Szybka dyssekcja i dysocjacja nabłonka węchowego myszy w celu uzyskania zawiesin jednojądrowych
1 sierpnia 2025
W tym artykule przedstawiono uproszczony protokół rozwarstwiania i dysocjacji mysiego nabłonka węchowego w celu sekwencjonowania jednojądrowego RNA.
Tutaj przedstawiamy protokół zaprojektowany, aby pomóc w szybkim rozwarstwieniu nabłonka węchowego w celu sekwencjonowania pojedynczej komórki lub pojedynczego jądra. Nasz protokół stawia na pierwszym miejscu szybkość i łatwość uczenia się i jest idealny do zastosowań jednokomórkowych, w których tkanka jest homogenizowana, a szybka sekcja jest ważniejsza niż zachowanie integralności anatomicznej, w przeciwieństwie do poprzednich metod. Nasz protokół umożliwia szybką, przyjazną dla użytkownika sekcję nabłonka węchowego, co ma na celu ułatwienie badań sekwencjonowania pojedynczych komórek i promowanie badań nad genetycznymi podstawami układu węchowego.
Aby rozpocząć, zdobądź pozbawioną skóry głowę myszy. Użyj pary cienkich nożyczek z ostrymi końcówkami, aby wykonać dwa nacięcia, aby obustronnie zerwać łuki jarzmowe z kości łuskowej, umieszczając jedną końcówkę nożyczek w tylnym oczodole, a drugą w sąsiedztwie kanału słuchowego. Wykonaj płytkie nacięcie od oczodołu do oczodołu wzdłuż najbardziej przedniej części kości czołowej, nacinając tylko grzbietową powierzchnię kości czołowej na głębokość około jednego do dwóch milimetrów.
Teraz przeciąć wzdłuż linii środkowej czaszki od otworu wielkiego przez szwy strzałkowe i międzyczołowe, aż do nacięcia międzyoczodołowego wykonanego wcześniej. Włóż parę kleszczy w nacięcie linii środkowej i mocno pociągnij jedną półkulę sklepienia czaszki na boki. Trzymając kość nosową i siekacze, użyj kleszczy, aby oderwać przeciwległe sklepienie czaszki.
Pozwól, aby mózg, w tym opuszki węchowe, został usunięty wraz z półkulą kości, gdy jest ona odrywana. Następnie użyj szczypiec do kości lub Rongeurs, aby usunąć pozostałą kość czołową i kość przedszczękową aż do podstawy siekaczy. Przeciąć wzdłuż szwu czołowo-nosowego za pomocą szczypiec do kości, aby uwolnić kość nosową z płytki cribriform.
Następnie użyj kleszczy, aby podnieść kość nosową z płytki cribriform, aby odsłonić nabłonek węchowy. Jeśli resztki kości przedszczękowej zasłaniają grzbietowy nabłonek węchowy, usuń go przed kontynuowaniem. Teraz użyj pary kleszczy z cienką końcówką, aby delikatnie zabezpieczyć grzbietową część przegrody nosowej na jej styku z płytką cribriform i pociągnij ją do tyłu.
Główny nabłonek węchowy uwolni się jako całkowicie nienaruszona struktura. Obrazowa cytometria przepływowa wykazała, że 53,69% wszystkich zdarzeń dotyczyło jąder. Wśród pojedynczych jąder 53,89% miało wysoką cyrkularność.
Poletka kontroli jakości potwierdziły stałą jakość sekwencjonowania w czterech próbkach, z jednolitym rozkładem liczby genów i mitochondriów. Geny markerowe w zbiorze danych są zgodne z wieloma dobrze znanymi genami markerowymi dla każdego typu komórki.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy artykuł przedstawia protokół szybkiej sekcji i dysocjacji nabłonka węchowego myszy, mający na celu ułatwienie sekwencjonowania RNA pojedynczych jąder komórkowych. Metoda ta kładzie nacisk na szybkość i łatwość wykonania, co czyni ją odpowiednią do zastosowań, w których konieczna jest homogenizacja tkanki.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neurobiologia
- Genomika
- Badania nad układem węchowym
Wstęp
- Sekwencjonowanie RNA pojedynczych komórek i pojedynczych jąder komórkowych ma kluczowe znaczenie dla zrozumienia różnorodności komórkowej.
- Poprzednie metody sekcji kładły nacisk na integralność anatomiczną, co może nie być optymalne w określonych zastosowaniach.
- Nabłonek węchowy odgrywa fundamentalną rolę w transdukcji sensorycznej węchu.
- Udoskonalenie technik sekcji może zwiększyć wydajność badań genetycznych związanych z węchem.
Cel badania
- Dostarczenie przejrzystego protokołu preparatyki nabłonka węchowego.
- Ułatwienie szybkiego przetwarzania tkanek na potrzeby badań z zakresu sekwencjonowania pojedynczych komórek.
- Wspieranie badań nad mechanizmami genetycznymi układu węchowego.
Zastosowane metody
- Metoda wykorzystuje wycinanie nabłonka węchowego z modeli mysich.
- Ten model biologiczny obejmuje układ węchowy myszy, co podkreśla potrzebę szybkiej ekstrakcji.
- Usunięcie kości oraz ostrożna manipulacja zapewniają integralność głównego nabłonka węchowego.
- Kluczowe etapy obejmują nacięcia w sklepieniu czaszki i wydobycie struktur węchowych.
- Wprowadzono kontrole jakości w celu utrzymania spójnej jakości sekwencjonowania.
Główne wyniki
- Ponad połowa zebranych zdarzeń została zidentyfikowana jako jądra komórkowe, co wskazuje na pomyślną izolację.
- Wysoka kołowość jąder sugeruje zachowanie wysokiej jakości podczas dyssekcji.
- Kontrola jakości wykazała jednorodny rozkład genów oraz mitochondriów.
- Geny markerowe były zgodne z ustalonymi punktami odniesienia dla poszczególnych typów komórek.
Wnioski
- Badanie przedstawia szybki postęp metodologiczny w zakresie preparatyki nabłonka węchowego.
- Umożliwiając wydajne sekwencjonowanie pojedynczych jąder komórkowych, przyczynia się ono do zrozumienia czynników genetycznych w procesie olfaksji.
- Niniejszy protokół może usprawnić analizę mechanizmów neuronalnych i plastyczności w systemach sensorycznych.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie przemysłowe
Szybkie i powtarzalne przygotowanie zawiesin pojedynczych jąder komórkowych z nabłonka węchowego myszy umożliwia wysokorozdzielcze profilowanie molekularne zróżnicowanych populacji neuronów i komórek progenitorowych. Niniejszy protokół rozwiązuje kluczowy problem w genomice pojedynczych komórek poprzez zminimalizowanie czasu ekstrakcji tkanki i zachowanie integralności jąder, co wspiera rzetelną walidację celów oraz redukcję ryzyka mechanistycznego w procesach badawczych z zakresu neuronauki sensorycznej. Zastosowane podejście zwiększa pewność prognostyczną we wczesnych etapach odkryć oraz w badaniach translacyjnych skoncentrowanych na genetycznych podstawach funkcji i regeneracji węchu.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Umożliwia szybką weryfikację hipotez dotyczących ekspresji genów w neuronach sensorycznych węchu i ich progenitorach.
- Wspiera funkcjonalną walidację celów poprzez zachowanie jakości jąder komórkowych do późniejszego sekwencjonowania.
- Ułatwia mechanistyczną redukcję ryzyka w odniesieniu do szlaków kandydackich zaangażowanych w obrót neuronów sensorycznych.
- Zwiększa pewność predykcyjną przy ustalaniu priorytetów dla celów w badaniach nad systemem sensorycznym.
Przesiewy i rozwój testów analitycznych
- Zapewnia wysokiej jakości zawiesiny pojedynczych jąder komórkowych, odpowiednie dla ustandaryzowanych protokołów sekwencjonowania pojedynczych komórek.
- Zapewnia powtarzalność i skalowalność w przypadku wielu próbek oraz serii eksperymentalnych.
- Dostarcza danych ilościowych, w tym wskaźników wydajności i jakości jąder, do walidacji testów.
- Umożliwia wiarygodną ocenę zmian w ekspresji genów w odpowiedzi na zaburzenia eksperymentalne.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Jest zgodne z modelami istotnymi dla schorzeń w badaniach nad dysfunkcją i regeneracją węchu.
- Zapewnia ciągłość od etapu genomiki odkrywczej po przedkliniczną walidację celów molekularnych.
- Zmniejsza ryzyko biologiczne poprzez dostarczanie spójnych, wysokiej jakości danych do identyfikacji translacyjnych biomarkerów.
- Ułatwia podejmowanie decyzji o dalszym rozwoju projektów w portfelach neuronauki sensorycznej w oparciu o ocenę ryzyka.
Integracja potoku i przepływu pracy
Niniejszy protokół integruje etap wczesnego odkrywania z identyfikacją związków wiodących, umożliwiając płynne przejście od ekstrakcji tkanki do sekwencjonowania pojedynczych jąder komórkowych i analizy danych.
- Biologia odkrywcza: Przyspiesza testowanie hipotez i wyjaśnianie szlaków w badaniach nad układem węchowym.
- Przesiewanie: Dostarcza zawiesiny jąder komórkowych gotowe do analizy z walidowanymi wskaźnikami jakości.
- Analityka: Zapewnia ilościowe odczyty do porównywania ekspresji genów w różnych typach komórek i warunkach.
- Badania translacyjne: Wspiera dopasowanie biomarkerów i rozwój modeli przedklinicznych dla zaburzeń węchu.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Ustanawia zstandaryzowany, reużywalny schemat postępowania w przygotowaniu pojedynczych jąder komórkowych w tkankach sensorycznych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność predykcyjną i zmniejsza niejednoznaczność mechanistyczną w walidacji celów.
- Wartość operacyjna: Poprawia standaryzację, powtarzalność i przepustowość w genomice pojedynczych komórek.
- Wartość strategiczna: Umożliwia podejmowanie świadomych decyzji go/no-go oraz efektywne zarządzanie kapitałem w portfelu projektów.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację skorygowaną o ryzyko oraz rozwój programów z zakresu neuronauki sensorycznej.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymaga wiedzy technicznej w zakresie szybkiej sekcji i izolacji jąder komórkowych ze złożonych struktur anatomicznych.
- Wymaga dostępu do specjalistycznej aparatury do przetwarzania tkanek i kontroli jakości (np. cytometrii przepływowej z obrazowaniem).
- Konieczna jest standaryzacja międzyzespołowa w celu zapewnienia powtarzalności wyników w różnych badaniach i przez różnych operatorów.
- Może wymagać adaptacji do zastosowań w innych typach tkanek lub systemach modelowych o odmiennych cechach anatomicznych.
- Ekstrakcja zorientowana na szybkość może ograniczać zastosowania w przypadkach, gdy kluczowa jest integralność anatomiczna.
