Name: Znakowanie hESC i hMSC nanocząstkami tlenku żelaza w celu nieinwazyjnego śledzenia in vivo za pomocą obrazowania MR (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-03-31T21:32:00.000+00:00
Duration: 9 min 6 s
Description: Poznaj metodę znakowania ludzkich komórek macierzystych mezenchymalnych i embrionalnych nanocząstkami tlenku żelaza do nieinwazyjnego śledzenia in vivo za pomocą obrazowania MR.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Projekt ten został sfinansowany z grantu Leon J. Thal SEED przyznanego przez California Institute for Regenerative Medicine. Tobias Henning otrzymał stypendium badawcze z Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, HE 4578/1-2). Pragniemy wyrazić wdzięczność Juanito Menesesowi za rady dotyczące hodowli ludzkich embrionalnych komórek macierzystych.

Znakowanie hMSC ferukarbotronem
Niniejsza technika opisuje sposób znakowania ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych za pomocą Ferucarbotranu, kontrastowego środka na bazie tlenku żelaza stosowanego w obrazowaniu MR:
<ol>
<li>Na początek, 18–24 godziny przed procedurą znakowania, wysiej komórki w kolbach T75 do osiągnięcia 80% konfluencji. W przypadku użycia innego naczynia hodowlanego odpowiada to około 10000 komórek na cm2.</li>
<li>Następnego dnia przygotuj medium do znakowania, dodając 30 µl Resovistu do 8 ml medium bezsurowiczego. Taka ilość wystarczy do oznakowania jednej kolby T75 przy 80% konfluencji, co odpowiada stężeniu 100 µg Fe/ml medium.</li>
<li>Usuń medium hodowlane i wypłucz komórki raz za pomocą PBS lub medium bezsurowiczego. Jest to konieczne w celu usunięcia pozostałości białek surowicy oraz innych składników medium, które mogłyby wiązać środek kontrastowy i wpływać na wydajność znakowania.</li>
<li>Dodaj medium do znakowania do kolby i wprowadź kolbę z powrotem do inkubatora.</li>
<li>Po 2 godzinach dodaj 2 ml FCS, aby uzyskać stężenie końcowe 20% FCS. Ma to na celu zapobieganie stymulacji różnicowania komórek i zapewnienie im wzrostu w znanym im środowisku.</li>
<li>Inkubuj komórki przez 18 godzin. Najlepiej przeprowadzić ten etap przez noc.</li>
<li>Następnego dnia wypłucz komórki za pomocą PBS, a następnie poddaj je trypsynizacji w sposób rutynowy.</li>
<li>Po trypsynizacji zawiesinę komórkową należy przemyć 3 razy, aby usunąć z medium pozostałości wolnego środka kontrastowego. Należy to wykonać za pomocą PBS, wirując komórki&nbsp;przy 400 rcf przez 5 minut.</li>
<li>Otrzymany osad komórkowy można resuspenderować; jest on gotowy do dalszych eksperymentów.</li>
<li>Przeprowadź teraz liczenie komórek, ponieważ część z nich mogła zostać utracona podczas wcześniejszych etapów płukania. W tym momencie wykonaj również test żywotności metodą wykluczania błękitu trypanu oraz pobierz próbki do analizy spektrometrycznej w celu pomiaru wydajności znakowania.</li>
</ol>
Znakowanie ludzkich embrionalnych komórek macierzystych ferumoksydami
<ol>
<li>Na początek, zgodnie ze standardową procedurą, wysiej hESC w naczyniach 10 cm. Naczynia te są wcześniej pokryte żelatyną i zawierają napromieniowane komórki karmne. Niniejszy protokół można stosować również dla kultur bezkomórkowych (feeder-free).</li>
<li>Pozostaw hESC do przyczepienia i wzrostu przez około 3-4 dni, aż utworzą kolonie średniej wielkości. W tym czasie dopilnuj, aby kolonie nie urosły zbyt duże, ponieważ większe kolonie są trudniejsze do rozbicia na późniejszym etapie.</li>
<li>Kultury te mogą zostać zanieczyszczone przez komórki zróżnicowane, więc w zależności od czystości kolonii,&nbsp;może być konieczne usunięcie zróżnicowanych kultur poprzez dyssekcję.</li>
<li>Przygotuj medium do znakowania, składające się z ferumoksydów w stężeniu 100µg/ml oraz pełnego medium do hESC. W tym celu zmieszaj 89µl ferumoksydów i 10 ml pełnego medium wzrostowego.</li>
<li>Przepłucz naczynie raz pełnym medium.</li>
<li>Dodaj 10 ml medium do znakowania na naczynie i inkubuj komórki przez 4 godziny.</li>
<li>Znakowanie jest teraz zakończone. W kolejnym kroku konieczne jest wypłukanie komórek i uzyskanie zawiesiny pojedynczych komórek do dalszego wykorzystania. W tym celu najpierw opłucz naczynie roztworem PBS.</li>
<li>Następnie zastąp PBS 5ml 0,25% trypsyny i inkubuj w inkubatorze przez 5 minut lub do czasu odklejenia się komórek. Pomocne jest częste opukiwanie naczynia.</li>
<li>Komórki zostały teraz odklejone. Należy pamiętać, że jeśli w naczyniu znajdowały się większe kolonie, mogły pozostać niektóre skupiska.</li>
<li>Aby pozbyć się tych skupisk, można raz wymieszać całą zawiesinę za pomocą pipety serologicznej, a następnie pozostawić ją na kolejne 2 minuty.</li>
<li>Nie używamy pipety typu Eppendorf, ponieważ wielokrotne zasysanie komórek przez cienką końcówkę może uszkodzić membrany komórkowe.</li>
<li>Jeśli obecne są pozostałości skupisk, zawiesinę komórkową można przefiltrować przez sitko komórkowe 40µm.</li>
<li>Jeśli wszystko przebiegło prawidłowo, uzyskano zawiesinę pojedynczych komórek zmieszaną z dużą ilością debris, pochodzących z powłoki żelatynowej, macierzy ESC i martwych komórek. Aby się ich pozbyć, wypłucz komórki dwukrotnie, wirując je przy 400 rcf przez 5 minut i resuspendując w pełnym medium.</li>
<li>Teraz ESC muszą zostać odizolowane od napromieniowanych komórek karmnych. Można to zrobić efektywnie, wysiewając zawiesinę komórkową na naczynie pokryte żelatyną.</li>
<li>Jeśli naczyniem nie manipulować, wszystkie komórki osiądą na dnie, ale komórki karmne przyczepią się szybciej niż ESC.</li>
<li>Zatem, jeśli supernatant zostanie zebrać po 45 minutach, powinien zawierać głównie ESC, podczas gdy komórki karmne powinny być w większości przyczepione do naczynia.</li>
<li>W ten sposób uzyskuje się zawiesinę pojedynczych, znakowanych magnetycznie ludzkich embrionalnych komórek macierzystych, które mogą być wykorzystane w dalszych eksperymentach.</li>
<li>Podobnie jak w poprzednim protokole, na tym etapie należy policzyć komórki oraz pobrać próbki do oceny żywotności i pomiaru wydajności znakowania.</li>
</ol>
&nbsp;

<ol><li>Daldrup-Link, H. E., Rudelius, M., Oostendorp, R. A. J., Settles, M., Piontek, G., Metz, S., Heinzmann, U., Rummeny, E. J., Schlegel, J., Link, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+of+Hematopoietic+Progenitor+Cells+with+MR+Contrast+Agents%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Targeting of Hematopoietic Progenitor Cells with MR Contrast Agents.</a> 228, 760-767 (2003).</li>
<li>Daldrup-Link, H. E., Rudelius, M., Piontek, G., Metz, S., Brauer, R., Debus, G., Corot, C., Schlegel, J., Link, T. M., Peschel, C., Rummeny, E. J., Oostendorp, R. A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Migration+of+iron+oxide+labeled+human+hematopoietic+progenitor+cells+in+a+xenotransplant+model%3A+in+vivo+monitoring+using+clinical+magnetic+resonance+imaging+equipment%5BTitle%5D)+AND+%22Radiology%22%5BJournal%5D)">Migration of iron oxide labeled human hematopoietic progenitor cells in a xenotransplant model: in vivo monitoring using clinical magnetic resonance imaging equipment.</a> Radiology. 234, 197-205 (2005).</li>
<li>Henning, T. D., Saborowski, O., Golovko, D., Boddington, S., Bauer, J. S., Fu, Y., Meier, R., Pietsch, H., Sennino, B., McDonald, D. M., Daldrup-Link, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+labeling+with+the+positive+MR+contrast+agent%5BTitle%5D)+AND+%22Gadofluorine+M.+Eur+Radiol%22%5BJournal%5D)">Cell labeling with the positive MR contrast agent.</a> Gadofluorine M. Eur Radiol. 17, 1226-1234 (2007).</li>
</ol>

Nieinwazyjne obrazowanie komórek macierzystych jest kluczowe dla monitorowania niemal każdej terapii opartej na komórkach macierzystych. Lepsze zrozumienie kinetyki in vivo znakowanych komórek macierzystych, wizualizowanej na obrazach MR, może utorować drogę do racjonalnego i bardziej efektywnego wykorzystania terapii komórkowych. Ponieważ stosujemy klinicznie dostępne środki kontrastowe i techniki obrazowania, prezentowane protokoły powinny być łatwo możliwe do przeniesienia na zastosowania u pacjentów. Potencjalne zast...

<table><tbody><tr><td>D-MEM High Glucose</td><td>Odczynnik</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5648</td><td></td></tr><tr><td>Żelatyna</td><td>Odczynnik</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1890</td><td>rozcieńczyć żelatynę w PBS do stężenia końcowego 0.1 %</td></tr><tr><td>PBS (bez Ca++ Mg++)</td><td>Odczynnik</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>Trypsyna-EDTA 0.05%</td><td>Odczynnik</td><td>Invitrogen</td><td>25300-120</td><td></td></tr><tr><td>Trypsyna-EDTA 0.25%</td><td>Odczynnik</td><td>Invitrogen</td><td>25200-114</td><td></td></tr><tr><td>FBS charakteryzowany</td><td>Odczynnik</td><td>Hyclone</td><td>SH30071.03</td><td></td></tr><tr><td>Sito do komórek (40 &amp;mu;m nylon)</td><td>Narzędzie</td><td>BD Biosciences</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>Knockout DMEM</td><td>Odczynnik</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>10829018</td><td></td></tr><tr><td>Knockout Serum Replacer</td><td>Odczynnik</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>10828028</td><td></td></tr><tr><td>b-merkapto&amp;#8211;etanol</td><td>Odczynnik</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>7522</td><td></td></tr><tr><td>nieistotne aminokwasy</td><td>Odczynnik</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>11140050</td><td></td></tr><tr><td>FGF-2</td><td>Odczynnik</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>233-FB-025</td><td></td></tr><tr><td>Glutamina</td><td>Odczynnik</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>25030081</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina/Streptomycyna</td><td>Odczynnik</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Ferumoksydy (Endorem)</td><td>Odczynnik</td><td>Guerbet</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ferukarbotran (Resovist&amp;#174;)</td><td>Odczynnik</td><td>Bayer AG</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

znakowanie hesc i hmsc nanocząsteczkami tlenku żelaza w celu nieinwazyjnego śledzenia in vivo za pomocą obrazowania mr

Labeling hESCs and hMSCs with Iron Oxide Nanoparticles for Non-Invasive in vivo Tracking with MR Imaging

W ostatnich latach badania nad komórkami macierzystymi doprowadziły do lepszego zrozumienia biologii rozwoju, różnych jednostek chorobowych oraz potencjalnego wpływu tych badań na medycynę regeneracyjną. Nieinwazyjna metoda umożliwiająca wielokrotne monitorowanie przeszczepionych komórek macierzystych in vivo znacznie zwiększyłaby nasze możliwości w zakresie zrozumienia mechanizmów kontrolujących śmierć komórek macierzystych oraz identyfikacji czynników troficznych i szlaków sygnałowych poprawiających ich engrafting. Wykazano, że obrazowanie rezonansem magnetycznym (MR) jest skutecznym narzędziem do obrazowania komórek macierzystych in vivo z niemal mikroskopową rozdzielczością anatomiczną. Aby wykryć komórki macierzyste za pomocą MR, komórki te muszą zostać znakowane specyficznymi dla komórek środkami kontrastowymi do MR. W tym celu stosuje się nanocząsteczki tlenku żelaza, takie jak superparamagnetyczne cząsteczki tlenku żelaza (SPIO), ze względu na ich wysoką czułość w wykrywaniu komórek oraz doskonałą biokompatybilność. Cząsteczki SPIO składają się z rdzenia z tlenku żelaza oraz otoczki z dekstranu, karboksydekstranu lub skrobi i działają poprzez tworzenie lokalnych niejednorodności pola, co powoduje spadek sygnału na obrazach MR ważonych w czasie T2. Niniejsza prezentacja przedstawi techniki znakowania komórek macierzystych za pomocą klinicznie stosowalnych środków kontrastowych do MR w celu późniejszego nieinwazyjnego śledzenia znakowanych komórek in vivo za pomocą obrazowania MR.

W celu oceny nowych terapii komórkami macierzystymi istotne jest nieinwazyjne śledzenie wstrzykniętych komórek in vivo. W tym filmie dowiedzą się Państwo, jak znakować ludzkie mezenchymalne i embrionalne komórki macierzyste za pomocą środków kontrastowych opartych na tlenku żelaza w celu późniejszego obrazowania MR in vivo.

Znakowanie hESC i hMSC nanocząsteczkami tlenku żelaza w celu nieinwazyjnego śledzenia in vivo za pomocą obrazowania MR

W ostatnich latach badania nad komórkami macierzystymi doprowadziły do lepszego zrozumienia biologii rozwoju, różnych jednostek chorobowych oraz ich potencjalnego wpływu na regeneracyjną...

Witamy w laboratorium dr. Haiku Dal Link. Chcielibyśmy podziękować California Institute of Regenerative Medicine za sfinansowanie tego projektu dotyczącego oceny nowych terapii komórkami macierzystymi. Ważne jest, aby nieinwazyjnie śledzić wstrzyknięte komórki in vivo.Jest to możliwe dzięki znakowaniu komórek in vitro specyficznymi lub wielofunkcyjnymi środkami kontrastowymi do obrazowania MR lub obrazowania optycznego. Ten film pokaże Państwu, jak znakować ludzkie mezenchymalne komórki macierzyste oraz ludzkie embrionalne komórki macierzyste do późniejszego obrazowania in vivo. Witam, jestem Tobias Henning z Grupy Badawczej nad Środkami Kontrastowymi w Centrum Obrazowania Molekularnego i Funkcjonalnego w Departamencie Radiologii na Uniwersytecie Kalifornijskim w San Francisco.Dzisiaj zaprezentuję procedury znakowania in vitro ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych za pomocą peric, carone oraz ludzkich embrionalnych komórek macierzystych za pomocą phem oxides. Technika ta jest przydatna do lokalizacji wstrzykniętych komórek in vivo lub do uzyskania informacji o ich stanie funkcjonalnym. Procedury znakowania komórek kontrastem do MRI różnią się dla embrionalnych i mezenchyma

labeling-hescs-hmscs-with-iron-oxide-nanoparticles-for-non-invasive

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Znaczenie hESC i hMSC nanocząstkami tlenku żelaza dla nieinwazyjnego śledzenia in vivo za pomocą obrazowania MR

W niniejszym filmie przedstawiono techniki znakowania ludzkich embrionalnych komórek macierzystych oraz mezenchymalnych komórek macierzystych barwnikami fluorescencyjnymi. Technika ta może być wykorzystana do śledzenia in vivo przeszczepionych komórek macierzystych za pomocą obrazowania optycznego oraz do korelacji histopatologicznych z wykorzystaniem mikroskopii fluorescencyjnej.

Znakowanie komórek macierzystych barwnikami fluorescencyjnymi do nieinwazyjnego wykrywania za pomocą obrazowania optycznego

W tym filmie pokazujemy, jak znakować ludzkie embrionalne komórki macierzyste (hESC) za pomocą chlorku manganu (MnCl2), który może wnikać do komórek poprzez napięciowo zależne kanały wapniowe, gdy komórki są biologicznie aktywne. Dodatkowo prezentujemy zastosowanie MnCl2 jako komórkowego środka kontrastowego w MRI w celu określenia żywotności hESC in vitro.

Znakowanie in vitro ludzkich embrionalnych komórek macierzystych do obrazowania metodą rezonansu magnetycznego

Celem prezentacji jest zademonstrowanie wysoce powtarzalnej metody generowania implantów komórek macierzystych związanych z macierzą w ubytkach chrząstki, które można wizualizować za pomocą obrazowania MR. Komórki macierzyste są znakowane zatwierdzonymi przez FDA ferumoksydami, mieszane z agarozą, implantowane w ubytkach chrząstki i obrazowane za pomocą skanera MR 7T.

Implantacja ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych znakowanych ferumoksydami w ubytkach chrząstki

Metody obrazowania biologicznego stosowane do oceny biodystrybucji komórkowej nanocząsteczek znajdują zastosowanie w monitorowaniu terapeutycznym i diagnostycznym związków sformułowanych w nanostruktury. Metody opisane w niniejszym opracowaniu są czułe i swoiste w ocenie za pomocą korejestracji histologicznej. Przedstawione metodologie zapewniają ścieżkę translacyjną od zastosowań na modelach gryzoni do zastosowań u ludzi.

Rejestrowane obrazowanie biomedyczne nanomateriałów w monitorowaniu diagnostyki i terapii

Opisujemy technikę znakowania i śledzenia komórek macierzystych przy użyciu zatwierdzonego przez FDA superparamagnetycznego tlenku żelaza (SPIO), ferumoksytolu (Feraheme). Ta technika obrazowania komórkowego, wykorzystująca obrazowanie metodą rezonansu magnetycznego (MR) do wizualizacji, jest łatwo dostępna w celu długoterminowego monitorowania i diagnozowania pomyślnych lub nieudanych przeszczepów komórek macierzystych u pacjentów.

Znakowanie komórek macierzystych za pomocą ferumoksytolu, zatwierdzonej przez FDA nanocząsteczki tlenku żelaza

Niniejszy artykuł opisuje zoptymalizowaną sekwencję zdarzeń dla obrazowania multimodalnego przeszczepów komórkowych w mózgu gryzoni z wykorzystaniem: (i) bioluminescencji in vivo i obrazowania rezonansem magnetycznym oraz (ii) pośmiertnej analizy histologicznej. Połączenie tych metod obrazowania u jednego zwierzęcia pozwala na ocenę przeszczepów komórkowych z wysoką rozdzielczością, czułością i swoistością.

Multimodalne obrazowanie implantacji komórek macierzystych w ośrodkowym układzie nerwowym myszy

Śledzenie komórek za pomocą MRI zyskało niezwykłą uwagę w ostatnich latach. Protokół ten opisuje znakowanie komórek dendrytycznych cząstkami bogatymi w fluor (19F), zastosowanie tych komórek in vivo oraz monitorowanie zakresu ich migracji do drenującego węzła chłonnego za pomocą 19F/1H MRI i 19F MRS.

Monitorowanie migracji komórek dendrytycznych za pomocą rezonansu magnetycznego 19F / 1H

Szczegóły protokołu są dostępne dla in vitro znakowania ludzkich embrionalnych komórek macierzystych za pomocą nanocząsteczek generujących drugą harmoniczną. Przedstawiono również metodyki badania hESC za pomocą mikroskopii wielofotonowej i ich różnicowania w klastry sercowe.

Nanocząstki harmoniczne w badaniach regeneracyjnych

Kombinatoryczne oznaczanie 5 fluorescencyjnych białek hematopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych pozwala na śledzenie klonów in vivo za pomocą mikroskopii konfokalnej i dwufotonowej, dostarczając wglądu w architekturę hematopoetyczną szpiku kostnego podczas regeneracji. Metoda ta umożliwia nieinwazyjne mapowanie losów kodowanych spektralnie komórek pochodzących z HSPC w nienaruszonych tkankach przez długi czas po przeszczepie.<br...

In vivo (in vivo) Klonalne śledzenie hematopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych oznaczonych pięcioma białkami fluorescencyjnymi przy użyciu mikroskopii konfokalnej i wielofotonowej

Ukierunkowane dostarczanie komórek jest przydatne w różnych zastosowaniach biomedycznych.  Celem tego protokołu jest wykorzystanie superparamagnetycznych nanocząstek tlenku żelaza (SPION) do znakowania komórek, a tym samym umożliwienie podejścia do magnetycznego celowania w komórki w celu uzyskania wysokiego stopnia kontroli nad dostarczaniem i lokalizacją komórek.

Znakowanie i celowanie w komórki za pomocą superparamagnetycznych nanocząstek tlenku żelaza

Prezentowany tutaj jest protokół dostarczania i śledzenia nieinwazyjnych mezenchymalnych komórek macierzystych (MSC) w mysim modelu urazowego uszkodzenia mózgu. Superparamagnetyczne nanocząstki tlenku żelaza są wykorzystywane jako sonda rezonansu magnetycznego (MRI) do znakowania MSC i nieinwazyjnego śledzenia in vivo po podaniu donosowym za pomocą rezonansu magnetycznego w czasie rzeczywistym.

Śledzenie superparamagnetycznych mezenchymalnych komórek macierzystych znakowanych tlenkiem żelaza za pomocą rezonansu magnetycznego po dososowym podaniu w mysim modelu urazowego uszkodzenia mózgu

Poznaj metodę znakowania ludzkich komórek macierzystych mezenchymalnych i embrionalnych nanocząstkami tlenku żelaza do nieinwazyjnego śledzenia in vivo za pomocą obrazowania MR.

Znakowanie hESC i hMSC nanocząsteczkami tlenku żelaza w celu nieinwazyjnego śledzenia in vivo za pomocą obrazowania MR

Przeglądaj więcej filmów