Detekcja metaboliczna w czasie rzeczywistym w żywych komórkach przy użyciu hiperpolaryzowanego ¹³C NMR

Opracowaliśmy nieinwazyjną metodę pomiaru metabolizmu surowicy w czasie rzeczywistym przy użyciu zaawansowanych technik hiperpolaryzacji NMR. Naszym celem jest tworzenie dostępnych narzędzi do różnych zastosowań w badaniach biologicznych. Zgłoszono kilka hiperspolaryzowanych systemów NMR do metabolizmu surowicy. Jednak do tej pory nie były dostępne ustandaryzowane i powtarzalne protokoły do szerszego wdrażania badań.

Nasz protokół zwiększa dostępność za pomocą dostępnych na rynku komponentów. Zapewniamy również kompleksową walidację, w tym korzyści związane z mieszaniem systemów i możliwością wielokrotnych pomiarów w celu szerszej adaptacji. Nasze wyniki umożliwiają śledzenie dynamicznych zmian metabolicznych w żywych komórkach w czasie rzeczywistym bez zakłóceń. Otwiera to nowe możliwości długoterminowych badań nad lekami w różnych zastosowaniach sond metabolicznych.

Nasze podejście ma ograniczenia, w tym opcje prób i wymagania dotyczące automatyzacji. Sprostanie tym wyzwaniom pozwoli na opracowanie technik pomiaru metabolizmu komórkowego i wzbogaci wysiłki badawcze naszego laboratorium w zakresie DNP w przyszłości.

[Narrator] Na początek dodaj dwa mililitry 0,25% objętościowo roztworu trypsyny EDTA do 10-centymetrowej naczynia. Delikatnie przechyl naczynie, aby upewnić się, że cała powierzchnia jest pokryta. Następnie odessać nadmiar trypsyny, roztworu kwasu etylenodiaminotetracetynowego. Umieść naczynie w inkubatorze ustawionym na 37 stopni Celsjusza i inkubuj przez dwie minuty. Następnie dodaj 10 mililitrów pożywki hodowlanej do naczynia. Za pomocą pipety delikatnie pipetuj w górę iw dół, aby oderwać komórki od powierzchni i zebrać całą zawiesinę komórek do stożkowej probówki o pojemności 15 mililitrów. Teraz weź około 10 mikrolitrów zawiesiny komórek i załaduj je do licznika komórek, aby określić liczbę komórek. Upewnij się, że zmierzona liczba potwierdza wydajność około 10 milionów komórek lub dostosuj w razie potrzeby. Odwirować pozostałą zawiesinę komórkową o stężeniu 120 x g przez pięć minut. Po odwirowaniu odessać i wyrzucić supernatant. Ponownie zawiesić powstałe osady komórkowe w czterech mililitrach 2% wagowo-objętościowego roztworu alginianu i powoli pipetować, aby zminimalizować tworzenie się pęcherzyków. Teraz dodaj 10 mililitrów 50-milimolowego roztworu chlorku wapnia do 50-mililitrowej probówki wirówkowej. Przymocować strzykawkę do nakrętki probówki wirówkowej zawierającej roztwór chlorku wapnia. Pobrać 300 mikrolitrów mieszaniny alginianów komórkowych do strzykawki o pojemności 0,5 mililitra wyposażonej w igłę o średnicy 10 milimetrów. Następnie szczelnie zamknij probówkę wirówkową ze strzykawką przymocowaną do nasadki i umieść zestaw w wirówce, aby delikatnie wirować z prędkością 200 x g przez pięć minut. Po odwirowaniu usunąć supernatant i ponownie zawiesić powstały żel w pożywce hodowlanej. Następnie, za pomocą pipety Pasteura, przenieś żel w kapsułkach do probówki NMR i włóż uchwyt gąbki, aby zapewnić szczelne uszczelnienie. Podgrzej zbiornik pożywki zawierający 5% objętościowo tlenku deuteru w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza. Rozpocznij krążenie z szybkością około 500 mikrolitrów na godzinę, aby ustabilizować warunki. Przed kontynuowaniem sprawdź konfigurację, aby upewnić się, że nie ma wycieków. Dodać 18 mikrolitrów kwasu pirogronowego znakowanego węglem 13 o stężeniu 14,2 molowym domieszkowanym 25 milimolowym OX063 do fiolki z próbką. Podłączyć fiolkę do ścieżki płynu systemu dynamicznego polaryzatora polaryzacji jądrowej. Następnie włóż podłączoną fiolkę do zespołu otworu dynamicznego polaryzatora jądrowego. Zastosuj promieniowanie mikrofalowe o częstotliwości około 188 gigaherców i mocy 22 miliwatów przez czas trwania od 60 do 80 minut. Użyj spektrometru magnetycznego rezonansu jądrowego w stanie stałym zintegrowanego z systemem dynamicznej polaryzacji jądrowej, aby monitorować intensywność sygnału węgla 13. Rejestruj dane sygnału co pięć minut za pomocą oprogramowania sterującego systemem. Teraz szybko rozpuść spolaryzowaną próbkę w 3,2 mililitra buforu do rozpuszczania podgrzanego do temperatury biologicznej. Załaduj przygotowaną próbkę do probówki NMR i włóż probówkę do spektrometru. Na konsoli NMR zainicjuj automatyczną procedurę, aby wykonać blokowanie, dostrajanie, dopasowywanie i podkładkowanie z próbką na miejscu, aby zapewnić optymalną rozdzielczość widmową i stabilność sygnału. Załaduj sekwencję akwizycji impulsów węglowych 13 z włączonym odsprzęganiem protonów przy użyciu ustawienia takiego jak 13-CPD. Ustaw kąt odwrócenia na 90 stopni za pomocą jednosekundowego impulsu oznaczonego jako P1. Następnie zdefiniuj czas akwizycji jako 1,376 sekundy, szerokość widmową jako 23 663 herców, a punkty akwizycji lub TD jako 65 536. Ustaw opóźnienie relaksacji D1 na zero sekund. Przypisz TD1 150 przyrostów czasowych w celu uzyskania 150 widm sekwencyjnych w trybie pseudo-2 wymiarowym i dostosuj wzmocnienie odbiornika do niskiej wartości, takiej jak około jeden, aby uniknąć nasycenia sygnału spowodowanego przez hiperspolaryzowane próbki. Teraz zatrzymaj pompę perystaltyczną, aby tymczasowo zatrzymać cyrkulację pożywki przed wstrzyknięciem hiperspolaryzowanego roztworu przez rurkę wlotową. Rozpocznij akwizycję widmową na około 10 sekund przed rozpuszczeniem hiperspolaryzowanego substratu, aby zapewnić przechwycenie sygnału po przybyciu do miejsca detekcji. Gdy roztwór opuści dynamiczny polaryzator polaryzacji jądrowej, pobierz jeden mililitr do strzykawki. Przełącz zawór trójdrogowy na wlocie bioreaktora do pozycji B, aby skierować hiperspolaryzowany roztwór do rurki NMR. Po zakończeniu wstrzykiwania należy przełączyć zawór z powrotem do pozycji A, aby wznowić krążenie medium i zapobiec cofaniu się. Na koniec potwierdź, że wstrzyknięcie się powiodło po odnotowaniu wzrostu sygnału zaniku swobodnej indukcji w oprogramowaniu akwizycyjnym. Upewnij się, że końcowy roztwór osiąga temperaturę między 308 a 313 kelwinów i pH około siedmiu przed przekazaniem do pomiaru NMR. Hiperspolaryzowane widma NMR węgla 13 tej samej próbki zamkniętej w komorze SCCVII zostały zebrane w odstępach 1,5-godzinnych w celu oceny wykonalności powtarzających się pomiarów nieniszczących. Pierwszy pomiar NMR wykazał znacznie zwiększony sygnał mleczanu, co wskazuje na konwersję metaboliczną aktywnego pirogronianu do mleczanu. Kolejne pomiary w odstępach 1,5-godzinnych wykazały postępujące zmniejszenie intensywności sygnału mleczanowego, co wskazuje na zmniejszoną aktywność metaboliczną w czasie. W komórkach HeLa wstępne pomiary potwierdziły udaną konwersję pirogronianu do mleczanu z wyraźnie dostrzegalnymi pikami sygnału. Chociaż sygnał zmniejszał się stopniowo z powodu relaksacji T2, stosunek sygnału do szumu pozostał odpowiedni przez 60 sekund akwizycji, co sugeruje, że obecny protokół ma szerokie zastosowanie i może służyć jako wszechstronne narzędzie do profilowania metabolicznego w czasie rzeczywistym w różnych typach komórek.