Name: Kwantyfikacja violaceiny w Chromobacterium violaceum i jej hamowanie przez związki bioaktywne (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-08-08T14:10:00.000+00:00
Duration: 7 min 13 s
Description: Poznaj metodę kwantyfikacji violaceiny w Chromobacterium violaceum do badania hamowania quorum sensing przez związki bioaktywne. Technika ta umożliwia identyfikację nowych inhibitorów komunikacji bakteryjnej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Chcielibyśmy podziękować Krajowej Radzie ds. Rozwoju Naukowego (CNPQ) poprzez granty #403661/2023-4 i #444794/2024-7 oraz stypendium #306685/2022-1, a także Fundacji Badawczej Sao Paulo (FAPESP) za granty #2024/05158-6 i 2023/17090-4 oraz wsparcie finansowe dla Centrum Badań nad Żywnością (FoRC) #2013/07914-8.

1. Przygotowanie kultury (rysunek 2)
<ol>
	<li>Hodować w probówce 5 ml kultury C. violaceum ATCC 12472 w bulionie Luria Bertani (LB: trypton 10 g/L, ekstrakt drożdżowy 5 g/L, 5 g/L NaCl) w temperaturze 30 °C w inkubatorze wytrząsającym (220 obr./min) przez 24 godziny.</li>
	<li>Dostosuj kulturę do OD595 wynoszącego 0,1 cala bulionu LB, co odpowiada w przybliżeniu 1 x 108 CFU/ml.</li>
</ol>
2. Przygotowanie związku
<ol>
	<li>Na płaskiej 96-dołkowej płytce dodać bulion LB i związek bioaktywny zgodnie z obliczeniami rozcieńczenia szeregowego, postępując zgodnie z poniższym opisem. W zależności od ich rozpuszczalności, związki bioaktywne są zwykle rozcieńczane w czystym roztworze DMSO lub DMSO: woda (1:1). UWAGA: W metodologiach oceniających QSI kluczowe znaczenie ma zapewnienie, że stosowane stężenia są poniżej minimalnego stężenia hamującego (sub-MIC), co oznacza, że nie wpływają one na wzrost bakterii. Dlatego zaleca się wykonanie testów krzywej wzrostu w różnych stężeniach w celu potwierdzenia, że związek specyficznie hamuje komunikację między komórkami, a nie żywotność drobnoustrojów. Na rysunku uzupełniającym 1 przedstawiono testy krzywej wzrostu badanych związków bioaktywnych stosowanych w tym protokole.</li>
	<li>Aby obliczyć stężenie związku bioaktywnego w studzience, biorąc pod uwagę roztwór podstawowy farnezolu i linalolu o stężeniu 20 mg/ml i stężeniu docelowym 200 μg/ml w studzience, a także resweratrol o stężeniu 2,5 mg/ml w roztworze podstawowym i 25 μg/ml w studzience, należy wykonać obliczenia w następujący sposób: C1V1 = C2V2 20 000 μg/ml x V1 = 200 μg/ml x 200 μl V1 = 40 000/20 000 μL V1 = 2 μL gdzie C1 = stężenie roztworu podstawowego (20 mg/ml, co odpowiada 20 000 μg/ml); V1 = objętość roztworu podstawowego, który ma zostać dodany; C2 = pożądane stężenie końcowe (200 μg/ml); V2 = końcowa objętość w studzience (200 μl).</li>
</ol>
3. Rozcieńczanie seryjne20 i przygotowanie płytki (rysunek 3)
UWAGA: Rozcieńczanie seryjne służy do szybkiej oceny zakresu stężeń badanego związku. W tym procesie związek jest sukcesywnie rozcieńczany w stałym stosunku, w tym przypadku 1:2. Każde rozcieńczenie zmniejsza stężenie związku o połowę w porównaniu z poprzednim stężeniem, co skutkuje zakresem stężeń malejących20.
<ol>
	<li>W pierwszej kolumnie seryjnego rozcieńczania dodać 196 μl bulionu LB (w naszym przykładzie kolumny 3, 5 i 7). Do kolejnych studzienek seryjnego rozcieńczania dodać 100 μl bulionu LB (w naszym przypadku kolumny 4, 6 i 8).</li>
	<li>Następnie dodać 2x ilość związku bioaktywnego obliczoną w poprzednim kroku (2.2), aby przeprowadzić seryjne rozcieńczanie. W wyniku obliczeń uzyskano 2 μl każdego badanego związku, aby osiągnąć końcowe stężenie w pierwszym dołku, a więc dodać 4 μl związku (kolumny 3, 5 i 7).</li>
	<li>Przenieś połowę całkowitej objętości studzienki (100 μl) do następnej kolumny (w naszym przypadku kolumn 4, 6 i 8) i tak dalej, aż do ostatniego pożądanego stężenia, jeśli wykonujesz rozcieńczanie szeregowe. Pamiętaj, aby przed przeniesieniem dokładnie wymieszać zawartość. UWAGA: W tym eksperymentalnym zestawie użyliśmy tylko dwóch stężeń dla uproszczenia, a wszystkie związki mieszczą się tylko na jednej płytce.</li>
	<li>Przeprowadzić doświadczenie w co najmniej trzech porcjach na stężenie każdego związku. Zalecane są również trzy kontrpróby biologiczne. Zmień końcówkę i powtarzaj procedurę aż do ostatniego pożądanego stężenia. W ostatniej kolumnie (w naszym przypadku 4, 6 i 8) weź z niej 100 μl i wyrzuć.</li>
	<li>Dodaj 80 μl bulionu LB do wszystkich studzienek, w sumie 180 μl (rzędy od B do D). Następnie dodać 20 μl kultury C. violaceum standaryzowanej w kroku 1.2, zapewniając końcową objętość 200 μl na studzienkę (rzędy B do D). Pamiętaj, aby wymieniać końcówki pipet za każdym razem podczas wymiany studzienek, aby uniknąć przenoszenia wyższych stężeń między studzienkami lub zanieczyszczenia.</li>
	<li>Jeśli związek jest rozpuszczony w jakimkolwiek rozpuszczalniku, należy przygotować kontrolę z tym rozpuszczalnikiem. Użyliśmy DMSO. W takim przypadku należy przygotować próbę rozpuszczalnikową, która będzie kontrolą niepoddawaną działaniu substancji - UC (bez związku bioaktywnego; kolumna 9). Dodać 2 μl DMSO na studzienkę kontrolną. Daje to maksymalne stężenie 1% DMSO w teście. UWAGA: DMSO w stężeniu 1% nie wpływa na wzrost bakterii21,22.</li>
	<li>Przygotuj półfabrykat lub kontrolę koloru, jeśli używasz związków pigmentowanych, bez bakterii. Po dodaniu 80 μl bulionu LB do wszystkich studzienek, co daje w sumie 180 μl (rzędy od B do D, jak opisano poprzednio), dodaj 20 μl bulionu LB do odpowiednich studzienek ślepych, w sumie 200 μl (rzędy E do G). Dzieje się tak, ponieważ istnieje pewne zabarwienie tła od fioletu krystalicznego, które należy odjąć od odczytów OD, jak zostanie opisane w kroku 5 tego protokołu.</li>
	<li>Jeśli którakolwiek kolumna pozostaje pusta, napełnij ją 200 μl bulionu LB lub sterylnej wody destylowanej (kolumny 1, 2, 10, 11 i 12). Ten krok jest ważny, aby zapobiec nadmiernemu wysuszeniu podłoża w inkubatorze.</li>
</ol>
4. Inkubacja i ekstrakcja violaceiny
<ol>
	<li>Przykryj płytkę pokrywką lub folią uszczelniającą (zgodnie z tabelą materiałów), aby zapobiec parowaniu, w zależności od zastosowanego spektrofotometru.</li>
	<li>Inkubować płytkę w temperaturze 30 °C z mieszaniem przy 130 obr./min przez 24 godziny. Następnie wyjąć płytkę z inkubatora, umieścić ją w inkubatorze suszącym w temperaturze 60 °C, zdjąć pokrywkę i pozostawić płytkę do całkowitego wyschnięcia (około 8 godzin).</li>
	<li>Po wyschnięciu płytki wyjmij ją z inkubatora i dodaj 200 μl czystego DMSO do każdej studzienki, a następnie przykryj. Umieścić płytkę w inkubatorze w temperaturze 25°C, wytrząsając z prędkością 130 obr./min przez 30 minut, aby rozpuścić pigment violaceiny.</li>
	<li>Po tym czasie wyjąć płytkę z inkubatora i przenieść 100 μl na inną mikropłytkę, unikając kontaktu między końcówką a ściankami studzienki.</li>
</ol>
5. Kwantyfikacja produkcji violaceiny
<ol>
	<li>Określić ilościowo wielkość produkcji violaceiny, mierząc absorbancję przy długości fali 595 nm za pomocą odpowiedniego spektrofotometru płytkowego (tabela materiałów). Hamowanie pigmentu violaceiny jest proporcjonalne do niższych odczytów absorbancji.</li>
	<li>Określić ilościowo produkcję violaceiny, stosując kontrolę ujemną (kontrola niepoddana działaniu substancji) jako odniesienie dla 100% produkcji violaceiny (Tabela 1). Po pierwsze, należy odjąć wartość absorbancji ślepej próby od każdej powtórzonej próby, aby uzyskać absorbancję odpowiadającą wyłącznie pigmentowi violaceiny (z wyłączeniem interferencji spowodowanej bulionem lub barwnikiem złożonym). Następnie oblicz procentową produkcję violaceiny dla każdego zabiegu, korzystając z następującego równania. % produkcja violaceiny = (OD związku bioaktywnego / OD kontroli niepoddanej działaniu środka) x 100</li>
	<li>Obliczyć analizy statystyczne w trzech powtórzeniach. Wyniki można przesłać do ANOVA, a następnie wykonać test Tukeya za pomocą oprogramowania GraphPad Prism 8.0. Wartość p <0,05 uznano za istotną statystycznie.</li>
</ol>

<ol><li>Mukherjee, S., Bassler, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+quorum+sensing+in+complex+and+dynamically+changing+environments%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Bacterial quorum sensing in complex and dynamically changing environments.</a> Nat Rev Microbiol. 17 (6), 371(2019).</li>
<li>Lima, E. M. F., Winans, S. C., Pinto, U. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quorum+sensing+interference+by+phenolic+compounds+-+A+matter+of+bacterial+misunderstanding%5BTitle%5D)+AND+%22Heliyon%22%5BJournal%5D)">Quorum sensing interference by phenolic compounds - A matter of bacterial misunderstanding.</a> Heliyon. 9 (7), (2023).</li>
<li>Papenfort, K., Bassler, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quorum+sensing+signal-response+systems+in+Gram-negative+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Quorum sensing signal-response systems in Gram-negative bacteria.</a> Nat Rev Microbiol. 14 (9), 576-588 (2016).</li>
<li>Grandclément, C., Tannières, M., Moréra, S., Dessaux, Y., Faure, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quorum+quenching%3A+role+in+nature+and+applied+developments%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Quorum quenching: role in nature and applied developments.</a> FEMS Microbiol Rev. 40 (1), 86-116 (2016).</li>
<li>Lima, E. M. F., de Almeida, F. A., Sircili, M. P., Bueris, V., Pinto, U. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((N-acetylcysteine+%28NAC%29+attenuates+quorum+sensing+regulated+phenotypes+in+Pseudomonas+aeruginosa+PAO1%5BTitle%5D)+AND+%22Heliyon%22%5BJournal%5D)">N-acetylcysteine (NAC) attenuates quorum sensing regulated phenotypes in Pseudomonas aeruginosa PAO1.</a> Heliyon. 9 (3), (2023).</li>
<li>Allen, R. C., Popat, R., Diggle, S. P., Brown, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+virulence%3A+can+we+make+evolution-proof+drugs%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Targeting virulence: can we make evolution-proof drugs.</a> Nat Rev Microbiol. 12 (4), 300-308 (2014).</li>
<li>Kalia, V. C., Patel, S. K. S., Kang, Y. C., Lee, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quorum+sensing+inhibitors+as+antipathogens%3A+biotechnological+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Adv%22%5BJournal%5D)">Quorum sensing inhibitors as antipathogens: biotechnological applications.</a> Biotechnol Adv. 37 (1), 68-90 (2019).</li>
<li>Santos, C. A., Lima, E. M. F., Franco, B. D. G. deM., Pinto, U. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploring+phenolic+compounds+as+quorum+sensing+inhibitors+in+foodborne+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Exploring phenolic compounds as quorum sensing inhibitors in foodborne bacteria.</a> Front Microbiol. 12, 735931(2021).</li>
<li>Ahmed, S. A. K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Natural+quorum+sensing+inhibitors+effectively+downregulate+gene+expression+of+Pseudomonas+aeruginosa+virulence+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Microbiol+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Natural quorum sensing inhibitors effectively downregulate gene expression of Pseudomonas aeruginosa virulence factors.</a> Appl Microbiol Biotechnol. 103 (8), 3521-3535 (2019).</li>
<li>Yang, Q., Defoirdt, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Weak+selection+for+resistance+to+quorum+sensing+inhibition+during+multiple+host+infection+cycles%5BTitle%5D)+AND+%22ISME+J%22%5BJournal%5D)">Weak selection for resistance to quorum sensing inhibition during multiple host infection cycles.</a> ISME J. 18 (1), 251(2024).</li>
<li>Defoirdt, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+antivirulence+activity%2C+A+new+concept+for+reliable+screening+of+virulence+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Specific antivirulence activity, A new concept for reliable screening of virulence inhibitors.</a> Trends Biotechnol. 34 (7), (2016).</li>
<li>Defoirdt, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quorum-sensing+systems+as+targets+for+antivirulence+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Quorum-sensing systems as targets for antivirulence therapy.</a> Trends Microbiol. 26 (4), 313-328 (2018).</li>
<li>Mahendrarajan, V., Easwaran, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quorum+quenching+effects+of+linoleic+and+stearic+acids+on+outer+membrane+vesicle-mediated+virulence+in+Chromobacterium+violaceum%5BTitle%5D)+AND+%22Biofouling%22%5BJournal%5D)">Quorum quenching effects of linoleic and stearic acids on outer membrane vesicle-mediated virulence in Chromobacterium violaceum.</a> Biofouling. , 1-11 (2024).</li>
<li>Durán, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+Chromobacterium+violaceum+and+properties+of+violacein-Its+main+secondary+metabolite%3A+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Adv%22%5BJournal%5D)">Advances in Chromobacterium violaceum and properties of violacein-Its main secondary metabolite: A review.</a> Biotechnol Adv. 34 (5), 1030-1045 (2016).</li>
<li>Nazir, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+phenolic+compounds+in+two+novel+lines+of+Pisum+sativum+L.+along+with+their+in+vitro+antioxidant+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Env+Sci+Pollut+Res+Int%22%5BJournal%5D)">Characterization of phenolic compounds in two novel lines of Pisum sativum L. along with their in vitro antioxidant potential.</a> Env Sci Pollut Res Int. 27 (7), 7639(2020).</li>
<li>Majdura, J., Jankiewicz, U., Gałązka, A., Orzechowski, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+quorum+sensing+molecules+in+bacterial-plant+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Metabolites%22%5BJournal%5D)">The role of quorum sensing molecules in bacterial-plant interactions.</a> Metabolites. 13 (1), (2023).</li>
<li>Çevikbaş, H., Ulusoy, S., Kaya Kinaytürk,, N, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploring+rose+absolute+and+phenylethyl+alcohol+as+novel+quorum+sensing+inhibitors+in+Pseudomonas+aeruginosa+and+Chromobacterium+violaceum%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Exploring rose absolute and phenylethyl alcohol as novel quorum sensing inhibitors in Pseudomonas aeruginosa and Chromobacterium violaceum.</a> Sci Rep. 14 (1), 15666(2024).</li>
<li>Choi, S. Y., Lim, S., Yoon, K. H., Lee, J. I., Mitchell, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biotechnological+activities+and+applications+of+bacterial+pigments+violacein+and+prodigiosin%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Eng%22%5BJournal%5D)">Biotechnological activities and applications of bacterial pigments violacein and prodigiosin.</a> J Biol Eng. 15 (1), (2021).</li>
<li>Moradi, F., Hadi, N., Bazargani, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+quorum-sensing+inhibitory+effects+of+extracts+of+three+traditional+medicine+plants+with+known+antibacterial+properties%5BTitle%5D)+AND+%22New+Microb+New+Infect%22%5BJournal%5D)">Evaluation of quorum-sensing inhibitory effects of extracts of three traditional medicine plants with known antibacterial properties.</a> New Microb New Infect. 38 (100769), 100769(2020).</li>
<li>Wiegand, I., Hilpert, K., Hancock, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agar+and+broth+dilution+methods+to+determine+the+minimal+inhibitory+concentration+%28MIC%29+of+antimicrobial+substances%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Agar and broth dilution methods to determine the minimal inhibitory concentration (MIC) of antimicrobial substances.</a> Nat Protoc. 3 (2), 163-175 (2008).</li>
<li>Scardino, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cinnamaldehyde+effectively+disrupts+Desulfovibrio+vulgaris+biofilms%3A+potential+implication+to+mitigate+microbiologically+influenced+corrosion%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Env+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Cinnamaldehyde effectively disrupts Desulfovibrio vulgaris biofilms: potential implication to mitigate microbiologically influenced corrosion.</a> Appl Env Microbiol. 91 (5), (2025).</li>
<li>Summer, K., Browne, J., Hollanders, M., Benkendorff, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Out+of+control%3A+The+need+for+standardised+solvent+approaches+and+data+reporting+in+antibiofilm+assays+incorporating+dimethyl-sulfoxide+%28DMSO%29%5BTitle%5D)+AND+%22Biofilm%22%5BJournal%5D)">Out of control: The need for standardised solvent approaches and data reporting in antibiofilm assays incorporating dimethyl-sulfoxide (DMSO).</a> Biofilm. 4, 100081(2022).</li>
<li>Ravichandran, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Virtual+screening+and+biomolecular+interactions+of+CviR-based+quorum+sensing+inhibitors+against+Chromobacterium+violaceum%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Infect+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Virtual screening and biomolecular interactions of CviR-based quorum sensing inhibitors against Chromobacterium violaceum.</a> Front Cell Infect Microbiol. 8, (2018).</li>
<li>Lima, E. M. F., de Almeida, F. A., Pinto, U. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploring+the+antivirulence+potential+of+phenolic+compounds+to+inhibit+quorum+sensing+in+Pseudomonas+aeruginosa%5BTitle%5D)+AND+%22World+J+Microbiol+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Exploring the antivirulence potential of phenolic compounds to inhibit quorum sensing in Pseudomonas aeruginosa.</a> World J Microbiol Biotechnol. 41 (2), (2025).</li>
<li>Blosser, R. S., Gray, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extraction+of+violacein+from+Chromobacterium+violaceum+provides+a+new+quantitative+bioassay+for+N-acyl+homoserine+lactone+autoinducers%5BTitle%5D)+AND+%22J+Microbiol+Methods%22%5BJournal%5D)">Extraction of violacein from Chromobacterium violaceum provides a new quantitative bioassay for N-acyl homoserine lactone autoinducers.</a> J Microbiol Methods. 40 (1), 47-55 (2000).</li>
<li>Zhu, H., He, C. C., Chu, Q. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+quorum+sensing+in+Chromobacterium+violaceum+by+pigments+extracted+from+Auricularia+auricular%5BTitle%5D)+AND+%22Lett+Appl+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Inhibition of quorum sensing in Chromobacterium violaceum by pigments extracted from Auricularia auricular.</a> Lett Appl Microbiol. 52 (3), 269-274 (2011).</li>
<li>Durán, N., Antonio, R. V., Haun, M., Pilli, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biosynthesis+of+a+trypanocide+by+Chromobacterium+violaceum%5BTitle%5D)+AND+%22World+J+Microbiol+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Biosynthesis of a trypanocide by Chromobacterium violaceum.</a> World J Microbiol Biotechnol. 10 (6), 686(1994).</li>
<li>Rettori, D., Production Durán, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((extraction+and+purification+of+violacein%3A+an+antibiotic+pigment+produced+by+Chromobacterium+violaceum%5BTitle%5D)+AND+%22World+J+Microbiol+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">extraction and purification of violacein: an antibiotic pigment produced by Chromobacterium violaceum.</a> World J Microbiol Biotechnol. 14 (5), 685(1998).</li>
<li>Cheng, K. -C., Hsiao, H. -C., Hou, Y. -C., Hsieh, C. -W., Hsu, H. -Y., Chen, H. -Y., Lin, S. -P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improvement+in+violacein+production+by+utilizing+formic+acid+to+induce+quorum+sensing+in+Chromobacterium+violaceum%5BTitle%5D)+AND+%22Antiox%22%5BJournal%5D)">Improvement in violacein production by utilizing formic acid to induce quorum sensing in Chromobacterium violaceum.</a> Antiox. 11 (5), 849(2022).</li>
<li>Defoirdt, T., Brackman, G., Coenye, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quorum+sensing+inhibitors%3A+how+strong+is+the+evidence%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Quorum sensing inhibitors: how strong is the evidence.</a> Trends Microbiol. 21 (12), 619-624 (2013).</li>
<li>Alyousef, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myrtus+communis+and+its+bioactive+phytoconstituent%2C+linalool%2C+interferes+with+Quorum+sensing+regulated+virulence+functions+and+biofilm+of+uropathogenic+bacteria%3A+In+vitro+and+in+silico+insights%5BTitle%5D)+AND+%22J+King+Saud+Univ+Sci%22%5BJournal%5D)">Myrtus communis and its bioactive phytoconstituent, linalool, interferes with Quorum sensing regulated virulence functions and biofilm of uropathogenic bacteria: In vitro and in silico insights.</a> J King Saud Univ Sci. 33 (7), 101588(2021).</li>
<li>Kanekar, S., Devasya, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth-phase+specific+regulation+of+cviI%2FR+based+quorum+sensing+associated+virulence+factors+in+Chromobacterium+violaceum+by+linalool%2C+a+monoterpenoid%5BTitle%5D)+AND+%22World+J+Microbiol+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Growth-phase specific regulation of cviI/R based quorum sensing associated virulence factors in Chromobacterium violaceum by linalool, a monoterpenoid.</a> World J Microbiol Biotechnol. 38 (2), (2022).</li>
<li>Dias, J. P., Domingues, F. C., Ferreira, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Linalool+reduces+virulence+and+tolerance+to+adverse+conditions+of+listeria+monocytogenes%5BTitle%5D)+AND+%22Antibiotics%22%5BJournal%5D)">Linalool reduces virulence and tolerance to adverse conditions of listeria monocytogenes.</a> Antibiotics. 13 (6), 474(2024).</li>
<li>Rodrigues, C. F., Černáková, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Farnesol+and+tyrosol%3A+Secondary+metabolites+with+a+crucial+quorum-sensing+role+in+Candida+biofilm+development%5BTitle%5D)+AND+%22Genes%22%5BJournal%5D)">Farnesol and tyrosol: Secondary metabolites with a crucial quorum-sensing role in Candida biofilm development.</a> Genes. 11 (4), (2020).</li>
<li>Hacioglu, M., Yilmaz, F. N., Yetke, H. I., Haciosmanoglu-Aldogan, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synergistic+effects+of+quorum-sensing+molecules+and+antimicrobials+against+Candida+albicans+and+Pseudomonas+aeruginosa+biofilms%3A+in+vitro+and+in+vivo+studies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Antimicrob+Chemother%22%5BJournal%5D)">Synergistic effects of quorum-sensing molecules and antimicrobials against Candida albicans and Pseudomonas aeruginosa biofilms: in vitro and in vivo studies.</a> J Antimicrob Chemother. 79 (11), 2828(2024).</li>
<li>Bhattacharyya, S., Agrawal, A., Knabe, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sol-gel+silica+controlled+release+thin+films+for+the+inhibition+of+methicillin+resistant+Staphylococcus+aureus%5BTitle%5D)+AND+%22Biomater%22%5BJournal%5D)">Sol-gel silica controlled release thin films for the inhibition of methicillin resistant Staphylococcus aureus.</a> Biomater. 35, 509-517 (2014).</li>
<li>Qu, Y., Zou, Y., Wang, G., Zhang, Y., Yu, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disruption+of+communication%3A+Recent+advances+in+antibiofilm+materials+with+anti-quorum+sensing+properties%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Appl+Mater+Interfaces%22%5BJournal%5D)">Disruption of communication: Recent advances in antibiofilm materials with anti-quorum sensing properties.</a> ACS Appl Mater Interfaces. 16 (11), 13353-13383 (2024).</li>
<li>Li, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+Rhapontigenin+as+a+Novel+Quorum-Sensing+Inhibitor+on+Exoenzymes+and+Biofilm+Formation+of+Pectobacterium+carotovorum+subsp.+carotovorum+and+Its+Application+in+Vegetables%5BTitle%5D)+AND+%22Molecules%22%5BJournal%5D)">Effects of Rhapontigenin as a Novel Quorum-Sensing Inhibitor on Exoenzymes and Biofilm Formation of Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum and Its Application in Vegetables.</a> Molecules. 27 (24), (2022).</li>
<li>Mattio, L. M., Catinella, G., Pinto, A., Dallavalle, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Natural+and+nature-inspired+stilbenoids+as+antiviral+agents%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Med+Chem%22%5BJournal%5D)">Natural and nature-inspired stilbenoids as antiviral agents.</a> Eur J Med Chem. 202 (112541), 112541(2020).</li>
<li>Duarte, A., Alves, A. C., Ferreira, S., Silva, F., Domingues, F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resveratrol+inclusion+complexes%3A+Antibacterial+and+anti-biofilm+activity+against+Campylobacter+spp.+and+Arcobacter+butzleri%5BTitle%5D)+AND+%22Food+Res+Int%22%5BJournal%5D)">Resveratrol inclusion complexes: Antibacterial and anti-biofilm activity against Campylobacter spp. and Arcobacter butzleri.</a> Food Res Int. 77, 244-250 (2015).</li>
<li>Martinelli, D., Grossmann, G., Séquin, U., Brandl, H., Bachofen, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+natural+and+chemically+synthesized+furanones+on+quorum+sensing+in+Chromobacterium+violaceum%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Effects of natural and chemically synthesized furanones on quorum sensing in Chromobacterium violaceum.</a> BMC Microbiol. 4 (1), (2004).</li>
<li>Tan, L. Y., Yin, W. F., Piper Chan, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((nigrum%2C+Piper+betle+and+Gnetum+gnemon-natural+food+sources+with+anti-quorum+sensing+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Sensors%22%5BJournal%5D)">nigrum, Piper betle and Gnetum gnemon-natural food sources with anti-quorum sensing properties.</a> Sensors. 13 (3), 3975-3985 (2013).</li>
<li>Tan, L. Y., Yin, W. F., Chan, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Silencing+quorum+sensing+through+extracts+of+Melicope+lunu-ankenda%5BTitle%5D)+AND+%22Sensors%22%5BJournal%5D)">Silencing quorum sensing through extracts of Melicope lunu-ankenda.</a> Sensors. 12 (4), 4339-4351 (2012).</li>
<li>Oliveira, B. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antioxidant%2C+antimicrobial+and+anti-quorum+sensing+activities+of+Rubus+rosaefolius+phenolic+extract%5BTitle%5D)+AND+%22Ind+Crops+Prod%22%5BJournal%5D)">Antioxidant, antimicrobial and anti-quorum sensing activities of Rubus rosaefolius phenolic extract.</a> Ind Crops Prod. 84, 59-66 (2016).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Pierwsza metoda ekstrakcji i charakterystyki violaceiny z C. violaceum pojawiła się w latach 90. XX wieku, koncentrując się na identyfikacji odpowiednich źródeł węgla do syntezy pigmentu. W tym procesie violaceina - wraz z komórkami i pożywką hodowlaną - została wysuszona, ponownie zawieszona w etanolu, a następnie oddzielona przez ekstrakcję supernatantem. Wiolaceina, teraz rozpuszczona w etanolu, została następnie ponownie wysuszona, dając czystą, suchą formę pigmentu27. W 1998 r. proto...

Bakterie mogą komunikować się za pośrednictwem systemu znanego jako QS, który umożliwia skoordynowaną modulację ich zachowania w odpowiedzi na zmiany gęstości komórek. Proces ten obejmuje produkcję, wydzielanie i wykrywanie małych zewnątrzkomórkowych cząsteczek sygnałowych, zwanych również autoinduktorami, które umożliwiają komunikację zarówno między różnymi gatunkami, jak i w obrębie tego samego gatunku 1,2.
Komunikacja ta jest zdolna do regulowania genów i funkcji, takich jak między innymi tworzenie i dyspersja biofilmu, ruchliwość i adhezja, proliferacja komórek, synteza egzoenzymów i sideroforów, zarodnikowanie, odporność na kwasy, horyzontalny transfer genów, oporność na antybiotyki, bioluminescencja, produkcja egzopolisacharydówmiędzy innymi 3,4,5. Biorąc pod uwagę znaczenie fenotypów regulowanych przez QS, istnieje duże zainteresowanie opracowaniem systemów zdolnych do zakłócania tej komunikacji komórkowej. Hamowanie sygnalizacji QS jest również nazywane wygaszaniem kworum (QQ)6. QQ może występować na kilka sposobów, w tym jako inhibitory syntezy autoinduktorów, enzymatyczna inaktywacja tych sygnałów oraz cząsteczki o antagonistycznym wpływie na te cząsteczki 4,7.
Rosnące zagrożenie opornością na antybiotyki skłoniło do badań nad alternatywnymi terapiami, w tym inhibitorami quorum sensing (QSI), które zakłócają komunikację bakterii bez bezpośredniego zabijania patogenów. Związki te mogą wykazywać działanie synergistyczne w połączeniu z antybiotykami, zwiększając podatność bakterii i umożliwiając zmniejszenie dawek antybiotyków, co jest kluczową strategią spowolnienia rozwoju oporności. Na przykład resweratrol i kanamycyna razem opóźniają wzrost Aeromonas hydrophila 8, podczas gdy N-acetylocysteina synergizuje z tobramycyną, zakłócając biofilmy Pseudomonas aeruginosa 5.
Przy nadużywaniu antybiotyków i stagnacji w opracowywaniu leków, podejścia przeciwwirusowe, takie jak hamowanie QS, oferują zmianę paradygmatu9. Zamiast skupiać się na żywotności, skupiają się na czynnikach wirulencji, dzięki czemu bakterie stają się mniej szkodliwe i bardziej podatne na odporność gospodarza lub antybiotyki5. Strategia ta narzuca słabszą presję selekcyjną w porównaniu z tradycyjnymi antybiotykami, minimalizując oporność i zachowując korzystną mikrobiotę10,11. Pomimo obiecujących wyników laboratoryjnych, walidacja w warunkach rzeczywistych w ramach badań klinicznych pozostaje niedostatecznie zbadana12. Hamowanie QS stanowi obiecujące uzupełnienie antybiotyków, ale jego zastosowanie w praktyce wymaga dalszych dowodów na skuteczność i bezpieczeństwo w złożonych środowiskach biologicznych.
C. violaceum to beta proteobacterium, które tworzy fioletowe kolonie o gładkiej i błyszczącej powierzchni. Są fakultatywnymi pałeczkami beztlenowymi i nie tworzą zarodników13. Mechanizm QS u C. violaceum obejmuje pętlę dodatniego sprzężenia zwrotnego opartą na układzie genów analogicznym do modelu luksów Aliivibrio fisheri, który zawiera białka CviI (homologiczne do LuxI) i CviR (homologiczne do LuxR; Rysunek 1). Violaceina wykazuje działanie biobójcze przeciwko różnym organizmom, w tym grzybom, bakteriom, nicieniom i wirusom, szczególnie w fazie stacjonarnego wzrostu drobnoustrojów, kiedy gęstość zaludnienia jest bardzo wysoka, a składniki odżywcze są prawie wyczerpane. W związku z tym produkcję violaceiny można uznać za konkurencyjną strategię mającą na celu przedłużenie przetrwania kolonii drobnoustrojów14.
Rośliny wytwarzają związki pochodzące z metabolizmu wtórnego, które odgrywają kluczową rolę w zwiększaniu ich zdolności do adaptacji do niekorzystnego środowiska. Te metabolity, takie jak alkaloidy, fenole, flawonoidy, chinony, garbniki, terpeny i lektyny, są powszechnie uznawane za mechanizmy obronne przeciwko roślinożercom imikroorganizmom. Potencjał związków pochodzenia roślinnego jako QSI przyciągnął szczególną uwagę ze względu na dynamiczne interakcje między roślinami a mikroorganizmami. Badania nad interakcjami roślina-patogen w ryzosferze wykazały, że rośliny mogą reagować na autoinduktory bakteryjne poprzez wydzielanie związków bioaktywnych zdolnych do działania jako inhibitory patogenów16.
W niniejszej pracy opisano praktyczną metodę mającą na celu ilościowe określenie produkcji violaceiny przez C. violaceum, koncentrując się na jej hamowaniu przez związki bioaktywne. Metoda ta służy jako wstępne narzędzie przesiewowe do wyboru związków o potencjalnej aktywności QSI. Zapewnia szybkie i praktyczne podejście do przyszłego rozwoju terapeutycznego przeciwko bakteriom chorobotwórczym Gram-ujemnym. Ten ustandaryzowany protokół będzie przydatny, ponieważ zawiera szczegółowy opis, który nie został przeprowadzony w poprzednich badaniach i ułatwi porównanie między różnymi badaniami w przyszłości 17,18,19.

<table><tbody><tr><td>DMSO&nbsp;</td><td>Synth</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Farnezol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Zobacz materiał F203</td><td>95%</td></tr><tr><td>Linalool</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Zobacz materiał L2602</td><td>97%</td></tr><tr><td>Luria-Bertani Medium</td><td>Firma Difco</td><td>244620</td><td></td></tr><tr><td>Optyczna folia samoprzylepna</td><td>Rybak termiczny</td><td>4311971</td><td>Wzmacniacz MicroAmp</td></tr><tr><td>Resweratrol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Czynnik R5010</td><td>&ge; 99% (HPLC)</td></tr><tr><td>Czytnik wielomodowy Synergy HTX</td><td>Biotek</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Płytki do hodowli tkankowych 96 dołków</td><td>Kasvi powiedział:</td><td>Zobacz materiał K12-096</td><td></td></tr></tbody></table>

kwantyfikacja violaceiny w chromobacterium violaceum i jej hamowanie przez związki bioaktywne

Quantification of Violacein in Chromobacterium violaceum and Its Inhibition by Bioactive Compounds

Bakterie komunikują się za pośrednictwem systemu znanego jako quorum sensing (QS), który pozwala im koordynować swoje zachowanie w odpowiedzi na zmiany gęstości komórek. Proces ten obejmuje produkcję, wydzielanie i wykrywanie małych zewnątrzkomórkowych cząsteczek sygnałowych, zwykle nazywanych autoinduktorami (AI). QS reguluje szeroki zakres genów i funkcji, w tym między innymi tworzenie i rozpraszanie biofilmu, ruchliwość roju, produkcję czynników wirulencji, oporność na antybiotyki i bioluminescencję. Hamowanie QS stało się obiecującą strategią przeciwwirusową przeciwko bakteriom opornym na antybiotyki, ponieważ wywiera niższe ciśnienie selekcyjne w porównaniu z tradycyjnymi antybiotykami. W bakterii Chromobacterium violaceum ATCC 12472 białka QS CviI/CviR, które są homologiczne do białek QS typu LuxI/LuxR Aliivibrio fisheri, kontrolują wiele genów, w tym te odpowiedzialne za produkcję fioletowego barwnika violaceiny. C. violaceum jest szeroko stosowany jako szczep biosensoryczny w badaniach nad hamowaniem QS, w szczególności w hamowaniu produkcji violaceiny. Wiele związków ma potencjał do hamowania QS poprzez wiązanie się z białkami QS, homologami LuxI lub LuxR, zakłócając obwody QS. Protokół ten opisuje metodę ilościowego oznaczania violaceiny wytwarzanej przez C. violaceum ATCC 12472 i jej hamowania przez związki bioaktywne w stężeniach, które nie wpływają na wzrost bakterii. Opisany tutaj test wykazuje znaczne zmniejszenie produkcji violaceiny przez badane związki. Badanie to podkreśla potencjał wykorzystania tego protokołu do badań przesiewowych obiecujących kandydatów w badaniach nad hamowaniem QS.

Do uzyskania przedstawionych tutaj wyników wykorzystano trzy związki bioaktywne wcześniej badane przez naszą grupę badawczą8: resweratrol, farnezol i linalool. Każdy związek przetestowano pod kątem zdolności do hamowania produkcji violaceiny w szczepie C. violaceum ATCC 12472, którego fenotyp jest regulowany przez system QS poprzez operon vioABCDE23.
Wyniki potwierdzają skuteczność naszego protokołu w ilościowym oznaczaniu produ...

Celem niniejszego protokołu jest ilościowe określenie produkcji violaceiny przez Chromobacterium violaceum ATCC 12472 jako wskaźnika zastępczego do oceny hamowania przez quorum sensing przez związki bioaktywne.

Kwantyfikacja violaceiny w Chromobacterium violaceum i jej hamowanie przez związki bioaktywne

Bacteria communicate through a system known as quorum sensing (QS), which allows them to coordinate their behavior in response to changes in cell density. ...

Nasze badania mają na celu zidentyfikowanie związków, które hamują quorum sensing, który reguluje kluczowe fenotypy. Protokół ten bada cząsteczki, które zmniejszają produkcję violaceiny bez wpływu na wzrost bakterii, co sugeruje interferencję quorum sensing. Ostatnie badania zidentyfikowały nowe związki bioaktywne, które hamują quorum sensing bez wpływu na wzrost bakterii, wzmacniając ich potencjał jako środków przeciwzjadliwych przeciwko bakteriom opornym na antybiotyki.Do głównych wyzwań należy specyficzność hamowania quorum sensing, ponieważ związki mogą wpływać na wzrost lub cechy. W tym protokole, zwanym poważaniem i rozpuszczalnością, wpływ równoważący kwantyfikację a wymaga ostrożnego obchodzenia się. Ustaliliśmy protokół stosowany w związkach bioaktywnych w stężeniach subhamujących, które nie wpływają na wzrost bakterii.Jest to kluczowa przesłanka do rozpoczęcia sygnalizacji quorum sensing innej niż badania nad środkami przeciwdrobnoustrojowymi. Skupimy się na identyfikacji nowych inhibitorów stanu kworum i wyjaśnieniu mechanizmów hamowania komunikacji, zwłaszcza u bakterii istotnych dla żywności i zdrowia. Na początek wyhoduj pięciomililitrową kulturę chromobacterium violaceum ATCC 12472 w bulionie Luria Bertani lub LB.Inkubuj kulturę w temperaturze 30 stopni Celsjusza w inkubatorze z wytrząsaniem ustawionym na 220 obrotów na minutę przez 24 godziny. Zmierz gęstość optyczną nocnej kultury i dostosuj ją do około 1 razy 10 do mocy ośmiu jednostek tworzących kolonie na mililitr. Za pomocą bulionu LB.W przypadku przygotowania związku należy zważyć związek bioaktywny i rozcieńczyć go w czystym DMSO lub mieszaninie jeden do jednego DMSO i wody, w zależności od rozpuszczalności. Weź płaską płytkę 96-dołkową i dodaj bulion LB wraz ze związkiem bioaktywnym zgodnie ze schematem rozcieńczania szeregowego. Aby obliczyć wymaganą objętość roztworu podstawowego dla pożądanego stężenia w każdym dołku, zastosuj wzór.W pierwszej kolumnie każdego zestawu do rozcieńczania zbóż. Dodaj 196 mikrolitrów bulionu Luria Bertani do kolumn trzeciej, piątej i siódmej. Następnie w kolejnych kolumnach używanych do rozcieńczania dodaj 100 mikrolitrów bulionu Luria Bertani do kolumn czwartej, szóstej i ósmej.Aby rozpocząć rozcieńczanie szeregowe, dodaj cztery mikrolitry związku bioaktywnego do pierwszego dołka z każdego zestawu, co odpowiada kolumnom trzecim, piątym i siódmym. Po wymieszaniu przenieś 100 mikrolitrów z każdej studzienki do sąsiedniej kolumny. Aby kontynuować seryjne rozcieńczanie, docieraj do kolumn czwartej, szóstej i ósmej.Powtórz całą procedurę w trzech egzemplarzach dla każdego stężenia każdego związku, używając świeżych końcówek, aby uniknąć zanieczyszczenia krzyżowego. Dodaj 80 mikrolitrów bulionu Luria Bertani do rzędów od B do D we wszystkich studzienkach. Daje to łącznie 180 mikrolitrów na studzienkę.Następnie do każdej z tych studzienek dodać 20 mikrolitrów standaryzowanej kultury chromobacterium violaceum z poprzedniego preparatu, osiągając końcową objętość 200 mikrolitrów. Na podstawie kompatybilności spektrofotometru. Przykryj mikropłytkę pokrywką lub folią uszczelniającą, aby zapobiec parowaniu.Inkubować szczelnie zamkniętą płytkę w temperaturze 30 stopni Celsjusza z mieszaniem przy 130 obrotach na minutę przez 24 godziny. Po inkubacji przenieść płytkę do inkubatora suszącego ustawionego na 60 stopni Celsjusza. Zdejmij pokrywkę i pozostaw do całkowitego wyschnięcia na około osiem godzin.Po wyschnięciu wyjmij płytkę z inkubatora i dodaj 200 mikrolitrów czystego DMSO do każdej studzienki. Przykryj płytkę i inkubuj ją w temperaturze 25 stopni Celsjusza, wstrząsając z prędkością 130 obrotów na minutę przez 30 minut, aby rozpuścić pigment violaceiny. Po inkubacji ostrożnie przenieść 100 mikrolitrów rozpuszczonego roztworu violaceiny na nową mikropłytkę.Unikanie kontaktu końcówki pipety ze ściankami studzienki. Zmierz absorbancję violaceiny przy 595 nanometrach w spektrofotometrze z mikropłytkami z założoną pokrywką, aby uniknąć zanieczyszczenia. Wstrząsaj przez pięć sekund przed każdym odczytem i wykonuj odczyt pod pokrywką, aby uniknąć zanieczyszczenia.Aby obliczyć produkcję violaceiny, najpierw odejmij absorbancję ślepej próby od każdej próbki, aby wykluczyć interferencję tła, a następnie oblicz procent violaceiny, używając niepoddanej działaniu kontrolnej jako odniesienia z równaniem. Trzy związki bioaktywne, resweratrol, farnezol i linalol, zostały przetestowane pod kątem ich zdolności do hamowania produkcji violaceiny w chromobacterium violaceum ATCC 12472. Farnezol znacznie zmniejszył produkcję violaceiny do 9% przy 200 mikrogramach na mililitr i do 19% przy 100 mikrogramach na mililitr, w porównaniu do 100% w nieleczonej kontroli.Leczenie linalolem zarówno w dawce 200, jak i 100 mikrogramów na mililitr spowodowało produkcję violaceiny na poziomie 32%, wykazując 68% zahamowanie w stosunku do kontroli. Resweratrol w dawce 25 mikrogramów na mililitr zmniejszył produkcję violaceiny do 15%, podczas gdy przy 12 mikrogramach na mililitr osiągnął 30% w porównaniu do 100% w nieleczonej kontroli. Obrazy z mikropłytek wizualnie potwierdziły zmniejszoną pigmentację violaceiny we wszystkich zabiegach w porównaniu z nieleczoną kontrolą.

quantification-violacein-chromobacterium-violaceum-its-inhibition

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Źródło: Tay, S. B. i in. Antywirusowe zaburzenie biofilmów patogennych przy użyciu inżynierowanych laktonan gaśniczych kworum.  J. Vis. Exp. (2016)Film demonstruje metodę ilościowego określenia biomasy biofilmu w patogennej bakterii, porównując nieleczone grupy kontrolne z próbkami objętymi enzymem gaszczącym kworum. Enzym zakłóca sygnalizację bakteryjną podczas wczesnej inkubacji, zmniejszając przyczepność komórek. Po płukaniu i dalszej inkubacji studnie kontrolne tworzą gęste biofilmy,...

Ilościowe tłumienie biofilmu indukowanego enzymami u bakterii patogennych

Źródło: Bucher, T. i in. Metodologie badania biofilmów B. subtilis jako modelu charakteryzowania inhibitorów biofilmu małocząsteczkowego. J. Vis. Exp. (2016)Ten film demonstruje test tworzenia pelikuli z użyciem Bacillus subtilis do oceny inhibitorów małych cząsteczek zakłócających syntezę matrycy i rozwój biofilmu, dostarczając modelu do przesiewania związków selektywnie hamujących wzrost związany z powierzchnią, nie wpływając na swobodnie unoszące się komórki.

Ocena wpływu inhibitorów na tworzenie pelikuli u Bacillus subtilis

Większość infekcji bakteryjnych wytwarza biofilm. Ze względu na środowisko, w którym działają, bakterie związane z biofilmem są często fenotypowo odporne na leki. Nowe cząsteczki przeciwbakteryjne, które zabijają bakterie w biofilmach, mają zatem wysoki priorytet. Opracowujemy test do szybkiego badania przesiewowego pod kątem związków przeciwdrobnoustrojowych, które są skuteczne w zwalczaniu biofilmów.

Celowanie w Staphylococcus aureus związany z biofilmem za pomocą testu wrażliwości na leki opartego na resazurynie

Opisujemy zmodyfikowaną metodę opartą na agarze, zaprojektowaną do ilościowego określenia przeciwgrzybiczego działania produktów pochodzenia roślinnego. Za pomocą tego protokołu można ocenić zarówno lotny, jak i nielotny wkład w aktywność przeciwgrzybiczą. Ponadto skuteczność przeciwko grzybom można zmierzyć na kluczowych etapach rozwoju w jednym zestawie eksperymentalnym.

Pomiar lotnej i nielotnej aktywności przeciwgrzybiczej produktów kontroli biologicznej

Ten manuskrypt opisuje metodę wykorzystania mikroskopii fluorescencyjnej pojedynczej komórki do wizualizacji i ilościowego określenia konkurencji bakterii w kokulturze.

Kwantyfikacja konkurencji międzybakteryjnej za pomocą obrazowania fluorescencyjnego pojedynczych komórek

Ten protokół opisuje przygotowanie inokulum, kwantyfikację biofilmu na płytkach mikromiareczkowych za pomocą barwnika fioletu krystalicznego, liczenie żywotnych w biofilmach oraz wizualizację biofilmów Acinetobacter.

Kwantyfikacja, ocena żywotności i strategie wizualizacji biofilmów Acinetobacter

Związki tiofenesulfonamidu są silnymi i specyficznymi inhibitorami regulatorów Vibrio quorum sensing LuxR/HapR, które blokują ich aktywność in vivo, zapobiegając w ten sposób transkrypcji genów zjadliwości, ruchliwości i biofilmów. Protokół ten szczegółowo opisuje, w jaki sposób związki te są syntetyzowane, modelowane in silico i oznaczane in vivo pod kątem aktywności przeciwko LuxR / HapR.

Synteza i test inhibitorów Vibrio Quorum Sensing

Ten protokół opisuje prostą i ekonomiczną metodę oceny skuteczności potencjalnych fotosensybilizatorów w antybakteryjnej inaktywacji fotodynamicznej (aPDI), przy użyciu formatu 96-dołkowej płytki w połączeniu ze źródłem światła na panelu LED. Takie podejście umożliwia jednoczesne testowanie wielu warunków eksperymentalnych, w tym różnych stężeń, związków i szczepów bakterii.

Badania przesiewowe in vitro oparte na diodach LED do oceny fotoaktywowanych cząsteczek w inaktywacji fotodynamicznej bakterii

Protokół ten zapewnia systematyczne ramy do oceny, w jaki sposób fitochemikalia mogą wzmacniać bakteriobójcze efekty tradycyjnych biocydów, wykorzystując modelowanie aktywności bakteriobójczej oraz testy interakcji kombinatorycznych, które mają na celu identyfikację synergicznych mieszanin poprawiających kontrolę mikroorganizmów i ograniczających ogólne zużycie biocydów.

In vitro Ocena wzmacniających efektów cząsteczek pochodzenia roślinnego na konwencjonalne biocydy

Oporność na antybiotyki wśród szczepów Escherichia coli adhezywno-inwazyjnych stanowi wyzwanie dla oceny inwazji bakteryjnej przy użyciu tradycyjnego testu ochrony gentamycyną. Opisano ulepszoną metodę oceny ilościowej inwazji bakteryjnej poprzez liczenie jednostek tworzących kolonie i oceny jakościowej poprzez wizualizację zakażonych komórek za pomocą konfokalnej mikroskopii immunofluorescencyjnej.

Test ochrony amikacyny do ilościowego i wizualnego określenia Escherichia coli inwazji komórkowej

Poznaj metodę kwantyfikacji violaceiny w Chromobacterium violaceum do badania hamowania quorum sensing przez związki bioaktywne. Technika ta umożliwia identyfikację nowych inhibitorów komunikacji bakteryjnej.

Kwantyfikacja violaceiny w Chromobacterium violaceum i jej hamowanie przez związki bioaktywne

Przeglądaj więcej filmów