Kwantyfikacja violaceiny w Chromobacterium violaceum i jej hamowanie przez związki bioaktywne

Nasze badania mają na celu zidentyfikowanie związków, które hamują quorum sensing, który reguluje kluczowe fenotypy. Protokół ten bada cząsteczki, które zmniejszają produkcję violaceiny bez wpływu na wzrost bakterii, co sugeruje interferencję quorum sensing. Ostatnie badania zidentyfikowały nowe związki bioaktywne, które hamują quorum sensing bez wpływu na wzrost bakterii, wzmacniając ich potencjał jako środków przeciwzjadliwych przeciwko bakteriom opornym na antybiotyki.

Do głównych wyzwań należy specyficzność hamowania quorum sensing, ponieważ związki mogą wpływać na wzrost lub cechy. W tym protokole, zwanym poważaniem i rozpuszczalnością, wpływ równoważący kwantyfikację a wymaga ostrożnego obchodzenia się. Ustaliliśmy protokół stosowany w związkach bioaktywnych w stężeniach subhamujących, które nie wpływają na wzrost bakterii.

Jest to kluczowa przesłanka do rozpoczęcia sygnalizacji quorum sensing innej niż badania nad środkami przeciwdrobnoustrojowymi. Skupimy się na identyfikacji nowych inhibitorów stanu kworum i wyjaśnieniu mechanizmów hamowania komunikacji, zwłaszcza u bakterii istotnych dla żywności i zdrowia. Na początek wyhoduj pięciomililitrową kulturę chromobacterium violaceum ATCC 12472 w bulionie Luria Bertani lub LB.

Inkubuj kulturę w temperaturze 30 stopni Celsjusza w inkubatorze z wytrząsaniem ustawionym na 220 obrotów na minutę przez 24 godziny. Zmierz gęstość optyczną nocnej kultury i dostosuj ją do około 1 razy 10 do mocy ośmiu jednostek tworzących kolonie na mililitr. Za pomocą bulionu LB.

W przypadku przygotowania związku należy zważyć związek bioaktywny i rozcieńczyć go w czystym DMSO lub mieszaninie jeden do jednego DMSO i wody, w zależności od rozpuszczalności. Weź płaską płytkę 96-dołkową i dodaj bulion LB wraz ze związkiem bioaktywnym zgodnie ze schematem rozcieńczania szeregowego. Aby obliczyć wymaganą objętość roztworu podstawowego dla pożądanego stężenia w każdym dołku, zastosuj wzór.

W pierwszej kolumnie każdego zestawu do rozcieńczania zbóż. Dodaj 196 mikrolitrów bulionu Luria Bertani do kolumn trzeciej, piątej i siódmej. Następnie w kolejnych kolumnach używanych do rozcieńczania dodaj 100 mikrolitrów bulionu Luria Bertani do kolumn czwartej, szóstej i ósmej.

Aby rozpocząć rozcieńczanie szeregowe, dodaj cztery mikrolitry związku bioaktywnego do pierwszego dołka z każdego zestawu, co odpowiada kolumnom trzecim, piątym i siódmym. Po wymieszaniu przenieś 100 mikrolitrów z każdej studzienki do sąsiedniej kolumny. Aby kontynuować seryjne rozcieńczanie, docieraj do kolumn czwartej, szóstej i ósmej.

Powtórz całą procedurę w trzech egzemplarzach dla każdego stężenia każdego związku, używając świeżych końcówek, aby uniknąć zanieczyszczenia krzyżowego. Dodaj 80 mikrolitrów bulionu Luria Bertani do rzędów od B do D we wszystkich studzienkach. Daje to łącznie 180 mikrolitrów na studzienkę.

Następnie do każdej z tych studzienek dodać 20 mikrolitrów standaryzowanej kultury chromobacterium violaceum z poprzedniego preparatu, osiągając końcową objętość 200 mikrolitrów. Na podstawie kompatybilności spektrofotometru. Przykryj mikropłytkę pokrywką lub folią uszczelniającą, aby zapobiec parowaniu.

Inkubować szczelnie zamkniętą płytkę w temperaturze 30 stopni Celsjusza z mieszaniem przy 130 obrotach na minutę przez 24 godziny. Po inkubacji przenieść płytkę do inkubatora suszącego ustawionego na 60 stopni Celsjusza. Zdejmij pokrywkę i pozostaw do całkowitego wyschnięcia na około osiem godzin.

Po wyschnięciu wyjmij płytkę z inkubatora i dodaj 200 mikrolitrów czystego DMSO do każdej studzienki. Przykryj płytkę i inkubuj ją w temperaturze 25 stopni Celsjusza, wstrząsając z prędkością 130 obrotów na minutę przez 30 minut, aby rozpuścić pigment violaceiny. Po inkubacji ostrożnie przenieść 100 mikrolitrów rozpuszczonego roztworu violaceiny na nową mikropłytkę.

Unikanie kontaktu końcówki pipety ze ściankami studzienki. Zmierz absorbancję violaceiny przy 595 nanometrach w spektrofotometrze z mikropłytkami z założoną pokrywką, aby uniknąć zanieczyszczenia. Wstrząsaj przez pięć sekund przed każdym odczytem i wykonuj odczyt pod pokrywką, aby uniknąć zanieczyszczenia.

Aby obliczyć produkcję violaceiny, najpierw odejmij absorbancję ślepej próby od każdej próbki, aby wykluczyć interferencję tła, a następnie oblicz procent violaceiny, używając niepoddanej działaniu kontrolnej jako odniesienia z równaniem. Trzy związki bioaktywne, resweratrol, farnezol i linalol, zostały przetestowane pod kątem ich zdolności do hamowania produkcji violaceiny w chromobacterium violaceum ATCC 12472. Farnezol znacznie zmniejszył produkcję violaceiny do 9% przy 200 mikrogramach na mililitr i do 19% przy 100 mikrogramach na mililitr, w porównaniu do 100% w nieleczonej kontroli.

Leczenie linalolem zarówno w dawce 200, jak i 100 mikrogramów na mililitr spowodowało produkcję violaceiny na poziomie 32%, wykazując 68% zahamowanie w stosunku do kontroli. Resweratrol w dawce 25 mikrogramów na mililitr zmniejszył produkcję violaceiny do 15%, podczas gdy przy 12 mikrogramach na mililitr osiągnął 30% w porównaniu do 100% w nieleczonej kontroli. Obrazy z mikropłytek wizualnie potwierdziły zmniejszoną pigmentację violaceiny we wszystkich zabiegach w porównaniu z nieleczoną kontrolą.