Name: Wielomodalny mikroskop Ramana z szeroką polową transformacją Fouriera (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-12-30T12:40:00.000+00:00
Duration: 6 min 48 s
Description: Poznaj wielomodalny mikroskop Ramana z szeroką polową transformacją Fouriera, który umożliwia szybkie pozyskiwanie widm z każdego piksela obrazu. Ta metoda znacząco skraca czas pomiaru i izoluje sygnały Ramana od fotoluminescencji.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

G.C. wyraża wsparcie ze strony Unii Europejskiej projektu Marie Skłodowska-Curie Actions ENOSIS H2020-MSCA-IF-2020-101029644 oraz programu badawczo-innowacyjnego Unii Europejskiej Horizon Europe (HORIZON) w ramach Marie Skłodowska-Curie Action PIONEER (Umowa Grantowa 101066108). G.V. i G.C. potwierdzają wsparcie w ramach programu NextGenerationEU Unii Europejskiej w ramach IPHOQS Infrastructure [IR0000016, ID D2B8D520, CUP B53C22001750006] "Zintegrowanej Inicjatywy Infrastruktury w Naukach Fotonicznych i Kwantowych".

Odczynniki i sprzęt użyty w tym badaniu są wymienione w Tabeli Materiałów.
1. Przygotowanie próbki
UWAGA: Podczas tego przygotowania noś rękawiczki lateksowe, ponieważ pigment CdS jest toksyczny, zwłaszcza podczas inhalacji.
<ol>
	<li>Użyj skrobaka, aby nałożyć 20 mg każdego proszku pigmentowego na precyzyjną wagę, uzyskując proporcję wagową 1:1:1. UWAGA: Ostrożnie czyść końcówkę skrobaczka przy każdej próbce, aby uniknąć zanieczyszczenia krzyżowego.</li>
	<li>Wymieszaj proszki z moździerzem, aby usunąć grudki.</li>
	<li>Wylej powstałą mieszankę na szkiełko mikroskopowe; Użyj końcówki skrobaka, aby delikatnie docisnąć i uzyskać niemal jednolitą grubość warstwy.</li>
	<li>Nałóż lakier na krawędzie pokrywy mikroskopu. Nałóż go na mieszankę, skierowanym do paznokci skierowanym do dołu, i przyłóż wystarczający nacisk, by ją uszczelnić. Pozwól wyschnąć przez kilka sekund, żeby polera stwardniała.</li>
</ol>
2. Ustawienie mikroskopu
UWAGA: Noś okulary ochronne, gdy laser jest włączony, ponieważ maksymalna moc osiągalna na płaszczyźnie próbki wynosi 300 mW.
UWAGA: Wydajność lasera pompowego pozostaje niezmieniona przez wahania temperatury, o ile jest on używany w zakresie temperatur określonych w karcie katalogowej (np. 10-40 °C dla lasera podanego w Tabeli Materiałów).
<ol>
	<li>Ustaw interferometr TWINS wzdłuż ścieżki detekcji mikroskopu. UWAGA: Jak szczegółowo opisali Candeo i in.17, moduł interferometryczny musi być umieszczony pomiędzy soczewką lampy a detektorem, co zapewnia odpowiednią odległość między nimi. W przypadku mikroskopu używanego w tej pracy jest to gwarantowane tylko po usunięciu modułu okularu.</li>
	<li>Aby dostosować schemat oświetlenia Koehlera do wzbudzenia laserowego, usuń wbudowaną lampę wzbudzającą mikroskopu i użyj obiektywu mikroskopowego do zbierania światła na wyjściu z dużego rdzenia światłowodu wielokodowego. UWAGA: Powiększenie obiektywne określa rozmiar wzoru oświetlenia, gdy czubek włókna jest sprzężony z płaszczyzną próbki. Jednym z możliwych wyborów jest cel 10x/0,25-0,30.</li>
	<li>Wybierz długość fali wzbudzenia i skoncentruj laser wzbudzający na wejściu światłowodu wielordzeniowego o dużym rdzeniu. Włącz kamerę i uruchom oprogramowanie do wizualizacji.<ol>
		<li>Przymocuj środkową część włókna do drgającej membrany cewki głosowej, co usunie plamkę. Mechanicznie mieszaj światłowód, mocno je wyginając tak, aby połączyć wszystkie jego mody przestrzenne. Włącz laser.</li>
		<li>Przygotuj próbkę do wyrównania, np. fluorescencyjne czerwone paski markerowe na okładce mikroskopu.</li>
		<li>Dostosuj pozycję końcówki światłowodu względem systemu optycznego oświetlenia, przesuwając światłowód za pomocą precyzyjnego stopnia translacji, aby uzyskać plamę o jednolitej intensywności i dobrze określonych krawędziach na płaszczyźnie próbki. UWAGA: Do wszystkich zgłaszanych pomiarów używany jest laser o częstotliwości 532 nm. Przy włóknie o rozmiarze rdzenia 400 μm, średnica plamki pokrywa 82% szerokości pola widzenia kamery.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Stosuj zestaw filtrów dla ścieżek wzbudzenia i detekcji, przyjmując następujące kryteria (Rysunek Uzupełniający 2):<ol>
		<li>Użyj filtra wąskopasmowego o średnicy 532 nm (szerokość pasma 2,0 nm) do czyszczenia linii laserowej i odrzucania wszelkich pasm bocznych pompy powstałych w wyniku nieliniowego rozszerzania się w wyniku propagacji w światłowodzie.</li>
		<li>Użyj lustra dichroicznego (DM na Rysunku 1), aby odbijać światło laserowe w kierunku próbki i przepuszczać przesunięte ku czerwieni promieniowanie wsteczne zebrane przez obiektyw.</li>
		<li>Użyj filtra długprzepustowego (LPF na rysunku 1) przy 532 nm, aby odrzucać pozostałe światło oświetleniowe.</li>
		<li>Podczas pomiaru rozpraszania Ramana używaj filtra krótkprzepustowego (SPF na Rysunku 1) przy 600 nm, aby tłumić fluorescencję tła.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zmierz moc na samolocie próbkowym za pomocą miernika mocy. Osłabić wiązkę pompy, aby uzyskać natężenie w próbce, które nie powoduje uszkodzeń (rzędu 2 W/cm2, jak podano w Tabeli 1). Używaj migawki laserowej, ustawiając pozostałe parametry pomiarowe. UWAGA: Ze względu na niewielki przekrój spontanicznego rozpraszania Ramana, potrzebna jest wysoka gęstość mocy, aby poprawić zbieranie sygnału. Jednak należy wziąć pod uwagę próg próbnych obrażeń. W przeciwieństwie do systemów punktowego skanowania, system szerokopolowy oświetla duży obszar, co zmniejsza efektywność rozpraszania energii i wymaga starannego zarządzania energią, aby zapobiec uszkodzeniom próbki.</li>
	<li>Połóż próbkę na stole mikroskopowym i dostosuj ostrość. UWAGA: Aby łatwo znaleźć ognisko, najpierw oświetl próbkę białą lampą w transmisji lub odbiciu. W tym drugim przypadku można użyć żarówki umieszczonej obok mikroskopu. Ostrość próbki zostanie następnie zoptymalizowana za pomocą światła lasera pompowego.</li>
</ol>
3. Parametry pomiarowe
<ol>
	<li>Włącz sterownik silnika, który wykonuje translację klina. Sterować komponentami sprzętowymi (kamerą i silnikiem) jednocześnie w celu wykonania pomiarów hiperspektralnych (przykład interfejsu użytkownika pokazany na Dodatkowym Rysunku 3).</li>
	<li>Ustaw parametry akwizycji kamery, czas ekspozycji oraz sprzętowe binowanie, aby zoptymalizować natężenie sygnału, stosując następujące instrukcje:<ol>
		<li>Ponieważ wysoki stosunek sygnału do szumu (SNR) w sygnale czasowym prowadzi do wysokiego SNR w uzyskanych widmach, należy uznać za długi czas naświetlania, który lepiej wypełnia zakres dynamiczny sensora. UWAGA: Dla słabych sygnałów, podobnie jak przy rozpraszaniu Ramana, należy znaleźć kompromis między poziomem sygnału a całkowitym czasem pomiaru: najdłuższy czas naświetlania może być niemożliwy.</li>
		<li>Wybierz sprzętowe binowanie, aby pobrać ładunek z większej liczby pikseli przed odczytem. UWAGA: Sumowanie ładunku i wykonanie pojedynczego odczytu daje lepszą wydajność szumu niż odczyt kilku pikseli i sumowanie ich sygnału w procesie końcowym. Wybór binningu jest również zależny od akceptowalnego zmniejszenia rozdzielczości przestrzennej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wybierz parametry skanowania, całkowitą długość skanowania oraz krok próbkowania zgodnie z następującymi kryteriami:<ol>
		<li>Aby uzyskać wysoką rozdzielczość spektralną dla szczytów Ramana, ustaw asymetryczną translację długiego klina (-2526 fs→ -36 fs). Z kolei wykonaj symetryczne skanowanie wokół pozycji zerowego opóźnienia (-65 fs → 65 fs), aby uzyskać więcej szerokopasmowych cech widmowych sygnału PL.</li>
		<li>Używając równania 1 dla opóźnienia τ jako funkcji translacji klina x, wybierz krok próbkowania, aby spełnić granicę Nyquista dla interesującej szerokości pasma widmowego. UWAGA: Dla danego minimalnego długości fali widma λmin, należy nałożyć (Równanie 2). 
		<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/68515/68515eq2.jpg" style="margin: auto;" /> gdzie dwułomność Δn zależy od długości fali (zob. równania Sellemeiera).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Otwórz migawkę, aby oświetlić próbkę laserem. Jeśli zaobserwuje się spadek intensywności sygnału, należy poczekać, aż próbka osiągnie stan stacjonarny (zazwyczaj kilka sekund). UWAGA: Aby zrekompensować spadek intensywności sygnału, dostosuj binning i czas ekspozycji, aby utrzymać dobrą SNR.</li>
	<li>Rozpocznij pobieranie obrazu monochromatycznego dla każdej pozycji klina, czyli opóźnienia czasowe między replikami z każdego punktu czujnika 2D. UWAGA: Oprogramowanie do rejestracji powinno zapisywać dwie zmienne: hiperkostkę czasową (zestaw obrazów 2D) oraz wektor pozycji silników rejestrowany przez enkoder podczas skanowania.</li>
	<li>Po zakończeniu pomiaru wyłącz laser i przejdź do analizy danych.</li>
</ol>
4. Przetwarzanie pozyskanej datacube
<ol>
	<li>Wygeneruj hiperkostkę spektralną z pozyskanego zbioru danych, stosując się do następujących instrukcji:<ol>
		<li>Załaduj plik korekcji pozycji silnika konkretnego silnika krokowego (zobacz dyskusję).</li>
		<li>Załaduj plik kalibracji częstotliwości dla konkretnego interferometru, aby powiązać zmierzone częstotliwości przestrzenne (pseudoczęstotliwości) z rzeczywistymi częstotliwościami optycznymi (patrz sekcja Dyskusja).</li>
		<li>Wybierz zakres częstotliwości widm, które zostaną obliczone przez transformację interferogramów wszystkich pikseli przez Fouriera.</li>
		<li>Spośród dostępnych funkcji apodizacyjnych12 do okienkowania zmierzonego interferogramu, wybierz tę, która oferuje dobry kompromis między poszerzaniem widma a redukcją artefaktów w odzyskanych widmach, na przykład okno Happ-Genzel (Hamming).</li>
		<li>Generuj hiperkostkę spektralną przez transformację Fouriera apodizowanych interferogramów dla wszystkich pikseli. Zapisz to w złożonych wartościach. UWAGA: Złożone widmo z FT niesie dodatkowe informacje, które będą przydatne do odszumienia zbioru danych i wyodrębnienia średnich widm zestawu wybranych pikseli.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Po obliczeniu hiperkostki widmowej należy przeprowadzić różne badania, np. uzyskać średnie widmo w wybranych obszarach; generować obraz RGB w fałszywych kolorach; piki spektralne na mapie; odejmij tło.</li>
	<li>Aby zmniejszyć szum spektralny, który może przytłoczyć znaczące piki, zwłaszcza w widmach Ramana, zaimplementuj Dekompozycję Wartości Osobliwych (SVD)18 , stosując następujące kroki:<ol>
		<li>Przekształcić hipersześcian czasowy w macierz A z interferogramami wzdłuż jej rzędów.</li>
		<li>Wykonaj SVD macierzy, uzyskując macierze U, S i V takie, że A = USVT. UWAGA: Kolumny U to rozkłady przestrzenne wektorów własnych V (kolumn), natomiast S to macierz diagonalna o liczbach osobliwych (SV) w kolejności malejącej.</li>
		<li>Przekształc każdą kolumnę U w macierz pikseli i wykonaj jej 2D FT, aby uzyskać częstotliwości przestrzenne.</li>
		<li>Ponieważ wysokie częstotliwości wiążą się z bardzo nagłymi zmianami mapy, traktujemy je jako szum; definiuj kwadratowy obszar centrowany w obliczonej przestrzeni Fouriera, który oddziela niskie (głównie sygnałowe) i wysokie (głównie szumy). UWAGA: Możliwym wyborem dla tego pola jest bok 1/4 względem rozmiaru przestrzeni Fouriera.</li>
		<li>Oblicz przestrzenny stosunek sygnału (SSR) dla każdego SV, dzieląc sumę intensywności pikseli (moduł zespolony) w obrębie granicy przez sumę intensywności poza granicą. Wyznacz SSR jako funkcję numeru SV.</li>
		<li>Zdefiniuj próg dla SSR, czyli liczbę istotnych SV, które należy zachować, aby zmniejszyć wkład szumu w zbiorze danych i uniknąć artefaktów. UWAGA: SSR zazwyczaj wykazuje tendencję malejącą, która wraz ze wzrostem liczby wartości osobliwych stabilizuje się w płaskowyż. Zasadą jest zachowanie wartości osobliwych do momentu, w którym zaczyna się plateau.</li>
		<li>Ustaw wszystkie dolne SV na zero w macierzy diagonalnej S, co daje Sbez szumowania, i oblicz denoizowany hipersześcian temporalny jako amerykańskidenoizowany VT. UWAGA: SVD to faktoryzacja macierza, którą można również zastosować do przekształconej hipersześcianu spektralnego (z wierszami zawierającymi widma zamiast interferogramów).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Powtórz kroki 4.1-4.2 z odemizowaną hiperkostką czasową, aby odzyskać widma.</li>
	<li>Pobierz program z linku w Referencji19 , aby przeprowadzić głębszą analizę zbioru danych za pomocą algorytmu Multivariate Curve Resolution-Alternating Least Squares (MCR-ALS). UWAGA: Programiści przedstawiają szczegółowy opis algorytmu20. Jest to metoda iteracyjny do rozwiązania problemu analizy mieszaninowej: każde widmo wyraża się jako liniowa kombinacja czystych profili spektralnych. Przy reprezentacji macierzowej: B = C RT+E, gdzie B to zbiór danych, C zawiera stężenia dla każdego widma, kolumny R to widma odniesienia składników składowych, a E wyraża błąd.<ol>
		<li>Przekształc hiperkostkę spektralną w macierz Npikseli xN częstotliwości, z łączną liczbą pikseli i N częstotliwością wektora częstotliwości.</li>
		<li>Wybierz liczbę gatunków oczekiwanych w próbce i załaduj ich spektra odniesienia. UWAGA: Widma odniesienia można mierzyć dla każdego pigmentu osobno. W przeciwnym razie program tworzy SVD zbioru danych i używa tylu głównych komponentów, ile wybranych składników do początkowych przypuszczeń.</li>
		<li>Wybierz ograniczenia: uzyskane profile spektralne muszą być nieujemne i jak najbardziej podobne do widm referencyjnych.</li>
		<li>Na wykresie narysuj mapę koncentracji (przekształcone kolumny C) oraz widma (kolumny litery R) dla każdego gatunku.</li>
		<li>Eksportuj te mapy i użyj ich do wygenerowania obrazu w fałszywych kolorach (rysunek 4A), kończąc analizę. UWAGA: Programy użyte do uzyskania przedstawionych tutaj wyników nie są publicznie dostępne, ale można je uzyskać od autorów na życzenie.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Dicker, D. T., Lerner, J. M., El-Deiry, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyperspectral+image+analysis+of+live+cells+in+various+cell+cycle+stages%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">Hyperspectral image analysis of live cells in various cell cycle stages.</a> Cell Cycle. 6 (20), 2563-2570 (2007).</li>
<li>Sellar, R. G., Boreman, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Classification+of+imaging+spectrometers+for+remote+sensing+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Opt+Eng%22%5BJournal%5D)">Classification of imaging spectrometers for remote sensing applications.</a> Opt Eng. 44 (1), 013602-013602 (2005).</li>
<li>McCreery, R. L. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMcCreery%2C+RL+%22Raman+spectroscopy+for+chemical+analysis%22">Raman spectroscopy for chemical analysis</a>. , 1st Edition, John Wiley & Sons. (2000).</li>
<li>Vanna, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vibrational+imaging+for+label-free+cancer+diagnosis+and+classification%5BTitle%5D)+AND+%22La+Rivista+del+Nuovo+Cimento%22%5BJournal%5D)">Vibrational imaging for label-free cancer diagnosis and classification.</a> La Rivista del Nuovo Cimento. 45 (2), 107-187 (2022).</li>
<li>Zhang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spotting+the+differences+in+two-dimensional+materials-the+Raman+scattering+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Soc+Rev%22%5BJournal%5D)">Spotting the differences in two-dimensional materials-the Raman scattering perspective.</a> Chem Soc Rev. 47 (9), 3217-3240 (2018).</li>
<li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multi-point+scanning+confocal+Raman+spectroscopy+for+accurate+identification+of+microorganisms+at+the+single-cell+level%5BTitle%5D)+AND+%22Talanta%22%5BJournal%5D)">Multi-point scanning confocal Raman spectroscopy for accurate identification of microorganisms at the single-cell level.</a> Talanta. 254, 124112(2023).</li>
<li>Qin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Line-scan+Raman+imaging+and+spectroscopy+platform+for+surface+and+subsurface+evaluation+of+food+safety+and+quality%5BTitle%5D)+AND+%22J+Food+Engg%22%5BJournal%5D)">Line-scan Raman imaging and spectroscopy platform for surface and subsurface evaluation of food safety and quality.</a> J Food Engg. 198, 17-27 (2017).</li>
<li>Hagen, N., Kudenov, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Review+of+snapshot+spectral+imaging+technologies%5BTitle%5D)+AND+%22Opt+Engg%22%5BJournal%5D)">Review of snapshot spectral imaging technologies.</a> Opt Engg. 52 (9), 090901-090901 (2013).</li>
<li>Morris, H. R., Hoyt, C. C., Treado, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+spectrometers+for+fluorescence+and+Raman+microscopy%3A+Acousto-optic+and+liquid+crystal+tunable+filters%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Spectr%22%5BJournal%5D)">Imaging spectrometers for fluorescence and Raman microscopy: Acousto-optic and liquid crystal tunable filters.</a> Appl Spectr. 48 (7), 857-866 (1994).</li>
<li>Wiener, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generalized+harmonic+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Mathematica%22%5BJournal%5D)">Generalized harmonic analysis.</a> Acta Mathematica. 55 (1), 117-258 (1930).</li>
<li>Bell, R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBell%2C+R+%22Introductory+Fourier+transform+spectroscopy%22">Introductory Fourier transform spectroscopy</a>. , 1st Edition, Elsevier. (1972).</li>
<li>Griffiths, P. R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGriffiths%2C+PR+%22Fourier+Transform+Infrared+Spectrometry%22">Fourier Transform Infrared Spectrometry</a>. , 2nd Edition, John Wiley & Sons. (2007).</li>
<li>Jullien, A., Pascal, R., Bortolozzo, U., Forget, N., Residori, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+hyperspectral+imaging+with+cascaded+liquid+crystal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Optica%22%5BJournal%5D)">High-resolution hyperspectral imaging with cascaded liquid crystal cells.</a> Optica. 4 (4), 400-405 (2017).</li>
<li>Müller, W., Kielhorn, M., Schmitt, M., Popp, J., Heintzmann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light+sheet+Raman+micro-spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Optica%22%5BJournal%5D)">Light sheet Raman micro-spectroscopy.</a> Optica. 3 (4), 452-457 (2016).</li>
<li>Wadduwage, D. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Near-common-path+interferometer+for+imaging+Fourier-transform+spectroscopy+in+wide-field+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Optica%22%5BJournal%5D)">Near-common-path interferometer for imaging Fourier-transform spectroscopy in wide-field microscopy.</a> Optica. 4 (5), 546-556 (2017).</li>
<li>Brida, D., Manzoni, C., Cerullo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phase-locked+pulses+for+two-dimensional+spectroscopy+by+a+birefringent+delay+line%5BTitle%5D)+AND+%22Opt+Lett%22%5BJournal%5D)">Phase-locked pulses for two-dimensional spectroscopy by a birefringent delay line.</a> Opt Lett. 37, 3027-3029 (2012).</li>
<li>Candeo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+hyperspectral+microscope+based+on+an+ultrastable+common-path+interferometer%5BTitle%5D)+AND+%22APL+Photonics%22%5BJournal%5D)">A hyperspectral microscope based on an ultrastable common-path interferometer.</a> APL Photonics. 4 (12), 120802(2019).</li>
<li>Camp, C. H. Jr, Lee, Y. J., Cicerone, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative%2C+comparable+coherent+anti-Stokes+Raman+scattering+%28CARS%29+spectroscopy%3A+correcting+errors+in+phase+retrieval%5BTitle%5D)+AND+%22J+Raman+Spectr%22%5BJournal%5D)">Quantitative, comparable coherent anti-Stokes Raman scattering (CARS) spectroscopy: correcting errors in phase retrieval.</a> J Raman Spectr. 47 (4), 408-415 (2016).</li>
<li>Multivariate curve resolution homepage. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://mcrals.wordpress.com/download/mcr-als-2-0-toolbox/">https://mcrals.wordpress.com/download/mcr-als-2-0-toolbox/</a> (2021).</li>
<li>de Juan, A., Jaumot, J., Tauler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multivariate+Curve+Resolution+%28MCR%29.+Solving+the+mixture+analysis+problem%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Methods%22%5BJournal%5D)">Multivariate Curve Resolution (MCR). Solving the mixture analysis problem.</a> Anal Methods. 6 (14), 4964-4976 (2014).</li>
<li>Di Benedetto, A., Pozzi, P., Valentini, G., Comelli, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrating+multimodal+Raman+and+photoluminescence+microscopy+with+enhanced+insights+through+multivariate+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Phys%3A+Photonics%22%5BJournal%5D)">Integrating multimodal Raman and photoluminescence microscopy with enhanced insights through multivariate analysis.</a> J Phys: Photonics. 6 (3), 035019(2024).</li>
<li>Rosi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((UV-Vis-NIR+and+micro+Raman+spectroscopies+for+the+non-destructive+identification+of+Cd1-xZnxS+solid+solutions+in+cadmium+yellow+pigments%5BTitle%5D)+AND+%22Microchemical+J%22%5BJournal%5D)">UV-Vis-NIR and micro Raman spectroscopies for the non-destructive identification of Cd1-xZnxS solid solutions in cadmium yellow pigments.</a> Microchemical J. 124, 856-867 (2016).</li>
<li>Ghirardello, M., Kelly, N. M., Valentini, G., Toniolo, L., Comelli, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photoluminescence+excited+at+variable+fluences%3A+A+novel+approach+for+studying+the+emission+from+crystalline+pigments+in+paints%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Methods%22%5BJournal%5D)">Photoluminescence excited at variable fluences: A novel approach for studying the emission from crystalline pigments in paints.</a> Anal Methods. 12 (32), 4007-4014 (2020).</li>
<li>Ardini, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+multimodal+wide-field+Fourier-transform+Raman+microscope%5BTitle%5D)+AND+%22Optica%22%5BJournal%5D)">High-throughput multimodal wide-field Fourier-transform Raman microscope.</a> Optica. 10 (6), 663-670 (2023).</li>
<li>Pickett, H. M., Strauss, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signal-to-noise+ratio+in+Fourier+transform+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Signal-to-noise ratio in Fourier transform spectrometry.</a> Anal Chem. 44 (2), 265-270 (1972).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Wprowadzono szerokokątowy mikroskop multimodalny FT do pozyskiwania spontanicznych obrazów rozpraszania Ramana i luminescencji, który jest stosowany w nauce o materiałach. Zastosowanie do próbek biologicznych wykazują Candeo i in.17, którzy przedstawiają hiperspektralny obraz fluorescencyjny barwionych ludzkich komórek. Głównym wyzwaniem przy pomiarach rozpraszania Ramana w tej dziedzinie jest zapobieganie uszkodzeniom foto wynikającym z nieefektywnego rozpraszania ciepła z szeroko oświetlonego ob...

Obrazowanie spektralne to technika dostarczająca zarówno informacje spektralne, jak i przestrzenne, i była stosowana w różnych dziedzinach, od mikroskopii1 po teledetekcję2. Obrazowanie wielospektralne i hiperspektralne rozróżnia się na podstawie tego, czy dla każdego piksela czujnika 2D zarejestrowano kilka dyskretnych pasm spektralnych, czy jedno widmo ciągłe. Obrazowanie Ramana to szczególna implementacja obrazowania spektralnego.
Mikroskopia rozpraszania Ramana to potężna technika pomiaru częstotliwości drgań νR układu. Tryby drgań są powiązane z wiązaniami chemicznymi, dlatego spektroskopia Ramana3 umożliwia badanie składu chemicznego próbek w biologii4 oraz naukach o materiałach5. W spontanicznej spektroskopii Ramana próbka jest oświetlana monochromatycznym promieniowaniem o częstotliwości ν0, zwanym pompą. Część światła pompy, oddziałując z trybami drgań, może ulegać rozpraszaniu nieelastycznemu, co skutkuje powstawaniem fotonów o częstotliwościach νS (νAS)=ν0-(+)ν R, gdzie νR to częstotliwość drgań molekularnych w próbce. Światło rozproszone o niższej energii (νS) nazywane jest promieniowaniem Stokesa, natomiast promieniowanie o wyższej energii (νAS) to promieniowanie anty-Stokesa. W równowadze termicznej większość cząsteczek zajmuje niższe stany energetyczne, dlatego składowe anty-Stokesa są znacznie słabsze niż składowe Stokesa. Z tego powodu mikroskopia rozpraszająca Ramana zazwyczaj wykrywa fotony Stokesa. Ponieważ cząsteczki i ciała stałe mają wiele trybów drgań, widmo Ramana charakteryzuje się wyraźnymi pasmami, które łącznie tworzą unikalny chemiczny podpis, umożliwiający identyfikację i analizę materiału. Głównym wyzwaniem tego podejścia jest niezwykle niski przekrój poprzeczny spontanicznego rozpraszania Ramana, przy czym tylko jeden z ponad 109-10 12 fotonów podlega temu procesu.
W standardowej konfiguracji mikroskopu rozpraszającego Ramana światło wzbudzające jest ściśle skupione na jednym punkcie próbki. Po odrzuceniu fotonów pompowych rozpraszanych sprężysto (zazwyczaj z filtrami spektralnymi), pozostałe światło jest zbierane i charakteryzowane spektrometrem w dziedzinie częstotliwości (np. siatką dyspersyjną); rozdzielczość spektralna tych urządzeń może sięgać ~0,5-1 cm-1. Pomiar powtarza się dla każdego punktu (x,y) w polu widzenia (FOV) próbki metodą zwaną skanowaniem punktowym lub rastrowym6. Istnieją dwa główne problemy tego podejścia: (1) niski przekrój czynny spontanicznego rozpraszania Ramana zazwyczaj wymaga długich czasów całkowania (0,1-1 s), aby zebrać wystarczającą ilość fotonów na każdy piksel spektrometru, dlatego mapa Ramana rozszerzonej próbki może wymagać długich czasów pomiaru; (2) wzbudzenie przez światło pompy powoduje również fotoluminescencję (PL), która nakłada się na spontaniczny sygnał Ramana i często może go przytłoczyć.
Aby zwiększyć szybkość akwizycji, można przyjąć podejście line scanning7 , w którym pompa skupia się wzdłuż linii FOV (np. na współrzędnej x), a zebrany sygnał (PL lub rozpraszanie Ramana) jest rozpraszany przez spektrometr z czujnikiem 2D, co daje dla danej współrzędnej x zbiór danych 2D, w którym jedna oś odpowiada widmowi, a druga jednej współrzędnej przestrzennej y. Niemniej jednak ta implementacja nadal cierpi na znaczne straty spowodowane przez szczelinę wejściową spektrometru, której wąska szerokość zapewnia lepszą rozdzielczość spektralną, ale także ogranicza ilość zebranego światła.
Konfiguracja szerokopolna może być bardziej odpowiednia do skrócenia czasu pomiaru: tą metodą oświetlany jest duży obszar próbki, a widmo jest rejestrowane dla wszystkich pikseli sensora 2D jednocześnie. W tym przypadku informacje spektralne można zbierać, używając zestawu filtrów pasmowych8 lub regulowanego filtraspektralnego 9 przed kamerą monochromatyczną. Ponadto metoda ta opiera się na podejściu w dziedzinie częstotliwości i obejmuje jedynie określoną liczbę pasm widmowych.
Alternatywną metodą pomiaru widma jest podejście transformaty Fouriera (FT). Jest to technika w dziedzinie czasu oparta na twierdzeniu10 Wiener-Kintchina, które mówi, że gęstość widmowa sygnału jest transformatą Fouriera jego autokorelacji czasowej. W optyce uzyskuje się to w praktyce poprzez generowanie dwóch opóźnionych replik przebiegu za pomocą interferometru. Ich interferencja jest mierzona przez detektor jako funkcja opóźnienia względnego, co daje tzw. interferogram11. Podejście FT jest szeroko stosowane do pomiaru widm w obszarze spektralnym podczerwieni, gdzie nazywa się spektroskopią podczerwieni z transformatem Fouriera (FTIR)12. FTIR jest rutynowo używany do pomiaru spektrum absorpcji przejść drgań w zakresie spektralnym średniej podczerwieni (~2,5−25 μm długości fali).
Podejście FT w dziedzinie czasu oferuje pewne zalety w porównaniu do konwencjonalnych spektrometrów dyspersyjnych: osiąga większą przepustowość dzięki braku szczelin (przewaga Jacquinota etendue12); zapewnia elastyczną rozdzielczość spektralną, która zależy wyłącznie od zakresu skanowania. Co więcej, jest dobrze przystosowany do konfiguracji szerokopolnych: w rzeczywistości, przy użyciu detektora 2D, metoda ta mierzy jeden interferogram na każdy piksel równolegle, co umożliwia jednoczesne rejestrowanie ciągłych widm na wszystkich pikselach. Z drugiej strony, system obrazowania FT musi spełniać dwa trudne wymagania: (1) względne opóźnienie między dwoma replikami światła musi być kontrolowane do niewielkiej części cyklu optycznego; (2) przesunięcie fazy między promieniami interferującymi w pojedynczym pikselu musi być ograniczone, aby zagwarantować dobrą spójność, a tym samym wysoki kontrast. Niektóre rozwiązania zostały zaproponowane na podstawie wspólnej ścieżki13, 14 lubprawie 15 interferometrów, ale są one dość nieporęczne lub mają rozdzielczość spektralną większą niż 100 cm-1.
W tej pracy opisano nowatorski mikroskop szerokokątny, który umożliwia pozyskiwanie zdjęć fotoluminescencyjnych i rozpraszania Ramana. Innowacyjnym blokiem tego systemu jest kompaktowy i ultrastabilny interferometr dwułamiący o wspólnej ścieżce, zwany Translating-Wedge-based Translating-Wedge-based Identical pulses eNcoding System (TWINS)16. Zapewnia skanowanie opóźnione przez setki cykli optycznych z dokładnością fazową niewielkiej części samego cyklu optycznego i wysoką stabilnością. Obie repliki światła mają polaryzacje ortogonalne i poruszają się kolijowo tą samą wspólną ścieżką, dlatego nie są podatne na fluktuacje długości ścieżki, typowe dla interferometru dwuwiązkowego. Schemat, pokazany na wkładzie na Rysunku 1, składa się z dwóch bloków kryształu dwułamnego o ortogonalnych osiach optycznych: jeden (B2) o stałej długości, a drugi (B1) podzielony na dwa kliny, które można przesuwać wzdłuż wspólnego kierunku przepustki. Światło padające jest spolaryzowane przez P1 pod kątem 45° względem osi optycznej kryształu dwułamnego, tak że połowa energii przypada wzdłuż polaryzacji zwyczajnej, a połowa wzdłuż nadzwyczajnej. Podczas przemieszczania się wzdłuż bloków dwułomnych dwa ortogonalne elementy kumulują względne opóźnienie, które jest precyzyjnie regulowane przez zmianę całkowitej grubości bloku B1 poprzez zmianę wstawienia klina. Drugi polaryzatorP2 projektuje składowe pola na wspólną polaryzację liniową, aby zakłócić ich interferencję. Opóźnienie τ między replikami zależy od przemieszczenia klina x wzdłuż wspólnej przepustki jako (Równanie 1) <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/68515/68515eq1.jpg" style="margin: auto;" />, z prędkością c prędkości światła, α kątem wierzchołka klinów, Δn= ne-n o różnicy w zwykłych i nadzwyczajnych współczynnikach załamania (dwójłomność). Ponieważ rozdzielczość spektralna Δv jest odwrotnie proporcjonalna do zakresu skanowania T=|T2-T 1|, z opóźnieniem początkowym i końcowym interferogramu T1,T2 , wysoka rozdzielczość spektralna wymagana przez spektroskopię Ramana wymaga wysokiej dwułamności i długich translacji klinowych. Wśród najczęściej spotykanych kryształów dwułomnych, YVO4 (ortowowandan ytru) jest szczególnie odpowiedni ze względu na wysokie Δn i przezroczystość w podczerwieni widzialnej i bliskiej. Kliny zaprojektowano z kątem wierzchołkowym 10°, dzięki czemu przy długości skanu 15,3 mm interferometr może nadawać opóźnienie 2500 fs przy 600 nm, uzyskując rozdzielczość spektralną 23 cm-1 na całym zakresie spektralnym zainteresowania (czułość kamery krzemowej stanowi górną granicę). Praca ta przedstawi strategię właściwego ustawienia próbkowania interferogramu (tj. zakres krokowy i skanowy), aby osiągnąć pożądaną rozdzielczość spektralną oraz poradzić sobie z tłem szerokopasmowym, oddzielając sygnał Ramana od fotoluminescencji.
Jak opisali Candeo i in.17, ten spektrometr dwułamny może być połączony z komercyjnym mikroskopem optycznym do wykonywania pomiarów hiperspektralnych. Wymagania to: konfigurowalny korpus mikroskopu optycznego, interferometr dwułamiący TWINS, niskoszumowy aparat monochromatyczny (np. CCD lub sCMOS) oraz wąskopasmowe źródło laserowe. Dla tego ostatniego typowe długości fal wzbudzenia dla spektroskopii Ramana i fluorescencji to 355 nm, 488 nm, 514 nm, 532 nm, 633 nm i 785 nm. Pomimo że lasery o wysokiej czystości spektralnej, takie jak ten wymieniony w Tabeli Materiałów, są najlepszym wyborem, można również użyć lasera o szerszej szerokości linii, np. ~0,1 nm, ze względu na ograniczoną rozdzielczość spektralną instrumentu. Mikroskop jest modernizowany poprzez umieszczenie TWINS w ścieżce detekcji, pomiędzy soczewką rury a detektorem monochromatycznym. Ta konfiguracja zapewnia jednolite opóźnienie ścieżki w polu widzenia oraz średni kontrast 55%. Ścieżka wzbudzenia jest zaprojektowana tak, aby uzyskać równomierne oświetlenie próbki: w praktyce końcówka wyjściowa światłowodu wielordzeniowego jest obrazowana na płaszczyźnie próbki. Dzięki użyciu mechanicznego scramblera mody są silnie sprzężone w rdzeniu włókna, tworząc płaski profil na płaszczyźnie próbki. Ponadto drgająca cewka głosowa uśrednia wzór plamkowy typowy dla promieniowania monochromatycznego. Charakterystyka tego oświetlenia cylindra przedstawiona jest na Rysunku Uzupełniającym 1. Wiązka jest skupiona na próbce za pomocą obiektywu korygowanego o nieskończoność, który również zbiera rozproszone światło Ramana i luminescencyjne w kierunku ścieżki detekcji. Filtry potrzebne do odrzucenia oświetlenia zostaną szczegółowo opisane.
Aby pokazać, jak mierzyć cechy spektralne szerokopasmowe i wąskopasmowe za pomocą tego mikroskopu hiperspektralnego, mierzy się zarówno luminescencję, jak i rozpraszanie Ramana dla próbki testowej specjalnie wybranej do celów ilustracyjnych. Próbka składa się z mieszaniny trzech pigmentów proszkowych o dobrze znanych widmach Ramana: dwóch polimorfów białych tytanów (TiO2), mianowicie rutylu i anatasu, oraz żółci siarczkowej kadmu (CdS). Jednak ta sama procedura może być stosowana w szerszym zakresie zastosowań, od nauki o materiałach po biologię.
Celem tego artykułu jest zilustrowanie kroków przeprowadzenia pomiaru hiperspektralnego, natomiast montaż i wyrównanie interferometru TWINS zostały szczegółowo opisane przez Candeo i in.17. Dlatego zainteresowany eksperymentator powinien zacząć od wcześniej złożonego interferometru opartego na tej technologii.
Protokół zaczyna się od przygotowania próbki i od sposobu ustawienia mikroskopu, aby wzbudzić i zebrać fotony rozpraszania Ramana oraz PL. Następnie parametry skanowania (długość skanowania, krok próbkowania) oraz parametry akwizycji (czas ekspozycji, sprzętowe binowanie) są ustawiane zgodnie z wymaganiami badanego sygnału. Na koniec zostanie przedstawiony proces postprocessingu, opisujący procedurę pobierania widma dla każdego piksela (hiperkostka spektralna, rysunek 2B) z pozyskanego zbioru danych czasowych (hiperkostka czasowa, rysunek 2A) oraz przedstawiający algorytmy redukcji szumów i zaawansowanej analizy spektralnej. Cały proces pracy przedstawiony jest na Rysunku 3.

<table><tbody><tr><td>Anatase</td><td>Kronos</td><td>1200</td><td>Polimorfia białego TiO2 pigment</td></tr><tr><td>Proszek siarczku kadmu</td><td>Kremer Pigmente GmbH & Kompanii</td><td>21060</td><td>Kadmowy żółty, indeks koloru ciemny/PY35</td></tr><tr><td>Kamera</td><td>Andor</td><td>Luca R</td><td>Kamera CCD mnożąca elektrony z 1004x1002 pikselami 8&mikro; m x 8&micro; m</td></tr><tr><td>Filtr oczyszczający</td><td>Semrock</td><td>LL01-532-12.5</td><td>&Oslash; 1/2" 2,0 nm - FWHM filtr liniowy laserowy na 532 nm</td></tr><tr><td>Pokrywki</td><td>BRAND GmbH & Co</td><td>4700 55</td><td>Szkło borokrzemowe 22x22x0,15 mm pokrywy mikroskopu</td></tr><tr><td>Lustro dichroiczne</td><td>Semrock</td><td>Di02-R532-25x36</td><td>25,2x35,6 mm laserowy dichroiczny rozdzielacz wiązki jednokrawędziowej na 532 nm</td></tr><tr><td>Światłowód</td><td>Thorlabs</td><td>M74L05</td><td>400&mikro; Rozmiar rdzenia m, światłowód wielomodowy NA 0.39</td></tr><tr><td>Laser</td><td>Fotonika Hubnera</td><td>Cobolt Samba 1000</td><td>Laser pompowany diodą CW z prędkością 532 nm, maksymalna moc 1000 mW</td></tr><tr><td>Filtr długprzepustowy</td><td>Semrock</td><td>LP03-532RU-25</td><td>Ultra stromy filtr długprzepustowy na krawędzi przy 532 nm</td></tr><tr><td>Mikroskop</td><td>Leica</td><td>DMRBE &nbsp; &nbsp;</td><td>Mikroskop badawczy trójnoczny (NPP);</td></tr><tr><td>Cel</td><td>Leica</td><td>PL-FLUOTAR, 10x/0,30</td><td>Cel wzbudzania i zbierania z powiększeniem 10x, 0,3 NA</td></tr><tr><td>Cel</td><td>Newport</td><td>M-10X</td><td>Soczewka obiektywu w ścieżce oświetlenia, z powiększeniem 10x, 0,25 NA</td></tr><tr><td>Rutile</td><td>Kronos</td><td>2900</td><td>Polimorfia białego TiO2 pigment</td></tr><tr><td>Filtr krótkprzepustowy</td><td>Thorlabs</td><td>FESH600</td><td>&Oslash; Filtr krótkoprzepustowy 25,0 mm z długością fali odcięciowej 600</td></tr><tr><td>Slajdy</td><td>Marienfeld</td><td>1000612</td><td>Szkiełka mikroskopowe 76x26x1 mm</td></tr></tbody></table>

wielomodalny mikroskop ramana z szeroką polową transformacją fouriera

A Multimodal Wide-Field Fourier-Transform Raman Microscope

Mikroskopia Ramana to potężna technika określająca skład chemiczny próbki. Głównym wyzwaniem nowoczesnych mikroskopów Ramana opartych na detekcji częstotliwości punktowej jest uzyskanie map Ramana dużych obszarów ze względu na zazwyczaj długie czasy zatrzymywania się pikseli (0,1-1 s). Szerokokątny mikroskop transformaty Fouriera (FT) prezentowany tutaj umożliwia szybkie pomiary rozległych próbek z rozdzielczością przestrzenną ~1 μm i spektralną ~23 cm-1 . Opiera się na ultra-stabilnym i kompaktowym interferometrze dwułamnym o wspólnej ścieżce, dodanym wzdłuż ścieżki detekcji mikroskopu komercyjnego, który umożliwia równoległe pozyskiwanie widm dla wszystkich pikseli detektora 2D, znacząco skracając czas pomiaru (10-100 razy szybciej). Podejście w dziedzinie czasu skutecznie rozwiązuje kolejne ograniczenie techniki w dziedzinie częstotliwości, czyli rozplątanie sygnału Ramana od tła fotoluminescencji, w którym sygnał Ramana może być ukryty. Protokół ten opisuje, jak wykonywać pomiary hiperspektralne za pomocą ulepszonego mikroskopu komercyjnego: wyrównanie schematu oświetlenia, kryteria wyboru parametrów pomiarowych oraz analizę danych w celu pobrania i badania widm.

Rysunek 4A przedstawia mapę Ramana dla wybranego obszaru mieszaniny proszkowej. Jest to fałszywa reprezentacja map obfitości pobranych za pomocą MCR-ALS, opisanych w kroku 4.5. Dostarcza informacji o składzie próbki, ponieważ trzy gatunki można wyraźnie rozróżnić w polu widzenia. Rysunek 4B przedstawia średnie widma w wybranych regionach mapy, z rozdzielczością spektralną 23 cm-1, określoną przez wybraną długość skanu. Wybrany zestaw filtrów pozwala z...

Mikroskop szerokokątowy z transformatem Fouriera, oparty na kompaktowym i ultrastabilnym interferometrze dwułamannym, umożliwia równoległe pozyskiwanie widm dla wszystkich pikseli detektora 2D. Podejście w dziedzinie czasowej umożliwia rozplątanie sygnałów fotoluminescencyjnych i Ramana oraz umożliwia szybkie mapowanie Ramana (~5 ms/piksel) z rozdzielczością przestrzenną ~1 μm i spektralną 23 cm-1 .

Wielomodalny mikroskop Ramana z szeroką polową transformacją Fouriera

Raman microscopy is a powerful technique to determine the chemical composition of a sample. The main challenge of the state-of-the-art spontaneous Raman ...

Opracowaliśmy multimodalny mikroskop hiperspektralny, który pozwala uzyskać widmo Ramana lub fotoluminescencji z każdego piksela obrazu, co skraca czas pomiaru. Konwencjonalne podejście skalowania rastrowego opiera się na spektrometrach dyspersyjnych. Zaawansowane techniki wzmacniają sygnał Ramana, wykorzystując światło w rezonansie lub za pomocą zsynchronizowanych krótkich impulsów laserowych, które wywołują drgania molekularne.Przekrój rozpraszania dolnego Ramana stawia przed sobą dwa główne wyzwania. Po pierwsze, słaby sygnał, który wymaga długiego czasu akwizycji. Po drugie, sygnał Ramana może zostać przytłoczony przez silne tło fotoluminescencji.Spektroskopia transformata Fouriera umożliwia równoległe pozyskiwanie widma na wszystkich pikselach dla szybszego pomiaru oraz regulowane próbkowanie do dostępu do konkretnych informacji widmowych, takich jak izolowanie słabych szczytów Ramana od silnego tła luminescencji. Podejście transformaty Fouriera umożliwia inteligentne próbkowanie i analizę danych, które wykorzystują informacje w śladach czasowych. Naszym celem jest dostosowanie strategii niedopróbkowania, aby jeszcze bardziej skrócić czas pozyskiwania.Na początek użyj skrobaka, aby nałożyć 20 miligramów każdego proszku pigmentu na precyzyjną wagę, uzyskując proporcję wagową jeden do jednego. Wymieszaj proszki z moździerzem, aby usunąć grudki. Wylej powstałą mieszankę na szkiełko mikroskopowe.Następnie użyj końcówki skrobaka, aby delikatnie docisnąć warstwę, aby uzyskać niemal jednolitą grubość warstwy. Nałóż lakier na krawędzie okładki mikroskopu. Nałóż go na mieszankę tak, że lakier jest skierowany w dół i wywieraj wystarczający nacisk, by go uszczelnić.Następnie ustaw długość fali wzbudzenia i skoncentruj laser wzbudzający na wejściu dużego rdzenia światłowodu wielomodowego. Umieść próbkę testową na stole mikroskopu i włącz kamerę, aby zobaczyć plamkę oświetloną laserem. Przymocuj środkową część włókna do drgającej membrany cewki, która usunie plamki.Mechanicznie mieszaj światłowód, mocno je wyginając tak, aby połączyć wszystkie jego mody przestrzenne. Włóż wąskopasmowy filtr o średnicy 532 nanometrów o szerokości pasma 2,0 nanometra, aby oczyścić linię lasera i odrzucić wszelkie niepożądane pasma spektralne pompy. Użyj lustra dichroicznego, aby odbijać światło laserowe w kierunku próbki i przepuszczać promieniowanie rozproszone do końca w kierunku czerwieni odbite wstecznie zebrane przez obiektyw.Włóż filtr długprzepustowy o średnicy 532 nanometrów, aby odrzucić pozostałe światło oświetleniowe. Zmierz moc na samolocie próbkowym za pomocą miernika mocy. Reguluj wiązkę pompy, aby uzyskać intensywność w próbce, która nie prowadzi do uszkodzenia.Teraz połóż próbkę na scenie mikroskopu i wyreguluj ostrość. Włącz sterownik silnika, który wykonuje translację klina, i naciśnij opcję akwizycji. Następnie ustaw parametry akwizycji, takie jak ramy czasowe i sprzętowe binowanie, aby zoptymalizować natężenie sygnału.Teraz ustaw długość kroku, pozycję wyjściową i liczbę kroków. Dodaj nazwę katalogu oraz nazwę pliku. Przesuń punkt krzyża do pozycji docelowej i kliknij na miarę, aby rozpocząć pobieranie obrazu monochromatycznego dla każdej pozycji klina.Po zakończeniu pomiaru wyłącz laser przed analizą danych. Następnie wygeneruj hiperkostkę spektralną z zebranego zbioru danych, ładując plik korekcji pozycji silnika specyficzny dla silnika krokowego oraz plik kalibracji częstotliwości odpowiadający interferometrowi. Ustaw długość fali widma obliczane przez Fouriera, transformując interferogramy wszystkich pikseli.Zastosuj funkcję apodyzacji, która oferuje dobry kompromis między poszerzaniem spektralnym a redukcją artefaktów, na przykład okno Happ-Genzel. Następnie generuj hiperkostkę spektralną i zapisuj ją w wartościach zespolonych. Uruchom oprogramowanie analityczne i otwórz hiperkostkę spektralną w wartościach zespolonych.Wygeneruj fałszywy obraz RGB i uzyskaj średnie widmo w wybranych obszarach, aby przeanalizować hiperkostkę spektralną. Dla pomiaru Ramana w tym samym polu widzenia dodaj filtr pasmowy na ścieżce detekcji. Ustaw ramy czasowe i sprzętowe binowanie, potem ustaw długość, pozycję domową i liczbę kroków.Wybierz nazwę pliku i katalog do zapisu przed naciśnięciem Measure. W polu widzenia wyraźnie wyróżnia się trzy pigmenty na podstawie ich sygnatur spektralnych Ramana, z charakterystycznymi szczytami dla rutylu o długości 454 i 616 centymetrów odwrotnie, anatasze o 396, 514 i 641 centymetrach odwrotnie oraz żółtej kadmu o 301 i 605 centymetrach odwrotnych. Na mapie fotoluminescencji zamiast tego jedynym pigmentem widocznie rozproszonym w polu widzenia jest żółty kadm, z silną emisją dominującą na całym obrazie.Rzeczywiście, słaba emisja defektów z rutylu i anazazy nie może być spektralnie odróżniona od żółtego proszku.

a-multimodal-wide-field-fourier-transform-raman-microscope

Research

JoVE Journal

Engineering

Inżynieria

Omówiono konstrukcję i działanie złożonego nieliniowego układu optycznego, który wykorzystuje ultraszybkie przełączanie całkowicie optyczne do izolacji sygnałów Ramanowskich od sygnałów fluorescencyjnych. Dzięki zastosowaniu tego układu możliwe jest skuteczne rozdzielenie sygnałów Ramanowskich i fluorescencyjnych przy użyciu energii impulsów oraz mocy średniej, które pozostają bezpieczne biologicznie.

Eliminacja tła fluorescencyjnego w rezonansowej i spontanicznej mikrospektroskopii Ramana

Spektroskopia Ramana jest odpowiednią techniką do bezkontaktowej, bezetykietowej analizy żywych komórek, konstruktów inżynierii tkankowej oraz tkanek natywnych. Specyficzne dla źródła sygnatury spektralne mogą być generowane i analizowane przy użyciu analizy wielowariancyjnej.

Bezkontaktowy i bezetykietowy monitoring komórek oraz macierzy pozakomórkowej z wykorzystaniem spektroskopii Ramanowskiej

Źródło: Espinoza, R., et al. Dwukolorowe, stymulowane w czasie rzeczywistym obrazowanie rozpraszania Ramana mózgu myszy w celu diagnozowania tkanek. J. Vis. exp. (2022).  Film przedstawia dwukolorowe, stymulowane rozpraszanie Ramana (SRS) wycinków tkanki mózgowej myszy. Dwie zsynchronizowane wiązki laserowe są kierowane na przekrój tkanki w celu wzbudzenia drgań molekularnych, co powoduje względną zmianę intensywności wiązek. Lipidy i białka w tkance są wykrywane za pomocą różnych par...

Dwukolorowe, stymulowane obrazowanie rozpraszania Ramana tkanki mózgowej myszy

W tym manuskrypcie opisana jest implementacja mikroskopu z wymuszonym rozpraszaniem Ramana (SRS), uzyskanego przez integrację eksperymentalnego zestawu SRS z laserowym mikroskopem skaningowym. Mikroskop SRS oparty jest na dwóch femtosekundowych (fs) źródłach laserowych, Ti-Sapphire (Ti:Sa) i zsynchronizowanym optycznym oscylatorze parametrycznym (OPO).

Wdrożenie mikroskopu nieliniowego opartego na wymuszonym rozpraszaniu Ramana

Mikroskopia stymulowanego rozpraszania Ramana (SRS) jest potężną, nieniszczącą i bezznacznikową techniką obrazowania. Jednym z pojawiających się zastosowań jest stymulowana histologia Ramana, w której dwukolorowe obrazowanie SRS w przejściach Ramana białek i lipidów jest wykorzystywane do generowania obrazów pseudo-hematoksyliny i eozyny. W tym miejscu demonstrujemy protokół dwukolorowego obrazowania SRS w czasie rzeczywistym w diagnostyce tkanek.

Dwukolorowe, stymulowane rozpraszaniem Ramana w czasie rzeczywistym mózgu myszy w celu diagnozowania tkanek

Ten artykuł przedstawia integrację modułu spektralnego ogniskowania i lasera impulsowego o podwójnym wyjściu, umożliwiającego szybkie obrazowanie hiperspektralne nanocząsteczek złota i komórek rakowych. Praca ta ma na celu zademonstrowanie szczegółów multimodalnych nieliniowych technik optycznych na standardowym laserowym mikroskopie skaningowym.

Obrazowanie biomolekularne wychwytu komórkowego nanocząstek przy użyciu multimodalnej nieliniowej mikroskopii optycznej

Ten artykuł bezpośrednio porównuje rozdzielczość, czułość i kontrasty obrazowania stymulowanego rozpraszania Ramana (SRS) i spójnego rozpraszania anty-Stokesa Ramana (CARS) zintegrowanych w tej samej platformie mikroskopowej. Wyniki pokazują, że CARS ma lepszą rozdzielczość przestrzenną, SRS daje lepsze kontrasty i rozdzielczość spektralną, a obie metody mają podobną czułość.

Bezpośrednie porównanie hiperspektralnie stymulowanego rozpraszania Ramana i koherentnej mikroskopii rozpraszania Ramana antystokesa do obrazowania chemicznego

Przedstawiamy protokół do pozyskiwania obrazów chemicznych za pomocą mikroskopii SRS (ang. broadband stimulated Raman scattering). Opierając się na mikroskopie SRS, który działa z różnicową detekcją wielokanałową typu lock-in, protokół opisuje przygotowanie próbki, regulację aparatury SRS i chemometrię w celu rozplątania różnych składników chemicznie niejednorodnych próbek.

Multipleksowe obrazowanie chemiczne oparte na szerokopasmowej mikroskopii rozpraszania Ramana stymulowanego

Multimodalny, szybki system obrazowania hiperspektralnego został opracowany w celu uzyskania szerokopasmowych obrazów generowania oscylacyjnej sumy częstotliwości (VSFG), wraz z modalnościami obrazowania jasnego pola i generacji drugiej harmonicznej (SHG). Ze względu na to, że częstotliwość podczerwieni rezonansuje z drganiami molekularnymi, ujawnia się mikroskopijna wiedza o morfologii strukturalnej i mezoskopowej próbek dopuszczonych do symetrii.

Multimodalne nieliniowe hiperspektralne obrazowanie chemiczne przy użyciu mikroskopii generacji drgań i częstotliwości ze skanowaniem liniowym

System opisany tutaj wykorzystuje tradycyjną pułapkę optyczną, jak również niezależną holograficzną linię pułapek optycznych, zdolną do tworzenia i manipulowania wieloma pułapkami. Pozwala to na tworzenie złożonych układów geometrycznych cząstek załamanych światła, a jednocześnie umożliwia jednoczesne szybkie pomiary aktywności enzymów biologicznych w wysokiej rozdzielczości.

Budowa mikroskopu o wysokiej rozdzielczości z konwencjonalnymi i holograficznymi możliwościami optycznego pułapkowania

Poznaj wielomodalny mikroskop Ramana z szeroką polową transformacją Fouriera, który umożliwia szybkie pozyskiwanie widm z każdego piksela obrazu. Ta metoda znacząco skraca czas pomiaru i izoluje sygnały Ramana od fotoluminescencji.

Wielomodalny mikroskop Ramana z szeroką polową transformacją Fouriera

Przeglądaj więcej filmów