Znakowanie hESC i hMSC nanocząstkami tlenku żelaza w celu nieinwazyjnego śledzenia in vivo za pomocą obrazowania MR

Witamy w laboratorium Dr.Haiku Dal Link. Chcielibyśmy podziękować Kalifornijskiemu Instytutowi Medycyny Regeneracyjnej za sfinansowanie tego projektu w celu oceny nowych terapii komórkami macierzystymi. Ważne jest, aby nieinwazyjnie śledzić wstrzyknięte komórki in vivo.

Jest to możliwe dzięki znakowaniu komórek in vitro specyficznymi lub wielofunkcyjnymi środkami kontrastowymi do obrazowania MR lub obrazowania optycznego. Ten film pokaże Ci, jak oznaczać ludzkie mezenchymalne i ludzkie embrionalne komórki macierzyste do późniejszego obrazowania in vivo. Cześć, nazywam się Tobias Henning i pracuję w Grupie Badawczej ds. Środków Kontrastowych w Centrum Obrazowania Molekularnego i Funkcjonalnego na Wydziale Radiologii Uniwersytetu Kalifornijskiego w San Francisco.

Dzisiaj pokażę Wam procedury znakowania in vitro ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych za pomocą peryku, karonu oraz ludzkich embrionalnych komórek macierzystych za pomocą tlenków phem. Technika ta jest przydatna w celu lokalizacji wstrzykniętych komórek in vivo lub uzyskania informacji o ich stanie funkcjonalnym. Procedury znakowania komórek za pomocą czynnika świadomego MRI różnią się w przypadku embrionalnych i mezenchymalnych komórek macierzystych, ale obie techniki obejmują następujące etapy: przygotowanie hodowli komórkowej, która polega na posiewaniu komórek jako przylegających do kultur komórkowych, przygotowanie znakowania, znakowanie komórek za pomocą prostej inkubacji trypsyny komórek macierzystych i zmywanie wolnego świadomego czynnika, ocena skuteczności znakowania i żywotności komórek.

Zacznijmy więc i oznaczmy niektóre komórki. Teraz zacznijmy od oznaczania mezenchymalnych komórek macierzystych za pomocą Theo Carbatrol. Po pierwsze, pokażę technikę znakowania ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych za pomocą teo karronu i środka kontrastowego na bazie tlenku żelaza do obrazowania MR.

Na początek platerujemy komórki od 18 do 24 godzin przed procedurą etykietowania w kolbach T 75 przy zbiegu 80% W przeciwnym razie, jeśli użyjesz innej szalki hodowlanej, która odpowiada około 10 000 komórek na centymetr kwadratowy następnego dnia, zaczynamy od przygotowania podłoża do etykietowania, dodając 30 mikrolitrów rezerwisty do ośmiu mililitrów pożywki wolnej od surowicy. Spowoduje to oznaczenie jednego T 75 FLA o płynności co 80% i odpowiada stężeniu stu mikrogramów żelaza na mililitr pożywki. Teraz zdejmujemy pożywkę hodowlaną i myjemy komórki raz pożywką PBS lub pożywką wolną od surowicy.

Robimy to, aby pozbyć się resztek białek surowicy i innych składników pożywki, które mogłyby wiązać środki kontrastowe i wpływać na skuteczność znakowania. Dodać pożywkę do etykietowania do kolby i umieścić kolbę z powrotem w inkubatorze. Po dwóch godzinach dodać dwa ml FCS, aby uzyskać końcowe stężenie 20% FCS.

Robimy to, aby upewnić się, że komórki nie otrzymują żadnego bodźca do różnicowania, że są martwe, rosną w znajomym środowisku. Teraz inkubujemy komórki przez 18 godzin. Następnego dnia przepłukujemy komórki PBS, a następnie poddajemy je działaniu zgodnie ze standardowymi protokołami hodowli w celu pozbycia się wolnego środka kontrastowego.

Po inizacji Trypsa zawiesinę komórkową przepłukuje się trzykrotnie przez odwirowanie w temperaturze 400 RCF przez pięć minut, a następnie ponowne zawieszenie w PBS. Otóż to. Ostatnia komórka P może zostać ponownie zawieszona i jest gotowa do dalszych eksperymentów.

Liczymy teraz komórki, ponieważ mogliśmy je stracić podczas poprzednich etapów prania. Na tym etapie przeprowadzamy również testy żywotności za pomocą testu wykluczenia trippin blue i pobieramy próbki do analizy spektrometrycznej w celu zmierzenia skuteczności etykietowania. Pozwólcie, że pokażę wam, jak oznaczać ludzkie embrionalne komórki macierzyste tlenkami femu.

Na początek umieszczamy ludzkie embrionalne komórki macierzyste w 10-centymetrowych szalkach. Jak zwykle, naczynia te są wstępnie zakodowane żelatyną i mają na sobie napromieniowane komórki podajnika. Możesz użyć tego protokołu również w przypadku kultur wolnych od karmnika.

Pozwalamy ludzkim embrionalnym komórkom macierzystym przyczepiać się i rosnąć przez około trzy do czterech dni, tak aby utworzyły średniej wielkości kolonie. W tym czasie dbamy o to, aby kolonie nie urosły zbyt duże, ponieważ większe rodziny są trudniejsze do rozbicia. Później zróżnicowane komórki mogą zanieczyścić te kultury.

Tak więc, w zależności od czystości kolonii, możemy być zmuszeni do pozbycia się zróżnicowanych kultur poprzez sekcję. Teraz przygotowujemy pożywkę do etykietowania, która składa się z tlenków twierdzenia o stężeniu stu mikrogramów żelaza na mililitr i pełnego podłoża z ludzkich embrionalnych komórek macierzystych. W tym celu mieszamy 89 mikrolitrów, tlenków phem i 10 mililitrów pełnej pożywki wzrostowej.

Jeśli chodzi o mezenchymalne komórki macierzyste, myjemy naczynie raz kompletnym podłożem, aby pozbyć się martwych komórek lub zanieczyszczeń. Następnie dodajemy 10 mililitrów podłoża do etykietowania na naczynie i inkubujemy komórki przez cztery godziny. Teraz etykietowanie jest zakończone.

W kolejnym kroku musimy umyć komórki i uzyskać zawiesinę pojedynczej komórki. Do dalszego wykorzystania W tym celu najpierw spłukujemy naczynie PBS. Teraz zastępujemy PBS pięcioma mililitrami 0,25% trypsyny i inkubujemy przez pięć minut w inkubatorze lub do momentu odłączenia komórek.

Pomocne jest częste stukanie w naczynie, komórki są teraz odłączone. Należy pamiętać, że jeśli naczynie zawierało większe kolonie, może to być kilka grudek pozostawionych do pozbycia się tych grudek. Całą zawiesinę dokładnie mieszamy, pipetując w górę i w dół, za pomocą pipety serologicznej, a następnie pozostawiamy na kolejne dwie minuty.

W trypszynie. Nie używamy pipety eppendorf, ponieważ wielokrotne pipetowanie komórek przez cienką końcówkę może spowodować uszkodzenie błon komórkowych, jeśli wszystko działa prawidłowo. Mamy teraz zawiesinę jednokomórkową, która jest zmieszana z dużą ilością zanieczyszczeń pochodzących z żelatyny pokrywającej matrycę embrionalnych komórek macierzystych i martwych komórek.

Możemy teraz pozbyć się pozostałych grudek lub kompleksów, przepuszczając komórki przez sitko o średnicy 40 mikrometrów. Teraz musimy wyizolować ludzkie embrionalne komórki macierzyste od napromieniowanych komórek żywicielskich. Można to skutecznie zrobić, posiewając zawiesinę komórek na naczyniu pokrytym żelatyną.

Jeśli nie będziemy manipulować naczyniem, wszystkie komórki ulegną osadowi, ale karmniki przyczepią się szybciej niż ludzkie embrionalne komórki macierzyste. Jeśli więc zdejmujemy SUP natin po 45 minutach, powinien on zawierać głównie ludzkie embrionalne komórki macierzyste, natomiast karmniki powinny być głównie przymocowane do naczynia. W ten sposób uzyskujemy jednokomórkową zawiesinę znakowanych magnetycznie ludzkich embrionalnych komórek macierzystych, które mogą być wykorzystane do dalszych eksperymentów, tak jak w poprzednim protokole.

W tym momencie należy policzyć komórki i pobrać próbki w celu oceny żywotności i pomiaru skuteczności etykietowania. Na tym kończymy protokoły, które chciałem wam dzisiaj pokazać. Przyjrzyjmy się teraz, w jaki sposób możemy śledzić znakowane komórki macierzyste in vivo.

Ten slajd pokazuje komórki macierzyste oznaczone OC Carone. Po wstrzyknięciu ich do mózgu myszy zawiesiliśmy 20 000 komórek w objętości 75 nanolitrów i wstrzyknęliśmy je do strefy podkomorowej. Tlenek żelaza w wszczepionych komórkach powoduje artefakt podatności, który można zobaczyć w MR. Obrazów.

Właśnie pokazaliśmy, jak oznaczać embrionalne i mezenchymalne komórki macierzyste. Śledzenie in vitro za pomocą środków Mr.Contrast mezenchymalnych i embrionalnych komórek macierzystych in vivo ma ogromny potencjał w ocenie nowych terapii komórkami macierzystymi. Więc to wszystko.

Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w oznaczaniu komórek.