></td></tr><tr><td>Bufor do ekstrakcji jąder&nbsp;</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-128-024</td><td></td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS), 1x bez wapnia i magnezu, pH 7,4 i plusmn; 0.1</td><td>Corning</td><td>21-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>Inhibitor RNAzy Protektora&nbsp;</td><td>Millipore Sigma</td><td>3335402001</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka z chłodzeniem Sorvall Legend XTR</td><td>Thermo Scientific</td><td>50119927-5</td><td></td></tr></tbody></table>

szybka dyssekcja i dysocjacja nabłonka węchowego myszy w celu uzyskania zawiesin jednojądrowych

Rapid Dissection and Dissociation of the Mouse Olfactory Epithelium for Single-Nucleus Suspensions

Mysi nabłonek węchowy jest początkowym punktem wejścia układu węchowego, w którym znajdują się różne typy komórek, w tym węchowe neurony czuciowe, ich regenerujące się komórki progenitorowe i komórki podporowe. Węchowe neurony czuciowe przekształcają chemiczne substancje zapachowe w sygnały neuronowe, jednak mechanizmy leżące u podstaw rozwoju i obrotu tych komórek, tworzenia synaps z opuszką węchową i regulowania ich receptorów zapachowych pozostają obszarami intensywnych badań. Zlokalizowany na grzbietowej stronie jamy nosowej nabłonek węchowy przylega do skomplikowanych struktur kostnych zwanych małżowinami. Anatomia ta stwarza wyjątkowe wyzwania dla jego ekstrakcji i dysocjacji, zwłaszcza w kontekście przygotowania żywotnych zawiesin jednokomórkowych. Ponieważ protokoły zawieszenia pojedynczych komórek często obejmują etapy przygotowawcze (np. dysocjacja papainy, FACS), które mogą stresować żywotność komórek i/lub opóźniać przygotowanie biblioteki, minimalizacja czasu ekstrakcji tkanek ma kluczowe znaczenie. W artykule przedstawiono uproszczoną metodę szybkiego rozwarstwienia nabłonka węchowego oraz protokół generowania wysokiej jakości zawiesin jednojądrowych.

Aby zapewnić kontekst anatomiczny do sekcji i analizy, szwy i kości czaszki myszy C57BL/6, a także centralna część nabłonka węchowego (OE), zostały zwizualizowane i oznaczone kolorami (ryc. 1). Jedna strona każdego obrazu została opatrzona adnotacjami, aby podkreślić odpowiednie szwy, kości i małżowiny, podczas gdy druga strona pozostała nieoznaczona w celach informacyjnych. Przekrój OE został przygotowany zgodnie z ustalonymi protokołami20, a identyfikacja małżowiny ...

W tym artykule przedstawiono uproszczony protokół rozwarstwiania i dysocjacji mysiego nabłonka węchowego w celu sekwencjonowania jednojądrowego RNA.

Szybka dyssekcja i dysocjacja nabłonka węchowego myszy w celu uzyskania zawiesin jednojądrowych

The murine olfactory epithelium is the initial entry point of the olfactory system, housing various cell types that include olfactory sensory neurons, ...

Tutaj przedstawiamy protokół zaprojektowany, aby pomóc w szybkim rozwarstwieniu nabłonka węchowego w celu sekwencjonowania pojedynczej komórki lub pojedynczego jądra. Nasz protokół stawia na pierwszym miejscu szybkość i łatwość uczenia się i jest idealny do zastosowań jednokomórkowych, w których tkanka jest homogenizowana, a szybka sekcja jest ważniejsza niż zachowanie integralności anatomicznej, w przeciwieństwie do poprzednich metod. Nasz protokół umożliwia szybką, przyjazną dla użytkownika sekcję nabłonka węchowego, co ma na celu ułatwienie badań sekwencjonowania pojedynczych komórek i promowanie badań nad genetycznymi podstawami układu węchowego.Aby rozpocząć, zdobądź pozbawioną skóry głowę myszy. Użyj pary cienkich nożyczek z ostrymi końcówkami, aby wykonać dwa nacięcia, aby obustronnie zerwać łuki jarzmowe z kości łuskowej, umieszczając jedną końcówkę nożyczek w tylnym oczodole, a drugą w sąsiedztwie kanału słuchowego. Wykonaj płytkie nacięcie od oczodołu do oczodołu wzdłuż najbardziej przedniej części kości czołowej, nacinając tylko grzbietową powierzchnię kości czołowej na głębokość około jednego do dwóch milimetrów.Teraz przeciąć wzdłuż linii środkowej czaszki od otworu wielkiego przez szwy strzałkowe i międzyczołowe, aż do nacięcia międzyoczodołowego wykonanego wcześniej. Włóż parę kleszczy w nacięcie linii środkowej i mocno pociągnij jedną półkulę sklepienia czaszki na boki. Trzymając kość nosową i siekacze, użyj kleszczy, aby oderwać przeciwległe sklepienie czaszki.Pozwól, aby mózg, w tym opuszki węchowe, został usunięty wraz z półkulą kości, gdy jest ona odrywana. Następnie użyj szczypiec do kości lub Rongeurs, aby usunąć pozostałą kość czołową i kość przedszczękową aż do podstawy siekaczy. Przeciąć wzdłuż szwu czołowo-nosowego za pomocą szczypiec do kości, aby uwolnić kość nosową z płytki cribriform.Następnie użyj kleszczy, aby podnieść kość nosową z płytki cribriform, aby odsłonić nabłonek węchowy. Jeśli resztki kości przedszczękowej zasłaniają grzbietowy nabłonek węchowy, usuń go przed kontynuowaniem. Teraz użyj pary kleszczy z cienką końcówką, aby delikatnie zabezpieczyć grzbietową część przegrody nosowej na jej styku z płytką cribriform i pociągnij ją do tyłu.Główny nabłonek węchowy uwolni się jako całkowicie nienaruszona struktura. Obrazowa cytometria przepływowa wykazała, że 53,69% wszystkich zdarzeń dotyczyło jąder. Wśród pojedynczych jąder 53,89% miało wysoką cyrkularność.Poletka kontroli jakości potwierdziły stałą jakość sekwencjonowania w czterech próbkach, z jednolitym rozkładem liczby genów i mitochondriów. Geny markerowe w zbiorze danych są zgodne z wieloma dobrze znanymi genami markerowymi dla każdego typu komórki.

rapid-dissection-dissociation-mouse-olfactory-epithelium-for-single

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Fotoliza związków klatkowanych pozwala na gwałtowny i zlokalizowany wzrost stężenia różnych związków aktywnych fizjologicznie. W niniejszej pracy przedstawiamy sposób uzyskiwania rejestracji metodą patch-clamp w połączeniu z fotolizą klatkowanego cAMP lub klatkowanego Ca w celu badania transdukcji węchowej w dysocjowanych neuronach sensorycznych węchu myszy.

Fotoliza błyskowa związków klatkowych w rzęskach neuronów sensorycznych węchu

Film pokazuje izolację neuronów ruchowych okoruchowych, bloczkowych i rdzeniowych od transgenicznego zarodka myszy. Zarodek wykazuje ekspresję neuronów ruchowych znakowanych zielonym białkiem fluorescencyjnym (GFP) w celu łatwej wizualizacji i identyfikacji. Neurony ruchowe są chirurgicznie izolowane pod mikroskopem fluorescencyjnym i utrzymywane w pożywce hodowlanej.

Izolacja i hodowla neuronów ruchowych okoruchowych, bloczkowych i rdzeniowych z zarodka myszy

Ten film demonstruje metodę izolowania pierwotnych komórek oligodendrocytów z zawiesiny komórek nerwowych uzyskanej od mysiego szczeniaka za pomocą separacji magnetycznej. Technika ta wykorzystuje kulki magnetyczne pokryte przeciwciałami specyficznymi dla antygenów oligodendrocytów, co umożliwia selektywną izolację tych komórek.

Izolowanie mysich pierwotnych oligodendrocytów za pomocą kulek immunomagnetycznych

Ten film demonstruje elektrofizjologiczny zapis węchowych neuronów czuciowych (OSN) u myszy przy użyciu techniki perforowanego patch-clamp. Nabłonek węchowy, zawierający OSN z receptorami zapachowymi znakowanymi fluoroforem, jest izolowany od myszy i umieszczany w komorze rejestracyjnej. Pipeta rejestrująca jest zaciśnięta na dendrytycznym pokrętle OSN, a nystatyna w pipecie perforuje membranę, tworząc połączenie elektryczne z komórką. Na koniec za pomocą kolejnej pipety dostarcza się...

Perforowany zapis węchowych neuronów czuciowych u myszy

Rzęski węchowych neuronów czuciowych zawierają białka kaskady transdukcji sygnału, ale szczegółowa analiza przestrzenna ich rozmieszczenia jest trudna w kriosekcjach. Opisujemy tutaj zoptymalizowane podejście do znakowania całego mocowania i wizualizacji en face białek rzęskowych.

Znakowanie całego mocowania rzęsek w głównym układzie węchowym myszy

Analiza fizjologicznych właściwości węchowych neuronów czuciowych nadal napotyka na techniczne ograniczenia. Tutaj rejestrujemy je przez perforowany patch-clamp w nienaruszonym preparowaniu nabłonka węchowego u myszy ukierunkowanych na geny. Technika ta pozwala na scharakteryzowanie właściwości błony i odpowiedzi na określone ligandy neuronów wyrażających określone receptory węchowe.

Perforowany zapis patch-clamp węchowych węchowych neuronów czuciowych myszy w nienaruszonym neuroepithelium: analiza funkcjonalna neuronów wyrażających zidentyfikowany receptor zapachowy

Oligodendrocyty to komórki mielinizujące ośrodkowego układu nerwowego. Protokół ten opisuje metodę izolacji i hodowli ich prekursorów, komórek progenitorowych oligodendrocytów, z kory szczura, a także szybką i wiarygodną metodę ilościową oceny oligodendrogenezy in vitro w odpowiedzi na czynniki eksperymentalne.

Przygotowanie hodowli progenitorowych oligodendrocytów szczurów i kwantyfikacja oligodendrogenezy za pomocą skanowania fluorescencyjnego w podwójnej podczerwieni

Opisujemy immunomagnetyczną izolację pierwotnych oligodendrocytów myszy, która pozwala na szybką i specyficzną izolację komórek do hodowli in vitro.

Szybka i swoista izolacja immunomagnetyczna pierwotnych oligodendrocytów myszy

Przedstawiono metodę mikrodysekcji jajowodu myszy, która pozwala na pobranie poszczególnych segmentów przy zachowaniu integralności RNA. Ponadto opisano nieenzymatyczną procedurę dysocjacji komórek jajowodowych. Metody te są odpowiednie do późniejszej analizy genów i białek funkcjonalnie różnych segmentów jajowodów i zdysocjowanych komórek jajowodowych.

Mikrodysekcja i dysocjacja mysiego jajowodu: identyfikacja poszczególnych segmentów i izolacja pojedynczych komórek

Sukces transkryptomiki i multiomiki pojedynczej komórki/pojedynczego jądra w dużej mierze zależy od jakości komórek/jąder. Dlatego izolowanie komórek/jąder od tkanek i ich oczyszczanie musi być wysoce ustandaryzowane. Protokół ten opisuje przygotowanie jąder z mózgu i szpiku kostnego do dalszego testu multiomu pojedynczego jądra.

Wysokiej jakości preparatyka jąder mózgu i szpiku kostnego do oznaczania wieloomów pojedynczych jąder

Poznaj szybką metodę dyssekcji nabłonka węchowego myszy w celu uzyskania zawiesin jednojądrowych do sekwencjonowania RNA. Protokół umożliwia efektywne badania genetyczne układu węchowego.

Szybka dyssekcja i dysocjacja nabłonka węchowego myszy w celu uzyskania zawiesin jednojądrowych

Przeglądaj więcej filmów