Name: Badanie cech anatomicznych komórek zwojowych siatkówki pod wpływem ekscytotoksyczności wywołanej kwasem N-metylo-D-asparaginowym (NMDA) (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-09-19T12:40:00.000+00:00
Duration: 7 min 11 s
Description: Poznaj metodę genetycznego znakowania fosfatazą zasadową do badania degeneracji komórek zwojowych siatkówki myszy pod wpływem ekscytotoksyczności NMDA. Odkryj nowe fenotypy umierających neuronów.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Prace te były wspierane przez granty z National Institutes of Health-National Eye Institute dla C.A.M. (EY024376) oraz częściowo przez National Eye Institute Vision Core Grants P30EY028102 (UTHealth). Dziękujemy również za wsparcie finansowe ze strony Stephen Lasher Endowment (UTHealth) i Raye White Endowment (UTHealth).

Wszystkie procedury na zwierzętach były zgodne z polityką amerykańskiej służby zdrowia publicznego dotyczącą humanitarnej opieki i wykorzystywania zwierząt laboratoryjnych i zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Wykorzystania Zwierząt w The University of Texas McGovern Medical School w Houston. Składy roztworów są wymienione w Tabeli materiałów.
1. Wstrzyknięcie tamoksyfenu
<ol>
	<li>Zmieszać 30 mg tamoksyfenu z 30 μl etanolu. W wodzie poniżej wrzenia podgrzej 1 ml oleju z nasion słonecznika i mieszaninę tamoksyfenu i etanolu.</li>
	<li>Po rozpuszczeniu tamoksyfenu w etanolu należy szybko dodać 1 ml podgrzanego oleju z nasion słonecznika do roztworu tamoksyfenu. Dobrze wymieszać przez pipetowanie.</li>
	<li>Wykorzystano myszy obu płci w różnym wieku, od 2 do 6 miesięcy. Roztwór tamoksyfenu należy wstrzyknąć dootrzewnowo w dawce 100 μg/g masy ciała za pomocą strzykawki insulinowej. Określić liczbę wstrzyknięć tamoksyfenu na podstawie linii myszy. W tym protokole tamoksyfen podawano raz na dobę przez cztery kolejne dni. UWAGA: Ponieważ roztwór tamoksyfenu jest zmieszany z gęstym olejem, trudno jest obchodzić się z nim za pomocą strzykawki z odłączaną igłą. Dlatego do wstrzykiwań tamoksyfenu preferowana jest strzykawka insulinowa z dołączoną igłą.</li>
	<li>Trzymaj mysz w grupach nie większych niż 5 sztuk w indywidualnie wentylowanych klatkach. do momentu wstrzyknięcia NMDA.</li>
</ol>
2. Wstrzyknięcie roztworu NMDA do oczu myszy
<ol>
	<li>Przygotować 20 mM roztworu NMDA w sterylnym 1x PBS. Umyj nano-wtryskiwacz igłą 35G dołączoną przy użyciu 100% etanolu 20x, a następnie umyj sterylną ultraczystą wodą dodatkowe 20x. Napełnij nano-wstrzykiwacz 1 μl roztworu NMDA.</li>
	<li>Znieczulić mysz przez dootrzewnowe wstrzyknięcie ketaminy/ksylazyny w mieszaninie roztworu 1X PBS (80/10 mg na kg masy ciała). Oceń utratę przytomności na podstawie odruchowej reakcji wycofania się na szczypanie ogona i palców u nóg.</li>
	<li>Umieść znieczuloną mysz na mikroskopie stereoskopowym. Ustaw mysz tak, aby prawe oko było skierowane do góry, a nos skierowany w prawą stronę. Nałóż kroplę 0,5% roztworu chlorowodorku proparakainy na prawą gałkę oczną w celu znieczulenia miejscowego.</li>
	<li>Użyj sterylnej igły do wstrzykiwań 30G, aby nakłuć rąbek w pozycji godziny 7, tworząc mały otwór. Monitorować położenie i kierunek igły pod mikroskopem stereoskopowym. Upewnij się, że rozmiar igły do wstrzykiwań jest nieco większy niż igła do wstrzykiwań nano, aby umożliwić łatwe wprowadzenie.</li>
	<li>Ostrożnie wyjąć igłę do wstrzykiwań z gałki ocznej i odpowiednio ją zutylizować. Użyj mikroskopu stereoskopowego do orientacji, wprowadź igłę nanoiniekcji do ciała szklistego przez rąbek pod kątem 45°.</li>
	<li>Powoli wstrzyknąć 1 μl roztworu NMDA do ciała szklistego. Po wstrzyknięciu należy trzymać igłę do nanoiniekcji w ciele szklistym przez około 10 sekund, aby zapobiec wypływowi wstrzykniętego roztworu.</li>
	<li>Ostrożnie i powoli wyjąć igłę do wstrzykiwań nano z oka. Nałóż 0,5% maści okulistycznej z erytromycyną na rogówkę wstrzykniętego oka.</li>
	<li>Umieść mysz w klatce na poduszce grzewczej. Monitoruj mysz co 15 minut, aż w pełni wyzdrowieje ze znieczulenia. Trzymaj mysz przez jeden do dwóch tygodni, aż do pobrania tkanki.</li>
</ol>
3. Pobieranie tkanek i barwienie fosfatazą alkaliczną (AP)
<ol>
	<li>Poddaj mysz eutanazji z uduszeniem CO2, a następnie zwichnięciem szyjki macicy. Ostrożnie przetnij mięśnie łączące się z gałką oczną i nerwem wzrokowym za pomocą nożyczek Vanna.</li>
	<li>Gałka oczna została następnie pobrana za pomocą kleszczy i przeniesiona do oddzielnych oznakowanych probówek o pojemności 2,0 ml.</li>
	<li>Umocuj gałki oczne w 10% neutralnej buforowanej formalinie na 10 minut w temperaturze pokojowej. Zamontuj siatkówki płasko na filtrze membranowym z azotanu celulozy, jak opisano poniżej.<ol>
		<li>Przenieś gałki oczne na 10-centymetrowe szalki Petriego zawierające 1x PBS. Przytrzymaj dowolną tkankę mięśniową przyczepioną do gałki ocznej za pomocą kleszczy. Utworzyć otwór w rąbku za pomocą igły iniekcyjnej 30G. Włóż końcówkę nożyczek Vanna do otworu i przetnij wokół ora serrata. Zdejmij soczewkę z muszli ocznej za pomocą kleszczy.</li>
		<li>Wykonaj 3-4 nacięcia na muszli ocznej i użyj kleszczyków, aby przytrzymać RPE i delikatnie usuń RPE z siatkówki.</li>
		<li>Wytnij mały kawałek filtra membranowego z azotanu celulozy i namocz go w 1x PBS. Umieść izolowaną siatkówkę na filtrze. Delikatnie popchnij peryferyjny obszar siatkówki końcówką cienkiego pędzla, aby przymocować krawędź siatkówki do filtra.</li>
		<li>Przytrzymaj krawędź filtra i powoli wyciągnij go z 1x PBS, upewniając się, że siatkówka pozostaje przymocowana i spłaszcza się na filtrze. Umieść siatkówkę/filtr na ręczniku papierowym na 1 minutę, aby przymocować przymocowaną siatkówkę do filtra.</li>
		<li>Przenieś siatkówkę/filtr z powrotem na szalkę Petriego z 1x PBS. Ostrożnie usuń wszelkie zanieczyszczenia, włosy i ciało szkliste z siatkówki za pomocą kleszczy i/lub cienkiego pędzla, tak bardzo, jak to możliwe. Aby odróżnić siatkówki z wtryskiem i bez iniekcji, przycinaj filtry w różnych kształtach.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przenieś siatkówkę/filtr z powrotem na szalkę Petriego. Utrwal siatkówkę w 10% neutralnej buforowanej formalinie przez 5 minut w temperaturze pokojowej z delikatnym mieszaniem.</li>
	<li>Przygotować łaźnię wodną o temperaturze 65 °C. Rozgrzej 30 ml 1x PBS w szklanej zlewce o pojemności 50 ml. Przenieś siatkówkę/filtry bezpośrednio do podgrzanego 1x PBS. Inkubować siatkówki w temperaturze 65°C przez 30 minut. UWAGA: Obróbka cieplna dezaktywuje endogenną aktywność AP, co powoduje barwienie tła w siatkówce. Bardzo ważne jest, aby leczyć siatkówkę w podgrzanym roztworze, aby skutecznie wyeliminować to tło.</li>
	<li>Po obróbce cieplnej przenieść siatkówki na szalkę Petriego o średnicy 30 mm zawierającą bufor AP (100 mM Tris, pH 9,5, 100 mM NaCl, 50 mM MgCl2).</li>
	<li>Inkubować siatkówki w buforze AP w temperaturze pokojowej przez 5 minut, delikatnie mieszając. UWAGA: Ten krok powoduje wymianę buforu w siatkówce z 1x PBS na bufor AP, zapobiegając wytrącaniu się substancji chemicznych podczas opracowywania koloru.</li>
	<li>Zastąp bufor AP roztworem barwiącym (30 μl 10 mg/ml BCIP i 60 μl 10 mg/ml NBP w 10 ml buforu AP).</li>
	<li>Umieść szalkę Petriego w pudełku z wyłączeniem światła. Rozwijać reakcję AP w temperaturze pokojowej przez 1 do 2 dni z delikatnym mieszaniem, aż intensywność barwienia AP będzie zadowalająca do obrazowania.</li>
	<li>Zatrzymaj reakcję, przemłukując siatkówki 1x PBS przez 5 minut, 2x, w temperaturze pokojowej z delikatnym mieszaniem.</li>
	<li>Utrwalaj siatkówki 10% neutralną buforowaną formaliną przez 10 minut w temperaturze pokojowej z delikatnym mieszaniem.</li>
	<li>Myj siatkówki 1x PBS przez 5 minut, 3x, w temperaturze pokojowej z delikatnym mieszaniem. Odwodnić siatkówki, inkubując je w 30% etanolu, a następnie w 50% etanolu przez 30 minut każda w temperaturze pokojowej z delikatnym mieszaniem.</li>
	<li>Za pomocą cienkiego pędzla delikatnie usuń siatkówki z bibuły filtracyjnej. Odwodnić siatkówki bez filtra w 70% etanolu przez 30 minut, a następnie dwie 30-minutowe inkubacje w 100% etanolu w temperaturze pokojowej z delikatnym mieszaniem.</li>
	<li>Oczyść siatkówki w szklanej szalce Petriego roztworem oczyszczającym benzylanu benzylu/alkoholu benzylowego (2:1, v/v) przez 30 minut do 2 godzin w temperaturze pokojowej, delikatnie mieszając. UWAGA: Ta procedura oczyszczania nie powinna być wykonywana przez noc, ponieważ długotrwała inkubacja może często powodować utratę barwienia AP. Roztwór czyszczący może stopić plastik, dlatego zabieg należy wykonać w szklanym pojemniku.</li>
	<li>Aby zamontować siatkówki na szkiełku podstawowym, należy przykleić do szkiełka taśmę dwustronną, aby stworzyć platformę dla szkiełka nakrywkowego i siatkówki. Umieść siatkówki na szkiełku, wypełnij przestrzeń roztworem czyszczącym, nałóż szkiełko nakrywkowe i uszczelnij szkiełko lakierem do paznokci, aby zabezpieczyć siatkówkę i szkiełko nakrywkowe.</li>
	<li>Zobrazuj siatkówki barwione AP za pomocą mikroskopu Zeiss Apotome.</li>
</ol>

<ol><li>Blennow, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Traumatic+brain+injuries%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Dis+Primers%22%5BJournal%5D)">Traumatic brain injuries.</a> Nat Rev Dis Primers. 2, 16084(2016).</li>
<li>Zetterberg, H., Blennow, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluid+biomarkers+for+mild+traumatic+brain+injury+and+related+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurol%22%5BJournal%5D)">Fluid biomarkers for mild traumatic brain injury and related conditions.</a> Nat Rev Neurol. 12 (10), 563-574 (2016).</li>
<li>Mohan, K., Kecova, H., Hernandez-Merino, E., Kardon, R. H., Harper, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinal+ganglion+cell+damage+in+an+experimental+rodent+model+of+blast-mediated+traumatic+brain+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Retinal ganglion cell damage in an experimental rodent model of blast-mediated traumatic brain injury.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 54 (5), 3440-3450 (2013).</li>
<li>Lund, B. J., Rule, G. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pressure+wave+dosimetry+for+%26%2334%3BRetinal+ganglion+cell+damage+in+an+experimental+rodent+model+of+blast-mediated+traumatic+brain+injury%26%2334%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Pressure wave dosimetry for &#34;Retinal ganglion cell damage in an experimental rodent model of blast-mediated traumatic brain injury&#34.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 55 (3), 1348-1349 (2014).</li>
<li>Peterson, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinal+Ganglion+Cell+Axon+Regeneration+Requires+Complement+and+Myeloid+Cell+Activity+within+the+Optic+Nerve%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Retinal Ganglion Cell Axon Regeneration Requires Complement and Myeloid Cell Activity within the Optic Nerve.</a> J Neurosci. 41 (41), 8508-8531 (2021).</li>
<li>Boccuni, I., Fairless, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinal+Glutamate+Neurotransmission%3A+From+Physiology+to+Pathophysiological+Mechanisms+of+Retinal+Ganglion+Cell+Degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Life%22%5BJournal%5D)">Retinal Glutamate Neurotransmission: From Physiology to Pathophysiological Mechanisms of Retinal Ganglion Cell Degeneration.</a> Life. 12 (5), 638(2022).</li>
<li>Shen, Y., Luo, X., Liu, S., Nawy, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rod+bipolar+cells+dysfunction+occurs+before+ganglion+cells+loss+in+excitotoxin-damaged+mouse+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Dis%22%5BJournal%5D)">Rod bipolar cells dysfunction occurs before ganglion cells loss in excitotoxin-damaged mouse retina.</a> Cell Death Dis. 10 (12), 905(2019).</li>
<li>Lambuk, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dose-dependent+effects+of+NMDA+on+retinal+and+optic+nerve+morphology+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Dose-dependent effects of NMDA on retinal and optic nerve morphology in rats.</a> Int J Ophthalmol. 12 (5), 746-753 (2019).</li>
<li>Asami, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-dependent+changes+in+the+severity+of+capillary+degeneration+in+rat+retina+following+N-methyl-D-aspartate-induced+neurotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Age-dependent changes in the severity of capillary degeneration in rat retina following N-methyl-D-aspartate-induced neurotoxicity.</a> Curr Eye Res. 40 (5), 549-553 (2015).</li>
<li>Siliprandi, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((N-methyl-D-aspartate-induced+neurotoxicity+in+the+adult+rat+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Vis+Neurosci%22%5BJournal%5D)">N-methyl-D-aspartate-induced neurotoxicity in the adult rat retina.</a> Vis Neurosci. 8 (6), 567-573 (1992).</li>
<li>Chidlow, G., Osborne, N. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rat+retinal+ganglion+cell+loss+caused+by+kainate%2C+NMDA+and+ischemia+correlates+with+a+reduction+in+mRNA+and+protein+of+Thy-1+and+neurofilament+light%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Rat retinal ganglion cell loss caused by kainate, NMDA and ischemia correlates with a reduction in mRNA and protein of Thy-1 and neurofilament light.</a> Brain Res. 963 (1-2), 298-306 (2003).</li>
<li>Shi, J. M., Jiang, Y. Q., Liu, X. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphological+changes+of+retina+after+N-methyl-D-aspartate+induced+damage+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Zhong+Nan+Da+Xue+Xue+Bao+Yi+Xue+Ban%22%5BJournal%5D)">Morphological changes of retina after N-methyl-D-aspartate induced damage in rats.</a> Zhong Nan Da Xue Xue Bao Yi Xue Ban. 29 (3), 287-291 (2004).</li>
<li>Nakazawa, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+N-methyl-D-aspartate-induced+retinal+ganglion+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Nippon+Ganka+Gakkai+Zasshi%22%5BJournal%5D)">Mechanism of N-methyl-D-aspartate-induced retinal ganglion cell death.</a> Nippon Ganka Gakkai Zasshi. 113 (11), 1060-1070 (2009).</li>
<li>Shen, Y., Liu, X. L., Yang, X. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((N-methyl-D-aspartate+receptors+in+the+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">N-methyl-D-aspartate receptors in the retina.</a> Mol Neurobiol. 34 (3), 163-179 (2006).</li>
<li>Bai, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NMDA+receptor+subunits+have+different+roles+in+NMDA-induced+neurotoxicity+in+the+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Brain%22%5BJournal%5D)">NMDA receptor subunits have different roles in NMDA-induced neurotoxicity in the retina.</a> Mol Brain. 6, 34(2013).</li>
<li>Cull-Candy, S., Brickley, S., Farrant, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NMDA+receptor+subunits%3A+diversity%2C+development+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">NMDA receptor subunits: diversity, development and disease.</a> Curr Opin Neurobiol. 11 (3), 327-335 (2001).</li>
<li>Wang, J. X., Furukawa, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissecting+diverse+functions+of+NMDA+receptors+by+structural+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">Dissecting diverse functions of NMDA receptors by structural biology.</a> Curr Opin Struct Biol. 54, 34-42 (2019).</li>
<li>Chou, T. H., Kang, H., Simorowski, N., Traynelis, S. F., Furukawa, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+insights+into+assembly+and+function+of+GluN1-2C%2C+GluN1-2A-2C%2C+and+GluN1-2D+NMDARs%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Structural insights into assembly and function of GluN1-2C, GluN1-2A-2C, and GluN1-2D NMDARs.</a> Mol Cell. 82 (23), 4548-4563.e4 (2022).</li>
<li>Tran, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-Cell+Profiles+of+Retinal+Ganglion+Cells+Differing+in+Resilience+to+Injury+Reveal+Neuroprotective+Genes%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Single-Cell Profiles of Retinal Ganglion Cells Differing in Resilience to Injury Reveal Neuroprotective Genes.</a> Neuron. 104 (6), 1039-1055.e12 (2019).</li>
<li>Yan, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+Retinal+Cell+Atlas%3A+Molecular+Identification+of+over+Sixty+Amacrine+Cell+Types%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Mouse Retinal Cell Atlas: Molecular Identification of over Sixty Amacrine Cell Types.</a> J Neurosci. 40 (27), 5177-5195 (2020).</li>
<li>Guo, C., Ma, Y. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+Permeable-AMPA+Receptors+and+Excitotoxicity+in+Neurological+Disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Neural+Circuits%22%5BJournal%5D)">Calcium Permeable-AMPA Receptors and Excitotoxicity in Neurological Disorders.</a> Front Neural Circuits. 15, 711564(2021).</li>
<li>Lucas, D. R., Newhouse, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+toxic+effect+of+sodium+L-glutamate+on+the+inner+layers+of+the+retina%5BTitle%5D)+AND+%22AMA+Arch+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">The toxic effect of sodium L-glutamate on the inner layers of the retina.</a> AMA Arch Ophthalmol. 58 (2), 193-201 (1957).</li>
<li>Karl, M. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stimulation+of+neural+regeneration+in+the+mouse+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Stimulation of neural regeneration in the mouse retina.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (49), 19508-19513 (2008).</li>
<li>DeParis, S., Caprara, C., Grimm, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intrinsically+photosensitive+retinal+ganglion+cells+are+resistant+to+N-methyl-D-aspartic+acid+excitotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Vis%22%5BJournal%5D)">Intrinsically photosensitive retinal ganglion cells are resistant to N-methyl-D-aspartic acid excitotoxicity.</a> Mol Vis. 18, 2814-2827 (2012).</li>
<li>Fogo, G. M., Shuboni-Mulligan, D. D., Gall, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Melanopsin-Containing+ipRGCs+Are+Resistant+to+Excitotoxic+Injury+and+Maintain+Functional+Non-Image+Forming+Behaviors+After+Insult+in+a+Diurnal+Rodent+Model%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Melanopsin-Containing ipRGCs Are Resistant to Excitotoxic Injury and Maintain Functional Non-Image Forming Behaviors After Insult in a Diurnal Rodent Model.</a> Neuroscience. 412, 105-115 (2019).</li>
<li>Cui, Q., Ren, C., Sollars, P. J., Pickard, G. E., So, K. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+injury+resistant+ability+of+melanopsin-expressing+intrinsically+photosensitive+retinal+ganglion+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The injury resistant ability of melanopsin-expressing intrinsically photosensitive retinal ganglion cells.</a> Neuroscience. 284, 845-853 (2015).</li>
<li>Christensen, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Susceptibility+of+Retinal+Ganglion+Cells+to+Glutamatergic+Excitotoxicity+Is+Type-Specific%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The Susceptibility of Retinal Ganglion Cells to Glutamatergic Excitotoxicity Is Type-Specific.</a> Front Neurosci. 13, 219(2019).</li>
<li>Yang, N., Young, B. K., Wang, P., Tian, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Susceptibility+of+Retinal+Ganglion+Cells+to+Optic+Nerve+Injury+is+Type+Specific%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">The Susceptibility of Retinal Ganglion Cells to Optic Nerve Injury is Type Specific.</a> Cells. 9 (3), 677(2020).</li>
<li>Badea, T. C., Nathans, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+analysis+of+neuronal+morphologies+in+the+mouse+retina+visualized+by+using+a+genetically+directed+reporter%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Quantitative analysis of neuronal morphologies in the mouse retina visualized by using a genetically directed reporter.</a> J Comp Neurol. 480 (4), 331-351 (2004).</li>
<li>Badea, T. C., Nathans, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphologies+of+mouse+retinal+ganglion+cells+expressing+transcription+factors+Brn3a%2C+Brn3b%2C+and+Brn3c%3A+analysis+of+wild+type+and+mutant+cells+using+genetically-directed+sparse+labeling%5BTitle%5D)+AND+%22Vision+Res%22%5BJournal%5D)">Morphologies of mouse retinal ganglion cells expressing transcription factors Brn3a, Brn3b, and Brn3c: analysis of wild type and mutant cells using genetically-directed sparse labeling.</a> Vision Res. 51 (2), 269-279 (2011).</li>
<li>Jamal, L., Kiyama, T., Mao, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetically+Directed+Sparse+Labeling+System+for+Anatomical+Studies+of+Retinal+Ganglion+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Genetically Directed Sparse Labeling System for Anatomical Studies of Retinal Ganglion Cells.</a> Methods Mol Biol. 2092, 187-194 (2020).</li>
<li>Hinds, J. W., Hinds, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+ganglion+cell+differentiation+in+the+mouse+retina%3A+an+electron+microscopic+analysis+utilizing+serial+sections%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Early ganglion cell differentiation in the mouse retina: an electron microscopic analysis utilizing serial sections.</a> Dev Biol. 37 (2), 381-416 (1974).</li>
<li>Sappington, R. M., Carlson, B. J., Crish, S. D., Calkins, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+microbead+occlusion+model%3A+a+paradigm+for+induced+ocular+hypertension+in+rats+and+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">The microbead occlusion model: a paradigm for induced ocular hypertension in rats and mice.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 51 (1), 207-216 (2010).</li>
<li>Mao, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T-box+transcription+regulator+Tbr2+is+essential+for+the+formation+and+maintenance+of+Opn4%2Fmelanopsin-expressing+intrinsically+photosensitive+retinal+ganglion+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">T-box transcription regulator Tbr2 is essential for the formation and maintenance of Opn4/melanopsin-expressing intrinsically photosensitive retinal ganglion cells.</a> J Neurosci. 34 (39), 13083-13095 (2014).</li>
<li>Chen, C. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+Tbr2-expressing+retinal+ganglion+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Characterization of Tbr2-expressing retinal ganglion cells.</a> J Comp Neurol. 529 (15), 3513-3532 (2021).</li>
<li>Zhang, X. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+restricted+expression+of+Cre+recombinase+in+cerebellar+Purkinje+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">Highly restricted expression of Cre recombinase in cerebellar Purkinje cells.</a> Genesis. 40 (1), 45-51 (2004).</li>
<li>Kiyama, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Essential+Roles+of+Tbr1+in+the+Formation+and+Maintenance+of+the+Orientation-Selective+J-RGCs+and+a+Group+of+OFF-Sustained+RGCs+in+Mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Essential Roles of Tbr1 in the Formation and Maintenance of the Orientation-Selective J-RGCs and a Group of OFF-Sustained RGCs in Mouse.</a> Cell Rep. 27 (3), 900-915.e5 (2019).</li>
<li>Kiyama, T., Chen, C. K., Zhang, A., Mao, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+Susceptibility+of+Retinal+Neurons+to+the+Loss+of+Mitochondrial+Biogenesis+Factor+Nrf1%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Differential Susceptibility of Retinal Neurons to the Loss of Mitochondrial Biogenesis Factor Nrf1.</a> Cells. 11 (14), 2203(2022).</li>
<li>Badea, T. C., Wang, Y., Nathans, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+noninvasive+genetic%2Fpharmacologic+strategy+for+visualizing+cell+morphology+and+clonal+relationships+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">A noninvasive genetic/pharmacologic strategy for visualizing cell morphology and clonal relationships in the mouse.</a> J Neurosci. 23 (6), 2314-2322 (2003).</li>
<li>Mao, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eomesodermin%2C+a+target+gene+of+Pou4f2%2C+is+required+for+retinal+ganglion+cell+and+optic+nerve+development+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Eomesodermin, a target gene of Pou4f2, is required for retinal ganglion cell and optic nerve development in the mouse.</a> Development. 135 (2), 271-280 (2008).</li>
<li>Shi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+interactions+between+Brn3+transcription+factors+in+retinal+ganglion+cell+type+specification%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Genetic interactions between Brn3 transcription factors in retinal ganglion cell type specification.</a> PLoS One. 8 (10), e76347(2013).</li>
<li>Muzyka, V. V., Brooks, M., Badea, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Postnatal+developmental+dynamics+of+cell+type+specification+genes+in+Brn3a%2FPou4f1+Retinal+Ganglion+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Neural+Dev%22%5BJournal%5D)">Postnatal developmental dynamics of cell type specification genes in Brn3a/Pou4f1 Retinal Ganglion Cells.</a> Neural Dev. 13 (1), 15(2018).</li>
<li>Liu, S., Aldinger, K. A., Cheng, C. V., Kiyama, T., Dave, M., McNamara, H. K., Zhao, W., Stafford, J. M., Descostes, N., Lee, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NRF1+association+with+AUTS2-Polycomb+mediates+specific+gene+activation+in+the+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">NRF1 association with AUTS2-Polycomb mediates specific gene activation in the brain.</a> Mol Cell. 81 (22), 4663-4676.e8 (2021).</li>
<li>Kiyama, T., Altay, H. Y., Badea, T. C., Mao, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pou4f1-Tbr1+transcriptional+cascade+controls+the+formation+of+Jam2-expressing+retinal+ganglion+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Pou4f1-Tbr1 transcriptional cascade controls the formation of Jam2-expressing retinal ganglion cells.</a> Front Ophthalmol. 3, 1175568(2023).</li>
<li>Park, K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Promoting+axon+regeneration+in+the+adult+CNS+by+modulation+of+the+PTEN%2FmTOR+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Promoting axon regeneration in the adult CNS by modulation of the PTEN/mTOR pathway.</a> Science. 322 (5903), 963-966 (2008).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów.

W tym badaniu wykorzystaliśmy genetycznie ukierunkowany rzadki system znakowania AP w połączeniu z wieloma genetycznie zmanipulowanymi liniami myszy w celu zbadania zdarzeń zwyrodnieniowych wywołanych przez NMDA w różnych podtypach RGC i AC i odkryliśmy kilka charakterystycznych fenotypów 29,31,39. Najbardziej zauważalnym fenotypem jest znaczna redukcja RGC i AC w siatkówkach, którym wstrzyknięto NMDA (Figur...

Urazowe uszkodzenie mózgu (TBI) to nagły uraz, który powoduje uszkodzenie neuronów w mózgu. W ciężkich postaciach TBI, takich jak te spowodowane wypadkami samochodowymi lub kolizjami sportowymi oraz obrażeniami spowodowanymi wybuchem w wyniku eksplozji, siły mechaniczne mogą zakłócać architekturę komórki, prowadząc do stanu zapalnego, stresu oksydacyjnego, ekscytotoksyczności i ostatecznie śmierci neuronów 1,2.
Siatkówka, najbardziej dostępna część ośrodkowego układu nerwowego (OUN), posłużyła jako modelowy system TBI do badania mechanizmów molekularnych leżących u podstaw ekscytotoksyczności i opracowania strategii interwencji terapeutycznej 3,4,5. Najbardziej istotnymi modelami siatkówki do badań TBI są model zmiażdżenia nerwu wzrokowego i ekscytotoksyczność siatkówki wywołana kwasem N-metylo-D-asparaginowym (NMDA). W modelu siatkówki ekscytotoksyczności indukowanej przez NMDA, komórki zwojowe siatkówki (RGC) zostały zidentyfikowane jako najbardziej podatny typ neuronów siatkówki, ponieważ RGC wykorzystują glutaminian jako główny neuroprzekaźnik pobudzający i różne typy receptorów glutaminianu, w tym receptory AMPA (AMPAR), receptory KAPA (KAPAR) i receptory NMDA, do wyzwalania potencjału aksonów6. Oprócz RGC, leczenie NMDA może również wpływać na inne komórki siatkówki i obwody nerwowe 7,8,9. Doszkliste podanie NMDA powoduje przedłużone otwarcie receptora NMDA, co prowadzi do nadmiernego napływu wapnia do komórek, powodując nadmierną pobudzającą aktywność neuronalną i niezrównoważoną homeostazę wapnia 10,11,12,13.
Receptor NMDA jest heteromerycznym kompleksem złożonym z trzech podjednostek: GluN1, GluN2 i GluN3 14,15,16,17,18. GluN1, kodowany przez Grin1, zawiera osiem izoform u myszy z powodu alternatywnego splicingu Grin1. Istnieją cztery różne podjednostki GluN2 (a-d), które są kodowane przez cztery oddzielne geny: Grin2a-2d. Istnieją dwie różne podjednostki GluN3 (a i b), które są kodowane przez Grin3a i 3b. Zgodnie z danymi scRNA-seq19,20, Grin1 jest wysoce eksprymowany w większości podtypów RGC (Figura 1A), a także w kilku podtypach komórek amakrynowych (AC) o słabych lub umiarkowanych poziomach ekspresji (Figura 1B). Grin2a jest wzbogacony w mniej podtypów RGC i AC, podczas gdy Grin2b ulega umiarkowanej ekspresji w większości RGC i wielu podtypach AC (ryc. 1A,B). Poziomy ekspresji Grin2c, Grin2d i Grin3b w RGC i AC są bardzo niskie (ryc. 1A,B). Ekspresję Grin3a można zaobserwować w kilku podtypach RGC i słabo w kilku AC (ryc. 1A,B). Oprócz roli receptorów NMDA, ekscytotoksyczność wywołana napływem wapnia przez przepuszczalne dla wapnia AMPAR została opisana w wielu modelach choroby21. Ekspresja podjednostek receptora NMDA może dostarczyć wskazówek, dlaczego ekscytotoksyczność wywołana przez NMDA jest ukierunkowana głównie na RGC, a także AC 9,10,14,22,23.
Konwencjonalne metody oceny poważnych fenotypów siatkówki wywołanych NMDA obejmują barwienie hematoksyliną i eozyną (H&E) w celu wykrycia nieprawidłowości histologicznych, test TUNEL na śmierć komórki oraz barwienie immunofluorescencyjne (IF) przy użyciu biomarkera specyficznego dla typu komórki 8,10,24,25,26 . Na poziomie komórkowym wykorzystano obrazowanie konfokalne i techniki wypełniania barwnikiem w celu zbadania sekwencji zdarzeń w umierających RGC w modelu siatkówki indukowanym przez NMDA. Metody te dostarczyły cennych informacji na temat subkomórkowych przedziałów umierających RGC i pozwoliły na identyfikację typów odpornych RGC, które przeżywają w warunkach NMDAinsult 27,28.
Tutaj stosujemy barwienie genetycznie aktywowaną fosfatazą alkaliczną (AP) w celu zbadania cech anatomicznych i fenotypów neuronów siatkówki myszy pod wpływem ekscytotoksyczności wywołanej przez NMDA 29,30,31. Uzasadnieniem wyboru tej metody jest jej prostota, opłacalność i możliwość uzyskania kompleksowego przeglądu cech anatomicznych podtypów neuronów w całej siatkówce, co sprawia, że dobrze nadaje się ona do ocen ogólnych i analiz porównawczych na dużą skalę. Podejście to dostarcza nowych informacji na temat tego, jak odrębne, genetycznie oznaczone neurony siatkówki reagują na NMDA zarówno na poziomie ogólnym, jak i subkomórkowym. Przewidujemy, że strategia ta będzie miała szerokie zastosowanie do oceny zmian morfologicznych w różnych modelach chorób, które wpływają na architekturę neuronów i organizację synaptyczną 4,26,32,33.

<table><tbody><tr><td>0,5% maść okulistyczna z erytromycyną&nbsp;</td><td>Bausch+Lomb</td><td>24208-910-55</td><td></td></tr><tr><td>0,5% chlorowodorek proparakainy&nbsp;</td><td>Bausch+Lomb</td><td>24208-730-06</td><td></td></tr><tr><td>10% neutralna buforowana formalina&nbsp;</td><td>Firma VWR</td><td>89370-094</td><td></td></tr><tr><td>10 cm Petrydisa</td><td>Corning</td><td>430167</td><td></td></tr><tr><td>10 kanałów PBS</td><td>Fisher Naukowy</td><td>Zobacz materiał BP399</td><td>Rozcieńczyć w wodzie, aby utworzyć 1x PBS i autoklaw.</td></tr><tr><td>Tubka 2,0 ml</td><td>Firma VWR</td><td>525-1136</td><td></td></tr><tr><td>Igła iniekcyjna o rozmiarze 30</td><td>EXELINT Międzynarodowa</td><td>26437</td><td></td></tr><tr><td>30 mm Petrydisa</td><td>Sokół</td><td>35208</td><td></td></tr><tr><td>Alchohol benzylowy&nbsp;</td><td>Acros Organics</td><td>447000010</td><td></td></tr><tr><td>Benzan benzylu</td><td>Acros Organics</td><td>105860010</td><td></td></tr><tr><td>Filtr membranowy z azotanu celulozy</td><td>Cytiva (Cytiwa)</td><td>7188-002</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełko nakrywkowe</td><td>Nauki o mikroskopii elektronowej</td><td>72204-01</td><td></td></tr><tr><td>Taśma dwustronna</td><td>Scotch</td><td>597020</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Laboratoria Decon</td><td>2716</td><td>Unikaj bioodczynników Fisher (Cat#: BP2818) do odhydtrowania po barwieniu AP. Ten odczynnik zniekształca siatkówki.</td></tr><tr><td>Kleszcze</td><td>TED PELLA</td><td>505</td><td></td></tr><tr><td>Poduszka grzewcza</td><td>Raczej</td><td>710298-001</td><td></td></tr><tr><td>Strzykawka insulinowa</td><td>BD</td><td>329424</td><td></td></tr><tr><td>Ketamina</td><td>Dechra (Głuch)</td><td>17033010110</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop</td><td>Zeiss</td><td>Axio Imager 2 (Kamera Axio Imager 2)</td><td></td></tr><tr><td>Lakier do paznokci</td><td>Nauki o mikroskopii elektronowej</td><td>72180</td><td></td></tr><tr><td>Wtryskiwacz Nanofil</td><td>Światowe instrumenty precyzyjne</td><td>NANOFIL</td><td></td></tr><tr><td>Igła Nanofil</td><td>Światowe instrumenty precyzyjne</td><td>NF25BL powiedział:</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw odczynników NBT/BICP</td><td>Invitrogen</td><td>Numer katalogowy N6547</td><td></td></tr><tr><td>Certyfikat NMDA (Międzynarodowa T</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Zobacz materiał M3262 TGL</td><td></td></tr><tr><td>Pędzlem</td><td>Sztuka królewska</td><td>6650</td><td></td></tr><tr><td>Szkło przesuwne</td><td>Fisher Naukowy</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop stereoskopowy</td><td>Motic</td><td>DM143 powiedział:</td><td></td></tr><tr><td>Olej z nasion słonecznika</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Zobacz materiał S5007 powiedział:</td><td></td></tr><tr><td>Tamoksyfen</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Zobacz materiał T5648 TGL</td><td>Roztwór tamoksyfenu należy przechowywać w temperaturze 4 stopni C w szczelnym pudełku. Roztwór tamoksyfenu należy zużyć w ciągu jednego tygodnia.</td></tr><tr><td>Nożyczki Vanna&nbsp;</td><td>Narzędzia naukowe</td><td>15000-00</td><td></td></tr><tr><td>Kąpiel wodna</td><td>Linia laboratoryjna</td><td>18052</td><td></td></tr><tr><td>Ksylazyna</td><td>Dechra (Głuch)</td><td>17033-0099-05</td><td>Nazwa produktu: Rompun</td></tr></tbody></table>

badanie cech anatomicznych komórek zwojowych siatkówki pod wpływem ekscytotoksyczności wywołanej kwasem n-metylo-d-asparaginowym (nmda)

Examination of Anatomical Features of Retinal Ganglion Cells Under N-methyl-D-aspartic Acid (NMDA)-induced Excitotoxicity

Komórki zwojowe siatkówki (RGC) są neuronami wyjściowymi siatkówki, odpowiedzialnymi za przekazywanie informacji wizualnych do mózgu. W dojrzałej siatkówce myszy zidentyfikowano ponad 40 typów RGC na podstawie cech genomicznych, morfologicznych i funkcjonalnych. Zwyrodnienie RGC jest cechą charakterystyczną różnych wyniszczających chorób siatkówki, w tym jaskry i pourazowej neuropatii nerwu wzrokowego. Uzyskanie głębszego wglądu w mechanizmy komórkowe i molekularne leżące u podstaw zwyrodnienia, przeżycia i odporności RGC w różnych stanach chorobowych ma kluczowe znaczenie dla opracowania skutecznych interwencji terapeutycznych. Aby zbadać zwyrodnienie RGC, zastosowaliśmy prostą, ale potężną technikę, która była wcześniej szeroko stosowana w badaniach rozwoju siatkówki dla morfologii RGC i projekcji centralnej. Tutaj stosujemy tę metodę do oceny anatomicznych fenotypów RGC w warunkach ekscytotoksyczności wywołanej przez NMDA. Takie podejście umożliwia wizualizację dużej liczby degenerujących się RGC w czasie, co pozwala nam zmapować sekwencję zdarzeń zwyrodnieniowych, zidentyfikować charakterystyczne fenotypy umierających RGC i rozróżnić RGC, które są odporne na uszkodzenia wywołane przez NMDA.

Zastosowanie NMDA w ciele szklistym indukuje śmierć RGC, która tradycyjnie była wykrywana za pomocą barwienia histologicznego lub barwienia immunofluorescencyjnego (IF) markerami RGC. W naszych warunkach eksperymentalnych, stosując konwencjonalną strategię IF z markerem RBPMS pan-RGC, potwierdziliśmy, że liczba RGC zmniejszyła się o około 65%, 1 tydzień po wstrzyknięciu NMDA (Figura 2E-G). Wcześniejsze badania wykazały, że RGC wykazujące ekspresję Tbr2 są rzeczywiście ipRGC<...

W tym miejscu opisujemy zastosowanie metody znakowania genetycznie ukierunkowanej fosfatazy alkalicznej (AP) do badania cech anatomicznych i fenotypów siatkówki myszy w warunkach ekscytotoksyczności wywołanej przez NMDA. W połączeniu z kilkoma liniami reporterowymi specyficznymi dla podtypu komórek zwojowych siatkówki (RGC), odkrywamy nowe fenotypy u umierających RGC w całym procesie zwyrodnieniowym.

Badanie cech anatomicznych komórek zwojowych siatkówki pod wpływem ekscytotoksyczności wywołanej kwasem N-metylo-D-asparaginowym (NMDA)

Retinal ganglion cells (RGCs) are the output neurons of the retina, responsible for transmitting visual information to the brain. In the mature mouse ...

Staramy się zrozumieć rozwój, przeżycie i degenerację komórek zwojowych siatkówki za pomocą przebudowy. Używamy genetycznie zmodyfikowanej linii myszy do znakowania określonych typów komórek w celu monitorowania degeneracji tych komórek. Dzięki temu protokołowi możemy badać cechy anatomiczne i fenotypy komórek zwojowych siatkówki pod wpływem ekscytotoksyczności wywołanej przez NMDA. Takie podejście dostarcza nowych informacji na temat tego, jak komórki zwojowe siatkówki reagują na NMDA na poziomie ogólnym i subkomórkowym. Na początek pobierz gałkę oczną od myszy, której wstrzyknięto NMDA po eutanazji, i przenieś ją do osobnej oznaczonej dwumililitrowej tubki. Umieść gałkę oczną w 10% neutralnej buforowanej formalinie na 10 minut w temperaturze pokojowej i uzyskaj filtr membranowy z azotanu celulozy, aby płasko zamontować siatkówkę. Po utrwaleniu przenieś gałkę oczną na 10-centymetrową szalkę Petriego zawierającą 1

examination-anatomical-features-retinal-ganglion-cells-under-n-methyl

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Iniekcja doszklistkowa jest powszechnie stosowaną techniką w badaniach nad naukami o widzeniu w kontekście chorób oczu lub jako metoda bezpośredniego zastosowania miejscowego leczenia. W tym filmie zaprezentowano protokół iniekcji doszklistkowej z użyciem strzykawki o pojemności 1ml z szklaną pipetą. Przedstawiono praktyczne wskazówki dotyczące unikania masywnych krwawień oraz uszkodzeń soczewki.

Iniekcja doplastycznej w głąb ciała szklistego w celu ustanowienia modelu chorób oczu

Niniejszy film prezentuje trzy rodzaje analiz morfometrycznych siatkówki, obejmujące pomiar grubości wewnętrznej warstwy jądrowej, określenie liczby komórek zwojowych siatkówki (RGCs) oraz pomiar wielkości RGCs. Technika ta może stanowić prostą, a zarazem naukową platformę do przeprowadzania analiz morfometrycznych.

Analizy morfometryczne przekrojów siatkówki

Ten film ilustruje metodę, przy użyciu klinicznego skanera 3 T, do obrazowania MR z kontrastem projekcji wzrokowej naiwnej myszy oraz do powtarzalnych i podłużnych badań in vivo zwyrodnienia nerwu wzrokowego związanego z ostrym uszkodzeniem nerwu wzrokowego i przewlekłym zwyrodnieniem nerwu wzrokowego u myszy z nokautem (p50KO).

In vivo (in vivo) Obrazowanie integralności włókien nerwu wzrokowego za pomocą rezonansu magnetycznego ze wzmocnieniem kontrastowym u myszy

Protokoły immunohistochemiczne są używane do badania lokalizacji określonego białka w siatkówce. Techniki obrazowania wapnia są wykorzystywane do badania dynamiki wapnia w komórkach zwojowych siatkówki i ich aksonach.

Metody obrazowania immunohistochemicznego i wapniowego w siatkówce szczura

Ten protokół opisuje prostą metodę izolowania i hodowli pierwotnych mysich neuronów ziarnistych (CGN) od 6-7 dniowych szczeniąt, efektywną transdukcję CGN dla badań nad utratą i zyskiem funkcji, oraz modelowanie ekscytotoksyczności neuronów indukowanej przez NMDA, śmierci komórek indukowanej niskim poziomem potasu, uszkodzeń DNA i stresu oksydacyjnego przy użyciu tego samego modelu hodowli.

Modelowanie śmierci i zwyrodnienia neuronów w pierwotnych neuronach ziarnistych móżdżku myszy

Celem tego protokołu jest ułatwienie badania receptorów NMDA (NMDAR) na większą skalę i umożliwienie badania modulacyjnych efektów małych cząsteczek i ich zastosowań terapeutycznych.

Wysokoprzepustowy test strumienia wapnia do badania receptorów NMDA z wrażliwością na glicynę/D-serynę i glutaminian

Obrazowanie in vivo jest potężnym narzędziem do badania biologii w zdrowiu i chorobie. Protokół ten opisuje obrazowanie przezźrenicowe siatkówki myszy za pomocą standardowego mikroskopu dwufotonowego. Zademonstrowano również różne metody obrazowania in vivo, które umożliwiają fluorescencyjne znakowanie wielu kohort komórkowych siatkówki.

Przezźrenicowe dwufotonowe obrazowanie in vivo siatkówki myszy

Ten artykuł opisuje protokół do określania różnic w podstawowym stanie redoks i redoks odpowiedzi na ostre perturbacje w pierwotnych neuronach hipokampa i kory mózgowej za pomocą konfokalnej mikroskopii na żywo. Protokół może być stosowany do innych typów komórek i mikroskopów przy minimalnych modyfikacjach.

Obrazowanie na żywo mitochondrialnego stanu redoks glutationu w neuronach pierwotnych przy użyciu wskaźnika ratiometrycznego

Metanol może być używany jako pomocnicze stałe podłoże do przygotowania całej siatkówki i długoterminowego przechowywania, co jest przydatne do badania komórek zwojowych siatkówki.

Preparat na bazie metanolu do badania komórek zwojowych siatkówki

W niniejszym filmie opisano metodę znakowania wstecznego komórek zwojowych siatkówki (RGC) poprzez aplikację fluoro-gold (FG) na powierzchnię wzgórka górnego (SC). Technika ta obejmuje wykonanie otworu trepanacyjnego w czaszce, aspirację kory oraz nałożenie gąbki żelatynowej na całą grzbietową powierzchnię SC.

Wsteczna znakowanie komórek zwojowych siatkówki poprzez aplikację Fluoro-Gold na powierzchnię wzgórka górnego

Poznaj metodę genetycznego znakowania fosfatazą zasadową do badania degeneracji komórek zwojowych siatkówki myszy pod wpływem ekscytotoksyczności NMDA. Odkryj nowe fenotypy umierających neuronów.

Badanie cech anatomicznych komórek zwojowych siatkówki pod wpływem ekscytotoksyczności wywołanej kwasem N-metylo-D-asparaginowym (NMDA) (Wideo) | JoVE Journal

Badanie cech anatomicznych komórek zwojowych siatkówki pod wpływem ekscytotoksyczności wywołanej kwasem N-metylo-D-asparaginowym (NMDA)

Przeglądaj więcej filmów