Zobrazenie in vivo sterydowane obrazem śledzenia przeszczepowanych komórek macierzystych nabłonka odległych płuc w przypadku zwłóknienia płuc przy użyciu obrazowania z zastosowaniem cząstek magnetycznych
27 czerwca 2025
Terapia komórkowa oferuje obiecujące leczenie dla pacjentów z przewlekłą chorobą płuc poprzez zastosowanie komórek progenitorowych do naprawy uszkodzonych tkanek i poprawy funkcji płuc. Ponieważ obrazowanie odgrywa kluczową rolę w śledzeniu integracji komórek, opisujemy tutaj śledzenie in vivo terapii komórkowej dla przewlekłej choroby płuc w modelu mysim z wykorzystaniem obrazowania cząstek magnetycznych.
To badanie koncentruje się na protokołach intubacji dotchętniowej jako krytycznej metodzie dostarczania terapii komórkowej płuc, mającej na celu optymalizację przeszczepu komórek i nieinwazyjne śledzenie za pomocą obrazowania cząstek magnetycznych w świączy płuc. Nasz protokół rozwiązuje problem braku nieinwazyjnych metod śledzenia terapii komórkowej w świączy płuc in vivo, łącząc intubację dotchętniową z obrazowaniem cząstek magnetycznych w celu monitorowania rozmieszczenia komórek. Nasz protokół oferuje precyzyjne, zlokalizowanie dostarczania komórek poprzez intubację dotchętniową i doskonałe śledzenie za pomocą obrazowania cząstek magnetycznych, zapewniając wysoką czułość, obrazowanie w czasie rzeczywistym bez tła szumów.
Aby rozpocząć, ważyć 12-tygodniowego samca myszy NOD lub SCID, aby obliczyć wymaganą dawkę bleomycyny. Przygotować roztwór bleomycyny w sterylnym roztworze fizjologicznym na żądanym stężeniu do ostatecznej objętości 50 mikrolitrów w 1,7-mililitrowej mikrocentryfuziarce. Następnie włożyć roztwór do pipety.
Wstępnie włożyć do strzykawki 200 mikrolitrów powietrza, aby upewnić się, że cały objętość płynu zostanie wypchnięta do tchawicy podczas wstrzyknięcia. Po znieczuleniu myszy, składać zestaw intubacji z włóknem świetlnym z sondą optyczną przewleczoną przez laryngoskopem i cewnik. Szczucić palca zwierzęcia, aby potwierdzić odpowiednie znieczulenie i nałożyć maść okulistyczną na oba oczy, za każdym razem, gdy zwierzę jest znieczulone.
Zwieszać myszę za siekacze w pozycji na plecach na nachylonej podstawie do intubacji gryzoni. Używając tępych kleszczy, chwycić język i delikatnie przesunąć go w górę i w lewo, aby odsłonić krtań dla jasnego widoku. Włączyć sondę światłowodową i przeprowadzić ją do ust, aby podejść do tchawicy.
Użyć lupy laryngoskopu, aby zwiększyć widoczność i zidentyfikować struny głosowe w otworze tchawicy. Włożyć cewnik do otworu tchawicy i delikatnie usunąć laryngoskopem. Następnie umieścić 20-mikrolitrową kroplę roztworu fizjologicznego na górnym końcu cewnika.
Przymocować strzykawkę wstępnie naładowaną 200 mikrolirami powietrza i przesunąć kroplę do tchawicy. Następnie, włożyć do cewnika do 50 mikrolitrów bleomycyny i wstrzyknąć go za pomocą strzykawki wypełnionej powietrzem. Pozostawić cewnik na miejscu przez 5-7 sekund, aby zapobiec odpływowi płynu z tchawicy.
Następnie delikatnie usunąć cewnik. Utrzymać myszę na podstawie do intubacji w tej samej pozycji przez co najmniej 30 sekund. Następnie zdjąć myszę ze stojaka i umieścić ją w klatce rekonwalescencyjnej umieszczonej na podgrzewaczu.
Monitorować myszy nieprzerwanie, aż całkowicie się obudzi z znieczulenia. Uzyskać oznaczone nanocząsteczkami ludzkie komórki nabłonka dróg oddechowych pacjentów z idiopatyczną świączyą płuc. 72 godziny po zastosowaniu bleomycyny, ponownie znieczulić myszy i powtórzyć procedurę intubacji dotchętniowej, aby podać 50 000 komórek w 50 mikrolitrach zawiesiny komórkowej.
Pozwólić myszy wyleczyć się przez co najmniej 20 minut przed obrazowaniem cząstek magnetycznych. Ustawić łóżeczko myszy w skanerze obrazowania cząstek magnetycznych po przepuszczeniu linii znieczulenia pod łóżeczkiem przez odpowiednie złącza. Podczas znieczulania myszy, przygotować skaner obrazowania cząstek magnetycznych.
Po potwierdzeniu odpowiedniego znieczulenia za pomocą testu szczypnięcia palca, delikatnie umieścić myszy na łóżeczku do obrazowania cząstek magnetycznych. Włożyć łóżeczko z myszą do otworu skanera i kliknąć na Start Scan w interfejsie oprogramowania, aby rozpocząć obrazowanie. Po zakończeniu skanowania, usunąć myszy z łóżeczka do obrazowania cząstek magnetycznych i umieścić ją w klatce rekonwalescencyjnej umieszczonej na podgrzewaczu.
Wreszcie, analizować uzyskane obrazy za pomocą oprogramowania do analizy obrazów. Intensywność sygnału 2D obrazowania cząstek magnetycznych lub MPI zwiększała się proporcjonalnie wraz ze stężeniem tlenku żelaza jako znacznika przez wszystkie testowane liczby komórek. Stężenie 250 mikrogramów na mililitr zostało wybrane jako optymalne stężenie do oznaczania.
Mikroskopia fluorescencyjna potwierdziła pomyślne oznaczanie komórek in vitro, wykazując czerwone sygnały dekstrany w cytoplazmie i niebieskie jądra oznakowane DAPI. Intensywności sygnałów w 2D obrazach MPI wzrosły wraz z liczbą oznaczonych komórek, potwierdzając pozytywną korelację między sygnałem a liczbą komórek. Na tej podstawie, wybrano 50 000 komórek do przeszczepu.
Obraz kontroli pustego łóżeczka nie wykazał tła sygnału MPI, co potwierdza specyficzność skanera dla oznaczonych komórek. Cztery zaobserwowane sygnały odpowiadają punktom kontrolnym użytym jako kontrole. Pomyślne przeszczepienie oznaczonych komórek do płuc wytworzyło charakterystyczny sygnał MPI w kształcie motyla z widocznym rozmieszczeniem w obu płucach, co potwierdza skuteczne dostarczenie
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Włóknienie płuc (PF) to ciężka choroba płuc charakteryzująca się postępującym bliznowaceniem i upośledzeniem funkcji oddechowych. Niniejsze badanie analizuje wykorzystanie obrazowania cząstek magnetycznych (MPI) do nieinwazyjnego śledzenia ludzkich komórek progenitorowych nabłonka dystalnego płuc przeszczepionych do płuc myszy z niedoborem odporności, w celu usprawnienia monitorowania i zwiększenia skuteczności terapii komórkowej w leczeniu PF.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Pulmonologia
- Terapia komórkowa
- Obrazowanie przedkliniczne
Wprowadzenie
- WF prowadzi do nadmiernego odkładania się macierzy zewnątrzkomórkowej, pogrubienia tkanek oraz dysfunkcji oddechowych.
- Obecne metody leczenia są ograniczone i służą głównie spowalnianiu progresji choroby.
- Terapia komórkowa stwarza potencjał do regeneracji tkanki płucnej i modulacji stanu zapalnego.
- Skuteczny monitoring przeszczepionych komórek jest kluczowy dla sukcesu terapeutycznego.
Cel badania
- Ocena MPI jako narzędzia do ilościowego śledzenia w czasie rzeczywistym przeszczepionych komórek progenitorowych płuc in vivo.
- Optymalizacja znakowania SPION w celu uzyskania maksymalnego sygnału MPI.
- Ocena dystrybucji, retencji i integracji komórek w tkance płucnej w czasie.
Zastosowane metody
- Znakowanie ludzkich komórek progenitorowych nabłonka dystalnego płuc przy użyciu różnych stężeń SPIONs.
- Potwierdzenie znakowania poprzez immunobarwienie i ilościowe oznaczenie żelaza.
- Instylacja dotchawiczna znakowanych komórek do myszy z niedoborem odporności.
- Pozyskiwanie obrazów MPI 2D w celu przestrzennego i podłużnego śledzenia przez okres 2 tygodni.
- Walidacja histologiczna po śmierci zwierząt.
Główne wyniki
- Zoptymalizowane znakowanie SPION umożliwiło silną detekcję sygnału MPI.
- Pomyślna instylacja komórek wykazała sygnały MPI w obu płucach.
- Sygnał MPI zmniejszył się o około 65% w ciągu 2 tygodni, co wskazuje na dynamikę retencji i usuwania komórek.
- Analiza histologiczna potwierdziła obecność i rozmieszczenie przeszczepionych komórek.
Wnioski
- MPI jest czułą, nieinwazyjną metodą do podłużnego śledzenia terapii komórkowych w modelach PF.
- Znakowanie SPION oraz MPI umożliwiają ocenę rozkładu i retencji komórek in vivo w czasie rzeczywistym.
- Podejście to wspiera opracowywanie i optymalizację terapii komórkowych w zwłóknieniu płuc.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Nieinwazyjne, ilościowe śledzenie przeszczepionych terapii komórkowych stanowi krytyczne wyzwanie w badaniach przedklinicznych nad włóknieniem płuc, co bezpośrednio wpływa na pewność prognostyczną i ciągłość translacyjną. Obrazowanie cząstek magnetycznych (MPI) umożliwia ocenę rozkładu i retencji komórek w czasie rzeczywistym i w sposób podłużny, wspierając ograniczanie ryzyka mechanistycznego oraz walidację celów dla strategii regeneracyjnych. Zdolność ta wzmacnia proces podejmowania decyzji w zakresie portfolio, dostarczając praktycznych danych na temat integracji i trwałości terapii komórkowej w modelach istotnych dla danej choroby.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Umożliwia bezpośrednią ocenę przeżywalności i rozwlekania się komórek in vivo.
- Wspiera biologiczną redukcję ryzyka poprzez ilościowe określenie retencji i rozmieszczenia komórek.
- Zapewnia funkcjonalną walidację hipotez dotyczących terapii komórkowych w modelach włóknienia płuc.
- Ułatwia uzyskanie pewności prognostycznej w celu dalszego rozwoju interwencji opartych na komórkach.
Przesiewanie i opracowanie testów
- Ustanawia zwalidowane parametry obrazowania w celu oceny lokalizacji i trwałości komórek.
- Standaryzuje ilościową ocenę dostarczania i integracji komórek.
- Umożliwia powtarzalną i skalowalną ewaluację kandydatów do terapii komórkowej.
- Wspiera późniejszy screening modyfikacji komórkowych lub protokołów dostarczania.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Umożliwia dopasowanie obrazowania przedklinicznego do punktów końcowych istotnych dla przebiegu włóknienia płuc.
- Zapewnia ciągłość procesu od etapu odkrycia po przedkliniczną walidację terapii komórkowych.
- Umożliwia dostosowanie rozwoju badań do poziomu ryzyka w oparciu o ilościowe, podłużne śledzenie komórek.
- Wspiera rozwój translacyjnych biomarkerów do monitorowania terapii komórkowych.
Integracja rurociągu i przepływu pracy
Śledzenie komórek w oparciu o MPI integruje się z kontinuum od odkryć do badań przedklinicznych, łącząc wczesne testowanie hipotez z walidacją translacyjną w modelach włóknienia płuc.
- Biologia odkrywcza: Ilościowe określanie stopnia i trwałości przeżycia przeszczepionych komórek w celu wyjaśnienia mechanizmów terapeutycznych.
- Screening: Dostarcza ustandaryzowane, powtarzalne wyniki obrazowania do oceny kandydatów.
- Analityka: Dostarcza ilościowe dane podłużne dotyczące rozkładu i retencji komórek.
- Badania translacyjne: Dostosowuje punkty końcowe obrazowania do przedklinicznych i przyszłych potrzeb monitorowania klinicznego.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Tworzy platformę obrazowania wielokrotnego użytku dla różnorodnych programów terapii komórkowej ukierunkowanych na choroby płuc.
Wpływ operacyjny i korporacyjny
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną i zmniejsza niejednoznaczność mechanistyczną w opracowywaniu terapii komórkowych.
- Wartość operacyjna: Umożliwia stosowanie zstandaryzowanych, skalowalnych i powtarzalnych procedur śledzenia komórek.
- Wartość strategiczna: Wspiera podejmowanie świadomych decyzji o kontynuowaniu lub przerwaniu badań (go/no-go) oraz efektywne pod kątem kapitałowym rozwijanie portfolio.
- Wpływ na portfolio: Ułatwia priorytetyzację kandydatów do terapii komórkowej w przebiegu włóknienia płuc z uwzględnieniem analizy ryzyka.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w znakowaniu komórek, obrazowaniu przedklinicznym oraz analizie ilościowej.
- Wymaga dostępu do aparatury MPI oraz zwalidowanych odczynników SPION.
- Konieczna jest międzyzespołowa standaryzacja protokołów obrazowania i interpretacji danych.
- Może wymagać adaptacji dla różnych typów komórek lub modeli chorób płuc.
- Należy wziąć pod uwagę przepustowość obrazowania podłużnego oraz ograniczenia modeli zwierzęcych.
Najczęściej zadawane pytania (FAQ) dotyczące biofarmacji
Chapters in this video
0:00
Introduction
0:48
Intratracheal Instillation of Bleomycin in Mice
3:16
Intratracheal Instillation of Nanoparticle Labeled Human Airway Epithelial Cells
3:50
Magnetic Particle Imaging for Tracking Nanoparticle-Labeled Cells
4:44
Results
6:40
Conclusion
