Name: Analiza behawioralna dysfunkcji narządu ruchu u Drosophila melanogaster jako odczyt neurotoksyczności (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-07-18T13:50:00.000+00:00
Duration: 7 min 3 s
Description: Poznaj metodę analizy behawioralnej dysfunkcji ruchowej u Drosophila melanogaster do wykrywania neurotoksyczności. Protokół łączy test wspinaczkowy z monitorowaniem w czasie rzeczywistym, umożliwiając wczesne wykrywanie zaburzeń motorycznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Badania zostały sfinansowane w ramach projektu MOD. PN. FRM.059.PT.V03 – Pęcherzyca pęcherzyca: innowacyjne i niewykorzystane źródło produktów kosmetycznych o wysokiej wartości dodanej; przez "Pacto da Bioeconomia Azul" (projekt nr C644915664-00000026) w ramach WP5 – Algae Vertical, finansowany przez Next Generation EU European Fund oraz portugalski plan odbudowy i zwiększania odporności (PRR); oraz przez Fundação para a Ciência e a Tecnologia (FCT) za pośrednictwem CBA (UIDB/05292/2020 i UIDP/05292/2020).

Na przykład protokół ten został wykorzystany do oceny potencjału neurotoksycznego frakcji jadu pęcherzycy pęcherzycowej . Grupa kontrolna otrzymała tylko bufor fizjologiczny i roztwór sacharozy bez badanego związku. Wszystkie eksperymenty przeprowadzono na szczepie W118 . W przypadku eksperymentów z Drosophila nie jest wymagane zezwolenie etyczne, ponieważ nie są one objęte przepisami dotyczącymi opieki nad zwierzętami.
1. Odczynniki i przygotowanie próbek
<ol>
	<li>Przygotować bufor biologiczny, taki jak PBS (10 mM, pH 7,0) lub HEPES (10 mM, pH 7,0), w zależności od wymagań konkretnego testu, oraz 10 M roztwór podstawowy sacharozy. Obliczyć objętość próbki na podstawie liczby powtórzeń i czasu trwania eksperymentu.</li>
	<li>Rozcieńczyć próbkę do pożądanego stężenia za pomocą buforu biologicznego, uzupełnionego roztworem sacharozy do końcowego stężenia 1 M. Jeśli próbka jest przezroczysta, można dodać odpowiedni barwnik spożywczy (np. 0,1 mg/ml niebieskiego lub czerwonego barwnika), aby wizualnie ocenić zachowanie żywieniowe. W niniejszym badaniu frakcję jadu pęcherzycy rozcieńczono za pomocą PBS do końcowego stężenia 10 μg/μL, a następnie uzupełniono roztworem sacharozy i barwnikiem spożywczym.</li>
	<li>Przygotować roztwór kontroli ujemnej zawierający tylko bufor i uzupełnić roztwór sacharozą do końcowego stężenia 1 M oraz barwnikiem spożywczym. W niniejszym badaniu jako roztwór kontroli ujemnej zastosowano PBS uzupełniony sacharozą i barwnikiem spożywczym.</li>
	<li>W przypadku pożywki dla muszek owocowych należy postępować zgodnie z protokołem podanym wpunkcie 18.</li>
</ol>
2. Utrzymanie materiału biologicznego
<ol>
	<li>Przenieś zdrowe, dojrzałe płciowo dorosłe muchy do butelki zawierającej świeżo przygotowane podłoże spożywcze. Aby kontynuować, postukaj muchami na dno butelki, otwórz ją i przenieś je przez odwrócenie butelki do nowej butelki zawierającej pożywkę muchową. Umieścić butelkę w inkubatorze nastawionym na temperaturę 25 °C z 12-godzinnym cyklem światło/ciemność i wilgotnością 50%. Pozwól muchom złożyć jaja przez noc (około 16-22 godzin), aby zebrać wystarczającą ilość zsynchronizowanych jaj.</li>
	<li>Po złożeniu jaj użyj nowej butelki zawierającej 70% etanolu, aby pozbyć się dorosłych much. Zapobiega to dodatkowemu składaniu jaj i zapewnia synchronizację wieku, co ma kluczowe znaczenie dla uzyskania kohorty dorosłych o minimalnej zmienności wieku.</li>
	<li>Aby zapewnić równomierny rozwój, utrzymuj butelki w tych samych kontrolowanych warunkach (25 °C, 12 godzin cyklu światła/ciemności, 50% wilgotności). Dorosłe osobniki zaczynają pojawiać się około 9 lub 10 dnia. Monitorowanie postępów rozwojowych może pomóc w przewidywaniu czasu pojawienia się dorosłych osobników.</li>
	<li>Utrzymuj zebrane muchy w tych samych kontrolowanych warunkach, aż osiągną pożądany wiek do testu. Zużyć je w ciągu 24-48 godzin po wschodach. Ten kontrolowany proces starzenia zapewnia minimalizację zmienności i zwiększa wiarygodność wyników eksperymentalnych.</li>
</ol>
3. Ujemny test geotaksji
UWAGA: Schematyczne przedstawienie ujemnego testu geotaksji przedstawiono na rysunku uzupełniającym 1.
<ol>
	<li>W dniu eksperymentu delikatnie przenieś muchy do pustej butelki.</li>
	<li>Muchy muszą być krótko znieczulone na lodzie przed transferem, aby zminimalizować stres związany z ruchem i obsługą. W tym celu umieść butelkę zawierającą muchy w pudełku z lodem, przykrywając całą butelkę.</li>
	<li>Po 1 minutach delikatnie postukaj w butelkę, aby sprawdzić, czy wszystkie muchy są znieczulone. Utrzymuj je na lodzie jeszcze przez 1 minutę, aby zapewnić pełne znieczulenie bez wywoływania stresu lub wpływu na ich zdolność do wspinania się. UWAGA: Należy pamiętać, że niektóre środki znieczulające, takie jak CO2, mogą wpływać na późniejsze zachowania, w tym upośledzone zachowanie podczas wspinaczki, i wpływać na wyniki negatywnego testu geotaksji.</li>
	<li>Podczas gdy muchy są znieczulane, przygotuj mniejszy pojemnik wypełniony lodem i umieść szalkę Petriego lub płaską, czystą powierzchnię na wierzchu lodu, aby stworzyć schłodzoną platformę. Taka konfiguracja pomaga utrzymać znieczulenie podczas sortowania i minimalizuje ruchy much po powrocie do zdrowia.</li>
	<li>Oceń znieczulenie, potwierdzając całkowite unieruchomienie much po 2 minutach na lodzie. Po całkowitym znieczuleniu delikatnie przenieś muchy, odwracając rurkę nad schłodzoną szalką Petriego i delikatnie stukając w nie, aby je uwolnić. Zimna powierzchnia pomoże utrzymać muchy w stanie unieruchomionym podczas przenoszenia.</li>
	<li>Za pomocą cienkiego pędzla i pod mikroskopem stereoskopowym (przy powiększeniu 10x i 20x, jeśli jest dostępny), delikatnie oddziel samce i samice much na podstawie cech wyróżniających, takich jak rozmiar i wzory pigmentacji. Samce są na ogół mniejsze z szerokimi czarnymi paskami, podczas gdy samice są większe i mają jaśniejsze, wydłużone odwłoki. Wykonaj ten krok tak szybko, jak to możliwe, aby zminimalizować wpływ znieczulenia na muchy. UWAGA: Jeśli w eksperymencie nie ma potrzeby różnicowania płci, pomiń etap segregacji. Zminimalizuj czas ekspozycji i delikatnie obchodź się z muchami, aby zmniejszyć stres i potencjalne zmiany w zachowaniu.</li>
	<li>Ostrożnie przenieść posortowane muchy do pustych fiolek z odpowiednim przypisaniem. Pozwól im dojść do siebie po znieczuleniu przez około 30 minut w kontrolowanym środowisku (25 °C, 12 godzin/12 godzin cykl jasny/ciemny, 50% wilgotności) przed przystąpieniem do testu.</li>
	<li>Do przygotowania paszy mikrokapilarnej należy użyć pipety, aby ręcznie załadować 10 μl roztworu testowego do każdej probówki mikrokapilarnej. Upewnij się, że objętość jest spójna we wszystkich próbkach, aby ustandaryzować warunki karmienia.</li>
	<li>Za pomocą pipety dodaj 3-5 μl oleju mineralnego do otwartego końca mikrokapilary. Zapobiega to parowaniu i wyciekaniu próbki podczas eksperymentu.</li>
	<li>Włóż wstępnie napełnione mikrokapilary przez otwory w bawełnianych zatyczkach fiolek, upewniając się, że są bezpiecznie umieszczone. W razie potrzeby użyj wcześniej przyciętych końcówek, aby ściśle przylegać do bawełny, nie utrudniając przepływu powietrza.</li>
	<li>Umieścić fiolki zawierające muchy w inkubatorze nastawionym na temperaturę 25 °C w cyklu 12 h/12 h światło/ciemność. Pozostaw je na czas eksperymentu i ręcznie wymieniaj mikronaczynia włosowate na świeżo przygotowane jedzenie codziennie, aby zapewnić stałą ekspozycję. Okres narażenia zależy od toksyczności i charakteru próbki i zwykle wynosi od 2 do 7 dni.</li>
	<li>W odstępach 12 godzin przenieś muchy do czystej, pustej fiolki, aby ocenić aktywność lokomotoryczną.</li>
	<li>Odmierzyć i zaznaczyć linię w odległości 7 cm od dna fiolki za pomocą markera permanentnego. Ta wysokość posłuży jako cel wspinaczkowy.</li>
	<li>Ustaw kamerę lub telefon w stabilnym miejscu, aby zarejestrować zachowanie podczas wspinaczki. Zadbaj o odpowiednie oświetlenie i przezroczyste tło do analizy. Upewnij się, że konfiguracja eksperymentalna jest zgodna z polem widzenia kamery.</li>
	<li>Delikatnie postukaj w fiolkę, aby sprowadzić muchy na dno, a następnie natychmiast rozpocznij nagrywanie. Unikaj nadmiernej siły, która mogłaby zranić lub zdezorientować muchy.</li>
	<li>Przejrzyj nagrania i zmierz czas potrzebny każdej muchie na dotarcie do zaznaczonej linii o długości 7 cm. Ustaw maksymalny limit czasu (np. 30 s); Przypisz ten czas każdej muchy, która nie dotrze do linii.</li>
	<li>Zwróć szczególną uwagę na wszelkie nietypowe zachowania, takie jak nieskoordynowane ruchy, opóźniona inicjacja wspinaczki lub nieregularne wzorce wspinaczkowe. Objawy te mogą świadczyć o neurotoksycznym działaniu badanego związku. UWAGA: Szczegółowe instrukcje dotyczące przygotowania paszy można znaleźć w protokole19 testu podajnika kapilarnego (CAFE). Metoda ta dostarcza precyzyjnych wskazówek dotyczących przygotowywania płynnych źródeł pokarmu dla muszek owocowych, zapewniając dokładne określenie ilościowe spożycia pokarmu i minimalizując zmienność w eksperymentach żywieniowych.</li>
</ol>
4. Testy monitorowania w czasie rzeczywistym
UWAGA: Aby zapoznać się z konfiguracją, w tym schematycznym przedstawieniem komponentów systemu śledzenia i protokołem kalibracji, należy postępować zgodnie z wcześniejszymi publikacjami11,12. Ogólny przegląd doświadczeń przedstawiono na rysunku uzupełniającym 2.
<ol>
	<li>Test lokomocji w czasie rzeczywistym (test śledzenia)<ol>
		<li>Powtórzyć kroki 3.8-3.9, aby przygotować mikrokapilary zasilające z próbką i uszczelką oleju mineralnego.</li>
		<li>Przygotuj indywidualne komory lokomocji za pomocą przezroczystych plastikowych słomek, każda o długości około 6 cm. Słomki te służą jako ekonomiczne i przezroczyste obudowy odpowiednie do nagrań. Rurki powinny być kompatybilne z areną snu11, która mieści 20 rurek do wysokoprzepustowych badań behawioralnych.</li>
		<li>Uszczelnij jeden koniec każdej słomki przezroczystą folią, zapewniając hermetyczne zamknięcie. W pobliżu uszczelnionego końca utwórz mały otwór, aby pomieścić wprowadzenie mikrokapilary zasilającej. Upewnij się, że otwór jest wystarczająco duży, aby bezpiecznie utrzymać mikrokapilarę, nie powodując wycieków lub ruchu podczas testu.</li>
		<li>Powtórz kroki 3.1-3.6 w celu znieczulenia, opcjonalnie segreguj i delikatnie umieść jedną znieczuloną muchę w każdej tubce za pomocą cienkiego pędzla. Uszczelnij otwarty koniec każdej rurki przezroczystą folią lub bawełnianą zatyczką, zapewniając przepływ powietrza i ochronę przed muchami.</li>
		<li>Umieść zmontowane probówki na arenie, upewniając się, że każda mikrokapilara pozostaje dostępna na zewnątrz w celu codziennej wymiany. Włóż wstępnie napełnioną mikrokapilę do każdej probówki. Pozwól muszkom zregenerować się i zaaklimatyzować przez około 30 minut przed rozpoczęciem testu.</li>
		<li>Umieść urządzenie w komorze o kontrolowanych warunkach środowiskowych (np. 25 °C, 12 h/12 h cykl światła/ciemności, 50% wilgotności). Podłącz urządzenie do sieci lub lokalnego systemu śledzenia.</li>
		<li>Uzyskaj dostęp do platformy i znajdź urządzenie przypisane do eksperymentu. Upewnij się, że system dokładnie śledzi każdą muchę, zgodnie ze wskazaniami znaczników. Wprowadź wszystkie odpowiednie metadane eksperymentalne i rozpocznij rejestrowanie testu. Do zaawansowanej analizy danych użyj struktury rethomics, pakietu R przeznaczonego do analizy danych behawioralnych o wysokiej przepustowości11,12.</li>
		<li>Codziennie zastępuj pokarm w mikronaczyniach włosowatych świeżo przygotowanymi roztworami. Codziennie sprawdzaj wzrokowo każdą muchę, aby zapewnić jej przeżycie i prawidłowe zachowanie przez cały okres eksperymentalny, który zwykle trwa od 3 do 5 dni.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ocena rytmu okołodobowego<ol>
		<li>Aby zbadać rytm okołodobowy much i ich potencjalne zmiany, upewnij się, że eksperyment rozpoczyna się zsynchronizowany z określonym cyklem światła/ciemności. Utrzymuj 12 godzin światła/12 godzin ciemnego fotoperiodu przez całą fazę nagrywania, aby uniknąć zakłóceń rytmów endogennych. Po ustawieniu warunków powtórz kroki 4.1.1-4.1.8, upewniając się, że wszystkie procedury są wykonywane konsekwentnie w fazach jasnych/ciemnych.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ocena zachowania preferencji jasnego/ciemnego<ol>
		<li>Powtórz kroki 3.1-3.11, aby przygotować muchy i karmić mikronaczynia włosowate.</li>
		<li>Po przygotowaniu fiolek do karmienia umieścić je w inkubatorze, aby umożliwić muchom żerowanie na badanej próbce przez 2 godziny (lub inny czas określony na podstawie wcześniejszych danych dotyczących aktywności lokomotorycznej).</li>
		<li>Aby ocenić zachowanie preferencji świetlnych, przygotuj indywidualne komory lokomocji pokrywające 50% każdej rurki folią aluminiową, aby stworzyć zdefiniowany ciemny obszar. Zapewnij spójne pokrycie we wszystkich rurach, aby umożliwić ustandaryzowane porównanie.</li>
		<li>Powtórzyć kroki 4.1.2-4.1.4 w celu przeniesienia much pojedynczo do komór lokomocyjnych, pomijając wprowadzanie mikronaczyń włosowatych.</li>
		<li>Umieść przygotowane rurki na arenie i pozwól muchom zaaklimatyzować się przez około 30 minut.</li>
		<li>Powtórz kroki 4.1.6-4.1.7 i rejestruj zachowanie much przez 60 minut. Rury, w których rejestrowany jest ograniczony ruch, mogą wskazywać na ciemną preferencję, ponieważ system śledzenia nie wykrywa much znajdujących się w obszarze pokrytym folią, aby zasygnalizować przeszkodę.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. Analiza danych
<ol>
	<li>Przygotuj szablon metadanych, uwzględniając wszystkie niezbędne informacje, takie jak identyfikator, leczenie, szczegóły związku, czas trwania testu i inne istotne zmienne. Przykładowy szablon i odpowiadający mu potok przetwarzania danych znajdują się w tabeli uzupełniającej 1.</li>
	<li>Zapisz ukończony plik metadanych w formacie CSV. Aby zapewnić zgodność, otwórz plik CSV w edytorze tekstu, aby sprawdzić, czy nie zawiera niepotrzebnych znaków lub problemów z formatowaniem. Usuń wszystkie zbędne znaki, jeśli są obecne.</li>
	<li>Przed przystąpieniem do analizy danych utwórz kopię zapasową danych. Otwórz terminal i wykonaj następujące polecenie: sudo python backup_tool.py. Ten krok zabezpiecza dane przed potencjalną utratą lub uszkodzeniem podczas analizy.</li>
	<li>Zidentyfikuj i zanotuj lokalizację plików danych odpowiadających eksperymentowi. Upewnij się, że te pliki są dostępne do analizy.</li>
	<li>Analizowanie danych za pomocą Rethomics. Otwórz program RStudio i załaduj niezbędne pakiety Rethomics do analizy danych behawioralnych. Szczegółowe instrukcje i samouczki są dostępne na stronie internetowej Rethomics: https://rethomics.github.io/scopr.html</li>
</ol>

<ol><li>Pandey, U. B., Nichols, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+disease+models+in+Drosophila+melanogaster+and+the+role+of+the+fly+in+therapeutic+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacol+Rev%22%5BJournal%5D)">Human disease models in Drosophila melanogaster and the role of the fly in therapeutic drug discovery.</a> Pharmacol Rev. 63 (2), 411-436 (2011).</li>
<li>Bellen, H. J., Tong, C., Tsuda, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((100+years+of+Drosophila+research+and+its+impact+on+vertebrate+neuroscience%3A+a+history+lesson+for+the+future%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">100 years of Drosophila research and its impact on vertebrate neuroscience: a history lesson for the future.</a> Nat Rev Neurosci. 11 (7), 514-522 (2010).</li>
<li>Rand, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophotoxicology%3A+the+growing+potential+for+Drosophila+in+neurotoxicology%5BTitle%5D)+AND+%22Neurotoxicol+Teratol%22%5BJournal%5D)">Drosophotoxicology: the growing potential for Drosophila in neurotoxicology.</a> Neurotoxicol Teratol. 32 (1), 74-83 (2010).</li>
<li>Gupta, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chlorpyrifos+induces+apoptosis+and+DNA+damage+in+Drosophila+through+generation+of+reactive+oxygen+species%5BTitle%5D)+AND+%22Ecotoxicol+Environ+Saf%22%5BJournal%5D)">Chlorpyrifos induces apoptosis and DNA damage in Drosophila through generation of reactive oxygen species.</a> Ecotoxicol Environ Saf. 73 (6), 1415-1423 (2010).</li>
<li>Grandjean, P., Landrigan, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurobehavioural+effects+of+developmental+toxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet+Neurol%22%5BJournal%5D)">Neurobehavioural effects of developmental toxicity.</a> Lancet Neurol. 13 (3), 330-338 (2014).</li>
<li>Bal-Price, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((International+STakeholder+NETwork+%28ISTNET%29%3A+creating+a+developmental+neurotoxicity+testing+roadmap+for+regulatory+purposes%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Toxicol%22%5BJournal%5D)">International STakeholder NETwork (ISTNET): creating a developmental neurotoxicity testing roadmap for regulatory purposes.</a> Arch Toxicol. 89 (2), 269-287 (2015).</li>
<li>Cabrita, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Motor+dysfunction+in+Drosophila+melanogaster+as+a+biomarker+for+developmental+neurotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22iScience%22%5BJournal%5D)">Motor dysfunction in Drosophila melanogaster as a biomarker for developmental neurotoxicity.</a> iScience. 25 (7), 104541(2022).</li>
<li>Mendes, C. S., Bartos, I., Akay, T., Márka, S., Mann, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+gait+parameters+in+freely+walking+wild-type+and+sensory+deprived+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Quantification of gait parameters in freely walking wild-type and sensory deprived Drosophila melanogaster.</a> Elife. 2, e00231(2013).</li>
<li>Dubovický, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+developmental+neurotoxicity%3A+some+important+issues+focused+on+neurobehavioral+development%5BTitle%5D)+AND+%22Interdiscip+Toxicol%22%5BJournal%5D)">Evaluation of developmental neurotoxicity: some important issues focused on neurobehavioral development.</a> Interdiscip Toxicol. 1 (3-4), 206-210 (2008).</li>
<li>Pereira, T. D., Shaevitz, J. W., Murthy, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantifying+behavior+to+understand+the+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Quantifying behavior to understand the brain.</a> Nat Neurosci. 23 (12), 1537-1549 (2020).</li>
<li>Geissmann, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ethoscopes%3A+an+open+platform+for+high-throughput+ethomics%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Ethoscopes: an open platform for high-throughput ethomics.</a> PLoS Biol. 15 (10), e2003026(2017).</li>
<li>Geissmann, Q., Garcia Rodriguez, L., Beckwith, E. J., Gilestro, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rethomics%3A+an+R+framework+to+analyse+high-throughput+behavioural+data%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Rethomics: an R framework to analyse high-throughput behavioural data.</a> PLoS One. 14 (1), e0209331(2019).</li>
<li>Blackhurst, L., Gilestro, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ethoscopy+and+ethoscope-lab%3A+a+framework+for+behavioural+analysis+to+lower+entrance+barrier+and+aid+reproducibility%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinform+Adv%22%5BJournal%5D)">Ethoscopy and ethoscope-lab: a framework for behavioural analysis to lower entrance barrier and aid reproducibility.</a> Bioinform Adv. 3 (1), vbad132(2023).</li>
<li>gilestrolab/ethoscopy. , 
 <a target="_blank" href="https://github.com/gilestrolab/ethoscopy">https://github.com/gilestrolab/ethoscopy</a> (2025).</li>
<li>Bilder, D., Irvine, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Taking+stock+of+the+Drosophila+research+ecosystem%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Taking stock of the Drosophila research ecosystem.</a> Genetics. 206 (3), 1227-1236 (2017).</li>
<li>Hirth, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+melanogaster+in+the+study+of+human+neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22CNS+Neurol+Disord+Drug+Targets%22%5BJournal%5D)">Drosophila melanogaster in the study of human neurodegeneration.</a> CNS Neurol Disord Drug Targets. 9 (4), 504-523 (2010).</li>
<li>Affleck, J. G., Walker, V. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+as+a+model+for+developmental+toxicology%3A+using+and+extending+the+Drosophotoxicology+model%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Drosophila as a model for developmental toxicology: using and extending the Drosophotoxicology model.</a> Methods Mol Biol. 1965, 139-153 (2019).</li>
<li>Frias, J., Simoes, N. Fruit Fly Potato Culture Media. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFrias%2C+J+%22protocols.io%22">protocols.io</a>. , (2020).</li>
<li>Diegelmann, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Capillary+Feeder+%28CAFE%29+Assay+measures+food+intake+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">The Capillary Feeder (CAFE) Assay measures food intake in Drosophila melanogaster.</a> J Vis Exp. (121), e55024(2017).</li>
<li>Bartholomew, N. R., Burdett, J. M., VandenBrooks, J. M., Quinlan, M. C., Call, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impaired+climbing+and+flight+behaviour+in+Drosophila+melanogaster+following+carbon+dioxide+anaesthesia%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Impaired climbing and flight behaviour in Drosophila melanogaster following carbon dioxide anaesthesia.</a> Sci Rep. 5, 15298(2015).</li>
<li>Gilestro, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Video+tracking+and+analysis+of+sleep+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Video tracking and analysis of sleep in Drosophila melanogaster.</a> Nat Protoc. 7 (5), 995-1007 (2012).</li>
<li>Ardekani, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+GFP+Video+to+Track+3D+Movement+and+Conditional+Gene+Expression+in+Free-Moving+Flies%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Using GFP Video to Track 3D Movement and Conditional Gene Expression in Free-Moving Flies.</a> PLoS One. 7 (7), e40506(2012).</li>
<li>Mackay, T. F. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Drosophila+melanogaster+Genetic+Reference+Panel%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The Drosophila melanogaster Genetic Reference Panel.</a> Nature. 482, 173-178 (2012).</li>
</ol>

Autorka Zuzanna Tomkielska była zatrudniona w Mesosystem S.A., a autorka Ana Casas jest również związana z Mesosystem S.A. Pozostali autorzy deklarują, że badanie zostało przeprowadzone przy braku jakichkolwiek powiązań handlowych lub finansowych, które mogłyby być interpretowane jako potencjalny konflikt interesów.

Przede wszystkim, ustalenie dawki nieśmiertelnej (subletalnej) jest krytycznym krokiem początkowym do przeprowadzenia eksperymentów neurotoksyczności. Gwarantuje to, że muszki pozostają żywotne przez cały czas trwania badania, co pozwala na obserwację efektów behawioralnych i lokomotorycznych bez zakłócającego czynnika śmiertelności. W naszym badaniu ustalono subletalną dawkę frakcji jadu pęcherzycy Physalis na 10 μg/μL. W celu zapewnienia wiarygodnych i powtarzalnych wyników zaleca się co najmniej trzy kontrpró...

Ocena neurotoksyczności ma kluczowe znaczenie dla oceny potencjalnego niekorzystnego wpływu związków środowiskowych i farmaceutycznych na rozwijający się układ nerwowy1. Tradycyjne badania neurotoksyczności opierają się na modelach ssaków, takich jak gryzonie, które są drogie, czasochłonne i etycznie ograniczone2. W związku z tym konieczne są alternatywne modele, które umożliwiają szybkie, wysokoprzepustowe badania przesiewowe neurotoksyczności3. Badania podkreślają, że muszka owocowa stała się potężnym organizmem modelowym do badania neurotoksyczności ze względu na dobrze scharakteryzowaną genetykę, konserwatywne szlaki neurorozwojowe i krótki cykl życiowy 4,5. Wśród behawioralnych punktów końcowych dysfunkcja motoryczna służy jako czuły i mierzalny biomarker upośledzenia neurorozwojowego, umożliwiając wczesne wykrycie efektów neurotoksycznych, które mogą korelować z zaburzeniami neurologicznymi u ludzi6.
Testy lokomotoryczne u much dostarczają wymiernej miary neurotoksyczności i umożliwiają ocenę dawka-odpowiedź, co czyni je istotnymi dla zmniejszenia ryzyka neurotoksyczności u ludzi7. Negatywny test geotaksji (wspinaczka) jest szeroko stosowanym podejściem, w którym muchy instynktownie wspinają się po stuknięciu w dno fiolki, co odzwierciedla ich poziom rozwoju motorycznego, koordynacji i równowagi 8,9. Chociaż metoda ta jest prosta, opłacalna i przydatna do oceny poważnych nieprawidłowości lokomotorycznych i jawnych zaburzeń, zapewnia tylko jednowymiarową ocenę ruchu i może nie mieć czułości w wykrywaniu subtelnych zaburzeń motorycznych, wyrafinowanych zmian i długoterminowego monitorowania behawioralnego objawów wywołanych przez neurotoksyny8. Aby zaradzić tym ograniczeniom, opracowano bardziej zaawansowane technologie śledzenia ruchu, takie jak system Ethoscope10. Ten zautomatyzowany system rejestracji jest wysokowydajnym urządzeniem do śledzenia wideo, zaprojektowanym specjalnie do analizy zachowania much z wysoką precyzją i powtarzalnością11. W przeciwieństwie do konwencjonalnych testów lokomotorycznych, system ten zapewnia ciągłe monitorowanie ruchu w czasie rzeczywistym, wychwytując subtelne nieprawidłowości behawioralne, które tradycyjne testy wspinaczkowe mogą przeoczyć 11,12,13. Technologia ta obejmuje zautomatyzowane śledzenie wideo za pomocą systemu kamer oświetlonych podczerwienią, który w sposób ciągły rejestruje ruchy muchy w wysokiej rozdzielczości, eliminując stronniczość obserwatora i poprawiając odtwarzalność eksperymentów13. Dodatkowo wykrywa mikroruchy, różnicując chodzenie, odpoczynek i drobne ruchy, takie jak pielęgnacja, karmienie lub drgawki, zapewniając bardziej szczegółową analizę zachowań motorycznych13. Możliwe jest długoterminowe monitorowanie behawioralne, co pozwala na ciągłe śledzenie przez dłuższy czas, dzięki czemu idealnie nadaje się do oceny postępujących skutków neurotoksycznych10. Skalowalność i wysoka przepustowość systemu rejestracji wideo umożliwiają równoległe śledzenie wielu much, ułatwiając jednoczesne badania przesiewowe wielu związków neurotoksycznych i chorób genetycznych10. Co więcej, system integruje oprogramowanie typu open source, umożliwiając naukowcom dostosowywanie potoków analiz w oparciu o potrzeby eksperymentalne, w tym cykle snu i czuwania, rytmy okołodobowe i szczegółowe wskaźniki lokomotoryczne10,14. Ostatnie osiągnięcia, takie jak integracja Ethoscopy, frameworka opartego na języku Python, usprawniły analizę danych, poprawiając dostępność i odtwarzalność w badaniach behawioralnych14. Ramy te umożliwiają naukowcom przeprowadzanie bardziej złożonych analiz lokomocji przy jednoczesnym zmniejszaniu barier dla użytkowników niebędących ekspertami. Laboratorium etoskopowe, środowisko oparte na Jupyter, dodatkowo ułatwia bezproblemowe przetwarzanie danych, promując wspólne badania i zapewniając odtwarzalność eksperymentalną14.
Wykorzystując wysokoprzepustową platformę śledzenia wideo wraz z tradycyjnymi testami wspinaczkowymi, badanie to zapewnia kompleksową i czułą ocenę dysfunkcji motorycznej po ekspozycji na neurotoksyczne czynniki rozwojowe. Zdolność do analizy drobnych wad ruchowych sprawia, że jest to potężne narzędzie do badań przesiewowych związków, które zaburzają rozwój neuronalny i koordynację ruchową. Wykorzystanie muszek owocowych do badań przesiewowych pod kątem neurotoksyczności ma kilka zalet, w tym opłacalność i wysoką przepustowość w porównaniu z modelami kręgowców, w przypadku których badania przesiewowe na dużą skalę są często ograniczone ze względu na ograniczenia kosztowe15. Model muchy umożliwia szybkie manipulacje genetyczne w celu naśladowania stanów chorobowych i identyfikacji szlaków molekularnych dotkniętych neurotoksynami16. Chociaż jest prostszy niż układ nerwowy ssaków, muchy zachowują kluczowe konserwatywne szlaki zaangażowane w rozwój neuronalny i kontrolę motoryczną17. Metody śledzenia o wysokiej rozdzielczości, takie jak system nagrywania wideo w czasie rzeczywistym, zwiększają dokładność i odtwarzalność danych, umożliwiając wczesne wykrywanie deficytów motorycznych spowodowanych narażeniem na działanie substancji toksycznych11.
Integracja technologii śledzenia i tradycyjnych testów wspinaczkowych pozwoliła na ciągłe monitorowanie zachowania w wysokiej rozdzielczości, zapewniając solidną i skalowalną metodę wykrywania subtelnych zaburzeń lokomotorycznych wywołanych ekspozycją na neurotoksyny. Połączenie narzędzi genetycznych, krótkiego cyklu życia i zaawansowanej analizy behawioralnej pozycjonuje muszkę owocową jako potężną alternatywę dla modeli kręgowców do badań przesiewowych neurotoksyczności, ostatecznie przyczyniając się do bezpieczniejszego opracowywania leków i lepszej oceny ryzyka środowiskowego.

<table><tbody><tr><td>Folia aluminiowa&nbsp;</td><td>-</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>Niebieski barwnik&nbsp;</td><td>&nbsp; RAYNERA</td><td>-</td><td>Niebieski barwnik Rayners 28ml</td></tr><tr><td>Moduł kamery 2 NoIR</td><td>Malina Pi&nbsp;</td><td>096-4062</td><td>Dostarczony w dniu Mauser.pt</td></tr><tr><td>Bawełniany niedoprzęd</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>BR28205</td><td></td></tr><tr><td>Butelki magazynowe Drosophila</td><td>Firma VWR</td><td>VWRI734-1249</td><td>Butelka Fly Round 60Z</td></tr><tr><td>Fiolki Drosophila</td><td>Firma VWR</td><td>WRI734-2255 powiedział:</td><td></td></tr><tr><td>Szklana szalka Petriego</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>BR455701</td><td></td></tr><tr><td>Mikro naczynia włosowate hematokrytu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>BR749321</td><td></td></tr><tr><td>Karta microSD</td><td>-</td><td>-</td><td>Producent zaleca używanie karty SD z co najmniej 32 GB pamięci do instalacji Raspberry Pi OS</td></tr><tr><td>Zasilacz Micro-USB</td><td>Malina Pi&nbsp;</td><td>096-4585</td><td>Dostarczony w dniu Mauser.pt</td></tr><tr><td>Olej mineralny&nbsp;</td><td>BIO-RAD</td><td>#1632129</td><td></td></tr><tr><td>Pędzlem</td><td>-</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>Salina buforowana fosforanami (PBS)</td><td>komponenty pochodzące od różnych firm</td><td>-</td><td>bufor stosowany do przygotowywania pokarmu dla grupy kontrolnej i stosowany do rozcieńczania próbki; 10 mM pH 7</td></tr><tr><td>Zatyczki do fiolek i butelek Drosophila</td><td>Firma VWR</td><td>VWRI734-2875</td><td></td></tr><tr><td>Zatyczki do fiolek i butelek Drosophila</td><td>Firma VWR</td><td>VWRI734-2673</td><td></td></tr><tr><td>Folia uszczelniająca</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>HS234526C</td><td></td></tr><tr><td>Komputer jednopłytkowy&nbsp; (3 Wzór B)</td><td>Malina Pi&nbsp;</td><td>096-5700</td><td>Dostarczony w dniu Mauser.pt</td></tr><tr><td>Sakroza</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Zobacz materiał S9378</td><td></td></tr><tr><td>Przezroczysta plastikowa słomka</td><td>-</td><td>-</td><td>Dowolna, która jest kompatybilna z etoskopową areną snu (6,5 cm x 0,5 cm)</td></tr></tbody></table>

analiza behawioralna dysfunkcji narządu ruchu u drosophila melanogaster jako odczyt neurotoksyczności

Behavioral Analysis of Locomotor Dysfunction in Drosophila melanogaster as a Readout for Neurotoxicity

Protokół ten przedstawia wysokoprzepustową, opłacalną metodę oceny neurotoksyczności u muszki owocowej (Drosophila melanogaster) poprzez ilościowe określenie dysfunkcji lokomotorycznej. Tradycyjne modele ssaków, choć skuteczne, wymagają dużych zasobów i są ograniczone etycznie, co podkreśla potrzebę alternatywnych modeli in vivo . Obecne podejście integruje klasyczny test wspinaczkowy z platformą monitorowania w czasie rzeczywistym w celu wychwycenia zaburzeń motorycznych u poszczególnych much. Ten połączony system zwiększa czułość, automatyzację i odtwarzalność, zapewniając skalowalną strategię badań neurotoksykologicznych. Krytyczne kroki proceduralne obejmują ustandaryzowane warunki hodowli, staranne znieczulenie i obchodzenie się z nimi w celu zminimalizowania śmiertelności much lub zmian w zachowaniu oraz właściwą kalibrację systemu. Żywienie oparte na mikrokapilarnach umożliwia opcjonalną integrację kwantyfikacji spożycia, uzupełniając analizę lokomotoryczną i umożliwiając ocenę spożycia związków w razie potrzeby. Metoda wspiera monitorowanie zachowań w czasie rzeczywistym i długoterminowe, zmniejsza stronniczość obserwatora i umożliwia codzienną ocenę postępów bez przerywania eksperymentu. Testowanie preferencji świetlnych można włączyć za pomocą pomiarów bezpośrednich. Platforma zapewnia znaczące korzyści w zakresie rozdzielczości behawioralnej, przepustowości i spójności danych. Chociaż brakuje mu możliwości fluorescencji w czasie rzeczywistym, które można znaleźć w niektórych alternatywnych systemach, pozostaje bardzo skuteczny w badaniach behawioralnych na dużą skalę. Protokół ten jest szczególnie cenny dla laboratoriów dążących do oceny neurotoksycznych skutków związków farmaceutycznych, czynników środowiskowych lub modyfikacji genetycznych przy użyciu czułego, powtarzalnego i etycznie korzystnego modelu in vivo .

Przykładowo, protokół ten został wykorzystany do oceny potencjału neurotoksycznego frakcji jadu Physalis physalis. Grupa badaną składały muchy karmione buforem fizjologicznym uzupełnionym roztworem sacharozy (do stężenia końcowego 1 M) oraz badaną frakcją jadu. Grupa kontrolna otrzymała jedynie bufor fizjologiczny i roztwór sacharozy bez badanego związku. Wszystkie eksperymenty przeprowadzono na szczepie W118.
W opisanym метоdzie muchy niepoddane działaniu substancji, stano...

Protokół przedstawia wysokoprzepustową, opłacalną metodę oceny neurotoksyczności u muszki owocowej poprzez kwantyfikację dysfunkcji lokomotorycznej jako alternatywę dla tradycyjnych modeli ssaków. Ma na celu ocenę neurotoksycznego wpływu związków farmaceutycznych, czynników środowiskowych lub modyfikacji genetycznych przy użyciu czułego, powtarzalnego i etycznie korzystnego modelu.

Analiza behawioralna dysfunkcji narządu ruchu u Drosophila melanogaster jako odczyt neurotoksyczności

This protocol presents a high-throughput, cost-effective method for assessing neurotoxicity in the fruit fly (Drosophila melanogaster) by quantifying ...

Celem naszych badań jest opracowanie wysoce opłacalnej i korzystnej pod względem etycznym metody badań przesiewowych związków neurotoksycznych. Tradycyjne metody badań toksykologicznych często opierają się na wirtualnych modelach stawek, które, jak wiemy, są drogie, czasochłonne, a poza tym, jak wiemy, budzą problemy etyczne. Chcieliśmy zbadać, czy jesteśmy w stanie wykryć wczesne oznaki neurotoksyczności przy użyciu alternatywnego modelu, jakim jest Drosophila melanogaster, który jest zarówno czuły, jak i skalowalny. Protokół ten pomaga nam wykrywać fenotypy zachowań, takie jak zmiany wzorców ruchowych i nadpobudliwość, ale także postępujący spadek motoryczny lub pisemne zakłócenia bezpieczeństwa, a także testowane są szerokie preferencje.Zaletą naszego protokołu jest to, że łączy klasyczny test wspinaczkowy z technologią monitorowania w czasie rzeczywistym, co pozwala nam uchwycić subtelne zaburzenia motoryczne, które mogą zostać pominięte. Tradycyjnymi metodami zapewniającymi większą czułość i bardziej precyzyjne dane behawioralne.[Narrator] Na początek delikatnie przenieś muchy do pustej butelki. Umieść butelkę zawierającą muchy w pudełku wypełnionym lodem, upewniając się, że cała butelka jest przykryta. Po minucie delikatnie postukaj w butelkę, aby sprawdzić, czy wszystkie muchy są znieczulone. Przygotuj mniejszy pojemnik wypełniony lodem. Umieść szalkę Petriego lub płaską, czystą powierzchnię na wierzchu lodu, aby stworzyć schłodzoną platformę. Teraz odwróć rurkę nad schłodzoną szalką Petriego i delikatnie postukaj, aby wypuścić muchy na zimną powierzchnię. Ostrożnie przenieść muchy do pustych fiolek. Pozwól muszkom dojść do siebie po znieczuleniu przez 30 minut w kontrolowanym środowisku w temperaturze 25 stopni Celsjusza z 12-godzinnym cyklem światła, ciemności i wilgotności 50%. Następnie, w celu przygotowania paszy mikrokapilarnej, za pomocą pipety ręcznie załaduj 10 mikrolitrów roztworu testowego do każdej probówki mikrokapilarnej, zapewniając stałą objętość we wszystkich próbkach. Dodaj od trzech do pięciu mikrolitrów oleju mineralnego do otwartego końca każdej rurki mikrokapilarnej, aby zapobiec parowaniu i wyciekom podczas eksperymentu. Wprowadzić wstępnie napełnione mikrokapilary przez otwory w bawełnianych zatyczkach fiolek, zapewniając bezpieczne dopasowanie. Umieścić fiolki zawierające muchy w inkubatorze ustawionym na 25 stopni Celsjusza z 12-godzinnym cyklem światła i ciemności pozostawić w inkubatorze na czas trwania eksperymentu. Co 12 godzin przenosić muchy do czystej, pustej fiolki, aby ocenić ich aktywność lokomotoryczną. Odmierz i zaznacz linię w odległości siedmiu centymetrów od dna fiolki za pomocą markera permanentnego. Ten znak będzie służył jako cel wspinaczkowy. Ustaw kamerę lub telefon w stabilnym miejscu, aby rejestrować zachowanie podczas wspinaczki. Zadbaj o odpowiednie oświetlenie i przezroczyste tło, aby zapewnić wyraźną widoczność i analizę. Upewnij się, że konfiguracja eksperymentalna jest zgodna z polem widzenia kamery i rozpocznij nagrywanie. Przejrzyj nagrania wideo i zmierz czas potrzebny każdej muchy na osiągnięcie znaku siedmiu centymetrów. Przygotować mikrokapilary zasilające z próbką i uszczelką z oleju mineralnego, jak pokazano wcześniej. Następnie przygotuj indywidualne komory lokomocji za pomocą przezroczystych plastikowych słomek przyciętych do około sześciu centymetrów długości. Uszczelnij jeden koniec każdej słomki przezroczystą folią, aby uzyskać hermetyczne zamknięcie. W pobliżu uszczelnionego końca słomki utwórz mały otwór, aby wprowadzić mikrokapilę do karmienia, upewniając się, że jest dobrze dopasowana i nie przecieka ani nie przesuwa się podczas testu. Po znieczuleniu i posegregowaniu much, jak pokazano wcześniej, delikatnie umieść jedną znieczuloną muchę w każdej tubce za pomocą cienkiego pędzla. Uszczelnij otwarty koniec każdej rurki przezroczystą folią lub bawełnianą zatyczką, umożliwiając przepływ powietrza, jednocześnie uniemożliwiając ucieczkę. Teraz włóż wstępnie napełnioną mikrokapilę do każdej przygotowanej komory przez wyznaczony otwór. Umieść zmontowane probówki na arenie testowej, upewniając się, że mikrokapilary pozostają dostępne do codziennej wymiany. Umieść cały zestaw w komorze utrzymywanej w temperaturze 25 stopni Celsjusza z 12-godzinnym cyklem światła i wilgotności 50%. Podłącz urządzenie do lokalnego systemu śledzenia lub sieci. Uzyskaj dostęp do platformy oprogramowania i znajdź urządzenie przypisane do eksperymentu. Upewnij się, że system prawidłowo śledzi każdą muchę na podstawie znaczników wizualnych. Wprowadź wszystkie metadane eksperymentalne i rozpocznij rejestrowanie testu. Zdolność wspinaczkowa oceniona za pomocą ujemnego testu geotaksji po 24 i 48 godzinach wykazuje podobną wydajność między grupą kontrolną i leczoną po 24 godzinach, co wskazuje na brak natychmiastowych deficytów motorycznych. Po 48 godzinach leczone muchy potrzebują prawie dwa razy więcej czasu, aby się wznieść w porównaniu z grupą kontrolną, co świadczy o znacznym upośledzeniu motorycznym. Ciągłe śledzenie aktywności ujawnia, że leczone muchy początkowo wykazują zwiększony ruch, ale ich aktywność gwałtownie spada po 12 godzinach, co sugeruje wczesną nadpobudliwość, a następnie zmniejszoną funkcję motoryczną. Po 24 do 40 godzinach leczone muchy wykazują zmniejszony ruch w porównaniu z grupą kontrolną. Ogólnie rzecz biorąc, leczone muchy mają około 20% zmniejszoną aktywność w ciągu 40 godzin. Leczone muchy początkowo reagowały opóźnieniem na sygnały świetlne, po których następowało przejściowe wyrównanie okołodobowe, ale stopniowo traciły rytmiczność o 48 godzin, prawdopodobnie w wyniku deficytu lokomocji. Leczone muchy wolą jasne strefy bardziej niż kontrole.

behavioral-analysis-locomotor-dysfunction-drosophila-melanogaster-as

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Testy behawioralne służące do pomiaru funkcji lokomocyjnych, zdolności uczenia się i pamięci u Drosophila.

Ocena deficytów motorycznych, uczenia się i pamięci w modelach neurodegeneracji u Drosophila

Drosophila melanogaster to genetycznie i behawioralnie podatny system modelowy, który od ponad wieku jest wykorzystywany do zrozumienia molekularnych i komórkowych podstaw wielu ważnych procesów biologicznych 1. Drosophila została szeroko wykorzystana w celu uzyskania wglądu w genetyczne podstawy zachowania much.

Metody oceny zachowania Drosophila

Tu opisujemy dwa testy, które zostały opracowane w celu badania związanej z wiekiem neurodegeneracji neuronów dopaminergicznych (DA) w Drosophila: test ujemnej geotaksji indukowanej wspinaczkami/skurczem, który pozwala badać efekty funkcjonalne zwyrodnienia neuronów DA oraz immunobarwienie na hydroksylazę tyrozyny, które jest używane do identyfikacji i liczenia neuronów DA w całych preparatach mózgu.

Ocena fenotypow neurodegeneracyjnych w Drosophila neuronach dopaminergicznych poprzez testy wspinaczkowe i immunobarwienie całego mózgu

Obwód żywieniowy u larw Drosophila melanogaster służy prostemu, ale potężnemu modelowi, który pozwala na skorelowanie zmian w tempie karmienia ze zmianami w obwodach nerwowych stomatogastrycznych. Obwód ten składa się z centralnych neuronów serotoninergicznych, które wysyłają projekcje do haczyków ustnych, a także do jelita przedniego.

Analiza funkcjonalna obwodu żerowania larw u Drosophila

Drosophila melanogaster są przydatne w badaniu manipulacji genetycznych lub środowiskowych, które wpływają na zachowania takie jak spontaniczna aktywność lokomotoryczna. Tutaj opisujemy protokół, który wykorzystuje monitory z wiązkami podczerwieni i oprogramowanie do analizy danych do ilościowego określania spontanicznej aktywności lokomotorycznej.

Oznaczanie spontanicznej aktywności lokomotorycznej u Drosophila melanogaster

Korzystając z kamery internetowej oraz kombinacji darmowych i niedrogich programów, wzorce lokomotyw u Drosophila melanogaster mogą być analizowane w celu wykrycia różnic w prędkości, odległości i czasie różnych aktywności motorycznych.

Tania metoda analizy aktywności i ruchu podobnego do napadów u Drosophila

Choroba Parkinsona jest zaburzeniem neurodegeneracyjnym, które wynika ze zwyrodnienia neuronów dopaminergicznych w ośrodkowym układzie nerwowym, powodując zaburzenia lokomocji. Rotenon modeluje chorobę Parkinsona u Drosophila. W artykule przedstawiono dwa testy, które charakteryzują zarówno spontaniczne, jak i wywołane przez przerażenie niedobory lokomocji spowodowane rotenonem.

Metody charakteryzowania spontanicznej i indukowanej przez odstraszenie lokomocji w modelu choroby Parkinsona wywołanym rotenonem Drosophila

Tutaj opisujemy prostą i powszechnie dostępną technikę mikroskopową, która pozwala uzyskać wysokiej jakości cyfrowe wideo z fenotypami dorosłych i larw zmutowanych Drosophila z perspektywy bocznej.

Akwizycja wysokiej jakości cyfrowego wideo larw Drosophila i zachowań dorosłych z perspektywy bocznej

Przedstawiamy zoptymalizowany, niedrogi i wiarygodny test negatywnej geotaksji u Drosophila melanogaster jako model zaburzeń neurodegeneracyjnych. Będąc bardziej wrażliwym na łagodne wady narządu ruchu, test ten pomoże w badaniach przesiewowych pod kątem potencjalnych interakcji genetycznych i celów leków.

Analiza ilościowa wad wspinaczkowych w modelu Drosophila zaburzeń neurodegeneracyjnych

Ten krok po kroku protokół analizuje zachowanie Drosophila w ujemnej geotaksji za pomocą zautomatyzowanego systemu wielocylindrowego, który pomieści setki much i synchronizuje ich działania za pomocą silnika elektrycznego. Po synchronizacji zachowanie ujemnej geotaksji much jest badane, nagrywane cyfrowo i analizowane za pomocą oprogramowania RflyDetection.

Automatyczne, szybkie, iteracyjne badanie ujemnej geotaksji do analizy zachowania wspinaczy u dorosłych w modelu Drosophila neurodegeneracji

Obecny protokół ocenia aktywność lokomotoryczną Drosophila poprzez śledzenie i analizowanie ruchu much na ręcznie wykonanej arenie za pomocą oprogramowania typu open source Fiji, kompatybilnego z wtyczkami do segmentacji pikseli każdej klatki na podstawie nagrania wideo w wysokiej rozdzielczości w celu obliczenia parametrów prędkości, odległości itp.

Prosta technika oznaczania aktywności lokomotorycznej u Drosophila

Poznaj metodę analizy behawioralnej dysfunkcji ruchowej u Drosophila melanogaster do wykrywania neurotoksyczności. Protokół łączy test wspinaczkowy z monitorowaniem w czasie rzeczywistym, umożliwiając wczesne wykrywanie zaburzeń motorycznych.

Analiza behawioralna dysfunkcji narządu ruchu u Drosophila melanogaster jako odczyt neurotoksyczności

Przeglądaj więcej filmów