Wielomodalny mikroskop Ramana z szeroką polową transformacją Fouriera
30 grudnia 2025
Mikroskop szerokokątowy z transformatem Fouriera, oparty na kompaktowym i ultrastabilnym interferometrze dwułamannym, umożliwia równoległe pozyskiwanie widm dla wszystkich pikseli detektora 2D. Podejście w dziedzinie czasowej umożliwia rozplątanie sygnałów fotoluminescencyjnych i Ramana oraz umożliwia szybkie mapowanie Ramana (~5 ms/piksel) z rozdzielczością przestrzenną ~1 μm i spektralną 23 cm-1 .
Opracowaliśmy multimodalny mikroskop hiperspektralny, który pozwala uzyskać widmo Ramana lub fotoluminescencji z każdego piksela obrazu, co skraca czas pomiaru. Konwencjonalne podejście skalowania rastrowego opiera się na spektrometrach dyspersyjnych. Zaawansowane techniki wzmacniają sygnał Ramana, wykorzystując światło w rezonansie lub za pomocą zsynchronizowanych krótkich impulsów laserowych, które wywołują drgania molekularne.
Przekrój rozpraszania dolnego Ramana stawia przed sobą dwa główne wyzwania. Po pierwsze, słaby sygnał, który wymaga długiego czasu akwizycji. Po drugie, sygnał Ramana może zostać przytłoczony przez silne tło fotoluminescencji.
Spektroskopia transformata Fouriera umożliwia równoległe pozyskiwanie widma na wszystkich pikselach dla szybszego pomiaru oraz regulowane próbkowanie do dostępu do konkretnych informacji widmowych, takich jak izolowanie słabych szczytów Ramana od silnego tła luminescencji. Podejście transformaty Fouriera umożliwia inteligentne próbkowanie i analizę danych, które wykorzystują informacje w śladach czasowych. Naszym celem jest dostosowanie strategii niedopróbkowania, aby jeszcze bardziej skrócić czas pozyskiwania.
Na początek użyj skrobaka, aby nałożyć 20 miligramów każdego proszku pigmentu na precyzyjną wagę, uzyskując proporcję wagową jeden do jednego. Wymieszaj proszki z moździerzem, aby usunąć grudki. Wylej powstałą mieszankę na szkiełko mikroskopowe.
Następnie użyj końcówki skrobaka, aby delikatnie docisnąć warstwę, aby uzyskać niemal jednolitą grubość warstwy. Nałóż lakier na krawędzie okładki mikroskopu. Nałóż go na mieszankę tak, że lakier jest skierowany w dół i wywieraj wystarczający nacisk, by go uszczelnić.
Następnie ustaw długość fali wzbudzenia i skoncentruj laser wzbudzający na wejściu dużego rdzenia światłowodu wielomodowego. Umieść próbkę testową na stole mikroskopu i włącz kamerę, aby zobaczyć plamkę oświetloną laserem. Przymocuj środkową część włókna do drgającej membrany cewki, która usunie plamki.
Mechanicznie mieszaj światłowód, mocno je wyginając tak, aby połączyć wszystkie jego mody przestrzenne. Włóż wąskopasmowy filtr o średnicy 532 nanometrów o szerokości pasma 2,0 nanometra, aby oczyścić linię lasera i odrzucić wszelkie niepożądane pasma spektralne pompy. Użyj lustra dichroicznego, aby odbijać światło laserowe w kierunku próbki i przepuszczać promieniowanie rozproszone do końca w kierunku czerwieni odbite wstecznie zebrane przez obiektyw.
Włóż filtr długprzepustowy o średnicy 532 nanometrów, aby odrzucić pozostałe światło oświetleniowe. Zmierz moc na samolocie próbkowym za pomocą miernika mocy. Reguluj wiązkę pompy, aby uzyskać intensywność w próbce, która nie prowadzi do uszkodzenia.
Teraz połóż próbkę na scenie mikroskopu i wyreguluj ostrość. Włącz sterownik silnika, który wykonuje translację klina, i naciśnij opcję akwizycji. Następnie ustaw parametry akwizycji, takie jak ramy czasowe i sprzętowe binowanie, aby zoptymalizować natężenie sygnału.
Teraz ustaw długość kroku, pozycję wyjściową i liczbę kroków. Dodaj nazwę katalogu oraz nazwę pliku. Przesuń punkt krzyża do pozycji docelowej i kliknij na miarę, aby rozpocząć pobieranie obrazu monochromatycznego dla każdej pozycji klina.
Po zakończeniu pomiaru wyłącz laser przed analizą danych. Następnie wygeneruj hiperkostkę spektralną z zebranego zbioru danych, ładując plik korekcji pozycji silnika specyficzny dla silnika krokowego oraz plik kalibracji częstotliwości odpowiadający interferometrowi. Ustaw długość fali widma obliczane przez Fouriera, transformując interferogramy wszystkich pikseli.
Zastosuj funkcję apodyzacji, która oferuje dobry kompromis między poszerzaniem spektralnym a redukcją artefaktów, na przykład okno Happ-Genzel. Następnie generuj hiperkostkę spektralną i zapisuj ją w wartościach zespolonych. Uruchom oprogramowanie analityczne i otwórz hiperkostkę spektralną w wartościach zespolonych.
Wygeneruj fałszywy obraz RGB i uzyskaj średnie widmo w wybranych obszarach, aby przeanalizować hiperkostkę spektralną. Dla pomiaru Ramana w tym samym polu widzenia dodaj filtr pasmowy na ścieżce detekcji. Ustaw ramy czasowe i sprzętowe binowanie, potem ustaw długość, pozycję domową i liczbę kroków.
Wybierz nazwę pliku i katalog do zapisu przed naciśnięciem Measure. W polu widzenia wyraźnie wyróżnia się trzy pigmenty na podstawie ich sygnatur spektralnych Ramana, z charakterystycznymi szczytami dla rutylu o długości 454 i 616 centymetrów odwrotnie, anatasze o 396, 514 i 641 centymetrach odwrotnie oraz żółtej kadmu o 301 i 605 centymetrach odwrotnych. Na mapie fotoluminescencji zamiast tego jedynym pigmentem widocznie rozproszonym w polu widzenia jest żółty kadm, z silną emisją dominującą na całym obrazie.
Rzeczywiście, słaba emisja defektów z rutylu i anazazy nie może być spektralnie odróżniona od żółtego proszku.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy artykuł omawia opracowanie multimodalnego mikroskopu hiperspektralnego, który umożliwia szybką akwizycję widm Ramana i fotoluminescencji dla każdego piksela obrazu. Innowacyjna konstrukcja znacząco skraca czas pomiaru w porównaniu z metodami konwencjonalnymi.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- neuronauka
- obrazowanie optyczne
- spektroskopia
Wstęp
- Konwencjonalne metody skalowania rastrowego opierają się na spektrometrach dyspersyjnych.
- Sygnały Ramana mogą być słabe i wymagać długiego czasu akwizycji.
- Silne tło fotoluminescencyjne może maskować sygnały Ramana.
- Zaawansowane techniki mogą wzmacniać sygnały Ramana z wykorzystaniem rezonansu lub zsynchronizowanych impulsów laserowych.
Cel badania
- Opracowanie mikroskopu umożliwiającego równoległe pozyskiwanie widm.
- Umożliwienie szybkiego mapowania Ramanowskiego z wysoką rozdzielczością przestrzenną i spektralną.
- Rozwiązanie problemów związanych ze słabymi sygnałami Ramanowskimi oraz tłem fotoluminescencyjnym.
Zastosowane metody
- Opracowanie szerokokątnego mikroskopu z transformatą Fouriera.
- Wykorzystanie kompaktowego i ultra-stabilnego interferometru dwójłomnego.
- Podejście w dziedzinie czasu w celu rozdzielenia sygnałów fotoluminescencyjnych i ramanowskich.
- Szybka akwizycja widm z prędkością ~5 ms/pixel przy rozdzielczości przestrzennej ~1-µm.
Główne wyniki
- Mikroskop umożliwia równoległe pozyskiwanie widm dla wszystkich pikseli.
- Osiąga rozdzielczość spektralną rzędu ~23-cm-1.
- Znacznie skraca czas pomiaru w porównaniu z metodami tradycyjnymi.
- Skutecznie oddziela fotoluminescencję od sygnałów Ramanowskich.
Wnioski
- Opracowany mikroskop stanowi potężne narzędzie do szybkiego mapowania Ramanowskiego.
- Rozwiązuje on kluczowe problemy związane z pozyskiwaniem widm Ramanowskich w próbkach biologicznych.
- Technologia ta znajduje potencjalne zastosowania w różnych dziedzinach badawczych.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Szerokokpola mikroskopia ramana z transformacją Fouriera umożliwia szybkie, wysokorozdzielcze mapowanie chemiczne złożonych próbek, rozwiązując problemy związane z wydajnością i zakłóceniami tła w początkowej fazie odkrywania. Możliwość ta wspiera rzetelną walidację celów oraz minimalizowanie ryzyka mechanistycznego poprzez dostarczanie ilościowych, rozdzielonych przestrzennie informacji molekularnych. Przyspieszona akwizycja widm usprawnia podejmowanie decyzji w kluczowych punktach zwrotnych w procesach badawczo-rozwojowych branży biofarmaceutycznej.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Umożliwia wysokoprzepustowe mapowanie składu chemicznego w celu walidacji funkcjonalnych celów.
- Ułatwia ograniczanie ryzyka mechanistycznego poprzez odróżnianie słabych sygnałów Ramana od tła fotoluminescencyjnego.
- Zwiększa pewność prognostyczną w badaniu szlaków poprzez wykorzystanie ilościowych danych spektralnych.
Przesiewanie i rozwój testów
- Przygotowuje zwalidowane zbiory danych hiperspektralnych dla dalszych etapów procesów przesiewowych.
- Zapewnia powtarzalne, ilościowe wyniki dla obszarów o dużej liczbie próbek przy minimalnym czasie przebywania wiązki.
- Umożliwia standaryzację i skalowalność testów poprzez równoległe pozyskiwanie widm.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Zapewnia przestrzennie rozdzielone sygnatury molekularne istotne dla modeli chorób, gdy mają one zastosowanie.
- Utrzymuje ciągłość od etapu odkryć po walidację przedkliniczną poprzez wspieranie rzetelnej charakterystyki chemicznej.
- Zmniejsza ryzyko niepowodzeń na późnych etapach badań dzięki wyjaśnieniu heterogeniczności i składu próbek.
Integracja potoków i przepływów pracy
Ten multimodalny mikroskop Ramanowski integruje się z kontinuum od odkrycia do badań przedklinicznych, umożliwiając szybkie i ilościowe mapowanie chemiczne na wczesnych i pośrednich etapach.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez i wyjaśnianie szlaków sygnałowych za pomocą obrazowania hiperspektralnego.
- Przesiewanie: Dostarcza gotowe do analizy, powtarzalne dane spektralne do oceny związków.
- Analityka: Zapewnia ilościowe widma z rozdzielczością do pojedynczego piksela w celu przeprowadzenia rzetelnego porównania statystycznego.
- Badania translacyjne: Dostosowuje wyniki obrazowania molekularnego do wymagań modeli przedklinicznych, w zależności od zastosowania.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Oferuje skalowalną i adaptowalną platformę do wielokrotnego zastosowania w różnych typach próbek.
Wpływ operacyjny i organizacyjny
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną i redukuje niejednoznaczność mechanistyczną w walidacji celu.
- Wartość operacyjna: Przyspiesza pozyskiwanie danych i standaryzuje przepływy pracy w analizie spektralnej.
- Wartość strategiczna: Poprawia jakość decyzji o kontynuacji lub przerwaniu projektu (go/no-go) oraz efektywność kapitałową dzięki umożliwieniu szybkiej analizy o wysokiej zawartości danych.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację dostosowaną do ryzyka oraz rozwój programów odkrywania leków.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga wiedzy specjalistycznej w zakresie obrazowania hiperspektralnego i spektroskopii Ramana.
- Wymaga dostępu do zaawansowanej aparatury optycznej i infrastruktury analizy danych.
- Wymaga standaryzacji parametrów akwizycji i analizy pomiędzy zespołami.
- Może wymagać adaptacji dla różnych rodzajów próbek lub macierzy biologicznych.
- Wydajność może być ograniczona przez fotoluminescencję próbek lub słabe rozproszenie Ramanowskie w niektórych przypadkach.
