Metody in vitro Rekonstrukcja sieci cytoszkieletu w oddzielonych fazowo gigantycznych pęcherzykach jednowarstwowych (GUV)

Nasze badania sprawdzają, czy minimalna syntetyczna komórka może replikować kluczowe funkcje biologiczne, koncentrując się na projektowaniu błon, które ściśle naśladują strukturę i zachowanie naturalnych błon komórkowych.

Do tworzenia pęcherzyków rozdzielanych fazowo stosuje się różne technologie i wykorzystuje te mikronośniki do różnych zastosowań. Technologie te to na przykład dwuwarstwowe cDICE i elektroformacja. Jednym z głównych wyzwań jest utrzymanie funkcjonalności białka przy jednoczesnym generowaniu separacji faz w pęcherzyku błonowym. Wzrost temperatury może zdestabilizować białka i inne biomolekuły.

[Narrator] Na początek zaopatrz się w fiolki z biotynylowanymi i niebiotynylowanymi mieszankami lipidów. Rozpuść 50 mikrolitrów każdej 32-milimolowej mieszanki lipidów w chloroformie. Następnie suszyć je w dwóch szklanych fiolkach pod strumieniem azotu przez około 15 minut. Umieścić szklane fiolki w eksykatorze. Przechowuj je w próżni przez około 30 minut, aby usunąć resztki chloroformu. Teraz rozproszyć wysuszone folie lipidowe w mieszaninie 20 mikrolitrów dekanu i 500 mikrolitrów oleju mineralnego w tych samych fiolkach, aby uzyskać końcowe stężenie lipidów 3,2 milimola. Za pomocą sonikatora do kąpieli poddaj obie mieszaniny sonikacji w temperaturze około 50 stopni Celsjusza przez 30 minut. Następnie przenieś mieszaniny lipidów i olejów do dwóch probówek. Podczas inkubacji mieszanin przygotuj wewnętrzną mieszankę kapsułkującą białka. Aby przygotować mieszaninę białek FtsZ, dodaj wymienione odczynniki do końcowej objętości 10 mikrolitrów w probówce. Trzymaj mieszaninę na lodzie do czasu użycia. Do kapsułkowania wiązek aktyny należy najpierw przygotować 10 mikrolitrów Actin Master Mix, zawierającego 86% G-aktyny, 10% aktyny ATTO 488 i 4% biotynylowanej aktyny w wodzie. Trzymaj mieszankę na lodzie i chroń ją przed światłem. Tuż przed użyciem przygotuj końcowy roztwór aktyny, dodając kolejno jodiksanol, wodę, NeutrAvidin, BSA, Ficoll 70, 10x bufor polimeryzacyjny aktyny, A-Mix, faszynę i ATP. Dobrze wymieszaj i użyj pięciu mikrolitrów do kapsułkowania. Aby kapsułkować FtsZ, należy odpipetować 500 mikrolitrów buforu reakcyjnego FtsZ do 1,5-mililitrowej plastikowej probówki. Delikatnie dodaj 200 mikrolitrów mieszanki lipidów i olejów, aby utworzyć interfejs olej-woda. W drugiej tubie dodaj 200 mikrolitrów mieszanki lipidów i olejów. Inkubuj tę probówkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 10 minut. Następnie odpipetuj pięć mikrolitrów mieszanki białkowej FtsZ do inkubowanej rurki lipidowo-olejowej, pozwalając jej zatonąć w postaci kropelki. Delikatnie postukaj w probówkę pięć do sześciu razy, aż roztwór stanie się mętny, aby utworzyć emulsję. Ostrożnie odpipetować tę emulsję na wierzch przygotowanej wcześniej granicy faz olej-woda. Następnie odwirować próbkę o masie 6 000 g przez 30 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Schłodzić próbkę do temperatury pokojowej przez 30 minut. Teraz za pomocą pipety delikatnie usuń wierzchnią warstwę oleju, pozostawiając od 100 do 200 mikrolitrów roztworu do obrazowania. Przyciąć końcówkę pipety pod kątem. Użyj go, aby pobrać od 50 do 100 mikrolitrów roztworu GUV z dna probówki. Aby zakapsułkować aktynę bezpośrednio w 96-dołkowej płytce, połącz 198 mikrolitrów dwumolowej glukozy z 802 mikrolitrami wody, aby przygotować zewnętrzny roztwór glukozy pasujący do osmolarności wewnętrznej mieszanki aktyny. Pasywować studzienkę na 96-dołkowej płytce, dodając do dołka 100 mikrolitrów BSA o gramaturze 10 gramów na litr. Po 10-15-minutowej inkubacji przemyć studzienkę pięć razy 100 mikrolitrami roztworu zewnętrznego. Pozostaw 100 mikrolitrów końcowego prania. Teraz delikatnie dodaj 50 mikrolitrów mieszanki lipidów i olejów do studzienki, opierając pipetę na ścianie bocznej, aby zapewnić prawidłowe ułożenie warstw na wierzchu roztworu zewnętrznego. W osobnej probówce dodaj 100 mikrolitrów lipidów w oleju i inkubuj. Dodaj 2,5 mikrolitra końcowego roztworu aktyny do inkubowanej rurki lipidowo-olejowej, pozwalając jej zatonąć w postaci kropelki. Delikatnie postukaj w spód rurki 10 do 20 razy, aż mieszanina stanie się mętna. Delikatnie odpipetować emulsję znajdującą się w środku monowarstwy oleju w studni, nie przerywając granic faz. Następnie odwirować 96-dołkową płytkę o masie 200 g przez 20 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Pozwól płytce ostygnąć do temperatury pokojowej przez 30 minut przed obrazowaniem. Uzyskano gigantyczne pęcherzyki jednowarstwowe (GUV) z błonami wymieszanymi na nieuporządkowane i uporządkowane domeny cieczowe oraz wysoką wydajność pęcherzyków o wielkości od 5 do 30 mikrometrów. Sieci FtsZ zostały zrekapitulowane w obrębie GUV i preferencyjnie zlokalizowane w nieuporządkowanych domenach błonowych w obecności GTP i Ficoll 70. Sieci aktynowe, po odtworzeniu, wyglądały jak cienkie wiązki przylegające do błony i tworzące rzadkie struktury przypominające pajęczynę. Bez biotynylowanych lipidów wiązki aktyny nie przylegały do błony, a zamiast tego pozostawały sztywne i proste w świetle pęcherzyka. W wyższych warunkach wirowania pęcherzyki zawierające miozynę aktynową agregowały się w upakowaną strukturę przypominającą tkankę w dołku produkcyjnym.